8/16/2019 Análisis Molecular y Técnicas de Amplificación Molecular
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Análisis molecular y técnicas de amplificación molecular.
PCR (Reacción en cadena de la polimerasa): La reacción en cadena de la polimerasa
es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia
específica de DNA durante varios ciclos repetidos. Para ello, la reacción aprovecha la
actividad de la enzima DNA-polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmenteel DNA en las clulas. Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde
!ADN o ADNc", la enzima, los oli#onucleótidos o primers, los deso$irri%onucleótidos
trifosfatados !dN&Ps' adenina, timina, citosina ( #uanina", el ión ma#nesio !)# *", una
solución amorti#uadora o %uffer ( a#ua. &odos estos elementos interact+an en tres etapas
principales de las que se compone la P' desnaturalización, hi%ridación ( e$tensión. Los
equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están
diseados para esta%lecer un sistema homo#neo en donde las condiciones de
temperatura ( tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos.
Aplicaciones: se utiliza para para amplificar cantidades mu( pequeas de DNA, analizar
( amplificar DNA de mezclas celulares, para la identificación #entica como herramientaforense para la identificación de personas.
PCR Multiplex: requiere que los primers #uíen la amplificación de re#iones +nicas de
DNA en com%inación de muchos primers %a/o un simple set de condiciones de reacción.
Posteriormente de%e ha%er mtodos disponi%les para el análisis de cada producto de
amplificación de la mezcla de todos los productos.
Aplicaciones: se utiliza en micro%iolo#ía dia#nostica como prue%a simultanea para
diferentes a#entes en la misma reacción, por e/emplo para identificar el virus 0erpes
simple$ 1 ( 2 en un mismo ensa(o o el virus de la influenza tipo A ( 3.
PCR Asimétrico: #enera DNA de cadena sencilla de%ido a concentraciones desi#uales
de primers en la reacción. 4curren dos fases' producción de DNA de do%le cadena
se#uido por la producción de DNA de cadena sencilla.
Aplicaciones:
Nested PCR: se efect+a haciendo entre 15 ( 67 ciclos con un primer con/unto de primers
( despus otros 15 a 67 ciclos con un se#undo con/unto de primers respecto a una re#ión
interna del producto de ADN amplificado en primer lu#ar. Así pues, el fra#mento más lar#o
producido en la primera ronda de P se utiliza como ADN molde para la se#unda P.
Aplicaciones: se aplica en el dia#nóstico clínico de pató#enos que se encuentran enpequeas cantidades en san#re ( te/idos, principalmente virus.
PCR: es un tipo de P para medir la cantidad de secuencias específicas de DNA. 8e
utiliza un colorante que se une a la do%le cadena del DNA para cuantificar el pro#reso del
P en cada ciclo de síntesis.
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Aplicaciones: se utiliza en la detección de microor#anismos pató#enos en el dia#nóstico
clínico.
!ifferential !isplay PCR: se realiza una transcripción reversa de mNAs utilizando un
set de primers oli#o d& anclados9 despus se realiza la amplificación de las especies
cDNA de cada fracción de un set de primers ar%itrarios ( primers anclados9
posteriormente se realiza una separación por electroforesis de los fra#mentos resultantes9
entonces se reamplifican los diferentes fra#mentos que se están %uscando, clonándolos (
secuenciándolos9 por +ltimo se realiza una confirmación de e$presión diferencial
!Northern %lottin#".
Aplicaciones: e$tensivo análisis de e$presión de #enes entre #randes po%laciones de
clulas.
Amplified fra"ment len"t# polymorp#ism (A$%P PCR): pertenece a la cate#oría de
tcnicas de amplificación de fra#mentos de restricción selectivos el cual se %asa en la
li#ación de adaptadores a fra#mentos de restricción #enómica se#uido de una P
%asado en la amplificación con primers específicos a los adaptadores.
Aplicaciones: construcción de mapas de marcadores #enticos de mu( alta densidad
para su aplicación en la investi#ación del #enoma, análisis de la diversidad #entica en
distintas especies ve#etales, detección de al#unos polimorfismos.
Amplificación dependiente de #elicasa (&!A): se utiliza una DNA helicasa para
separar un DNA de do%le cadena !dsDNA" ( #enerar plantillas de cadena simple para la
hi%ridación del primer ( la su%secuente e$tensión. omo la DNA helicasa desenrolla
enzimáticamente dsDNA, el calor inicial de desnaturalización ( los su%secuentes pasos
del termociclador requeridos para el P pueden ser todos omitidos. 0DA proporciona un
simpe esquema de amplificación de DNA' una temperatura desde el inicio hasta el final dela reacción.
Aplicaciones: detección de la presencia de al#+n microor#anismo en una muestra.
&i'ridación in situ fluorescente ($&): se %asa en la hi%ridación de DNA nuclear con
una sonda de DNA marcada con un fluoróforo en la interfase celular o en la fi/ación de los
cromosomas en metafase en un portao%/etos.
Aplicaciones: aplicaciones dia#nosticas para la identificación de anomalías en los
cromosomas.
*lectroforesis en +el con +radiente de !esnaturali,ación-emperatura
(!++*-++*): D::; se %asa en la mi#ración de fra#mentos amplificados por P en
#eles de acrilamida. ;l am%iente desnaturalizante se crea por mantener una temperatura
uniforme entre 57 (
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parcialmente desnaturalizada, ( la mi#ración de la molcula prácticamente se detiene. Las
variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de
desnaturalización sean diferentes dentro del #radiente desnaturalizante, lo#rándose la
separación de los dominios de manera efectiva.
&::; e$plota los principios de D::;, sin utilizar los #eles de #radiente químico
desnaturalizante, hacindolo más simple ( rápido. ;l DNA amplificado se aplica a un #el
de poliacrilamida que contiene urea. Durante la electroforesis, la temperatura se
incrementa #radual ( uniformemente. ;l resultado es un #radiente de temperatura lineal
en el transcurso de la electroforesis. ;l am%iente desnaturalizante se forma por una
concentración constante de urea en el #el, com%inado con el #radiente de temperatura
temporal.
Aplicaciones: se pueden detectar mutaciones puntuales por la separación de los
fra#mentos de DNA que difieren en su secuencia de una %ase nitro#enada, análisis de la
estructura ( dinámica de comunidades micro%ianas comple/as.
mall su'unit ri'osomal RNA (/ rRNA): se utiliza la tcnica de P para amplificar
la pequea su%unidad ri%osomal del NA de los #enes de una %acteria. 8e utiliza un
primer del P marcado con un compuesto fluorescente para permitir la detección del
producto amplificado. ;l producto es diferido con enzimas de restricción ( se emplea un
una unidad de electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducido por laser
detectando +nicamente los fra#mentos con la marca fluorescente.
Aplicaciones:
Analisis de restricción de A!N ri'osomal amplificado (AR!RA): ;sta tcnica se %asa
en la di#estión del #en ri%osomal 1
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