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Biología Molecular
BIOSÍNTESIS DE RNA
Dra. Elena G. Orellano
2019
Contacto: [email protected] de consulta: Martes 16.30 hs
Clases de biosíntesis de RNA
1‐Mecanismo de la transcripción. RNA polimerasas I, II y III.
Inicio de la transcripción. Elongación y terminación. Capping
y poliadenilación.
2‐ Procesamientos post‐transcripcionales‐ Splicing. Tipos de
intrones.
3‐ Técnicas empleadas en el estudio de la transcripción.
4‐ Regulación de la expresión génica.
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Mecanismos de transcripción en eucariotas
• RNA Polimerasas.
• RNA polimerasa II
Iniciación: Elementos cis y trans. Factores
generales de la transcripción.
Elongación y terminación.
TEMAS A DESARROLLAR
Dogma central de la Biología Molecular
“La información fluye del DNA a las proteínas”
Replicación
Transcripción Traducción
Retro‐transcripción
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Transcripción en células eucariotas
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004
Secuencia de DNA necesaria para codificar un producto génico: RNA maduro funcional o proteína.
Región del genoma que contiene la información necesaria para sintetizar una molécula de polipéptido, miRNA (RNA pequeños no codificantes, microRNA) o
tRNA, rRNA ribosomal.
Existen 2 regiones con funciones diferentes en un gen
Región estructuralRegión regulatoria
Concepto de gen
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Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Regiones promotora, codificante y terminadora de un gen típico
‐‐‐(‐) nt upstream (corriente arriba)‐‐‐+1‐‐‐‐(+) nt downstream (corriente abajo)
Hebra molde
Hebra no-molde Hebra sentido
Hebra antisentido
-200bp +200bp
TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS
n1ATP + n2GTP + n3CTP + n4UTP RNA + (n1+n2+n3+n4) PPi
PPi 2(n1,2,3,4) PiPPasa
DNA molde
RNA polimerasa
• Es el primer paso de la expresión génica.
• Síntesis de RNA dirigida por DNA (molde).
• El RNA es complementario a la hebra del DNA molde.
• RNA polimerasa: enzima que cataliza el proceso de transcripción.
• La polimerización no requiere cebador ni energía.
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Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.
Fig. 5.2 Chemical reaction involved in the RNA polymerase-catalyzed synthesis of RNA on a DNA template strandTranscripción: síntesis de RNA
polimerasa
Cadena de RNA Cadena de DNA molde
RNA
Dirección de síntesis5´a 3’
TIPOS DE RNAs
miRNA(micro)
DNA
TRANSCRIPCIÓN
snRNA(pequeño no codificante)
rRNA(ribosomal) mRNA
(mensajero)
tRNA(de transferencia)
LncRNA(largo no
codificante)
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RNA polimerasas
RNA pol I RNA pol II RNA pol III
Nucléolo: genes 5.8S, 18S y 28S rRNA
Nucleoplasma: genes que codifican proteínas, siRNAs, snRNAs, microRNAs
Nucleoplasma: genes tRNAs, 5S rRNA, snRNAsU6, 7S RNAs, otros RNA pequeños
rRNA precursores mRNA precursores
mi‐RNA
5S rRNA, tRNA, snRNAs
EUCARIOTAS: 3 TIPOS
RNA pol IV y V en plantas siRNAs
Subunidades de las RNA polimerasas
*
* Cola CTD (Carboxy terminal domain)
J.D. Watson, et al. Molecular Biology of the Gene (5th. Edition), 2004.
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’
RPB3
RPB11
RPB2
RPB1
RPB6
RNA Pol. PROCARIOTARNA Pol.
PROCARIOTA
RNA pol. II EUCARIOTARNA pol. II EUCARIOTA
SITIO ACTIVO
J.D. Watson, et al. Molecular Biology of the Gene (5th. Edition), 2004.
RNA polimerasa II: Síntesis de mRNA
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Gen eucariota: estructura
Promoter/Enhancer 5’ UTR
Cis-Regulatory Elements
Start Codon ATG
Exon1 Exon2 Exon3
Stop CodonTAA, TAG, TGA
3’ UTR
Exon1 Exon2 Exon3
AAAAAAAAExon1 Exon2 Exon3
5’ UTR 3’ UTR
Start Codon Stop Codon
polyA tail
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Región promotora de genes transcriptos por la RNA polimerasa II: elementos cis
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th‐ 7th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004, 2012
Gen de mamífero con TATA box
Gen de mamífero con isla CpG
Gen de levaduras
Caja TATA genes nucleares con alta tasa de transcripciónIslas CpG (60‐70%) de los genes de mamíferos 100‐1000pb‐ transcripción bidireccional
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Iniciación de la transcripción focalizada y dispersa
Focused versus dispersed transcription initiation.In focused transcription, there is either a single major transcription start site or several start siteswithin a narrow region of several nucleotides. Focused transcription is the predominant mode oftranscription in simpler organisms.In dispersed transcription, there are several weak transcription start sites over a broad region ofabout 50 to 100 nucleotides. Dispersed transcription is the most common mode of transcription invertebrates. For instance, dispersed transcription is observed in about two thirds of human genes. Invertebrates, focused transcription tends to be associated with regulated promoters, whereasdispersed transcription is typically observed in constitutive promoters in CpG islands.
Modos focalizados y dispersos de iniciación de la transcripción.En la transcripción focalizada, existe un único sitio de inicio de la transcripciónpredominante o un grupo de sitios de inicio en una pequeña región de variosnucleótidos.En la transcripción dispersa, hay múltiples sitios de inicio débil que se distribuyen en unaregión más grande de aproximadamente 50‐100 nucleótidos.Los promotores concentrados generalmente se asocian con genes regulados, mientrasque los promotores dispersos se encuentran típicamente en genes de mantenimiento,que mantienen niveles constantes de transcripción.
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Mecanismos hipotéticos para la transcripción de promotores focalizados y dispersos.(a) En el modelo para promotores focalizados, el complejo de preiniciación de transcripción(PIC) se ensambla en una única ubicación en el promotor central, y la selección del sitio deinicio se determina por la preferencia de la RNA polimerasa II para iniciar la transcripción ennucleótidos cercanos. En algunos casos, puede haber un nucleótido fuertemente favorecido yse observa un solo sitio de inicio predominante. En otros casos, la transcripción puede iniciarseen múltiples nucleótidos que no son necesariamente adyacentes entre sí.(b) En el modelo de transcripción dispersa, existen múltiples promotores débiles que se creanmediante la combinación de un sitio de unión de un factor de unión a DNA específico desecuencia, como Sp1 o NF‐Y, y un iniciador (Inr) ‐ como secuencia. Por lo tanto, una únicaunidad promotora sería un sitio de unión de factor específico de secuencia y una secuencia detipo Inr. Estas unidades promotoras se pueden organizar tanto en tándem como intercaladas.
Promotor central y Elementos proximales
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004
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Promotor central Promotor central Caja TATA
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004
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Elementos Regulatorios que actúan en trans
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004
Proteínas que actúan en transFactores de transcripción
• Factores Basales se unen al
promotor. Proteínas:
– TBP (TATA binding protein)
– TAF (Factores asociados a la
transcripción)
• RNA polimerasa II interacciona
con los factores basales
H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004
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Factores generales de la transcripción (GTFs)Factores generales de la transcripción (GTFs)
J.D. Watson, et al. Molecular Biology of the Gene (5th. Edition), 2004.
Proteínas Activadoras
• Se fijan a las regiones amplificadoras o “enhancer” del
DNA de manera específica
• Interaccionan con otras proteínas y/o con el DNA para
activar e incrementar la transcripción (~100‐veces los
niveles basales)
• Dos dominios estructurales que median estas funciones:
– Dominio de unión a DNA
– Dominio de unión a proteínas
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Activadores
Transcripcionales
Se unen a enhancers
específicos en tiempos
determinados para
incrementar los niveles
transcripcionales
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Canales de la RNA polimerasa II
Sitio de corrección‐edición del RNA
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Funciones de la RNA polimerasa IIFunciones de la RNA polimerasa II
Desenrolla el DNA por delante
Renaturaliza el DNA por detrás
Polimeriza/sintetiza el RNA
Disocia la cadena de RNA del DNA
Revisa y corrige el RNA
Desenrolla el DNA por delante
Renaturaliza el DNA por detrás
Polimeriza/sintetiza el RNA
Disocia la cadena de RNA del DNA
Revisa y corrige el RNA
Funciones de la RNA polimerasa IIFunciones de la RNA polimerasa II
RNA polimerasa realiza dos funciones de corrección de pruebas
Edición pirofosforolítica. La enzima utiliza su sitio activo, en un back‐reacción simple, para catalizar la eliminación de un ribonucleótido incorrectamente insertado, mediante la incorporación de PPi. La enzima puede entonces incorporar otro ribonucleótido en su lugar en la cadena de RNA en crecimiento (puede eliminar bases correctas o incorrectas).
En el segundo mecanismo de corrección de pruebas, llamado de edición hidrolítica, la polimerasa retrocede por uno o más nucleótidos y escinde el producto de RNA, la eliminación de la secuencia que contiene errores.
RNA polimerasa realiza dos funciones de corrección de pruebas
Edición pirofosforolítica. La enzima utiliza su sitio activo, en un back‐reacción simple, para catalizar la eliminación de un ribonucleótido incorrectamente insertado, mediante la incorporación de PPi. La enzima puede entonces incorporar otro ribonucleótido en su lugar en la cadena de RNA en crecimiento (puede eliminar bases correctas o incorrectas).
En el segundo mecanismo de corrección de pruebas, llamado de edición hidrolítica, la polimerasa retrocede por uno o más nucleótidos y escinde el producto de RNA, la eliminación de la secuencia que contiene errores.
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CTD: 52 repeticiones de Tyr‐Ser‐Pro‐Thr‐Ser‐Pro‐Ser
Core de la RNA polimerasa y cola CTD
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Subunidad RPB1
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Etapas de la transcripción
• El proceso de transcripción consta de tres etapas:
• Iniciación
• Elongación
• Terminación
• El RNA es transcripto desde un DNA molde después que las
bases del DNA son expuestas por desenrollado de la doble
hélice.
• En una dada región del DNA, solamente una de las dos hebras
puede actuar como molde para la transcripción del RNA.