Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología Curso 2011
Cultivo de tejidos vegetales IMaría Mercedes Rivero
Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales
Micropropagación vegetal
Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas
Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis
Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales
Sistemas de micropropagación vegetal. Proliferación de yemas axilares o apicales
Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas
Sistemas de micropropagación vegetalLiberación de patógenos
Sumario
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Referencias
Conservación de germoplasma
Sumario
Semillas sintéticas
Cultivo in vitro de células haploides y de embriones-Cultivo de anteras-Cultivo de polen-Cultivo de óvulos-Cultivo de embriones
Cultivo de protoplastos
Variación somaclonal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Técnicas del cultivo de célulasy tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de cé lulas y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- Desdiferenciación / Rediferenciación
- Balance de reguladores del crecimientovegetal
Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• La teoría de la totipotencialidad celular , enunciadapor Haberlandt a principios del siglo XX, postula qu e toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren co ndiciones específicas referidas al medio del cultivo, relacio nes hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
• La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización d e un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemát ico. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la redifereciación de las células previamente desdiferenciadas.
• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento , fundamentalmente de auxinas y citocininas .
Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Micropropagación vegetal
• Regeneración de plantas(embriogénesis y organogénesis)
• Cultivo de meristemas
• Cultivo de suspensiones de células vegetales
• Cultivo de protoplastos
• Cultivo de anteras
• Cultivo de óvulos y embriones
Técnicasdel cultivode célulasy tejidosvegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Micropropagación vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala.
• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperat ura, luz y fotoperíodo.
La micro-propagaciónconstituyela principal aplicacióncomercialdel cultivode tejidosvegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Propagación vegetativa rápida y a gran escala
• Uniformidad seleccionada del material clonado
• Multiplicación de plantas recalcitrantesa las técnicas convencionales
• Reducción en el tiempo de multiplicacióny en el espacio requerido para tal fin
• Mayor control sobre la sanidad del material propagado
• Introducción rápida de nuevos cultivares
• Conservación de germoplasma
• Facilidades para el intercambio internacionalde material vegetal
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Alcances de la micro-propagación vegetal
Consideraciones técnicas de la propagaciónclonal masiva de plantas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Laboratorio- Area de preparación de medios- Area de lavado y esterilización- Cuarto estéril- Cámara de cultivo- Area de rusticación
• Material vegetal
- Plantas madres seleccionadas(preacondicionamiento)
- Explantos (elección, disección,esterilización, etc.)
• Condiciones de cultivo
- Asepsia- Recipientes- Temperatura- Luz y fotoperíodo
La micro-propagaciónrequiere unainfraestructuramínimaespecializaday condicionescontroladasde cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Compuestos inorgánicosMacronutrientes: NO4
- , PO43- , K+, Ca2+,
Mg2+, SO42-
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-
CarbohidratosSacarosa, glucosa, mio-inositol
VitaminasTiamina (B1)PiridoxinaAcido nicotínico (C)Biotina
AminoácidosGlicina
Reguladores del crecimientoAuxinasCitocininasGiberelinas
Soporte inerte (medios semisólidos)Agar (0,7 a 1%)Gelrite®
pH5,6 – 5,8
Esterilización1 atmósfera, 15 a 20 min en autoclave
Medios de cultivo: composición general
• Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
• Soluciones concentradas de microelementos (100x)
• Vitaminas grupo B (500 ó 1000x)
• Mio-inositol (100 mg/L)
• Azúcares: sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L
• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L
Formulaciónbásica de un medio de cultivo para tejidos vegetales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).
• En el caso de un medio sólido, la concentracióny calidad del ágar pueden tener importantes efectosen el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.)
• El cultivo en medio líquido resulta imprescindiblecuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:
- Inducción de embriogénesis- Cultivo de protoplastos- Cultivo de suspensiones celulares
Consistencia del medio
Semisólido
Líquido
Propiedades físicas de los medios de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Intercambio gaseoso:Los recipientes de cultivo se tapan con un film de polietieleno (Resinite ����) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La inducción de yemas a partir de callosde tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno
- La acumulación de etileno puede inhibirla regeneración de brotes
• pH:- Constituye un factor crítico- Se ajusta en el rango 5,5-5,8- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos
Propiedades físicas de los medios de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Composición de medios de cultivo comúnmente usados
8,6121-ZnSO4.7H20
--0,0250,2-CuSO4
6,2135-H3BO3
--1010-MnSO4.H2O
-600---NaNO3
1.900-3002.50081KNO3
----142Ca(NO3)2
--134--(NH4)2SO4
---300-NH4H2PO4
1.650----NH4NO3
-750--65KCl
44075150200-CaCl2.2H2O
37025050040074MgSO4.7H2O
22,30,1---MnSO4.4H2O
-125150--NaH2PO4.H2O
170---12KH2PO4
Concentración en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto
-
0,03
0,01
Heller
0,250,250,1-NaMoO4.2H2O
0,025---CuSO4.5H2O
0,830,751-KI
Murashige y Skoog
Gamborg(B5
Schenk y Hildebrandt
(SH)White
8,6121-ZnSO4.7H20
--0,0250,2-CuSO4
6,2135-H3BO3
--1010-MnSO4.H2O
-600---NaNO3
1.900-3002.50081KNO3
----142Ca(NO3)2
--134--(NH4)2SO4
---300-NH4H2PO4
1.650----NH4NO3
-750--65KCl
44075150200-CaCl2.2H2O
37025050040074MgSO4.7H2O
22,30,1---MnSO4.4H2O
-125150--NaH2PO4.H2O
170---12KH2PO4
Concentración en el medio de cultivo (mg/L)Compuesto
-
0,03
0,01
Heller
0,250,250,1-NaMoO4.2H2O
0,025---CuSO4.5H2O
0,830,751-KI
Murashige y Skoog
Gamborg(B5
Schenk y Hildebrandt
(SH)White
Composición de medios de cultivo comúnmente usados
5,85,55,9pH
--10,5-Piridoxina-HCl
-0,03---NiCl 2.6H2O
-0,03---AlCl 3
0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O
----2,46Fe(SO4)3
27,86--15-FeSO4.7H2O
-1---FeCl3.6H2O
100-1001.000-Mio-inositol
37,26--20-Na2EDTA
--28--Sequestrene 330 Fe
----100Extracto de Levadura
--15-Acido nicotínico
0,4-105-Tiamina-HCl
Concentración en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto
-
Heller
30.00020.00030.00020.000Sacarosa
Murashige y Skoog (MS)
GamborgB5
Schenk y Hildebrandt
(SH)White
5,85,55,9pH
--10,5-Piridoxina-HCl
-0,03---NiCl 2.6H2O
-0,03---AlCl 3
0,025-0,0250,1-CoCl2.6H2O
----2,46Fe(SO4)3
27,86--15-FeSO4.7H2O
-1---FeCl3.6H2O
100-1001.000-Mio-inositol
37,26--20-Na2EDTA
--28--Sequestrene 330 Fe
----100Extracto de Levadura
--15-Acido nicotínico
0,4-105-Tiamina-HCl
Concentración en el medio de cultivo (mg/L)
Compuesto
-
Heller
30.00020.00030.00020.000Sacarosa
Murashige y Skoog (MS)
GamborgB5
Schenk y Hildebrandt
(SH)White
Reguladores del crecimiento comúnmente usadosen medios de cultivos vegetales
10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina
(kinetina)
10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábily no debería ser
autoclavada
Las citoquininasson normalmente
disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso
10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas
10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético
10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-diclorofenoxiacético El AIA puede ser
oxidado por células vegetales. Es
frecuentemente usadocomo única fuente de auxinas en el medio
de cultivo
Las auxinas son usualmentetituladas en solución con
NaOH
10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina
10-7-10-5202,2NOAAcido β-naftoxiacético
10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético
10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico
10-7-5x10-6
10-7-10-5
Rango de concentración
(M)
Soluble en agua
Preparación de solución stock
Es termolábil, no debeser autoclavada. Es
comúnmente necesariopara la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en
suspensión. Algunasveces necesario para la
regeneración de plántulas.
364,4GA3Acido giberelicoGiberelina
219,2ZeaZeatina
ComentariosPeso
MolecularAbreviaturaNombreClase
10-7-10-5215,2K6-furfurilaminopurina
(kinetina)
10-7-10-5203,32iPN-isopentenilaminopurina La zeatina es termolábily no debería ser
autoclavada
Las citoquininasson normalmente
disueltas en NaOH diluídas o en etanol acuoso
10-7-10-5225,2BAP6-bencilaminopurinaCitoquininas
10-7-10-5175,2AIAAcido indol 3-acético
10-7-10-5221,02,4-DAcido 2,4-diclorofenoxiacético El AIA puede ser
oxidado por células vegetales. Es
frecuentemente usadocomo única fuente de auxinas en el medio
de cultivo
Las auxinas son usualmentetituladas en solución con
NaOH
10-7-10-5186,6pCPAAcido clorofenoxiacéticoAuxina
10-7-10-5202,2NOAAcido β-naftoxiacético
10-7-10-5186,2NAAAcido 1-naftalenoacético
10-7-10-5203,2IBAAcido 3-indolbutírico
10-7-5x10-6
10-7-10-5
Rango de concentración
(M)
Soluble en agua
Preparación de solución stock
Es termolábil, no debeser autoclavada. Es
comúnmente necesariopara la iniciación o el mantenimiento de callos y cultivos en
suspensión. Algunasveces necesario para la
regeneración de plántulas.
364,4GA3Acido giberelicoGiberelina
219,2ZeaZeatina
ComentariosPeso
MolecularAbreviaturaNombreClase
• Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
- Auxinas- Citoquininas- Giberelinas- Acido abscísico- Etileno
• Generalidades:
- Actúan a bajas concentraciones
- Interactúan unos con otros (los resultadosestán determinados por las concentracionesrelativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todosu ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en funcióndel estado fisiológico de la planta y en cadauno de los órganos de ésta.
- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.
Reguladoresdel crecimiento
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensa jero responsable de la elongación y de la respuesta foto trópica del coleoptile de gramíneas.
- Alargamiento y división celular- Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventícias- Dominancia apical- Acción herbicida- Estimulación de la producción de etileno
• Se sintetizan en las yemas, hojas jóvenes, frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta var ía entre 0,001 y 0,1 mg/Kg.
• Su transporte es polar
• Auxinas sintéticas:
- Acido indol butírico (IBA)- Acido naftalen acético (ANA)- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
NOH
O
Acido indol acético (AIA)(auxina endógena)
Las auxinas se emplean como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro.
• Están involucradas en variadas respuestas fisiológi cas:
- Promoción de la división celular- Promoción de la organogénesis (relación
auxinas/citoquininas) - Retardo de la senescencia- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
• Citoquininas endógenas:
- Zeatina (Zea)- Isopenteniladenina (2iP)
• Citoquininas sintéticas:
- Kinetina (Kin)- Benziladenina (BAP)
• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuen tran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 ����g/Kg.
• Su transporte es no polar.
Las citoquininasdeterminan diferentes respuestas morfogenéticasen combinación con las auxinas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Fueron aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presenta ban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del ho ngo.
• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina i dentificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 giberel inasdiferentes.
• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:
- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanoso plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes- Germinación de semillas en dormición- Floración- Movilización de reservas en la semilla
• Se sintetizan en hojas jóvenes, en yemas y en el em brión.
• Su transporte no es polar.
Las giberelinasfavorecen el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
O
HCH3 H COOH
H
HO OH
CH3
C O
Acido giberélico (GA3)
Etapas del cultivo in vitrode plantas superiores
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Elección de una plantamadre selecta
Explantos
Desinfección superficial
Establecimiento en mediode cultivo apropiado
Transferencia a un medio de multiplicación
Formación de brotes o embrioides
Transferencia a un mediopara el enraizamiento de
los brotes
Pasaje a maceta en un invernáculo
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
ETAPA 4
El procesode micro-propagaciónde especiesvegetalesconsta de varias etapas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Elección del explanto inicial
Escarificación
Esterilización
Semillas estériles
Germinación
% de germinación?
Disección bajo lupa
Esterilidad Medio de Hoagland
Tritón X-100 3%, 10 minHipoclorito de Na 15%, 20 min
M. apicalHojaM. axilarTalloRaízM. radicular
MS + 2,4-D
• Protocolo tipo de esterilizació n superficial de material vegetal:
- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO)de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
- Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
- En el caso del HgCl2, el material se debeenjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
Explanto(asepsia)
Ambiente
Cultivo
• Sin respuesta
• Cultivo infectado
• Regeneración indirecta
• Regeneración directa
Respuesta
Explanto(asepsia)
Ambiente
Cultivo
• Sin respuesta
• Cultivo infectado
• Regeneración indirecta
• Regeneración directa
Respuesta
Vías morfogenéticas:organogénesis y embriogénesis
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Posibles vías morfogenéticas:
- Organogénesis
- Embriogénesis
• Diferencias entre las dos posibles vías:
- La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explanto inicial se desdiferenciainicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas.
- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.Una célula del explanto se aísla y constituye el puntode partida para la obtención de un embrión somático.Se diferencian embriones o estructuras bipolaresque completan cada una de las etapas implicadasen la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.
Existen dos posibles vías morfogenéticaspara la diferenciación de novo de brotes o plantas completas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
EmbriogénesisOrganogénesis
Fotomicrografías de las dos vías morfogenéticas
d
pfpf
av
arcv
Propagación vegetativa por embriogénesis somática
Explanto (disco de hoja)
Explanto (células
vegetales)
REGENERACIÓN
Suspensión celular
Embriones somáticos
ENCAPSULACIÓN
GERMINACIÓN
GERMINACIÓN Semillaartificial
Callo
Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de yemas axilares o apicales
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Proliferación de yemas apicales o axilares
- Consiste en la multiplicación de plantas a partirde las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemas.
- La tasa de multiplicación (tm) se calcula en base al número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explanto inicial, entre un repique y el sucesivo. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables.
- Por ejemplo, con una tm de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año a partir de una única yema inicial.
- El cultivo de meristemas es un caso especial del uso de esta técnica.
Propagaciónvegetativa a partir de yemaspreexistentes
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de micropropagación vegetalProliferación de tejidos desdiferenciados
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Consideraciones generales:
- Callo: masa de células desdiferenciadasobtenidas a partir de un explanto cultivadoin vitro (disco de hoja, meristema,células en suspensión, etc.)
- Es posible regenerar brotes o vástagos a partirde estos callos.
- Las plantas diferenciadas puedenno ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.
Resulta posibleregenerar broteso yemas a partirde tejidosvegetalesdesdiferenciadosin vitro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta
Explanto(disco de tejido)
Explanto(suspensión de células)
Regeneracióndirecta
Regeneraciónindirecta
CalloFormación
directade brotes
Formaciónindirectade brotes
Planta regenerada
Sistemas de propagaciónvegetativain vitro
Propagación vegetativa in vitroRegeneración directa e indirecta
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Sistemas de micropropagación vegetalCultivo de meristemas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Cultivo de meristemasEl empleo de meristemascomo explantos es una posibleherramienta parael saneamientode plantasinfectadas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Meristema apical
Meristema axilar
Domo meristemático
• Posibilitan la micropropagación de diferentes espec ies vegetales.
• Constituyen el explanto ideal para liberar de patóg enos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos o bacterias.
• Son ampliamente utilizados como explantos para la criopreservación y conservación de germoplasma.
Los meristemasson grupos de células indiferenciadas que retienenla capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta
Los meristemas determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Aplicaciones del cultivo de tejidos: Liberación de patógenos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
- El domo meristemático no está vascularizado(muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción).
- El número de partículas virales es menoren los meristemas que en otros tejidos (White, 1934).
- La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus.
- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivode meristemas fueron obtenidas por Morel y Martinentre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.
El cultivo de meristemasfacilita la eliminación de patógenos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Mediante esta técnica es posible sanear plantas infectadas sistémicamente por diferentes tipos de patógenos como bacterias, hongos, virus y viroides.
El cultivo de tejidos posibilita el saneamientode las plantas multiplicadas vegetativamente Síntomas producidos
por el Tomato mosaic virus.
Partículas de Potato virus Y
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
El material vegetal infectado por virus, bacterias, hongos y/o micoplasmas puede ser tratado con diferentes técnicas:
• Termoterapia
• Quimioterapia
• Cultivo de meristemas
Estos tratamientos pueden usarse por separado, pero incrementan su efectividad notablemente cuando se los combina, trabajando in vivo e in vitro.
El tratamiento de plantas madres puede efectuarse por distintas técnicas
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Termoterapia
El tratamiento por calor es un método eficaz para inactivar algunos virus y viroides. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivación del virus.
Ejemplo: El tratamiento de plantas madres de Solanumtuberosum a 8ºC durante 4 meses permiten obtener un 30% de platas libres de Potato spindle tuber viroid (PSTV).
Consideraciones prácticas para el saneamiento de plantas madres por termoterapia
Sintomasinducidospor PSTV en tubérculosde papa
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Quimioterapia
Esta técnica implica el tratamiento de las plantas madres o explantos (in vivo o in vitro) con las siguientes sustancias:
- Fungicidas en el caso de hongos
- Insecticidas frente al ataque de insectos
- Antibióticos en el caso de bacterias
- Inhibidores metabólicos (actinomicina D)
- Análogos de aminoácidos (fluorofeniladenina)
Aspectos prácticos del saneamiento de material vegetal por quimioterapia
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patógeno considerado.
• Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistemahuesped-patógeno de que se trate.
• Se incluyen entre estas pruebas:
- Selección visual u observación de síntomas
- Empleo de hospedantes indicadores
- Métodos serológicos
- Microscopía electrónica
La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Consiste en la observación de síntomas.
• Se trata de un método impreciso.
• Resulta confiable en el caso de enfermedadesque inducen síntomas muy característicoso conspícuos.
PotatoVirus X
ColiflowerBlack Rot
Observaciónvisual
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Mosaico clorótico producido por Tomato mosaic virus en tomate
Síntomas de pie negro y podredumbre blanda causados porErwinia carotovora en papa.
Enfermedades bacterianasy/o viralescon síntomas distintivos
Tubérculo inoculadocon E. carotovora
Tuberculo no inoculadoPie negro
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Antracnosis en Fragaria spp. causada por Colletotrichum
Powdery Mildew en Solanum tuberosumcausado por Erysiphespp.
Síntomas de enfermedadescausadas porhongos
Síntomas en estolones Síntomas en frutos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
Disminución de tamaño causada por nematodes en maíz
Micrografías de un nematode del género Trichodorus(tamaño aproximado: 0,5 µM de diámetro, 1 mm de largo).
Síntomas de enfermedades causados por nematodes
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Es una técnica frecuentemente utilizadapara detectar virus que pueden transmitirsemediante el jugo infeccioso extraído de plantas enfermas.
• Se usan como indicadoras variedadesmuy susceptibles de la especie estudiadau otras especies que desarrollan síntomascaracterísticos en un corto tiempo.
• Los síntomas inducidos en la plantaindicadora revelan la presenciadel patógeno y permiten identificarlo.
Empleo de hospedantes indicadores
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Se basan en la alta especificidad de la reacciónantígeno-anticuerpo, por la cual un anticuerporeconoce y se combina sólo con la porción de antígeno que le dio origen.
- Pruebas inmunoenzimáticas(DAS-ELISA)
- Floculación de látex sensibilizado(partículas de látex recubiertas poranticuerpos específicos, se observaagregación de partículas con formaciónde precipitado)
- Microprecipitación (gotas de antisueroy antígeno, se observa formación de precipitado)
Métodosserológicos
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Observación de partículas virales en extractosvegetales (dip method)
• Inmunoelectromicroscopía
• Cortes ultrafinos de tejidos vegetales (observación directa del patógeno o de anomalías citológicaso efectos histopatológicos como secuelade la presencia del patógeno)
Inclusiones virales detectadas con el microscopio óptico
Microscopíaelectrónica
Inclusión cristalina del virus delmosaico de tabaco (I) en células
epidérmicas de Nicotiana tabacum
Célula de tricoma de Vicia fabacon inclusión amorfa (I)
Agrobiotecnología
Cultivo de tejidosvegetales
• Las plantas regeneradas in vitro deben ser evaluadas para comprobar si ha sido eliminadoel patógeno considerado.
• Estas pruebas se denominan ensayos de indización (indexing) y difieren según el sistemahuesped-patógeno de que se trate.
• Se incluyen entre estas pruebas:
- Selección visual u observación de síntomas
- Empleo de hospedantes indicadores
- Métodos serológicos
- Microscopía electrónica
La metodología de saneamiento empleada debe ser evaluada
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Cultivo de tejidosvegetales
Conservación de germoplasma
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Cultivo de tejidosvegetales
Las técnicas de cultivo in vitro de tejidosvegetales costituyen parte esencial de unaestrategia general para la conservacióne intercambio de recursos fitogenéticos.
Conservaciónde germoplasma
Gentillieza W. Roca
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Cultivo de tejidosvegetales
• Colecciones in vitro
• Bancos de semillas
• Crioconservación
Existen diferentesmétodos parala conservaciónde germoplasma
www.cgiar.org
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Cultivo de tejidosvegetales
• La conservación de germoplasma medianteel cultivo de tejidos se basa en la limitacióndel crecimiento del material vegetal.
• Implementación:
- Medios de cultivo de composición subóptima
- Baja intensidad lumínica (<500 lux)
- Temperaturas inferiores a las adecuadaspara el activo metabolismo de las células y tejidos vegetales bajo cultivo (15-20 ºC)
- Alta concentración de compuestos osmóticamente activos (sacarosa, manitol)
Bancos de germoplasma in vitro
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Cultivo de tejidosvegetales
• Resultan de utilidad en el caso plantas cuyas semillas se mantienen viables durante un largo período de almacenamiento.
• El material debe mantenerse bajo condicionescontroladas en una cámara de mantenimiento:
- Bajas temperaturas
- Bajo contenido de humedad
• Este método no puede aplicarse a la conservaciónde plantas cuyas semillas presentan longevidad reducida, especies autoincompatibles o especiesde propagación vegetativa obligada
Los bancos de semilla permiten la conservación de especies vegetales que se propagan sexualmente
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Cultivo de tejidosvegetales
• Consiste en el mantenimiento de material vegetal a temperaturas ultrabajas (-196 ºC),por inmersión en nitrógeno líquido
• Diferentes explantos (ápices de yemas, meristemas, anteras, embriones inmaduros) así como callos y suspensiones celularespueden ser crioconservados a -196 ºC.
Crioconservaciónde germoplasma
www.science.siu.edu
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Cultivo de tejidosvegetales
• Crioprotección
• Congelamiento
• Almacenamiento
• Descongelamiento
• Pruebas de viabilidad
• Recultivo
Etapas del proceso de crioconservaciónde material vegetal
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Cultivo de tejidosvegetales
Crioconservación y cultivo de meristemas de soja
Cultivo in vitro de células haploidesy embriones
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Cultivo de tejidosvegetales
• Mejoramiento vegetal.
• Estudios de genética cuantitativa.
• Estudios de diferenciación celular y alternancia de generaciones.
Aplicacionesdel cultivoin vitrode célulashaploides
Tétradas demicrosporas
Sacos polínicos(con granos de polen)
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Cultivo de tejidosvegetales
Consiste en el cultivo de anteras inmadurasen medios sintéticos que promueven la divisióncelular y la formación de embriones o callos.Los embriones, transferidos a un mediode regeneración, darán lugar a plantas haploides.
Cultivo in vitrode anteras
anteras
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Cultivo de tejidosvegetales
- Genotipo de las plantas donantes
- Fisiología de las plantas donantes
- Caracterización citológica y bioquímicade etapas muy tempranas del desarrollode los granos de polen
- Pretratamiento de las anteras con altaso bajas temperaturas o con choqueosmótico
- Medios de cultivo con alto contenido en osmóticos para la inducción de callos y menores concentraciones de sacarosapara la regeneración de plantas
Condicionesque afectanel cultivode anteras
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Cultivo de tejidosvegetales
- Permite la expresión e identificaciónde alelos recesivos
- Constituye una fuente útil para el mejoramientointravarietal
- Permite la rápida introducción de caracterescitoplasmáticos en un fondo genéticohomocigótico
- Crea y acrecienta las reservas citogenéticasy citoplasmáticas de los cultivos
- La obtención de haploides duplicados resultaútil para el desarrollo de nuevas variedadescon el fin de distribuirlas en ambientes ecológicosmuy diversos y para ensayarlas en ellos.
- Las microsporas o células haploides puedenusarse para la inducción de mutantes y parala selección de caracteres esporofíticos.
El cultivo de anteras ofrecenumerosasventajas para el mejoramientode plantas de interés comercial
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Cultivo de tejidosvegetales
• Estudio de requerimientos nutricionalesde embriones en desarrollo.
• Rescate de embriones híbridos derivadosde cruzamientos interespecíficos e intergenéricos.
• Produción de monoploides.
• Superación de la latencia de las semillas.
El cultivode embrionesinmadurospermiterealizardiferentesaplicaciones
Embrión cigótico
Corte longitudinal de una semilla de Brassica
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Cultivo de tejidosvegetales
Embriones somáticos (es) obtenidos a partir del cultivo de óvulos de Arabidopsis.
• Rescate de embriones (mediante polinizacióny fertilización in vitro)
• Inducción de la embriogénesis somáticaa partir de nucelos de diferentes especiesvegetales.
Aplicaciones del cultivode óvulos
es
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Cultivo de tejidosvegetales
Semillas sintéticas
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Semillassintéticas
Embriones somáticos de Pinus sp
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Cultivo de tejidosvegetales
Las semillas artificiales reproducen la estructura de una semilla de origen sexual
Las semillas artificiales poseen una cubierta de protección, contienen sustancias de reserva y portan un embrión en su interior.
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Cultivo de tejidosvegetales
Procedimiento para encapsularembrionessomáticos
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Cultivo de protoplastos
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Los protoplastos son célulasvegetalesdesprovistasde pared celular
Suspensión de protoplastosde mesófilo de tabaco
Protoplasto de mesófilo de tabacoProtoplastos de la línea celular By2
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Cultivo de tejidosvegetales
Esquema general de la manipulación genética de protoplastos in vitro para la realización de técnicas de mutagénesis, fusión o transformación.
Los protoplastosconstituyen un explanto ideal para diferentes fines biotecnológicos
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• Método mecánico
- Bajo rendimiento- Procedimiento tedioso- Aplicabilidad limitada
Choque osmótico para producir plasmólisis celulary ruptura de la pared. Los protoplastos se liberande las células rotas mediante el restablecimientode su nivel osmótico.
• Método enzimático
Consiste en la incubación de las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas contienen además proteasas, nucleasas y lipasas.
Métodos parael aislamientode protoplastos
• Protocolo para la obtención de protoplastos . de mesófilo de hoja de tabaco:
- Esterilizar superficialmente el explanto (hojas jóvenes de tabaco).
- Remover la epidermis abaxial. Cortar secciones de hoja. Disponer los explantos en un regulador osmótico.
- Disponer las secciones de hoja en una placa de Petri conteniendo la solución mezcla de enzimas y medio nutritivo para el cultivo de protoplastos en una proporción 1:1.
- Incubar con la mezcla de enzimas durante 4 a 12 hen oscuridad, a 22-25ºC, a 50 rpm.Observar la liberación de los protoplastos en un microscopio invertido.
- Lavar los protoplastos cuidadosamente tamizándolos y centrifugándolos a 100 g. Usar las soluciones formuladas para tal fin.
- Remover el sobrenadante y resuspenderlos protoplastos en medio de cultivo.
Pasosimplicados en el aislamientode protoplastos de mesófilode tabaco
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Variación somaclonal
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Entre otras causas:
• Modificaciones genéticas heredables porlas progenies de las plantas obtenidasmediante cultivo in vitro
• Prevalencia del cariotipo específico de plantas y tejidos quiméricos y de mosaicos
• Cambios en el cariotipo, debidos a una respuesta diferencial a los procedimientosde cultivo (composición del medio, etc.)
• Aneuploides no separables en el cultivo
La variaciónsomaclonalpuede explicar la variación fenotípicade las plantas regeneradas in vitro
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• Cese mitótico que lleva a líneas poliploides
• Mutaciones del cariotipo
• Amplificación o disminución de genes
• Reordenamiento de mutaciones en genomasde organelas
• Transposones
• Inversiones, traslocaciones y otros accidentes cromosómicos
Otra posibles causas de la variabilidad de las plántulas regeneradas
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• Indeseable en la micropropagación de plantas de interés comercial (diversidad genotípica)
• Potencial para el mejoramiento vegetal cuando se trata de verdaderas modificaciones del material genético (variabilidad)
Características de la variación somaclonal
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Referencias 1. Altman, A. and Loberant, B. Micropropagation: clonal plant propagation in vitro. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 2: 19 – 40 Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
2. Cassells, A. S. In vitro production of pathogen-free plants. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 4: 57 – 82. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
3. Doods, J. H. and Roberts, L. W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press. Cambridge, U.S.A. 1992.
4. Herrera Estrella, A. and Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenicfungi. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 11: 263 –282. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
5. Litz, R. E. Cultivo de embriones y óvulos. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. Cap. 12: 295 – 312, 1991.
6. Roca, W. M., Núñez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de AgriculturaTropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 – 294, 1991.
7. Sasson, A. Biotechnology and Natural Products. Prospects for Commercial Productio, ACTS, African Centre for Technology Studies. Nairobi, Kenya. 1992.
8. Roca, W. M., Núñez, V. M. & Mornan, K. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Centro Internacional de AgriculturaTropical. Cali, Colombia. Cap. 11: 271 – 294, 1991.
9. Scragg, A. H. Large scale plant tissue culture. En: Agricultural Biotechnology. Arie Altman Ed. Chapter 9: 225 – 249. Marcel Dekker, New York, U.S.A., 1998.
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