7/21/2019 aislamiento y cultivo de microorganismos
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Práctica No 4:Aislamiento y Siembra de Bacterias Aerobias
OBJETIVO
Adquirir conocimientos básicos teóricos y prácticos de la siembra y aislamiento de bacterias.
INTROD!!I"N
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos
complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que
dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que serequiera. Para ello existen tcnicas de siembra! conservación y mantenimiento de los
cultivos microbianos.
"na tcnica esencial en #icrobiología es la de obtención de cultivos puros! a partir de los
cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. "n cultivo
puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es
necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento.
SIE#BRA
Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo! elegido de acuerdo a las
exigencias vitales del microorganismo! lo que permite su desarrollo y multiplicación! si se
incuba en condiciones adecuadas! un tiempo conveniente.
Para ello una peque$a porción de cultivo o muestra! que se denomina in$c%lo se trans%iere
al medio con precauciones especiales de asepsia a %in de evitar la introducción de otrosmicroorganismos ajenos al inóculo.
El conjunto de pasos a e%ectuar para lograr una siembra correcta! se conoce como t&cnicaas&'tica.
&a toma del inóculo es simple! pero se requiere tener en cuenta lo siguiente'
(. &a siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire )cerrar bien
puertas y ventanas*! con movimientos pausados! poco amplios! sin brusquedad y sin+ablar.
,. -oloque %rente a usted el mec+ero y la preparación o muestra que contiene los
microorganismos! así como el resto del material necesario )portaobjetos! tubos!
placas*. odo ello +a de ser alcanzado con %acilidad y sin tropiezos.
/. Se debe trabajar a una distancia no mayor de (0 cm. de la llama de un mec+ero.
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1. El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo )%lamelo +asta que
alcance un rojo incandescente* y antes de retirar el inóculo debe %acilitarse suen%riamiento! a %in de evitar el deterioro del material a sembrar )en%ríelo en la
proximidad de la llama unos (2 segundos*.
0. "na vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llama del
mec+ero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo. 3unca debe depositarse untapón sobre la mesa o gradilla! pues estos elementos están cargados de
microorganismos.
4. -uando est destapado! mantener el tubo en la %orma más +orizontal posible paraevitar que los microorganismos del ambiente! en su caída! tengan acceso al interior.
5. &as bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde serán
trans%eridos! deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de queel ansa o aguja sea introducida. ambin se debe %lamear la boca del tubo antes de
taparlo. Este procedimiento %ija al vidrio los microorganismos que pueden estar en
dic+a boca y tiende a crear corrientes +acia a%uera )el aire tiende a salir*!
disminuyendo así el riesgo de contaminación.6. Para retirar el inóculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri! coloque la
placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio
de cultivo con los microorganismos. &lvela a la proximidad de la llama delmec+ero y tome el inóculo con el ansa de siembra. 7tro mtodo permitido consiste
en retirar el inóculo a sembrar! levantando la tapa solo lo su%iciente para permitir la
introducción del ansa o aguja! para evitar que los microorganismos ambientales sedepositen en la super%icie del medio.
8. Si la siembra se realiza con pipeta! sta debe estar convenientemente preparada y
esterilizada +asta el momento de su empleo. "na vez utilizada se descartaintroducindola en una solución antisptica.
(2. rans%iera el inóculo a otro medio de cultivo estril! tomando las mismas
precauciones en su manejo )%lameando bocas de tubos! trabajando en la proximidad
de la llama! etc.*.
&a %inalidad de una siembra puede ser la de realizar una trans%erencia o un aislamiento. &a
primera se e%ect9a con cultivos puros )una sola especie bacteriana*! ya sea con el objeto derenovar el medio de cultivo para perpetuar la especie! o bien para conocer alguna de sus
propiedades culturales o bioquímicas. El aislamiento! en cambio! se realiza a partir de un
material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas paraobtener cultivos puros.
TO#A DE( IN"!(O
• Si la muestra proviene de un medio líquido! el inóculo se toma agitando el
suavemente el ansa dentro del mismo! quedando la muestra ad+erida por tensión
super%icial en el extremo del %ilamento del ansa de siembra.
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• Si el medio es sólido y se encuentra en super%icie la muestra a sembrar )caja de
Petri*! tome una peque$a porción de cultivo mediante un ligero roce con el ansa de
siembra. Si la muestra se encuentra en la pro%undidad del agar )tubo con agar en pico de %lauta*! +unda el %ilamento dentro del medio +asta tomar una peque$a
porción de la misma. :lamee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el
soporte necesario.
TRANS)EREN!IA
&a tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo derecipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos'
a* Siembra de medio líquido a medio líquido' El procedimiento se puede realizar conansa en anillo! aguja o pipeta y en tubos de ensayo! matraces o %rascos.
b* Siembra de medio sólido a medio líquido' El procedimiento se puede realizar con
ansa en anillo o aguja y en tubo de ensayo! matraces o %rascos.
c* Siembra de medio sólido a medio sólido' El procedimiento se puede realizar con
ansa o aguja y en tubo de ensayo! ya sea en super%icie o en pro%undidad o en caja dePetri! en super%icie.
d* Siembra de medio líquido a medio sólido' El procedimiento se puede realizar conansa en anillo! aguja o pipeta y en tubo de ensayo! ya sea en super%icie o en
pro%undidad o en caja de Petri! ya sea en super%icie o por +omogenización.
T&cnica de trans+erencia en t%bos de ensayo,
T&cnica 'ara medio l-.%ido
&os dos tubos! el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los
microorganismos a trans%erir! se toman con una mano! con las bocas colocadas a la
misma altura.
Se sostienen con los dedos índice! medio y anular apoyándolos en el dedo me$ique! y se
los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualización de todala super%icie del cultivo.
-on el dedo pulgar e índice )como un lápiz* de la otra mano! se toma la pipeta estril oel mango de ;oll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza.
Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa! de la siguiente
manera' el tapón del tubo más alejado del operador )que es el que contiene la muestra*entre el dedo me$ique y la palma de la mano< el tapón del tubo más cercano al operador
)que contiene el medio de cultivo estril* entre el me$ique y el anular.
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Se %lamean las bocas de los tubos! se toma el inóculo< se siembra< se %lamean
nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de lostapones y se quema el ansa.
-omo el inóculo procede de un medio líquido! antes de realizar la trans%erencia se debe
agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio líquido! se agita el tubo sembrado para
distribuir +omogneamente el inóculo.
Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos
índice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la
otra mano con una amplitud de 0 cm. 7tra %orma consiste en +acer rotar los tubos entrelas palmas de las manos.
T&cnicas 'ara medio s$lido,
-uando el medio de cultivo a sembrar es sólido! se puede sembrar en super%icie! en pro%undidad o en pro%undidad y super%icie.
a* En super%icie'
• Por estr-a: =ntroducir el asa o aguja en el tubo de agar inclinado +asta el %ondo
diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte! luegomover el ansa suavemente sobre la super%icie del agar con un movimiento en zig>
zag ascendiendo desde el %ondo +asta la parte superior del medio.
• Por tra/o: =ntroducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar
una línea de siembra desde la base del pico de %lauta +asta el extremo superior! sinejercer presión para que no se rompa el medio.
b* En pro%undidad'
• Por '%nci$n: El medio de cultivo que se emplea está solidi%icado en tubo en %orma
vertical y la siembra se realiza con aguja! la que se introduce con el inóculorápidamente en el seno del medio y se retira de la misma %orma. &a punción se
realiza en el centro del medio o excntricamente.
c* En pro%undidad y super%icie'
• Por '%nci$n y estr-a: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con
muc+o %ondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado! se punza el %ondo!se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de %lauta.
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T&cnica de trans+erencia en ca0a de Petri,
&a siembra en caja de Petri! puede +acerse'
(. En super%icie.
• Por estr-a central: Se levanta la tapa lo su%iciente como para permitir la
introducción del ansa con la carga de microorganismos! iniciándose la estría en el
borde del medio más alejado del operador y se la extiende +asta llegar al centro de
la placa! luego se gira sta (62 ? y se contin9a realizando otra estría de la mismamanera. Esta división evita el obstáculo del borde de la placa
• Por estr-a en c%adrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en
estría cada uno de ellos! partiendo del borde de la caja +acia el centro. El cuadrante
a sembrar debe ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso puede ser el mismo )la misma especie* o distinto )di%erente especie* para cada cuadrante.
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• Por diseminaci$n con es'át%la de Dri1als2y: Se deposita sobre el medio sólido
contenido en la placa! una asada o una gota con pipeta del material a sembrar! que
luego se extenderá por toda la super%icie del medio con una espátula de@=BA&S;C. &a espátula se introduce inmediatamente despus de su uso en un
recipiente para su esterilización en autoclave o en %ormalde+ído al 0 D.
,. Por +omogeneización'
• T&cnica de la siembra en t%bo 'ara 3olcar en 'laca: El inóculo se introduce con
el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo %undido y en%riado a 10 ?- encantidad su%iciente para cubrir la placa de Petri. Se +omogeneiza por rotación y se
vuelca en la placa previo %lameado de la boca del tubo.
• T&cnica del a1ar 3olcado: Se deposita el inóculo con pipeta en el centro de la caja
de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo %undido y en%riado a
10?-. Se +omogeneiza por rotación para lo cual se le imprime a la caja movimientoscirculares! en sentido +orario y en sentido anti+orario y movimientos rectilíneos!+orizontales y verticales.
Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio de cultivo
para sembrar! debe eliminarse el agua de sinresis )condensación* antes de e%ectuar dic+a operación. Para tal %in es aconsejable preparar las placas con ,1 +s. de
anticipación y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.
EIPOS
•
-ampana de :lujo &aminar
#ATERIA(ES
• -ajas Petri con agar #c-oney
• -ajas Petri con agar nutritivo.
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NOTA: ANTES 7 DESPES DE TO#AR (A #ESTRA PROB(E#A ESNE!ESARIO ESTERI(I8AR POR #EDIO DE( #E!9ERO E( EIPOTI(I8ADO 7A SEA E( ASA DE SIE#BRA O (A A;JA DE SIE#BRA,
PRE;NTAS(. @escriba las %ormas de reproducción bacteriana.
,. FGu di%erencias existe entre una siembra por di%usión y por diseminaciónH/. F-uál es el objetivo de la siembra de microorganismosH 1. FGu mtodos utilizaría para cultivar y aislar microorganismos anaerobiosH
RES(TADOS 7 !ON!(SIONES,
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