CULTIUS CEL·LULARS Apunts 3r Biotecnologia
2020 UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
Consell d’Estudiants de Biociències
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 1
Índex Capítol I – Introducció ........................................................................................................... 3
Tema 1 – Breu Història dels cultius cel·lulars .................................................................... 3
Com hem estudiat l’ésser humà. .................................................................................... 3
Models d’Estudi de la fisiologia ...................................................................................... 4
Aplicacions dels estudis amb cultius cel·lulars. .............................................................. 5
Capítol II – Organització d’un Laboratori de Cultius Cel·lulars ............................................... 6
Tema 2 – Distribució d’instal·lacions i equipament ............................................................ 6
Consideracions clau pel plantejament i el disseny d’un laboratori. ................................. 6
Estructura de la Sala de Cultius. .................................................................................... 6
Estructura de les Sales associades a la sala de cultius. ................................................. 8
Tema 3 - Nivells de contenció biològica i Bioseguretat. .................................................... 8
Agents Biològics. ........................................................................................................... 9
Nivells de contenció biològica. ....................................................................................... 9
Comitès de Bioseguretat. ............................................................................................. 11
Gestió de Residus. ....................................................................................................... 12
Capítol III – Principis bàsics dels Cultius Cel·lulars animals. ............................................... 13
Tema 4 – Cultius Cel·lulars: Condicions físico-químiques i biològiques. .......................... 13
Condicions físico-químiques dels cultius cel·lulars ....................................................... 13
Condicions Biològiques ................................................................................................ 15
Tema 5 - Cultius cel·lulars: producció i manteniment. ...................................................... 18
Autoritzacions. ............................................................................................................. 18
Treballar en una Cabina de Seguretat Biològica. ......................................................... 18
Tipus de cultius de cèl·lules ......................................................................................... 18
Establiment d’un cultiu primari ..................................................................................... 18
Subcultiu de cèl·lules adherents .................................................................................. 19
Selecció o separació de cèl·lules ................................................................................. 19
Cellular Lifespan .......................................................................................................... 20
Tema 6 - Cultius cel·lulars: quantificació de cèl·lules ....................................................... 21
Recompte de cèl·lules.................................................................................................. 21
Quantificació cèl·lules vives/mortes en cultiu ............................................................... 22
Mort cel·lular regulada ................................................................................................. 23
Tema 7 - Cultius cel·lulars: criopreservació de cèl·lules ................................................. 24
Avantatges la criopreservació ...................................................................................... 24
Principis de la congelació ............................................................................................. 25
Protocols de congelació i descongelació. ..................................................................... 25
Estocs de cèl·lules. ...................................................................................................... 26
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 2
Tema 8 – Cultius cel·lulars: contaminacions. ................................................................... 27
Fonts de contaminació. ................................................................................................ 27
Contaminació biològica visible. .................................................................................... 27
Contaminació biològica no visible. ............................................................................... 27
Contaminacions creuades. ........................................................................................... 29
Tema 9 - Cultius cel·lulars: caracterització i autentificació. ............................................. 29
Mètodes de caracterització. ......................................................................................... 29
Caracterització morfològica. ......................................................................................... 29
Caracterització immunològica. ..................................................................................... 30
Caracterització citogenètica. ........................................................................................ 30
Polimorfismes de DNA. ................................................................................................ 31
Cas exemple. ............................................................................................................... 31
Tema 10 - Tècniques especials: sincronització cel·lular. ................................................. 32
El cicle cel·lular. ........................................................................................................... 32
Mètodes físics de separació de cèl·lules. ..................................................................... 33
Mètodes químics de separació de cèl·lules. ................................................................. 34
Capítol IV - Biotecnologia en cèl·lules animals i teixits. ....................................................... 35
Tema 11 - Línies cel·lulars en recerca i producció biotecnològica. ................................. 35
Expression host Systems. ............................................................................................ 35
Cèl·lules de mamífer. ................................................................................................... 35
Cases comercials. ........................................................................................................ 36
Tema 12 - Escalat de cultius cel·lulars ............................................................................ 36
Biotecnologia vermella. ................................................................................................ 36
Consideracions per l’escalat. ....................................................................................... 37
Sistemes d’immobilització de cèl·lules. ........................................................................ 37
Producció de productes cel·lulars. ............................................................................... 37
Producció de cèl·lules. ................................................................................................. 38
Substitució de proves en organismes. .......................................................................... 39
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 3
Capítol I – Introducció
Tema 1 – Breu Història dels cultius cel·lulars
Com hem estudiat l’ésser humà.
L’ésser humà ha estat, des de fa molts i molts anys, interessat en el seu propi cos. N’ha estat
interessat tant a nivell de malalties que el poden afectar com a nivell del seu
desenvolupament. Per tant, l’ésser humà ha hagut de buscar diverses maneres d’investigar-
se a si mateix sol i en interacció amb altres espècies.
Però investigar els complexos mecanismes que regulen la malaltia i el desenvolupament
humans no és senzill. La nostre incapacitat d’observar i pertorbar, directament, els processos
biològics d’interès ens dificulta aquesta tasca. En conseqüència, la recerca s’ha de basar en
l’ús de models d’estudi i en sistemes in vitro.
El problema de cadascun d’aquests és la seva baixa rellevància fisiològica respecte l’ésser
humà, ja que n’és ben diferent. En el que superen a aquest és en la tractabilitat
experimental, és a dir, la facilitat amb la que es poden fer servir en els experiments.
La història dels cultius cel·lulars ha tingut les següents fites al llarg del temps:
1885
•S'aconsegueix mantenir cèl·lules vives en una solució salina i fora del cos de l'animal del ques'han extret.
1913
•Les cèl·lules poden crèixer per llargs períodes en cultius alimentats regularment sotacondicions asèptiques.
1948
•Cèl·lules solitàries de la línia cel·lular L mostren que poden fer clons de cèl·lules en cultius deteixits.
1952
•S'estableix una línia continua de cèl·lules humanes derivades d'un carcinoma cervical a les quemés tard s'anomenaran HeLa Cells.
Finals dels 1980s i principis dels 1990s
•Quasi totes les cèl·lules del medi estan envoltades per altres cèl·lules i per la matriuextracel·lular.
•Els cultius de cèl·lules en tres dimensions prenen en consideració tots els aspectes ambientalsde les mateixes.
2008 - 2009
•Orgànuls intestinals es poden derivar de cèl·lules mare adultes.
•Les cèl·lules mare pluripotents podrien refer in vitro el desenvolupament de teixits corticals.
2010
•Es crea el terme Organ-on-a-chip.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 4
Models d’Estudi de la fisiologia
Cultius 2D
Els cultius en dues dimensions (cultius 2D) són el mètode d’estudi de l’ésser humà amb
menor rellevància fisiològica però amb major tractabilitat experimental. Consisteixen en un
conjunt de cèl·lules vives adherides a una superfície plana. Aquesta pot ser de plàstic o
d’algun element metàl·lic.
Cultius 3D
A la vida real, la cèl·lules d’un ésser humà no es troben soles i aïllades, sinó que tenen un
conjunt d’elements al voltant. A part de la resta de cèl·lules iguals que ella que formen un
òrgan o una estructura, les cèl·lules tenen una matriu i secreten un conjunt de factors de
creixement que els són essencials. Per tal de poder analitzar algunes d’aquestes estructures
que formen les cèl·lules d’un teixit o conjunt de teixits, es fa un cultiu de les mateixes en
immersió en una matriu proteica.
Si en aquest cultiu tan sols hi creixen densament cèl·lules d’una línia cel·lular i d’un sol tipus
cel·lular, se’ls sol permetre formar agregats 3D en la suspensió. En aquest cas s’anomena
cultiu histotòpic o monotípic.
En el cas que al cultiu hi hagués cèl·lules de diferents llinatges recombinades o mesclades,
se’n determinaria la ràtio i les relacions espacials per recrear un component de l’òrgan
d’estudi.
Organoides i Òrgan-on-a-chip.
Un organoide és una versió miniaturitzada i simplificada d'un òrgan produït in vitro en tres
dimensions que mostra una microanatomia realista. Es deriven d'una o poques cèl·lules d'un
teixit, cèl·lules mare embrionàries o cèl·lules mare pluripotents induïdes, que poden
autoorganitzar-se en un cultiu tridimensional a causa de les seves capacitats d'autorenovació
i diferenciació1.
El terme òrgan-on-a-chip, inventat per Donald Ingber, es basa en el nostre coneixement dels
òrgans humans per dissenyar-ne fragments en els quals les cèl·lules formants i el seu
microambient estan extremadament controlats. Aquesta tècnica no només incorpora múltiples
tipus de cèl·lules, sinó que també involucra aspectes d’enginyeria com el control de l’espai
final i la incorporació de sensors i canals microfluídics.
Avantatges i Desavantatges de l’ús de cèl·lules.
Els cultius en una matriu proteica tenen una sèrie d’avantatges respecte els altres tipus
d’investigacions. Per començar, els cultius en una matriu proteica fan servir una quantitat
relativament petita de cèl·lules, el que permet reduir el nombre d’animals amb els que es
treballa. Per un altre banda, cultivar algunes cèl·lules atorga un major control sobre
variables molt difícils de gestionar en obert, com les dosis que es subministren, en qui temps,
a quina concentració... i això sense ni tan sols mencionar el control de les condicions
fisiològiques! Finalment, donat que les cèl·lules inicials d’un cultiu de cèl·lules en una matriu
proteica són poques i que es coneixen en profunditat molts dels passos que s’hauran de
seguir durant el procés, és possible mecanitzar i obtenir gran quantitat de cèl·lules al final
del cultiu.
No per tenir unes tres avantatges, els cultius en matrius no tenen limitacions. En són
principalment dos: el requeriment d’experiència prèvia en el treball i la possibilitat d’haver-
1 Extret de la Viquipèdia.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 5
hi inestabilitat plasmídica, ja sigui genotípica o fenotípica arran de la divisió i la reproducció
cel·lulars.
Aplicacions dels estudis amb cultius cel·lulars.
Els cultius cel·lulars tenen moltes aplicacions, des de l’estudi de l’activitat intracel·lular fins a
la producció de teixits tot passant per la proteòmica i la genòmica. En l’àmbit concret de la
biotecnologia en destaquen les aplicacions d’enginyeria de teixits i l’obtenció de productes
cel·lulars, d’entre els quals trobem molts medicaments.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 6
Capítol II – Organització d’un Laboratori de Cultius Cel·lulars
Tema 2 – Distribució d’instal·lacions i equipament
Consideracions clau pel plantejament i el disseny d’un laboratori.
En el mateix moment què tenim clar que volem realitzar una investigació sobre la vida
(humana o bacteriana) cal que assumim que hi haurà un punt on caldrà treballar amb cèl·lules.
Això no es pot fer en un laboratori qualsevol ni de qualsevol manera. Per tant, en
dissenyar el nostre laboratori cal que ens plantegem quina estructura tindrà i quin nivell de
contenció biològica necessitarà.
L’estructura d’un laboratori ve definida per 3 factors: quantitat d’usuaris que el faran servir,
l’espai disponible que hi ha i les àrees de treball que caldrà fer servir. Segons aquests
criteris es prendran les decisions de la mida de la sala (gran o petita) i de si aquesta serà
única o en tindrà d’adjacents.
En el cas de contenció biològica, però, la intenció no és tant la comoditat i eficiència amb
què es treballa. Enlloc d’això, té a veure amb les mesures i controls que ha de tenir el
laboratori en qüestió. Principalment, des de l’aspecte de la contenció biològica, el més
important és saber el tipus de treball que es farà al laboratori, el nivell de bioseguretat que
aquest tipus de treball implica per la meva investigació i els mecanismes que cal seguir per
evitar la contaminació i mantenir així l’esterilitat.
Estructura de la Sala de Cultius.
En el disseny de l’estructura de la sala o sales de laboratori cal tenir molt clar que sempre que
es treballa amb cèl·lules es necessita, si ó sí, de cert equipament i seguretat bàsics.
Equipament inventariable bàsic.
L’element més important en el treball amb cèl·lules és el que s’anomena campana de cultiu
cel·lular. Aquesta estructura de vidre i filtres serveix per generar un espai aïllat de la resta
de laboratori. Una de les més utilitzades quan els riscos són baixos són les campanes de
flux laminar.
Una campana de flux laminar, el qual pot ser horitzontal o vertical, genera un espai on treballar
amb un producte o espècie on estarà protegida de la contaminació per partícules com els
microorganismes. Això s’aconsegueix gràcies al flux laminar d’aire net que ha sortit del filtre
HEPA, el qual es bufa a través de l’espai de treball en direcció a l’usuari i al laboratori.
Arran d’aquest flux cap a l’usuari, una campana de flux laminar normal i corrent no atorga
cap protecció a l’investigador enfront de materials infecciosos o químicament perillosos. El
que si que atorga aquest nivell de protecció son les cabines de seguretat.
Existeixen 3 tipus de cabines de seguretat biològiques, cadascuna més protectora de l’altre.
Les classificacions es fan en ordre ascendent de seguretat, obtenint les Classes I, II i III.
Consideracions clau pel plantejament i disseny d'un laboratori
EstructuraQuantitat d'usuaris
Espai disponible
Àrees de Treball
Contenció biològica
Tipus de treball
Bioseguretat
Mecanismes d'esterilitat
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 7
Les cabines de seguretat Biològica de classe I protegeixen l’usuari i el medi ambient però
no el producte. En aquestes cabines, l’aire és aspirat cap a la cabina i expulsat lluny de
l’investigador, normalment per la part superior.
Les cabines de Seguretat Biològica de classe II es separen en 4 subtipus (A1, A2, B1 i B2)
però totes elles protegeixen el producte o espècie, l’usuari i el medi ambient de
contaminar-se. Les cabines de Bioseguretat de tipus B atorguen protecció a l’usuari al
treballar amb vapors i gasos on es necessiten condicions asèptiques. En aquests casos el
flux d’aire és eliminat en un 70 o un 100% de la cabina. Aquestes cabines han d’estar
connectades al sistema d’expulsió de l’aire de l’edifici.
Les cabines de seguretat biològica de classe III són aquelles on es fan servir caixes vidriades
amb guants incorporats i garanteixen la màxima protecció per treballar en laboratoris de
contingència de bioseguretat de nivell 4. Aquest tipus de cabines són essencials per
treballar amb agents amb un nivell 4 de bioseguretat o altres materials perillosos com aerosols
de patògens o toxines. Aquestes caixes de guants segellades hermèticament amb un accés
a través d’un segon tanc o càmera de doble porta adjacent permeten aplicar una
descontaminació si fos necessari. Normalment, les cabines de seguretat biològica de classe
III tenen dos filtres HEPA en el sistema d’expulsió d’aire per afegir una protecció ambiental
superior.
Malgrat les campanes de cultiu cel·lular són l’element més important en el treball amb cultius
cel·lulars, no es poden obviar altres equipaments igualment essencials com un incubador
(preferiblement humit i de CO2), un microscopi de contrast de fase invertit, un comptador
de cèl·lules, un contenidor de nitrogen líquid, un bany d’aigua, una centrífuga, un
congelador o nevera i un contenidor d’emmagatzematge.
Seguretat Bàsica.
En el disseny de l’estructura de la sala o sales de laboratori cal tenir molt clar que sempre que
es treballa amb cèl·lules es necessita, si ó sí, de cert equipament i seguretat bàsics.
En referència a la seguretat, a tots els laboratoris hi ha d’haver uns contenidors de residus,
els quals es separen en diferents categories i en destaca els de residus bioperillosos, els
equipaments de protecció individual (o EPIs) i les alarmes. Els equipaments de protecció
individual difereixen una mica dels contenidors de residus i de les alarmes, ja que no són
material de seguretat per tot el laboratori sinó que són elements de seguretat que només
protegeixen a l’individu que els porta. Són EPIs les bates de laboratori, els guants, les
mascaretes, les ulleres...
En un laboratori hi ha d’haver, sempre, dos tipus d’alarmes. L’alarma d’oxigen és essencial
perquè l’absència o baixos nivells d’aquest gas poden produir pèrdua de consciència, danys
cerebrals greus i fins i tot la mort per asfíxia. Una alarma que indiqui que les seves
concentracions són baixes pot evitar que es produeixin aquests efectes prenent mesures
ràpides.
L’altre alarma important és la de diòxid de Carboni, conegut com “assassí silenciós” per la
seva manca d’olor característica (al contrari que al butà, per exemple). La seva inhalació en
altes concentracions és, òbviament, mortal i ningú és capaç d’adonar-se’n fins que ja és
massa tard.
Altre equipament inventariable.
En un laboratori les campanes, les centrífugues i les alarmes són elements essencials que
sempre hi ha d’haver, però existeixen una sèrie d’equipaments que, de ser-hi, agilitzen la
feina del laboratori i la fan molt més eficient que no pas si no hi fossin. Són d’aquest tipus
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 8
d’equipaments els sistemes d’aspiració, els vòrtex, els microscopis invertits de
fluorescència i les pipetes automàtiques i pipetejadors.
Estructura de les Sales associades a la sala de cultius.
Investigar no consisteix només en realitzar els experiments que creguem convenients, sinó
que té associats molts altres processos. Aquests, arran de les seves característiques, no es
poden dur a terme a la sala de cultius, que és l’espai del laboratori on es realitzen totes
les pràctiques relacionades amb la nostra investigació. Depenent de les seves
característiques, els processos associats s’hauran de dur a terme en sales també associades
a la principal. Aquestes sales, a més, han d’estar estructurades per no dificultar la recerca.
Les tres activitats principals que cal tenir en compte són: la neteja, l’esterilització i la
preparació de solucions. Aquestes tres es poden realitzar en la mateixa sala, a la qual es
sol anomenar “sala de preparació”. Quan es planifica l’existència d’aquesta sala també es
solen dissenyar les sales de quarantena i de microscòpia. La primera no té contacte directe
amb la sala d’experimentació principal i serveix per recollir les mostres i línies cel·lulars
comprades i mantenir-les a una temperatura còmode per comprovar si són pures o si estan
contaminades amb altres línies cel·lulars. La sala de microscòpia sí que sol estar connectada
amb la sala principal i és, tal i com el seu nom indica, on es fan les mesures amb els
microscopis.
Quan l’espai és més gran i es disposa de moltes més sales, es mira d’aïllar amb un passadís
les sales de neteja, esterilització, preparació de solucions i emmagatzematge perquè sigui
més difícil el contacte amb la sala d’experimentació i evitar així contaminacions. Les dues
sales adjacents anteriors continuen dissenyant-se adjacents per agilitzar el funcionament del
laboratori.
Equipament bàsic de les sales associades a la sala de treball
En els processos de neteja, esterilització i preparació de solucions és adient disposar d’una
sèrie d’equipaments per tal que siguin mínimament funcionals. Per tal de netejar són
clarament indispensables piques i aixetes que permetin eliminar el màxim de restes
possibles dels recursos que s’han fet servir. Per tal d’esterilitzar cal un mètode d’esterilització
per calor sec (que permeti fer pasteuritzacions) i un de calor humit (un autoclau). Aquests
mètodes, combinats amb alguns indicadors físics o biològics d’esterilització i amb la llum
ultraviolada, permeten aconseguir un material reutilitzable al laboratori. En la preparació de
solucions no es pot permetre la presència de substàncies no desitjades, per això és necessari
tenir un mecanisme de purificació d’aigua i, a més, una filtració de la mateixa.
Tema 3 - Nivells de contenció biològica i Bioseguretat. La bioseguretat, en el sentit més ampli, es pot definir com el conjunt de mesures dirigides
a prevenir i protegir les saluts humana, animal, vegetal i del medi ambient davant de
tots aquells agents, factors i riscos d’origen biològic. Les mesures es poden prendre en
el camp de l’organització, pràctiques de treball, disseny d’instal·lacions, equips de seguretat,
etc.
Per poder valorar si allò amb el què s’està treballant necessita d’algun tipus concret de
contenció biològica o alguna mesura de precaució addicional es consulten els comitès de
bioseguretat com el de la UAB. Els comitès de bioseguretat avaluen l’agent biològic amb
què es treballa i l’activitat que amb ell es realitza, el que dictaminarà el grau de bioseguretat
que cal aplicar. Si el laboratori compleix amb aquesta bioseguretat, el comitè generarà un
certificat per tal que el laboratori pugui realitzar el seu experiment. De vegades, però, cal
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 9
també un certificat del comitè de bioètica per poder realitzar l’experiment. La UAB disposa
d’un Comitè de Bioseguretat i un de Bioètica.
Agents Biològics.
Un agent biològic és un element viu que es fa servir en un laboratori. Per tal d’analitzar el
risc que suposa treballar amb algun d’ells, es classifiquen en 4 grups de risc segons el seu
risc infecciós, el seu risc de propagació a la col·lectivitat i l’existència de profilaxi o
tractaments eficaços.
Aparts d’aquests tres criteris (Capacitat de causar una malaltia, capacitat d’infectar i
disponibilitat de mesures terapèutiques) es solen prendre en consideració altres factors de
risc. Es té en compte el mode de transmissió, la dosi infectiva, l’estabilitat, el rang
d’hostes i vectors, la naturalesa endèmica, l’efecte sobre altres espècies i l’efecte sobre
l’economia i el medi ambient.
Dins del grup de risc 2 és on trobem els teixits, sang i fluids d’origen humà o d’altres
primats. També formen part del grup de risc 2 les línies cel·lulars establertes, els cultius
primaris d’origen humà i qualsevol tipus de mostra en què existeixi la incertesa sobre la
presència d’agents patògens humans.
Per obtenir més informació respecte els agents biològics es pot consultar la pàgina web
(www.insst.es/databio-fitchas-de-agentes-biologicos)
Nivells de contenció biològica.
Hi ha 4 Nivells de Contenció Biològica reconeguts universalment. Els BSL (BioSafety Levels)
estan ordenats de menor a major contenció. Aquests nivells, malgrat ser la mateixa quantitat
i ordre, NO són grups de risc (tot i que es correlacionen amb ells). Els Nivells de Contenció
venen determinats per una combinació específica de:
Agent Biològic del Grup de Risc 1
•Poc probable que causin malalties.
•No existeix un risc que es propagui a la col·lectivitat.
•El seu tractament, en cas d'infecció, és innecessari.
Agent Biològic del Grup de Risc 2
•Pot causar una malaltia i constituir un perill pels treballadors.
•Té poca probabilitat de propagar-se a la col·lectivitat
•En cas d'infecció, existeix un tractament eficaç de manera general
Agent Biològic del Grup de Risc 3
•Pot provocar una malaltia greu i constitueix un perill pels i les treballadores.
•És probable que aquest agent es propagui a la col·lectivitat.
•En cas d'infecció, existeix un tractament eficaç de manera general.
Agent Biològic del Grup de Risc 4
•Provoca una malaltia greu i constitueix un seriós perill pels i les treballadores.
•Hi ha una elevada probabilitat que es propagui a la col·lectivitat.
•No se'n coneix un tractament eficaç.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 10
BioSafety Level 1.
El BSL-1 és el nivell bàsic de protecció comú a la majoria de laboratoris de recerca i
laboratoris clínics i és adequat per a agents dels que no es té constància que causin
malalties en humans normals i sans.
En aquest tipus de laboratoris el treball es pot realitzar en una poyata de laboratori o en una
taula, la instal·lació ha de disposar d’un lavabo per al rentat de mans i ha de tenir portes per
separar l’espai de treball amb la resta de la instal·lació.
Les pràctiques que es segueixen són les estàndards i calen equips de protecció individual
que es porten segons calgui. Entre aquests equips es troben la bata de laboratori, guants i
protecció pels ulls.
Biosafety Level 2.
El BSL-2 és adequat per agents de risc moderat que se sap que causen malalties humanes
de diversa gravetat per ingestió o mitjançant exposicions percutànies o a la mucosa. La
majoria de laboratoris de cultiu cel·lular han de ser com a mínim BSL-2 però els requisits
exactes depenen de la línia cel·lular utilitzada i de tipus de treball realitzat.
En aquests laboratoris es tenen totes les mesures de BSL-1 i, a més, hi ha d’haver un accés
controlat, un autoclau i una cabina de bioseguretat. Les cabines de seguretat són per fer-
hi tots els procediments que puguin generar aerosols o esquitxades. L’autoclau dels
laboratoris de BSL-2 és substituïble per un mètode alternatiu de descontaminació per a la
seva correcta eliminació. Els equips de protecció d’un BSL-2 són iguals que els d’un BSL-1
i un EPI adequat, incloent-hi bata i guants de laboratori. També es pot portar protecció per als
ulls i per a cara, segons sigui necessari.
Biosafety Level 3.
El BSL-3 està dissenyat i preparat per al treball amb microorganismes del grup de risc 3 i amb
grans volums o altes concentracions de microorganismes del grup de risc 2 que suposin un
augment de la possibilitat de propagació dels aerosols. La contenció del nivell 3 de
bioseguretat requereix l'enfortiment dels programes de seguretat operatius i superiors als dels
laboratoris bàsics. Són laboratoris adequats per a agents indígenes o exòtics amb un
potencial conegut de transmissió d’aerosol i per a agents que poden causar infeccions greus
i potencialment letals com el causant de la tuberculosi o la SIDA.
Biosafety Level 4.
El laboratori de contenció màxim, BSL-4, està dissenyat per a treballs amb microorganismes
del grup de risc 4. Abans que es construeixi i es posi en funcionament un laboratori d’aquestes
característiques, s'haurien de realitzar consultes intensives amb institucions que tinguin
experiència en operar una instal·lació similar. Els laboratoris operatius BSL-4 haurien d'estar
sota el control de les autoritats sanitàries nacionals o d'altres autoritats. Les entitats
Equips de protecció individual
Bones pràctiques microbiològiques
Equips de seguretat
Disseny i construcció d’instal·lacions
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 11
que treballin per desenvolupar un laboratori de nivell bioseguretat 4 s'han de posar en
contacte amb el programa de Bioseguretat de la OMS. El BSL-4 és adequat per a agents
exòtics que presenten un risc individual elevat de malalties que poden posar en perill i per
aerosols infecciosos i per als quals no hi ha tractament disponible. Aquests agents estan
restringits a laboratoris d’alta contenció.
Indicacions del Centro Nacional de Biotecnología.
Segons el CNB, en el seu manual de seguretat i higiene en els laboratoris de seguretat
biològica, als laboratoris BSL-1 només s’hi ha de dur a terme la manipulació de fluids, teixits
i òrgans d'origen animal o vegetal, tenint la certesa de la inexistència d'Agents Biològics
patògens humans contaminants; la manipulació de mostres constituïdes per fluids, teixits
i òrgans d'origen humà o d'altres primats inactivades prèviament mitjançant mètodes
verificats en laboratoris NCB2 o superiors; la manipulació d'Agents Biològics silvestres
purificats no patògens per a humans, animals o plantes ni possiblement nocius per al
medi ambient; i la manipulació, cultiu o producció d'OMG en Activitats d'utilització
confinada a laboratoris de Tipus 1.
En canvi, consideren que als laboratoris de BSL-2 el que s’hi ha de fer és la manipulació de
teixits i fluids d'origen humà o d'altres primats assimilables al grup de risc 2, sempre
que no se sospiti la presència d'Agents biològics dels Grups de risc 3 o 4, la manipulació
d'Agents Biològics silvestres purificats del GR 2 com a màxim o patògens per animals
o plantes assimilables al Grup de risc 2 com a màxim, el Cultiu de línies cel·lulars
establertes o de teixits primaris d'origen humà o d'altres primats sempre que no se sospiti
o no es conegui la presència d'Agents Biològics de l'GR3 o GR4, la manipulació, cultiu o
producció d'OMG en Activitats d'utilització confinada Tipus 2 (ACT2) com a màxim;
l'obtenció i manteniment de línies de ratolins transgènics i "Knockout" en ACT2 i la
Producció i cultiu de plantes transgèniques en ACT2.
Comitès de Bioseguretat.
Un comitè de bioseguretat és un organisme que determina el risc biològic sobre un
determinat agent o activitat per establir quines son les condicions d’infraestructura de
contenció o confinament necessàries i quines normes s’hi han de complir.
Els Comitès de Bioseguretat es recolzen en els paràmetres recollits en la legislació, com
en els que dictin les autoritats competents per a aquest tipus d'avaluacions. Poden sol·licitar
Aspectes a analitzar amb qualsevol tipus de material biològic
Possible patogenicitat.
Vies de transmissió i gamma d'hostes.
Tipus d'activitats i tècniques a realitzar.
Quantitat i concentració de l'agent a manipular.
Disponibilitat de mesures de contenció i protecció eficaços.
Disponibilitat de profilaxi i tractament sanitari eficaços.
Experiència prèvia i formació de personal que realitzarà les activitats
Aspectes a analitzar amb OMG
Característiques de l'organisme receptor o parental i del donant si existís.
Característiques de l'insert o inserits.
Característiques de el vector o vectors utilitzats.
Possible inducció de patogenicitat.
Canvis en la patogenicitat (tropisme, virulència, etc.).
Possible impacte en el medi ambient després una fuita accidental.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 12
més informació si existissin dubtes sobre les característiques dels organismes a utilitzar o
produir o sobre les condicions d'execució.
Gestió de Residus.
Considerem residus biològics no bioperillosos els que són o contenen Agents Biològics de
grup 1 i que, per tant, tenen una capacitat molt reduïda d'induir o produir una infecció, una
al·lèrgia o toxicitat als éssers vius i que no suposen cap perill per al medi ambient.
Són residus biològics bioperillosos els residus que són o contenen Agents Biològics de grup
2 de perillositat o superior i, per tant, tenen capacitat de produir una infecció, una al·lèrgia o
toxicitat als éssers vius, o de ser perillosos per al medi ambient. També s'inclouen els
organismes genèticament modificats (OGM) de qualsevol grup. Els residus bioperillosos es
guarden en tancs que després s’incineren en una empresa especialitzada. Els materials
citotòxics són processats de manera específica.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 13
Capítol III – Principis bàsics dels Cultius Cel·lulars animals.
Tema 4 – Cultius Cel·lulars: Condicions físico-químiques i biològiques.
Condicions físico-químiques dels cultius cel·lulars
Les cèl·lules, cultivades in vitro, necessiten trobar-se en unes condicions el més similars
possible a quan es troben in vivo. Això significa que els paràmetres de Temperatura, pH i
pressió osmòtica han d’estar controlats a la perfecció. Cal tenir en compte que les cèl·lules
es troben adaptades a la temperatura fisiològica de l’organisme del qual provenen, que la
majoria de cèl·lules de mamífer creixen correctament a un pH de 7.4 i que un excés de soluts
a l’exterior o l’interior de la membrana plasmàtica pot acabar produint una crenació o una lisi,
respectivament.
Un altre factor a tenir en compte però que no té la intenció d’imitar les condicions fisiològiques
és el suport i substrat dels cultius. Això és perquè els contenidors dels cultius atorguen una
barrera contra la contaminació per protegir els cultius de l’ambient exterior mentre mantenen
l’interior.
Temperatura.
Per poder fixar correctament el factor físic de la temperatura cal saber quines cèl·lules tenim
i de quin organisme provenen. Els principals tipus de cèl·lules i les seves temperatures de
creixement són les següents:
El control de la temperatura del cultiu és molt important, ja que les cèl·lules, en la seva gran
majoria, no toleren increments de més de 2ºC de la temperatura d’incubació i moren. Pel
contrari, solen sobreviure a una temperatura inferior malgrat això es tradueixi en una
proliferació reduïda. Aquesta reducció és arran d’un alentiment de tot el cicle cel·lular provocat
per un allargament de la fase G1, el que permet sincronitzar un cultiu de cèl·lules
asincròniques.
Composició de la fase gasosa i pH.
Malgrat semblin espais inconnexes, el control del pH es troba molt relacionat amb el de la
composició de la fase gasosa, sobretot en relació al diòxid de carboni, el qual es troba en
equilibri amb la concentració de protons del medi de cultiu.
Cèl·lules Humanes i de Mamífer
•La majoria de línies cel·lulars es mantenen entre 36ºC i 37ºC per un creixement òptim.
•En són una excepció les cèl·lules testiculars, per exemple, que creixen a 32ºC.
Cèl·lules d'Insectes
•Es cultiven a 27ºC per un creixement òptim.
•Per obtenir un creixement més lent es cultiven per sota de 27ºC o entre 27 i 30ºC.
Cèl·lules d'Aus
•Necessiten d'una temperatura de 38.5ºC per un creixement màxim.
•També es poden fer crèixer a 37ºC, tot i que ho faran més lent.
Cèl·lules d'Animals de Sang Freda
•Són les cèl·lules sortides d'amfibis o de peixos d'aigua freda.
•Toleren un rang de temperatura d'entre 15 i 28ºC.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 14
Això és perquè el diòxid de carboni, en equilibri entre els seus estats gasós i soluble, pot
reaccionar amb l’aigua quan es troba en aquest segon. La reacció amb l’aigua produeix
àcid carbònic (H2CO3), un àcid feble que allibera protons al medi de cultiu.
𝐶𝑂2𝑔𝑎𝑠ó𝑠 ⇌ 𝐶𝑂2𝑙í𝑞𝑢𝑖𝑑 + 𝐻2𝑂 ⇌ 𝐻2𝐶𝑂3 ⇌ 𝐻+ + 𝐻𝐶𝑂3−
És important mantenir el pH a nivells òptims tant a cultius tancats, on la concentració de
diòxid de carboni va augmentant i per això es redueix el pH, com en sistemes de cultius
oberts, on es sol perdre tant de CO2 a l’atmosfera que el pH ha d’augmentar per compensar-
ho.
Per contrarestar aquests efectes hi ha diverses opcions. Per començar, en els cultius tancats
el tamponament es sol fer amb alts nivells d’aminoàcids, galactosa i piruvat i sense
bicarbonat. En sistemes de cultiu oberts, en canvi, cal mantenir constant la pressió de diòxid
de carboni alhora que es tampona el medi de cultiu mitjançant bicarbonat o HEPES.
L’HEPES és un bon tampó per pH entre 7.2 i 7.6. Tenint en compte que la majoria de cèl·lules
creixen a un pH que es troba entre 7.2 i 7.4, això està molt bé. A més, es pot fer servir HEPES
en incubacions amb i sense CO2. Així i tot, quan hi hagi diòxid de carboni l’efecte tamponant
del HEPES és òptim a concentracions com a mínim dobles de la del bicarbonat. Cal tenir en
compte, però, que l’HEPES és un producte tòxic si es troba en altes concentracions, com
també cal tenir en compte que genera peròxid d’hidrogen si entra en contacte amb la llum.
Per evitar haver de posar gaire tampó es fan servir taps de cultiu permeables al CO2.
S’utilitzen, sobretot, en cultius amb una pressió de diòxid de carboni d’entre el 2 i el 10% i
possibiliten l’intercanvi de gasos del cultiu amb l’exterior sense comprometre’n l’esterilitat. A
més, als medis s’hi afegeix roig de fenol com a indicador de pH. Aquest producte acoloreix
els cultius segons el seu valor d’acidesa: vermell a pH 7.4, rosat a més de 7.6, taronja a 7.0 i
groc a 6.5. En cas que es torni de color groc és esperable suposar una contaminació per
bacteris, ja que aquests produeixen més CO2 que les cèl·lules animals. Així i tot, el roig fenol
no s’ha de fer servir en cultius de cèl·lules sensibles a estrògens, com les cèl·lules mamàries,
ni tampoc quan es fan estudis de citometria de flux.
Pressió Osmòtica.
La pressió osmòtica és aquella que es dona en referència a la quantitat total de soluts en
una solució aquosa. Aquesta quantitat es calcula mitjançant l’osmolalitat i l’osmolaritat.
L’osmolalitat s’aconsegueix dividint la quantitat d’osmols del solut entre els quilograms del
solvent, mentre que l’osmolaritat s’obté del quocient dels osmols de solut entre els litres de
solvent. Un osmol és un mol de partícula de solut independentment de la composició exacte
de la molècula. Per entendre millor el concepte d’osmol farem servir 4 exemples:
És important controlar la pressió osmòtica per no tenir ni medis hipertònics, on l’osmolaritat
del medi és superior al de les cèl·lules i aquestes es turgeixen, ni tampoc medis hipotònics,
1 mol de Glucosa
1 Osmol Glucosa
1 mol NaCL
1 Osmol Na+
1 Osmol Cl-
1 mol NaHCO3
1 Osmol Na+
1 Osmol HCO3
-
1 mol Na2SO4
2 Osmols Na+
1 Osmol SO4
2-
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 15
on l’osmolaritat del medi és inferior al de les cèl·lules i aquestes es lisen. S’ha de buscar
l’osmolaritat del medi justa per tal que aquest sigui isotònic.
Tipus de contenidors i substrats.
Els cultius cel·lulars poden ser de cèl·lules adherents o de cèl·lules en suspensió. Els dos
tipus de cèl·lules es diferencien en el que el seu nom ja bé diu: s’adhereixen al contenidor i
allà creixen o creixen al medi sense unir-se al contenidor. Ambdós tipus de cèl·lules poden
ser estacionàries o mòbils.
La majoria de les cèl·lules són cèl·lules adherents. Aquestes, quan son estacionàries,
creixen en flascons, plats i en pouets que no es troben en moviment. Són els sistemes de
cultiu més fàcils de fer servir i són els que necessiten menys equipament. Així i tot, les cèl·lules
adherents estacionàries requereixen molta feina intensiva per produir-ne en grans quantitats.
Si són cèl·lules adherents mòbils es solen cultivar en ampolles rodants que giren a una
velocitat d’entre 0.5 i 1 rpm en tambors. Es fan servir per produir grans quantitats de cèl·lules.
Les cèl·lules en suspensió solen ser línies hematopoètiques2, alguns tipus de cèl·lules
transformades, gàmetes... En cas que siguin cèl·lules estacionàries, creixen sense agitació
en plats i flascons sense tractar. Són molt útils per fer créixer petits volums de cèl·lules
independents d’ancoratge que creixen malament en cultius en suspensió tradicionals. En cas
que siguin cèl·lules mòbils, les cèl·lules en suspensió creixen en bioreactors, fermentadors
o flascons giratoris. Les cèl·lules en suspensió mòbils solen ser el mètode per produir grans
volums de cèl·lules tant al laboratori com a la indústria.
Els substrats d’un cultiu cel·lular poden ser sòlids inorgànics com el vidre o el plàstic,
semisòlids orgànics com l’agar, la gelatina o el metocel, matrius com el col·lagen, la poli-
lisina o la fibronectina, o poden ser un co-cultiu amb altres tipus cel·lulars que subministrin
factors de creixement, nutrients... Cal anar amb compte en la preparació de les matrius, doncs
la presència de molècules lliures (no adherides al plàstic) pot ser tòxica per a les cèl·lules.
Les cèl·lules mare creixen entre fibroblasts. La capa d'alimentació ajuda a proporcionar
nutrició per a les cèl·lules mare a més de factors que les eviten diferenciar.
La matriu CELLvo™ és una matriu extracel·lular (ECM) de proteïnes sintetitzada in vitro per
cèl·lules estromals de la medul·la òssia. Aquest producte està compost per més de 150
proteïnes que van ser secretades i reunides per cèl·lules de medul·la òssia durant la
producció de la matriu CELLvo™. El producte final és lliure de cèl·lules, només amb l'ECM
unida a la superfície del recipient de cultiu. Aquest substrat de cultiu cel·lular proporciona un
microambient tridimensional natiu, que es pot utilitzar per a una expansió cel·lular ràpida i
fiable de cèl·lules mare mesènquimes de gran qualitat (MSCs).
Condicions Biològiques
Les condicions biològiques d’un cultiu venen donades per les solucions salines
equilibrades i pels medis de cultiu.
Les solucions salines equilibrades tenen una composició simple que només inclou sals
inorgàniques tot i que, de vegades, té glucosa afegida com a nutrient. Les solucions salines
serveixen per mantenir les condicions fisiològiques com el pH, la pressió osmòtica i les
concentracions de sals inorgàniques. Les solucions salines també són útils per mantenir els
teixits i les cèl·lules vives fora del cos per curts períodes de temps, generalment uns pocs
dies. És per això que es fan servir per transportar, ràpidament, les cèl·lules d’un lloc a un altre
o netejar-les.
2 El teixit hematopoètic és el responsable de la producció de cèl·lules sanguínies.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 16
Els medis de cultiu es separen en medis naturals, els quals consisteixen en substàncies
biològiques naturals com el plasma, el sèrum i l’extracte d’embrions, i en medis sintètics,
compostos d’un medi basal i de suplements com sèrum, factors de creixement i hormones.
Solucions salines equilibrades.
Les solucions salines equilibrades tenen diverses aplicacions, com ser un irrigador o dilució
que manté el balanç osmòtic intracel·lular i extracel·lular, mantenir un aprovisionament d’ions
inorgànics essencials pel metabolisme normal de la cèl·lula, subministrar la principal font
d’energia a la cèl·lula (només si la solució està barrejada amb glucosa o algun altre
carbohidrat) i ser un sistema tamponant per mantenir el medi a un rang fisiològic de pH. Cada
tipus de sal atorga a la solució unes característiques diferents:
Medis de Cultiu.
Un medi base és aquell que és capaç d’oferir una certa regulació del pH i de la osmolaritat
alhora que proporciona nutrients i energia. Un medi de cultiu bàsic ha d’incloure tots els
aminoàcids essencials a més de la cisteïna, la tirosina i la glutamina. Amb aquest últim
cal anar amb compte, doncs la degradació de la L-glutamina genera amoníac que, per alguns
tipus cel·lulars, pot ser tòxic i més crític que la falta de L-glutamina. Aquest medi també ha
d’incloure vitamines del grup B perquè actuïn com a cofactors, sals i ions i carbohidrats.
Hi ha vegades que als medis de cultiu se’ls afegeixen antibiòtics, els quals eviten
contaminacions. Aquests afecten a la proliferació cel·lular i a la diferenciació, apart que poden
emmascarar infeccions o contaminacions. Per això s’hauria d’evitar fer-ne servir rutinàriament
excepte si són antibiòtics de selecció, quan no en sol durar gaire la seva aplicació.
Els medis de cultiu es suplementen amb més o menys complexitat. Segons com de ric
vulguem que sigui el nostre medi li hem d’afegir més o menys suplements, entre els que
trobem el sèrum o qualsevol component químic que li vulguem afegir. Si li afegim sèrum hem
de tenir en compte que el nostre medi passa a ser un no definit i que ja no el podem fer servir
en la producció de fàrmacs, per exemple.
El sèrum és el component sanguini que no és ni una cèl·lula sanguínia ni un factor de
coagulació. És el plasma sanguini amb els fibrinògens eliminats. Només n’hem retirat les
cèl·lules, pel que inclou totes les proteïnes que no es veuen involucrades en la coagulació i
tots els electròlits, anticossos, antígens i substàncies exògenes (com drogues i
oRegulen la permeabilitat.
Na+ i Ka+
oMantenen la integritat de les membranes cel·lulars i d’estructures internes.
Ca2+ i Mg2+
oControlen la concentració d’ions mitjançant el seu efecte tampó.
HPO4- i HCO3
-
oTambé inclou glucosa, el que suposa energia ja preparada per la cèl·lula.
BSS
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 17
microorganismes). Així i tot, es pot inactivar el sèrum si es manté a 56ºC durant 30 minuts.
El sèrum s’extreu de vedells, poltres, cavalls i humans.
Existeixen diversos medis de cultiu disponibles al mercat. Un d’ells s’anomena Medi mínim
essencial d’Eagle (EMEM) i permet el creixement d’un ampli espectre de cèl·lules, incloent
les cèl·lules del moll de l’os. És un medi simple de BSS amb aminoàcids no essencials,
piruvat sòdic i bicarbonat sòdic reduït. El medi EMEM es troba sovint reforçat amb suplements
o alts nivells de sèrum i n’existeixen nombroses variacions en la fórmula per diferents
aplicacions.
Un dels medis sorgits com a variació del EMEM és el DMEM, la modificació del medi
d’Eagle per Dulbecco. Aquest medi és EMEM enriquit amb el doble d’aminoàcids en
concentració i amb 4 vegades la quantitat de vitamines. A més a més, porta nitrat fèrric, piruvat
sòdic i alguns aminoàcids suplementaris. També porta una alta concentració de glucosa.
Les barreges de nutrients de Ham es van desenvolupar per donar suport al creixement
clonal de les cèl·lules d'ovari de hàmster xinès (CHO). Hi ha nombroses modificacions a la
formulació original, com el medi F-12 o el F-10, més complex i adequat per a la propagació
lliure de sèrum.
La barreja DMEM / F12 (en proporció 1:1) és un medi extremadament ric i complex que
s'utilitza per donar suport al creixement d'una àmplia gamma de tipus de cèl·lules tant en
formulacions sense sèrum com amb sèrum.
El 5A de McCoy es va utilitzar originalment per cultivar cèl·lules de l'hepatoma de Novikoff i
dona suport al creixement de cultius primaris.
El RPMI-1640 és una modificació del 5A de McCoy desenvolupat per al cultiu a llarg termini
dels limfòcits en sang perifèrica. Suporta el creixement d'una gran varietat de cèl·lules en
suspensió, així com d'un nombre de cèl·lules cultivades com a monocapa.
Al medi L-15 de Leibovitz, el sistema de tampó de bicarbonat de sodi estàndard / CO₂ està
substituït per una combinació de tampons fosfat, aminoàcids de base lliure, nivells més
elevats de piruvat sòdic i galactosa. Tot i que es va formular per al seu ús sense incubació de
CO₂, les cèl·lules es poden cultivar en incubadores de CO₂ sempre que no hi hagi intercanvi
entre l'aire del vas de cultiu i el de la incubadora.
Els medis de cultiu sense sèrum milloren la reproductibilitat dels cultius, disminueixen el
risc de contaminació, faciliten la purificació dels productes, prevenen el sobre-creixement dels
fibroblasts en cultius primaris i incrementen la productivitat del cultiu. Així i tot, fer servir
aquests medis provoca la necessitat de formulacions específiques per diferents tipus
cel·lulars i fa créixer més lent les cèl·lules. A més a més, necessita que els reactius tinguin
un elevat nivell de puresa, el que és molt car.
Estudis demostren que la composició del medi de cultiu i de l’alimentació pot influenciar
el creixement cel·lular, la productivitat proteica, l’expressió gènica, la qualitat del producte i el
metabolisme del lactat i de l’amoni. És per això que, quan es planteja un experiment i s’ha
d’escollir un medi de cultiu, cal tenir en consideració diversos aspectes:
Primer de tot, cal definir l’objectiu. Volem que les cèl·lules proliferin, es diferenciïn o que
únicament es mantinguin vives? Volem que produeixin? Què volem que facin les nostres
cèl·lules?
Segon, es pot optimitzar el medi de cultiu? Inicialment és millor que les línies cel·lulars les
cultivem en el medi original. Si volem modificar el medi, podem testar diferents medis i
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 18
comparar el creixement cel·lular al llarg de 5 passes (congelar cèl·lules a cada canvi per tenir
un estoc de reserva), modificar-los suplementant amb hormones, glucosa, glutamina,
vitamines, aminoàcids, insulina, transferrina, albúmina, lípids (colesterol, àcid linoleic,
fosfatidiletanolamina...)..., variar la osmolalitat amunt i avall, escollir el medi i barreja que
millors resultats hagin donat...
Si necessitem grans quantitats de medi cal tenir present que el medi en pols és més
econòmic. És preferible treballar sense antibiòtics, sempre que sigui possible. També és
convenient utilitzar material de vidre i plàstic exclusivament per cultius. Si cal rentar-lo, fer-ho
sense detergents. L’aigua és un factor crític, sobretot quan es treballa amb medis sense
sèrum.
Tema 5 - Cultius cel·lulars: producció i manteniment.
Autoritzacions.
El treball amb cèl·lules animals no es pot fer si abans no es compta amb el suport o
autorització del comitè de bioètica de la institució on es treballa, el qual està subjecte a
comitès de bioètica superiors a si mateix. En el cas de la UAB, qui fa aquesta feina és el
comitè de bioseguretat de la UAB en quant a la valoració del risc i la comissió d’ètica en
l’Experimentació animal i humana en quant a l’ètica.
Treballar en una Cabina de Seguretat Biològica.
Les cabines de seguretat biològica han de complir una sèrie de requisits per poder-se fer
servir. Per començar, cal que estiguin a una distància mínima de 500mm l’una de l’altre, que
es netegin amb etanol al 70% i que disposin del mínim material necessari dins d’elles.
En referència a com s’hi ha de treballar, cal fer moviments lents per no destorbar el flux
d’aire laminar alhora que no es bloquegen ni les reixes ni les ranures de corrent. Això
implica, per tant, mantenir un ordre i una neteja constants, distingir els articles nets dels que
estan contaminats i ser especialment curós amb el manteniment de l’asèpsia.
Tipus de cultius de cèl·lules
Els cultius primaris són aquells aïllats de teixits o de cèl·lules individuals. Aquests cultius
poden ser tant en suspensió com adherents i solen ser molt heterogenis en el seu inici de
cultiu. Per poder-los posar en una placa, el procediment consisteix en disgregar els teixits,
sembrar-ne una part o cèl·lules individualitzades i mantenir-ho en vida.
Els cultius secundaris són aquells derivats d’un cultiu primari i reben el nom de Subcultius.
El seu procediment és més senzill, doncs consisteix en seleccionar algunes cèl·lules i cultivar-
les en un medi diferent, el que dona una mostra de treball més homogènia.
Després del primer subcultiu, el cultiu primari rep el nom de línia cel·lular o subclon. Les
línies cel·lulars poden ser finites o contínues. Les línies cel·lulars finites són les cèl·lules
normals, que només es divideixen una quantitat concreta de vegades abans de perdre la seva
habilitat per proliferar, el qual és un esdeveniment determinat genèticament i anomenat
sensescència. Les línies cel·lulars contínues es tornen immortals a través d’un procés
anomenat immortalització induïda víricament o química o bé immortalització espontània.
Establiment d’un cultiu primari
Els cultius primaris són aquells aïllats d’un teixit animal, ja sigui embrionari, adult, normal o
neoplàstic. Pot ser un explant o cèl·lules individuals, que sigui de cèl·lules en suspensió o
adherents i sol ser inicialment heterogeni.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 19
La disgregació d’un teixit es pot fer de forma fina, mecànica o enzimàtica, cadascuna amb els
seus procediments. La disgregació fina d’un teixit es dona tot tallant el teixit a trossos tan
petits com un explant. La disgregació mecànica és per mètodes més dràstics, com un
pipeteig o molt de moviment. La disgregació enzimàtica es sol fer amb tripsina freda o
temperada o amb col·lagenasa.
Per poder realitzar la digestió enzimàtica primer cal recollir una mostra del cultiu en DBSS
per després tallar-lo a trossos de 2 o 3mm i posteriorment resuspendre’l i afegir-hi l’enzim que
es consideri. És important saber, a l’hora d’escollir l’enzim, que n’hi ha de més digestius
com la tripsina i menys digestius com la col·lagenasa. Si es vol fer amb col·lagenasa, el
procediment consisteix en incubar les cèl·lules resuspeses en un medi complet amb
col·lagenasa per, posteriorment, dispersar les cèl·lules per pipeteig. Seguidament a aquest,
s’han de transferir les cèl·lules a un tub i permetre que s’hi dipositin al fons. D’aquest pot, cal
centrifugar el sobrenedant i resuspendre’n les cèl·lules en un medi de creixement. El mateix
s’ha de fer amb les cèl·lules que s’havien dipositat: resuspendre-les en un medi de
creixement. Això permetrà que hi hagi una proliferació cel·lular.
Subcultiu de cèl·lules adherents
Un subcultiu és un cultiu bastant homogeni de cèl·lules seleccionades d’un cultiu
primari. A mesura que les cèl·lules estan en cultiu, van proliferant. Així i tot, arriba un punt
on, independentment de les bones condicions del medi on estiguin, el cultiu deixa de
proliferar perquè les cèl·lules s’han fet velles.
Per poder fer un subcultiu d’una línia cel·lular cal primer tripsinitzar les cèl·lules. Això es fa
en una sèrie de passos. Primer cal eliminar el medi de cultiu i netejar el flascó amb
PBS/HBSS. Posteriorment s’hi afegeix tripsina que, deixant-la actuar 5 minuts a 37ºC,
trencarà les unions de les cèl·lules amb el flascó. Després de retirar la majoria de la tripsina i
deixant incubar uns 10 minuts més a 37ºC, les cèl·lules s’haurien de veure rodones i surant
pel flascó. Resuspenem aleshores amb molt més medi i canviem de flascó tant per les
cèl·lules originals com per les de subcultiu.
Cal tenir en compte que la tripsina i la solució PBS/HBSS és la que es fa servir amb la majoria
de cèl·lules contínues, però cada cèl·lula és diferent i n’hi ha que potser els va millor que
l’enzim utilitzat sigui TrypLE, Dispasa o col·lagenasa, que la solució de balanç que genera un
ambient que mantingui la integritat estructural i fisiològica de les cèl·lules in vitro sigui HBSS,
PBS o DPBS, o que necessitin un agent quelant que segresti alguns ions metàl·lics com fa
l’EDTA.
Selecció o separació de cèl·lules
Centrifugació
Un dels mètodes de separació de cèl·lules d’un cultiu primari és la centrifugació, la qual pot
ser diferencial o de gradient de densitat. En la centrifugació diferencial es van fent
successives centrifugacions, cadascuna a major velocitat i sobre el sobrenedant de l’anterior.
La centrifugació de gradient de densitat, en canvi, consisteix en fer servir de “medi” un
gradient d’algun material que augmenti la resistència i després perforar el contingent per anar
recollint les mostres en base a la seva fracció corresponent.
Una versió de la centrifugació és l’ultracentrifugació. En aquesta es combinen els mètodes
de la centrifugació diferencial i de la del gradient de densitat. Això ho fa després d’una segona
centrifugació, on es resuspèn el pellet en una columna de gradient per separar posteriorment,
aconseguint així una millor separació.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 20
Afinitat per anticossos específics
Un altre mètode de separació és el de l’afinitat per anticossos específics mitjançant
immune panning, on es fan circular cèl·lules per plaques recobertes d’anticossos, o mitjançant
magnètic sorting, on s’uneixen cèl·lules i anticossos conjugats amb una partícula magnètica,
el que permet fer selecció en un camp magnètic. Aquesta última opció es pot modificar per
tal que es faci en continu mitjançant un MACS, on les cèl·lules d’interès es queden retingudes
a la columna que disposa d’un imant que l’envolta.
Els anticossos també permeten fer un FACS, una selecció de cèl·lules en base a la
fluorescència activada. Aquest procediment es fa mitjançant una citometria de flux, la qual
permet separar les gotes del medi on es troba cada cèl·lula en base a la fluorescència que
aquesta tingui.
Cellular Lifespan
Els Population Doubling Levels (PDL) calculen l’envelliment de la població de la línia cel·lular.
Aquesta xifra fa referència a la quantitat total de vegades que les cèl·lules de la població s’han
duplicat des de la seva primera isolació in vitro. Es calcula amb una fórmula en base a les
cèl·lules sembrades i tripsinitzades. L’entrada en senescència es sol donar al cap de 50 o 60
PDL. La fórmula per calcular els population doublings que ha tingut la línia cel·lular és la
següent:
𝑃𝐷𝐿 = 𝑋 + 3.322 ∗ (log 𝑌 − log 𝐼)
On X és el doubling level de la població inicial, I és la quantitat inicial de cèl·lules sembrades
al flascó i Y és la quantitat de cèl·lules al final del període de creixement.
A mesura que les cèl·lules es divideixen, els telòmers s’escurcen. És un paràmetre, la
llargada dels telòmers, bastant inversament proporcional o indicativa de la quantitat de PDL
que la línia cel·lular porta i que li queden. Això sol passar per la manca de telomerasa en les
cèl·lules velles. Quan els extrems cromosòmics són molt curts, no protegeixen els
cromosomes. Aquesta manca de protecció activa p53 i pRb que fan entrar la línia cel·lular en
senescència. El procés mitjançant el qual evitem aquesta arribada a la senescència és el
que anomenem “immortalització”. Això sí, les cèl·lules immortalitzades, a mesura que
passa el temps, perden rellevància biològica. Cal tenir molt clar perquè es faran servir.
Immortalització cel·lular.
Hi ha diferents maneres d’immortalitzar les cèl·lules, tot i que també es pot donar de manera
espontània. Els mètodes provocats solen ser mitjançant càncers, virus o l’activació de la
telomerasa. Cada tipus d’immortalització té un efecte diferent de la resta i també es diferent
segons el tipus cel·lular al que se li apliqui, ja que hi ha cèl·lules a les que no els agrada
alguna de les estratègies. Per aquest motiu es solen combinar els mètodes que explicarem
a continuació.
La immortalització, doncs, es pot induir. Una de les maneres més fàcils de fer-ho és mitjançant
l’expressió de la telomerasa, on podem afegir una GFP control per saber si s’està
expressant realment. Sempre cal fer un western per determinar-ho, ja que es podria donar
una expressió de la GFP i no de la telomerasa. L’activació de la telomerasa no implica un
gran problema a nivell gènic i d’expressió, pel que és una bona opció. Aquesta expressió de
la telomerasa es pot aconseguir per la introducció de hTERT.
Una altre manera de fer-ho és a través dels oncogens virals de les cèl·lules, una sèrie de
gens que codifiquen per maneres d’aturar la p53 o la pRb. Dins d’aquests hi ha el SV40 LT,
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 21
el HPV16 E6/E7 i l’Epstein Barr. Això provocarà una reorganització del genoma, que les fa
entrar en crisi. Algunes cèl·lules, i tan sols per acció de l’atzar, es tornen immortals.
Així i tot, per alguns tipus cel·lulars, la sobre expressió de SV40LT o hTERT no és suficient
per aconseguir la immortalització. En aquests casos es pot intentar la combinació de les dues
metodologies.
Un altre mètode d’aconseguir la immortalització induïda és la fusió cel·lular de línies finites
amb línies immortals, el que genera cèl·lules híbrides. La fusió es dona gràcies al virus
Sendai inactivat i a la presència de polietilenglicol. El resultat de la fusió pot ser triple:
homocarions mortals i immortals (mortals els que són unió de dos finits i immortals la unió
de dos infinits) i heterocarions immortals.
El mètode per seleccionar els heterocarions immortals és el de generar cèl·lules parentals
sense capacitat de generar nucleòtids mitjançant la via de la hipoxantina i cèl·lules parentals
sense capacitat de generar nucleòtids per la via de la timidina. Com que les cèl·lules de
mamífer necessiten de la dihidrofolat reductasa o d’aquestes dues vies per generar nous
nucleòtids, cultivem el resultat de la fusió de les dues cèl·lules parentals en medi HAT. El
medi HAT conté, apart de tots els components que necessita un medi, Aminopterina,
Hipoxantina i Timidina.
Com que l’aminopterina inhibeix la dihidrofolat reductasa i les cèl·lules heterocariones
podran fer servir les dues vies de síntesi de nucleòtids, seran les úniques que sobreviuran
en un medi HAT.
Una important utilitat de la immortalització és la producció d’anticossos. En aquest cas,
es comença subministrant a un animal l’antigen contra el qual volem els anticossos.
Seguidament li retirem unes quantes cèl·lules B i les fusionem amb cèl·lules canceroses
immortals i deficients en TK i HGPRT, els enzims de les vies de la timidina i de la hipoxantina,
respectivament. Cultivem les cèl·lules resultants en medi HAT per tal que només hi creixin les
cèl·lules B immortals, a les que anomenarem hibridomes. D’aquests, en fem un screening
amb l’antigen per seleccionar-ne només les que produeixen l’anticòs d’interès. Això permet la
generació d’anticossos monoclonals.
Una altre manera de aconseguir cèl·lules immortals és mitjançant la transformació cel·lular,
és a dir, la infecció vírica no productiva i que acaba generant cèl·lules mutants immortals.
El seu problema és que una cèl·lula transformada té inestabilitat genòmica. Això significa que
va patint i acumulant alteracions al llarg del temps. A més, la inestabilitat va lligat a un
creixement aberrant i a la malignitat. No sempre es compleixen tots els trets, però això no
implica que no siguin transformades. Les cèl·lules transformades, a més, poden créixer
independentment del substrat i tenen la capacitat de perdre l’ancoratge amb la superfície i
créixer en suspensió. Aquestes cèl·lules es saturen més tard i es dupliquen a una velocitat
més elevada.
Tema 6 - Cultius cel·lulars: quantificació de cèl·lules
Recompte de cèl·lules
Tenir unes cèl·lules en cultiu és com tenir un fill o una mascota: implica estar pendent d’elles
en tots els paràmetres possibles. Una cosa que cal fer per analitzar-les és tripsinitzar-les
setmanalment. Aquest recompte de cèl·lules que la tripsinització ens permet fer ens farà tenir
constància de l’avenç de la senescència.
Per fer el recompte de cèl·lules quan hi ha pocs flascons es fa servir l’hemocitòmetre o
cambra de Neubauer. El procediment d’aquest aparell és senzill: partint d’una suspensió de
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 22
cèl·lules ben homogeneïtzada, se n’afegeix un volum determinat a la graella. D’aquesta en
seleccionem les caselles més externes i en fem el recompte. Com que el volum que es
diposita en cadascuna de les cambres de Neubauer és de 10-4 ml, es pot saber amb
bastanta precisió quantes cèl·lules hi ha al cultiu. En funció de la cambra de Neubauer
que es tingui, es segueix un mecanisme de recompte diferent que depèn dels límits de la
quadrícula. En el recompte a la cambra de Neubauer es sol fer servir blau tripà, que permet
saber la quantitat de cèl·lules vives i la quantitat de cèl·lules mortes. Aquest tint funciona,
sobretot, en cèl·lules animals.
Sempre que sigui possible, interessa treballar amb sistemes electrònics de recompte de
cèl·lules. N’hi ha diferents tipus, ja que estan basats en diferents estratègies de recompte.
La majoria es poden separar en dues estratègies: canvi de resistència elèctrica a mesura
que la cèl·lula passa per un orifici o Anàlisi de fluorescència. També existeix la citometria
de flux com a mètode alternatiu. Els experiments ens demostren que la desviació en el
recompte de cèl·lules respecte diverses passades de l’aparell és minúscula comparada
amb la que hi pot haver entre diverses persones fent un recompte manual.
Els recomptes de cèl·lules són útils per vàries coses, però la més important de totes és el
recompte de PDL i el càlcul de PDT. Les PDL són els Population Doubling Levels, la quantitat
total de vegades que les cèl·lules de la població s’han duplicat des de la seva primera isolació
in vitro. És important saber calcular la quantitat de PDL que han passat en un cultiu, ja que
s’han d’anar sumant els PDL acumulats per saber quants en porta el cultiu primari. El PDT
és un element similar al PDL, sols que aquest paràmetre serveix per calcular el temps que
triga el cultiu cel·lular en duplicar-se. Els dos paràmetres es calculen tal que:
𝑃𝐷𝐿 =log 𝑁 − log 𝑁0
log 2 𝑃𝐷𝑇 =
𝑇 ∗ log 2
log 𝑁 − log 𝑁0
On T és el temps transcorregut en hores, N la quantitat de cèl·lules finals i N0 és la quantitat
de cèl·lules inicials.
És importar conèixer els PDL i els PDT de les nostres cèl·lules perquè permet detectar
qualsevol problema que aquestes tinguin. En cas que a les cèl·lules els passi alguna cosa,
es veurà reflectit a les corbes de creixement. També tenen corbes diferents els cultius
transformats.
Quantificació cèl·lules vives/mortes en cultiu
La quantificació de cèl·lules també permet avaluar la toxicitat, ja que podem separar
entre cèl·lules mortes i cèl·lules vives d’un mateix cultiu. Hi ha moltes tècniques per separar-
les, cadascuna amb diferents criteris de selecció: la presència d’enzims actius a les cèl·lules,
l’avaluació de la pèrdua de permeabilitat de la membrana, la capacitat d’incorporació de
nucleòtids...
Un mètode és el kit viu o mort. En aquest, afegim la molècula no fluorescent acetoximetil
calceina, la qual pot ser transportada dins de les cèl·lules vives a través de la membrana
cel·lular, i Iodur de Propidi, un agent intercalant que únicament entra a la cèl·lula si la
membrana plasmàtica està malmesa. Dins la cèl·lula viva, les enterases eliminen el grup
acetometoxi, la molècula es queda atrapada dins la cèl·lula i emet una forta fluorescència
verda. A través d’una posterior irradiació i anàlisi de la fluorescència, el recompte de cèl·lules
verdes indicarà la quantitat de cèl·lules vives i el recompte de cèl·lules vermelles indicarà
la quantitat de mortes.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 23
L’assaig MTT és una altre manera de comptabilitzar cèl·lules vives o mortes. Es basa en la
capacitat de les deshidrogenases mitocondrials per convertir un substrat groc i soluble en
aigua (el MTT) en formazan, de color blau fosc i insoluble en aigua. La quantitat de formazan
és directament proporcional al número de cèl·lules vives d’un cultiu cel·lular. Per
comptabilitzar-les, cal solubilitzar els cristalls de formazan i estudiar-ne les absorbàncies, el
que mataria les cèl·lules que hi hagués. Hi ha diverses variants comercials derivades de
l’MTT: MTS, XTT, WST-8...
Una variant molt útil de l’assaig és aquesta última, la que fa servir WST-8. Aquesta substància
és incolora i, en reduir-se, pren un color taronja. Aquesta molècula no entra a les cèl·lules,
però cal que actuïn deshidrogenases internes per degradar-la. Per aconseguir-ho, es combina
amb una molècula reduïda per les deshidrogenases de dins les cèl·lules i que pot sortir i entrar
al citoplasma. Aquesta molècula reduïda s’oxida per contacte amb WST-8, el que permet
repetir el cicle una vegada i una altre sense matar les cèl·lules, no com passa amb MTT.
L’assaig AlamarBlue és una prova similar al MTT. En aquesta prova, enzims cel·lulars
redueixen el Resazurin, que pot entrar a la cèl·lula i no és tòxic, en Resorufin. Aquest últim
es valora de forma colorimètrica en el sobrenedant amb una placa d’ELISA. La quantitat de
fluorescència és proporcional al nombre de cèl·lules vives. Aquest assaig té un gran
avantatge: com que no és tòxic, les cèl·lules no s’han de fixar i com que s’utilitza el
sobrenedant, es pot fer servir diverses vegades en el mateix cultiu.
Mort cel·lular regulada
Quan es mesuren cèl·lules vives i mortes, es vol saber de què o com es moren. Això permet
parlar de dos conceptes. La mort cel·lular regulada resulta de l’activació d’una o més
cascades de senyalització amb efectors específics i conseqüències bioquímiques, funcionals
i immunològiques úniques.
La mort cel·lular programada, en canvi, és una particular forma de mort cel·lular regulada
que succeeix en escenaris estrictament fisiològics. No es relaciona amb pertorbacions amb
l’homeòstasi i, per tant, no es dona en el context d’una mala adaptació a l’estrès cel·lular. La
mort cel·lular regulada es pot donar de diverses maneres en els cultius cel·lulars:
Existeixen 3 modalitats de mort cel·lular regulada, classificades en base a les característiques
morfològiques i estructurals que es donen quan succeeixen.
L’apoptosi és una mort cel·lular neta. En aquest tipus de mort programada, la cèl·lula es va
destruint des de l’interior. Hi ha un arrodoniment de la cèl·lula, es fragmenta o s’acumula el
DNA a la perifèria del nucli, es fragmenta el nucli cel·lular i, finalment, es generen gemmes
cel·lulars o vesícules anomenades cossos apoptòtics. El més important d’aquest tipus de
mort cel·lular programada és que el contingut interior de la cèl·lula mai arriba a l’exterior.
Les cèl·lules fagocítiques de l’organisme les ingereixen arran dels flip-flops dels àcids grassos
de la membrana, el que senyalitza aquesta necessitat d’eliminació.
Eliminació de factors de creixement en línies cel·lulars que creixen a densitats elevades
Exposició a agents citotòxics
No adhesió al substrat
Diferenciació terminal de les cèl·lules in vitro
Nombre de divisions finit
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 24
En la necrosi, tot l’interior es veu alliberat a l’exterior. És pràcticament el procediment invers
que en l’apoptosi. Quan s’inicia el procés de necrosi, hi ha un inflament cel·lular seguit d’una
lisi de la cèl·lula, alliberant tot el contingut a l’exterior amb una moderada condensació de
la cromatina.
L’autofàgia és un procediment mitjançant el qual les cèl·lules desintegren totes les seves
membranes internes i les concentren a la membrana externa, quedant-se així buides de
contingut.
Quantificació apoptosi en cultiu.
Per comptabilitzar la quantitat de cèl·lules que en un cultiu han mort per apoptosi el primer
que cal fer és una Caracterització morfològica de la cèl·lula o del nucli. Això es pot
aconseguir per tinció Leishman, DAPI o Hoechst. En tots els casos, el que s’ha d’analitzar per
trobar cèl·lules apoptòtiques és la presència dels cossos apoptòtics, que són visibles com
petites esferes al voltant d’una cèl·lula més petita del normal. Quan hi ha una tinció amb DAPI
o Hoechst, es veuen els nuclis, els quals estan explotats si hi ha un tractament inductor de
l’apoptosi.
També es pot comptabilitzar la translocació de la fosfatidilserina, que de normal es troba
a la membrana interna de la bicapa i es transloca a la externa quan s’inicia l’apoptosi. A la
fosfatidilserina s’hi uneix nexina, que brilla amb un color verd. A mesura que va passant
l’apoptosi, la membrana es desestabilitza, cas en que podem afegir Iodur de Propidi, que
entrarà a la cèl·lula i ens mostrarà els nuclis. Hi ha un tipus de cèl·lules, les necròtiques, que
tenen la membrana solubilitzada però prou estable i que, per tant, es veurien alhora verdes
però amb un centre vermellós.
Una altre cosa que es pot mesurar és l’activitat de les caspases, unes proteïnes que
digereixen diferents components de la cèl·lula mitjançant una cascada enzimàtica. Aquesta
és una de les característiques que s’aprofiten amb la tinció per un tint de DNA amb alta afinitat.
Aquest substrat, el qual és alhora no fluorescent i no funcional com a tint de DNA, creua les
membranes cel·lulars a molt alta velocitat per entrar al citoplasma, on és tallat per la caspasa-
3 per formar un tint de DNA d’alta afinitat que marca el nucli amb un verd brillant, permetent
la detecció de l’activitat de la caspasa-3 i la visualització de canvis en la morfologia nuclear
durant l’apoptosi.
L’últim mètode de quantificació de l’apoptosi en un cultiu és el mètode TUNEL. El mètode
TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labelling of
DNA fragments), utilitza l’activitat de la transferasa terminal de desoxinucleòtids (TdT) per
incorporar dNTP als extrems 3’ del DNA fragmentat que poden ser detectats mitjançant
diferents estratègies.
Tema 7 - Cultius cel·lulars: criopreservació de cèl·lules
Avantatges la criopreservació
La criopreservació de cèl·lules cultius cel·lulars és el procediment mitjançant el qual les
cèl·lules es mantenen a molt baixa temperatura, sovint en nitrogen líquid, per descongelar-
les quan se’n necessiti alguna mostra o calgui fer algun experiment. La criopreservació
presenta diversos avantatges, com estalviar temps i materials quan les cèl·lules no s’han
d’utilitzar immediatament, fer rèpliques d’experiments a PDL similars o distribuir cèl·lules a
altres laboratoris. Aquest últim avantatge es realitza sovint, ja que es solen produir moltes
cèl·lules i la solidaritat entre laboratoris és un element molt important en recerca.
L’ús de la criopreservació també és molt útil si es vol evitar certs problemes amb la utilització
d’una mateixa línia cel·lular. Això és perquè fer servir la criopreservació evita efectes
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 25
relacionats amb la vellesa del cultiu com la inestabilitat genètica i la deriva genotípica
associada, la selecció i diferenciació, l’increment de les possibilitats de transformació,
l’envelliment cel·lular en línies no immortalitzades, la contaminació per microorganismes
o altres línies cel·lulars i les pèrdues dels cultius per fallades dels aparells.
Principis de la congelació
Quan es comença a congelar unes cèl·lules, es treballa amb unes solucions isotòniques,
amb la mateixa osmolaritat que el citoplasma. Quan es congela aigua es formen cristalls de
gel. La presència de cristalls redueix la concentració d’aigua allà on es trobin. Si el
refredament és lent, el gel comença a formar-se a partir de nuclis concrets a l’exterior
cel·lular. Això provoca un increment en la concentració de soluts del líquid i la pèrdua d’aigua
de les cèl·lules per adaptar-s’hi. Si el refredament és ràpid, les cèl·lules no tenen temps de
deshidratar-se i formen cristalls de gel a l’interior.
Els crioprotectors són molècules solubles en aigua amb un pes molecular inferior a 100Da
que disminueixen el punt eutèctic, la temperatura on tot el material està congelat. La seva
aplicació és mitjançant solubilització al medi, on tindran una difusió simple a través de les
membranes cel·lulars fins arribar a l’equilibri osmòtic.
La disminució de la temperatura provoca la formació gel a l’exterior cel·lular. Per compensar
la diferència de soluts a l’exterior, la cèl·lula es deshidrata. Això provoca un increment en la
concentració de crioprotector a l’interior de la cèl·lula tot entrant-hi per difusió simple. Com
que el crioprotector és una substància viscosa, la seva presència disminueix la
probabilitat de formació de cristalls de gel a l’interior de la cèl·lula. Aquest últim fenomen,
la disminució de cristalls dins la cèl·lula, també es dona perquè més del 50% de l’aigua de
dins la cèl·lula és substituïda per molècules de crioprotector.
Quan s’ha subministrat crioprotector, el qual pot ser PVP, DMSO o glicerol; cal que el cultiu
es congeli poc a poc (-1ºC/min). No tots els crioprotectors són igual d’efectius. El
Polivinilpirrolidó (PVP) manté l’habilitat d’alguns tipus de cèl·lules mare per diferenciar-se un
cop es descongelen. La contrapartida és que té una viabilitat cel·lular inferior que altres
crioprotectors intracel·lulars i pot afectar a la integritat dels àcids nucleics. El Dimetil Sulfòxid
(DMSO) ofereix una protecció superior a la lisi osmòtica, però pot ser absorbit directament a
través de la pell i és citotòxic en alguns tipus cel·lulars. El glicerol, finalment, és molt menys
citotòxic que la resta de crioprotectors i és més segur per l’operari que el DMSO. El problema
del glicerol és que provoca més lisis cel·lulars que el DMSO i que s’ha de retirar abans de
cultivar les cèl·lules en plaques, igual que el DMSO, un procediment complex.
Per conservar les cèl·lules d’alt Valor afegit, s’ha de fer una vitrificació. Una vitrificació
consisteix en una congelació ultra ràpida per evitar la formació de cristalls de gel. Per realitzar-
la es requereix d’un refredament ràpid, una alta viscositat del medi, una alta concentració
de crioprotector i un volum de medi limitat. Per disposar de l’alta concentració de
crioprotector, aquest es va afegint gradualment a temperatura ambient. Un cop s’ha assolit la
concentració adequada, s’introdueixen els cultius en flascons prims i llargs directament a
196ºC sota 0 (nitrogen líquid). És important que quan es faci una congelació, aquesta sigui
amb un gran nombre de cèl·lules (unes 106). De la mateixa manera, és important marcar
els pots de conservació.
Protocols de congelació i descongelació.
Congelació de cèl·lules.
El procés per congelar unes cèl·lules consta de varis passos. Primer, tripsinitzar les cèl·lules
i fer-ne un recompte. Després s’ha de centrifugar i resuspendre en medi que contingui
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 26
crioprotector (glicerol o DMSO). Aquesta resuspensió s’ha de fer amb unes concentracions
entre 5 i 10 vegades superiors a les de sembra. Un cop resuspeses, cal disposar la solució
en criotubs. Aleshores es provoca una disminució gradual de la temperatura (-1ºC/minut)
utilitzant contenidors especials per aquesta tasca i es deixen dins d’un congelador de -80ºC
durant un mínim de 4 o 6 h. Passades aquestes, s’han de transferir els criotubs al nitrogen
líquid, tenint cura que la temperatura no pugi de –50ºC. Finalment, només queda mantenir
les cèl·lules congelades submergides en el líquid o en la fase gasosa de sobre el nitrogen
líquid.
Existeixen diferents tipus de contenidors per a la criopreservació. N’hi ha de coll prim, de coll
ample, de conservació en canyes i de conservació en calaixos.
Descongelació de cèl·lules.
El procés de descongelació cel·lular és més simple que el de congelació i consisteix en menys
passos. El procediment comença per retirar el criotub del N2 i immediatament “sucar-lo” en
un bany María a 37ºC sense submergir el tap del criotub. Un cop descongelada la mostra,
rentar el criotub per fora amb etanol al 70%. Aleshores transferir la suspensió, lentament,
a un flascó de cultiu que contingui el medi. Al dia següent, quan les cèl·lules ja estan
adherides, fer un canvi de medi per extreure les possibles restes de crioprotector.
Per alguns tipus cel·lulars sol anar bé no deixar restes de crioprotector. Llavors, es centrifuga,
s’elimina el medi de congelació i es resuspenen les cèl·lules en medi fresc.
Estocs de cèl·lules.
És important congelar les cèl·lules per tenir estocs. No val la pena fer un cultiu primari
per un sol experiment o per un sol criotub. No només per la quantitat de feina que comporta
Mantenir les cèl·lules congelades.
Transferir els criotubs al nitrogen líquid.
Deixar dins d’un congelador de 4 a 6h.
Disminuir gradualment la temperatura.
Disposar la solució en criotubs.
Centrifugar i resuspendre en medi que contingui crioprotector.
Tripsinitzar les cèl·lules i fer-ne un recompte.
Al dia següent fer un canvi de medi.
Transferir la suspensió a un flascó de cultiu que contingui el medi de cultiu.
Rentar el criotub per fora amb etanol al 70%.
Retirar el criotub del N2 i sucar-lo en un bany María a 37ºC sense submergir-ne el tap.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 27
sinó per la importància de tenir expansions de cultius primaris. Es descongela un vial i es fa
una expansió del mateix per distribuir.
La primera expansió s’ha de fer a partir d’un cultiu primari. L’expansió implica diversos
subcultius per crear l’estoc de cèl·lules congelades, de les que alguns autors en recomanen
12 vials congelats. Un cop haguem generat l’expansió de l’estoc de sembra mitjançant
aquest procediment se l’ha de caracteritzar i testar per assegurar l’absència de contaminació,
moment a partir del qual serveix de reservori cel·lular.
En cas de voler fer un estoc de distribució, el procediment a seguir comença per
descongelar un vial de l’estoc de sembra, cultivar-lo i expandir-lo per crear un segon estoc
d’uns 50 vials. Aquest serà l’estoc de distribució. Aquest estoc és el que s’ha d’utilitzar per
repartir als peticionaris.
Finalment, cal que cada investigador/a o grup de recerca estableixi els seus estocs d’usuari,
els quals s’han de generar amb un màxim de 20 vials per 5 anys i que s’haurien d’eliminar un
cop acabada l’experimentació. Així i tot, es recomana no mantenir cultius de més de 3
mesos.
Tema 8 – Cultius cel·lulars: contaminacions.
Fonts de contaminació.
Quan es treballa amb cultius cel·lulars és essencial mantenir les condicions d’asèpsia.
Això significa que cal assegurar que la contaminació biològica, la que prové de llevats, fongs,
bacteris, micoplasma, virus i altres cèl·lules; no es doni si no és pròpia del cultiu. Per
aconseguir una bona asèpsia és important assegurar-se de treballar correctament i amb
esterilitat. Implica garantir una esterilització efectiva, tenir una manipulació correcte i eficient,
fer servir material de bona qualitat, tenir un bon emmagatzematge i que es mantingui
correctament l’equipament del laboratori. Aquest conjunt de factors també impliquen, en el
fons, disposar de cabines de la bioseguretat corresponent i que, amb el seu funcionament en
perfecte estat, s’hi treballi correctament.
Contaminació biològica visible.
La contaminació biològica visible és un tipus de contaminació provocada per bacteris,
fongs i llevats que podem detectar de diverses maneres. Una és mitjançant canvis en el pH
del medi de cultiu i en la seva transparència, la qual es redueix. Un altre manera és
mitjançant la microscòpia de contrast de fase, on es fa molt evident aquesta contaminació.
Algunes de les soques que provoquen contaminació biològica visible poden tenir un
creixement molt lent i necessiten de períodes de temps més llargs (de fins a sis setmanes)
per ser detectades. Per poder detectar la contaminació biològica visible es recomana
treballar en absència d’antibiòtics.
Un cop s’ha detectat, per qualsevol de les mesures anteriors, la presència de contaminació
al cultiu, aquesta s’ha d’eliminar. També cal autoclavar tot el material que s’ha fet servir i la
font de la que s’ha extret el cultiu. En cas que la contaminació provingui d’un cas extern, és a
dir, de cultius que provenen d’un altre laboratori per realitzar un experiment, es poden testar
combinacions d’antibiòtics o d’antifúngics. El problema amb aquests és que s’acaben creant
resistències que impedeixen fer net de la contaminació. A més, cal recordar que l'ús
d’antibiòtics pot afectar les cèl·lules en cultiu.
Contaminació biològica no visible.
Mycoplasma és un gènere de bacteris que no tenen paret cel·lular. Són petits, d’entre
0,2 i 0,8 µm, pel que poden travessar filtres. Al no tenir paret cel·lular, no estan afectats per
molts antibiòtics com la penicil·lina o d’altres que tenen l'objectiu d'atacar la paret cel·lular.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 28
Són sensibles, en canvi, a les Tetraciclines, als Pleuromutilins i a les Quinolones. Existeixen
unes 190 espècies de Mycoplasma diferents, tot i que el 95% de les contaminacions estan
produïdes per 8 espècies.
La principal causa d’infecció per micoplasma és una contaminació creuada per part d’un
cultiu cel·lular prèviament infectat de micoplasma que es fa servir en el mateix laboratori. Si
a això li afegim que els micoplasmes contaminants normalment provenen de l’ésser
humà, la contaminació per micoplasma sol ser fruit de la mala manipulació al laboratori. Com
que és molt probable que es doni aquesta contaminació, la majoria de laboratoris solen
demanar proves de detecció de micoplasma abans d’acceptar unes cèl·lules d’un altre.
La presència de micoplasma en un cultiu pot generar varis problemes, ja que competeix
amb les cèl·lules cultivades per precursors bioquímics, s’adhereix a la superfície cel·lular
o s’hi fusiona. Això provoca alteracions en el metabolisme, creixement i genoma de la
cèl·lula; danys a la membrana que porten a una pèrdua de la integritat cel·lular, interferències
amb els receptors de membrana que alteren els mecanismes de transport, senyalització i
producció de citoquinines i tot junt pot acabar tenint efectes citopàtics. En definitiva, la
contaminació per micoplasma en un cultiu pot acabar generant la mort de moltes de les
cèl·lules que es tenen en aquest, el que deriva en una mala interpretació dels resultats i pot
posar en compromís la validesa de les dades generades per la recerca o projectes
d’investigació i desenvolupament.
Es poden fer dos tipus de test per detectar la presència de micoplasma en els diversos cultius
cel·lulars. Per començar està el test directe, consistent en realitzar un cultiu microbiològic en
agar. Per altra banda estan els tests indirectes, com la Tinció de DNA, la realització d’una
PCR sobre el 16s rRNA de micoplasma o fer servir mycoalert, el qual es basa en la
presència d’enzims d’aquest organisme per generar compostos luminescents. Per realitzar la
tinció del DNA es poden fer servir fluorocroms que s’enllacen al DNA com Hoechst o 33258 /
DAPI. Quan es fa, en els cultius infectats s’observen els nuclis cel·lulars fluorescents i DNA
extra-nuclear.
Si s’ha detectat una infecció per micoplasma, el que es pot fer és autoclavar els cultius
infectats i els reactius i desinfectar els equips utilitzats. També es poden combinar diferents
antibiòtics sempre i quan actuïn sobre el metabolisme bacterià i no sobre la formació de
paret.
Els micoplasma són uns organismes molt infecciosos i s’expandeixen molt ràpid. En un
experiment realitzat el 1976, un investigador va infectar, de manera voluntària, un cultiu amb
micoplasma. Tot fent diversos anàlisis, va voler comprovar l’estat del material del laboratori.
Va veure que, al cap de 6 setmanes, la major part de les línies cel·lulars, al igual que les
pipetes, poyates i resta de material estaven infectats per micoplasma.
Existeix un altre tipus de contaminació no visible: la de virus. Els virus que infecten de manera
no visible poden ser Virus endògens específics d’espècie o Virus contaminants com els
que s’utilitzen per immortalitzar cèl·lules. Els primers solen provenir del sèrum animal que es
fa servir com a suplement del medi de cultiu i els segons poden provenir de limfoblastoides
Epstein Barr, per exemple.
Per detectar la presència de virus cal comprovar si hi ha efecte citopatogènic (CPE) com
lisi cel·lular, vacúols o vesícules, multinucleació i transformació... L’absència d’efecte
citopatogènic no exclou la possibilitat de presència de virus. Per comprovar del cert si n’hi ha,
cal fer Tests immunològics (ELISA), citològics, bioquímics i/o ultraestructurals apropiats.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 29
Contaminacions creuades.
Les contaminacions creuades són les contaminacions més importants i poden ser de 2 tipus.
Una opció és que la cèl·lula que contamina tingui més capacitat de proliferació en
aquelles condicions en les que estem cultivant. Si això passa, desplaçarà a les cèl·lules
originals. Una altra és que en un laboratori es treballi amb cèl·lules iguals però que
provinguin de diferents donants. No es pot considerar, doncs, que els resultats que
s’obtinguin siguin igualment vàlids. No totes les tècniques d’identificació cel·lular
serveixen ni tampoc sempre van bé.
Hi ha, al menys, 324 línies cel·lulars infectades per altres cèl·lules. D’aquestes, 106 línies
estan infectades per cèl·lules HeLa. Hi ha un registre de totes les línies contaminades per
altres o línies cel·lulars mal caracteritzades. Per tal d’evitar aquest tipus de contaminacions,
les creuades, és important que les cèl·lules s’obtinguin de fonts fiables, validar
periòdicament les característiques de les cèl·lules i controlar les pràctiques d’asèpsia.
Tema 9 - Cultius cel·lulars: caracterització i autentificació. Quan es realitza un cultiu cel·lular és molt important caracteritzar i autentificar les cèl·lules
que hi ha en ell. Això servirà per detectar contaminacions creuades amb altres línies
cel·lulars, el que podria haver dut a generar hipòtesis biològiques inapropiades o a resultats
irreproduïbles i enganyosos, validar línies per a l’obtenció de vacunes que validin les
vacunes obtingudes i per identificar canvis en la línia a mida que incrementem el nombre
de subcultius, com la inestabilitat genètica o les propietats associades a la transformació.
Sempre que existeixin marcadors específics, i si es tenen les eines adequades, la
caracterització també pot permetre identificar el teixit d’origen, el llinatge i la posició en
el llinatge.
Mètodes de caracterització.
Els mètodes de caracterització cel·lular es separen, la majoria, en 4 tipus segons en què es
basin o quines tècniques facin servir. Així i tot, també existeixen altres mètodes, com
l’enzimatologia, que no tractarem en aquest tema. La caracterització d’una línia cel·lular
es sol fer abans d’experimentar amb ella. Els 4 mètodes de caracterització són segons la
Morfologia, Mitjançant anticossos, per Citogenètica o per Polimorfismes del DNA.
Caracterització morfològica.
Hi ha diferents tipus de morfologia perquè hi ha diferents tipus de cèl·lules. Per començar,
poden ser cèl·lules en suspensió o cèl·lules adherents, i aquestes poden ser cèl·lules
endotelials, fibroblasts, epitelials, melanòcits, queratinòcits, cèl·lules del múscul llis...
Utilitat de la caracterització cel·lular
Detectar contaminacions
creuades.
Evita hipòtesis inadequades i
resultats enganyosos.
Validar línies per l'obtenció de
vacunes.
Valida vacunes obtingudes.
Identificar canvis en la línia cel·lular.
Detectem inestabilitat gènica.
Identificar el Teixit d'origen i el
llinatge cel·lular.
Permet ubicar en el llinatge.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 30
La caracterització morfològica de les nostres cèl·lules ens permetrà veure canvis
morfològics deguts a la confluència o a la diferenciació. Aquestes característiques són
importants de saber perquè, quan les observem en diferents estadis de l’experiment i les
comparem amb les control, podrem saber si la morfologia ha canviat en funció de l’edat del
cultiu, els factors de maduració o la contaminació per altres organismes.
Caracterització immunològica.
A més de la caracterització morfològica, la qual estudia i anota les característiques que
presenten les cèl·lules a través de la seva visió general, n’hi d’immunològica , la qual aprofita
les característiques dels anticossos. Els anticossos poden ser monoclonals i que reaccionin
davant un sol epítop o poden ser policlonals i que reaccionin davant diferents epítops. Els
epítops són els fragments dels elements de la superfície on es pot adherir l’anticòs i que fan
que aquest s’hi uneixi. De normal, es pot interpretar que una proteïna i un epítop acaben
sent termes sinònims.
Quan es barregen anticossos per fer una caracterització immunològica, es fan servir tots els
que ataquen al mateix invasor o antigen. En aquestes caracteritzacions primer es posen
els anticossos monoclonals, que s’adhereixen a l’epítop i que s’hauran de detectar. Aquesta
detecció es pot fer mitjançant un fluorocrom que portin unit de bon principi o es pot fer afegint
un anticòs secundari policlonal contra l’organisme generador dels primers anticossos
marcat amb fluorescència. Com que els segons ataquen l’organisme del qual han sortit els
primers, és important saber d’on surten els anticossos amb els que treballem en un
experiment de caracterització immunològica.
Quan es realitza una caracterització immunològica es sol fer servir un marcatge amb l’anticòs
secundari perquè és més senzill i econòmic que unir l’anticòs primari amb un fluorocrom.
Això és perquè ja estan comercialitzades una bateria d’anticossos secundaris anti-rabbit de
colors i una bateria anti-mouse. Com que se’n fan servir molts, se’n produeixen molts i es
redueix el preu. Si es volguessin detectar dues proteïnes alhora s’haurien d’evitar
reaccions creuades i, per tant, fer servir diferents organismes generadors d’anticossos.
Els anticossos també es poden marcar amb altres molècules que no siguin
fluorescents, com metalls pesants o un substrat de la peroxidasa. El consum del substrat
per part de la peroxidasa genera un color i un precipitat vermell, indicant on hi ha l’anticòs.
Caracterització citogenètica.
Un altre tipus de caracterització de les cèl·lules és la Caracterització citogenètica.
Consisteix en identificar el cariotip que tenen o haurien de tenir les cèl·lules del cultiu. Si
després de realitzar aquesta caracterització s’identifiquen anomalies morfològiques en els
cromosomes, és molt probable que hi hagi hagut una contaminació.
La preparació dels cromosomes per fer una tinció uniforme requereix de l’addició de
colquicina o viniblastina per bloquejar les cèl·lules en les seves mitosis a l’alçada de les
metafases. Un cop fixades en metafase, cal tripsinitzar les cèl·lules o simplement sacsejar
fora del pot les cèl·lules metafàsiques poc adherides. Les cèl·lules extretes s’haurien de
resuspendre en una solució hipotònica de citrat. Les cèl·lules s’haurien aleshores de fixar
en suspensió amb metanol acètic fred i resuspendre en un fixant fresc.
Després d’una centrifugació i una nova resuspensió, es deixa caure una gota de la mescla en
un portaobjectes i es fixa amb Giemsa.
Un procediment paral·lel a la preparació de cromosomes per tinció uniforme és el Bandeig
cromosòmic o la Hibridació fluorescent in situ (FISH). Aquesta última consisteix en la
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 31
introducció de sondes fluorescents a la mostra en metafase i comprovar si hi ha una
il·luminació corresponent a l’esperada. D’aquestes sondes se’n fabriquen d’un sol gen, de
centròmer, de telòmer, de pintat, de genoma... La Hibridació in situ fluorescent de pintat
permet veure reorganitzacions quan no es fa un cariotip.
Polimorfismes de DNA.
La caracterització de les cèl·lules i les línies cel·lulars per mitjà dels polimorfismes de DNA
consisteix en detectar variacions en el DNA dels cultius en diferents moments, permetent-
nos veure si hi ha variacions esperades o inesperades. Hi ha 2 mètodes de caracterització
per polimorfismes de DNA: RFLP i STR.
Restriction Fragment Length Polymorphisms.
Dins del DNA hi ha regions altament polimòrfiques, és a dir, variables. La RFLP és la
primera tècnica que es va descriure per caracteritzar a nivell molecular les línies cel·lulars i
es basa, precisament, en aquestes regions variables. La tècnica consisteix en determinar
canvis en la longitud de zones d’entre 10 i 20 parells de bases en el genoma d’un individu o
línia cel·lular. Les mides del fragment de restricció, en tant que es veuen alterades pels canvis
en o entre els llocs de reconeixement d’enzims, permeten determinar les variacions entre
línies cel·lulars o en el temps.
Els canvis o mutacions en aquestes regions es poden detectar per Southern blots. Per fer-
ho, s’ha d’extreure tot el DNA i tallar-lo amb uns enzims de restricció determinats. A
continuació s’ha de córrer un gel d’agarosa o poliacrilamida, transferir-lo a una membrana
i hibridar-lo amb una sonda. Gràcies a aquesta hibridació es troba un patró de bandes que
permet comparar genomes.
Short Tandem Repeats.
Les STR són elements de seqüència d’entre 3 i 7 parells de bases que es repeteixen.
Poden ser pentanucleòtids, tetranucleòtids, trinucleòtids o dinucleòtids.
La quantitat de repeticions STR en uns loci pot ser altament variable entre individus, el que fa
que aquests marcadors genètics siguin efectius per la identificació humana o els
processos d’autentificació cel·lulars. Els STRs s’han tornat marcadors de repetició del
DNA perquè son fàcilment amplificables per la reacció en cadena de la polimerasa (PCR)
si es fan servir primers que s’uneixin a les regions circundants de la repetició STR. Es poden
examinar múltiples loci STR simultàniament per crear un perfil de DNA.
Estudis retrospectius de 500 línies cel·lulars humanes revelen que hi ha un mínim de 8
marcadors STR centrals: D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, vWA, TH01, TPOX,
CSF1PO. Per buscar la relació entre diferents línies cel·lulars, es recomana fer-los servir tots
8. Permet identificar de manera única les diferents cèl·lules humanes i fer comparacions de
perfils. A més a més, s’utilitza la amelogenina, que determina si és XX o XY, el que permet
observar i comparar perfils amb prou certesa.
La identificació de contaminacions del nostre cultiu mitjançant les STRs consisteix en quins
fragments nous apareixen que abans no hi fossin. Aquests nous fragments correspondran
a altres línies cel·lulars responsables de la infecció.
Cas exemple.
Creixement normal i diferenciació en una línia cel·lular de queratinòcits humans immortalitzada
espontàniament.
En aquest experiment que ara posarem d’exemple per a comprendre la caracterització
cel·lular, es van aïllar queratinòcits normals del prepuci de nadons humans. Els
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 32
queratinòcits són les cèl·lules de la pell. Els cultius de queratinòcits es van establir tot
plaquejant alíquotes d’una suspensió cel·lular en presència d’una capa d’alimentadors
(feeders).
Les cèl·lules cultivades inicialment, al cap de 15 PDLs, van aparèixer planes i grans, indicant
senescència. Al PDL 16, malgrat tot, va aparèixer una nova població de cèl·lules amb una
morfologia empaquetada i petita. Al PDL 17, aquestes cèl·lules havien reemplaçat
completament tota la població anterior. Les mateixes cèl·lules es van anar subcultivant fins
arribar a un PDL 58 al cap de 372 dies.
Els investigadors postulaven que aquestes cèl·lules eren, tal i com diu el seu títol,
immortalitzades espontàniament. Per corroborar-ho, van realitzar un anàlisi cariogenètic on
van observar un canvi només a la fase 32 amb un iso-cromosoma 8 (s’havien reproduït els
braços llargs dues vegades en comptes de tenir dos llargs i dos curts). També van realitzar
un anàlisi dels polimorfismes de DNA mitjançant 4 loci de STRs en 5 línies cel·lulars diferents.
Les línies dels STR coincidien, indicant que, certament, eren la mateixa línia cel·lular.
Tema 10 - Tècniques especials: sincronització cel·lular.
El cicle cel·lular.
Les cèl·lules humanes que es divideixen de forma ràpida tenen un cicle cel·lular que dura
unes 24 hores. El cicle cel·lular està dividit en dues parts fonamentals: interfase, que ocupa
la majoria del cicle cel·lular, i mitosi, que dura uns 30 minuts. El cicle finalitza amb la divisió
de la cèl·lula. Durant la interfase, el DNA es troba distribuït de manera difusa pel nucli i els
cromosomes no es poden distingir individualment. Poca activitat és visible a través del
microscopi, però hi ha dos tipus de processos importants que estan succeint. Els processos
continus ocorren durant la interfase i són referits col·lectivament com a creixement.
Els processos esglaonats ocorren un cop per cicle. La replicació cromosòmica, per exemple,
està restringida a una part concreta de la interfase anomenada fase S. La fase S ocorre enmig
de la interfase, precedida per un interval anomenat G1 i seguida d’un altre anomenat G2.
Després que cada cromosoma s’hagi replicat, els dos cromosomes fills es mantenen
enganxats l’un amb l’altre en múltiples punts en la seva longitud i ens hi referim com a
cromàtides germanes. En un cicle cel·lular animal típic, G1 dura 12 hores, la fase S en dura
6, G2 en dura 6 més i la mitosi triga uns 30 minuts.
La supervivència de tots els organismes depèn de la transmissió precisa de la
informació genètica d’una cèl·lula a les seves filles. Aquesta transmissió fefaent reflecteix
la precisió de la replicació del DNA i l’assemblatge del fus mitòtic, així com dels mecanismes
que reparen el DNA danyat i que realineen cromosomes que s’han unit incorrectament al fus
mitòtic. Però aquests processos no poden garantir la transmissió de la informació genètica a
no ser que les cèl·lules puguin solucionar el problema de la fi, pel qual alguns processos han
d’haver acabat abans que altres comencin.
Per fer-ho, les cèl·lules han de garantir que no entren en la mitosi fins que la replicació
del DNA s’ha completat i que no comencen l’anafase fins que tots els cromosomes es
troben correctament alineats al fus. De forma similar, les cèl·lules que hagin patit danys en
el DNA durant la G1 haurien d’esperar fins a la seva reparació abans d’entrar a la replicació
del mateix, i les cèl·lules que han patit danys en el DNA durant la fase S o la fase G2 haurien
de reparar-lo abans d’entrar en mitosi.
El progrés del cicle cel·lular es troba regulat en checkpoints o controls que corresponen
a la transició en la maquinària del cicle cel·lular. El pas a cada fase està regulat per ciclines
CDK, responsables de fosforilar proteïnes diana i promoure el transcurs del cicle. Les CDK
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 33
són constants però les ciclines associades a elles varien segons quin pas regulin, ja
que fosforilen diferents proteïnes. El checkpoint del final de G1 controla les condicions
externes: que hi hagi factors de creixement, que la cèl·lula tingui la mida adequada, que no
hi hagi un DNA lesionat (si p53 estigués danyat, obtindríem poliploïdies). Si passa aquest
checkpoint, s'ha de replicar sí o sí. En cas que no repliqui, la cèl·lula es mor. Un altre
control és al final de la G2 i abans de la mitosi, el qual controla que el DNA estigui replicat i
no lesionat, a part de la mida cel·lular. Quan se supera, s'entra en mitosi. L'últim checkpoint
és el de Metafase-Anafase. Aquest punt de control assegura que tots els cromosomes
estiguin ben orientats i units al fus mitòtic.
Per citometria de flux es pot mesurar la quantitat de DNA en cada cèl·lula individual tot
detectant la fluorescència de tints d’unió al DNA. Un cop ha analitzat moltes cèl·lules, el
citòmetre retorna una lectura de la distribució de les cèl·lules amb diferents continguts de DNA
en la població. Les cèl·lules en G2 tenen el doble de DNA que les cèl·lules en G1 i les cèl·lules
en fase S tenen una quantitat intermèdia. L’alçada relativa dels diferents pics en la lectura
indicarà la fracció de la població cel·lular en cadascun del estadis del cicle. Un pic del
citòmetre abans del 100% són cèl·lules en apoptosi. Si hi ha pic de citòmetre més enllà del
200% de contingut de DNA és que hi ha cèl·lules poliploides. Existeixen colorants vitals que
permeten marcar el DNA de la cèl·lula sense matar-les i existeixen els colorants DAPI o el
Iodur de propidi que només funcionen sobre cèl·lules mortes.
En cas que al nostre cultiu hi tinguem cèl·lules polinucleades, els pics es desplaçarien per
indicar una quantitat doble de DNA. Fins i tot es podria arribar a tenir cèl·lules 4n, aconseguint
un perfil més estrany de citometria de flux.
Mètodes físics de separació de cèl·lules.
Fluorescence Activated Cell Sorter.
Un FACS consisteix en un citòmetre de flux que, en funció del valor de la fluorescència que
obtingui sobre el DNA, aprofitarà la càrrega elèctrica que pot provocar per traslladar les
cèl·lules a un col·lector de cèl·lules mitòtiques o a un d’interfàsiques. Depenent de la
precisió que es busqui es pot aconseguir separar les cèl·lules en funció de la fase del cicle
cel·lular en què es trobin.
Mitotic shakeoff.
El Mitotic Shakeoff és una tècnica de separació física que aprofita que les cèl·lules perden
adhesió amb el substrat quan estan en mitosi. El procediment del mitotic shakeoff consisteix
en fer 10 cultius de 75cm2 amb unes 106 cèl·lules en cadascun i incubar-los durant dos dies
en multilayer flasks. Passats els dos dies cal agitar i recuperar el medi amb les cèl·lules
mitòtiques, aproximadament entre un 2 i 5% de les que hi havia al flascó. Aquest medi que
hem recollit s’ha de centrifugar i recollir-ne les cèl·lules per després afegir-hi 5mL de medi
fresc, incubar durant dues hores més i repetir el procés.
La gran quantitat de mostra que requereix aquest procediment és perquè la mitosi té una
durada aproximada de 30 min. Si tenim en compte que el cicle cel·lular en mamífers dura
unes 24 hores, només una quantitat aproximada del 5% de les cèl·lules estaran en fase
M. Arran d’això, necessitarem un nombre considerable de flascons, així com algun treball en
equip per reduir al màxim el temps de processament.
Elutriació per centrifugació
En una elutriació, les cèl·lules carregades a la cambra de separació estan sotmeses a la
força centrífuga generada per la rotació d'un rotor en sentit exterior i a la força de fluid
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 34
bombada a la cambra de separació en sentit interior. En canviar gradualment l'equilibri
d'aquestes dues forces, les cèl·lules se separen segons la mida, la forma i / o la densitat.
A l'elutriador centrífug contraflux microfluídic, s'introdueix al microcanal un flux impulsat
per rotació que conté partícules o cèl·lules. A la cambra de separació, les partícules queden
en posicions específiques on s'equilibren les forces líquides i centrífugues. Finalment, la
recuperació de partícules s'aconsegueix augmentant gradualment la densitat de fluids.
Mètodes químics de separació de cèl·lules.
Els mètodes químics de separació cel·lular consisteixen en bloquejar algun fenomen
del cicle cel·lular. Així i tot, s’ha d’anar amb cura amb fer-los servir, ja que poden ser tòxics.
Bloqueig a G0.
La fase G0 és la més fàcil de sincronitzar. Per aconseguir-ho primer hem de tenir les
cèl·lules creixent en DMEM amb el 10% de FCS, un medi complet. Aleshores prenem les
nostres cèl·lules i les incubem entre 2 i 3 dies a 37ºC i reemplacem el medi per DMEM amb
el 0.5% de FCS. Deixem incubar entre 2 i 3 dies més i rentem amb una solució salina que no
contingui ni Ca2+ ni tampoc Mg2+. Un cop rentat, tripsinitzem. La suspensió cel·lular resultant
ha de ser dispersada amb la pipeta, transferida a un tub de centrífuga, diluïda en un volum
igual de medi de creixement i centrifugada. Finalment, només queda resuspendre les cèl·lules
en un medi complet (10% de FCS) i inocular a una densitat de 106 cèl·lules per placa.
Bloqueig a G1.
Per realitzar un Bloqueig a G1 disposem de 2 compostos químics diferents: la Lovastatina i
la mimosina.
La Lovastatina inhibeix la HMG-CoAreductasa, donant lloc a l'esgotament del mevalonat,
que és un precursor essencial de la síntesi de colesterol i un requisit per a la isoprenilació de
molècules de substrat, incloses les rases p21. La Lovastatina és un inhibidor còmode i ràpid
de les cèl·lules G1 primerenques. La Lovastatina no és eficaç amb tots els tipus cel·lulars, i
en alguns també indueix una aturada parcial de cèl·lules en G2 / M. La Lovastatina és
més cara que alguns altres mètodes.
La mimosina, un aminoàcid derivat de les plantes l'objectiu cel·lular del qual encara no està
clar, bloqueja les cèl·lules sigui en la fase G1 tardana sigui al límit G1 / S. La mimosina és
barata i relativament no tòxica en comparació amb altres inhibidors químics, com ara
l'afidicolina. A diferència d’aquesta, però, la mimosina requereix diverses hores per inhibir
la progressió del cicle cel·lular. Els estudis de seguiment de la progressió del cicle cel·lular
indiquen que la replicació s'inicia d'1 a 2 hores després de l'alliberament del bloqueig induït
per mimosina.
Bloqueig a G1/S.
La sincronització de cèl·lules a la frontera de la fase G1 / S s'aconsegueix generalment
mitjançant la inhibició de la síntesi d'ADN mitjançant inhibidors químics, incloent-hi
hidroxiaurea, excés de timidina o l’afidicolina. El primer destrueix una Tyr essencial de la
ribonucleòtid reductasa, el segon inhibeix el mateix enzim per acumulació de timidina trifosfat
i el tercer inhibeix directament la DNA polimerasa. Independentment de l’agent, calen dues
rondes de bloqueig per induir la sincronia.
Bloqueig a M.
El nocodazol és un agent antineoplàstic que exerceix el seu efecte en les cèl·lules interferint
en la polimerització de microtúbuls. Diversos fàrmacs, inclosa la vincristina i el colcemid, són
similars al nocodazol, ja que també interfereixen amb la polimerització de microtúbuls.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 35
Capítol IV - Biotecnologia en cèl·lules animals i teixits.
Tema 11 - Línies cel·lulars en recerca i producció biotecnològica.
Expression host Systems.
En general, la majoria de les línies de cèl·lules animals secreten proteïnes. Això ens evita
la lisi cel·lular per a l'extracció i el posterior pas de replegament de proteïnes. La glicosilació
de proteïnes és una característica important i té un paper crucial en l'eficàcia, vida mitjana
sèrica i antigenicitat d'un biofàrmac recombinant. Cal tenir en compte, però, que les cèl·lules
de mamífer, de llevat i d’insecte difereixen en els patrons de glicosilació. El cultiu
cel·lular, els paràmetres bioquímics i els processos físics són, també, els responsables
d'aconseguir les glicoformes desitjades d'una proteïna terapèutica recombinant.
Cèl·lules de mamífer.
Les línies cel·lulars de mamífers no humanes també produeixen PTMs que s'expressen en
humans. A saber, la galactosa-α1,3-galactosa (α-gal) i l’àcid N-glicolilneuraminic (NGNA).
Com que els humans posseeixen anticossos circulants contra tots dos N-glicans, les línies de
cèl·lules no humanes se solen analitzar durant la seva producció per identificar clons amb un
perfil glicà acceptable. Per PTMs entenem la glicosilació, la formació de ponts disulfur, la
fosforilació o el processament proteolític.
Les cèl·lules de mamífer produeixen un bon plegament i secreció proteiques apart de l’alta
qualitat de les mateixes. Així i tot, tenen una baixa ràtio de creixement, un alt cost total, un alt
temps de producció, una difícil propagació i un alt risc de contaminació.
Línies cel·lulars de ratolí.
Les línies cel·lulars de ratolí que es fan servir són les Línies de Mieloma (NS0 i Sp2/0).
Aquestes cèl·lules són derivades de cèl·lules tumorigèniques (mieloma) productores
d’Immunoglobulines. ·Ja no produeixen les originals però que contenen la maquinària per
produir-les i secretar-les. Les cèl·lules NS0 han estat utilitzades en processos de fusió per
produir cèl·lules d’hibridoma que produeixen anticossos monoclonals. NS0 s’ha convertit en
una important cèl·lula hoste per a la producció de proteïnes recombinants, especialment en
combinació amb el sistema de selecció GS (Glutamine synthetase). Sp2/0-Ag14 cell line es
troba adaptada a créixer en medi químicament definit animal i sèrum-free.
Línies cel·lulars de hàmster.
Les cèl·lules CHO, cèl·lules d’ovari de hàmster xinès, són les cèl·lules més utilitzades (70%
proteïnes recombinants aprovades). Creixen tant adherides com en suspensió. Poden créixer
sense sèrum i en medis químicament definits. Tenen una baixa susceptibilitat a la infecció
vírica, són molt tolerants a canvis de pH, pressió, nivell d’oxigen i de temperatura. Hi ha
soques CHO deficients per la dihidrofolat reductasa (dhfr), útils per a la co-transfecció amb
un gen diana. Les FUT8-/-CHO cells, es fan servir per la producció de fucosylated anti-HER2
antibody.
Hi ha estudis que afirmen que una deficiència de fucosa de la cadena de carbohidrats
connectada a Asn297 a la regió Fc IgG1 humana podria millorar l'afinitat amb el receptor
FcγRIII sobre cèl·lules naturals assassines (NK) i millorar la bioactivitat de la citotoxicitat
cel·lular depenent dels anticossos (ADCC).
Línies cel·lulars de mico.
Les línies cel·lulars mico que més es fan servir són les cèl·lules Vero, les quals deriven de
ronyó normal de la mona verda africana. Tenen una morfologia de fibroblasts i un creixement
depenent d’ancoratge. S’adapta bé a sistemes de creixement amb perfusió contínua, i permet
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 36
obtenir elevades densitats. Hi ha variants adaptades al creixement sense sèrum. S’ha utilitzat
massivament en la producció de vacunes virals.
Línies cel·lulars humanes.
Existeixen vàries línies cel·lulars humanes que es poden cultivar i que es fan servir.
La WI-38 és una línia derivada de teixit pulmonar embrionari humà. Amb una morfologia de
fibroblast, són cèl·lules dependents d’ancoratge i que formen multicapes quan creixen durant
períodes llargs. Com que tenen un ampli ventall de susceptibilitat a virus, és una línia
cel·lular utilitzada en la producció de vacunes.
La MRC-5 és una línia cel·lular derivada de teixit pulmonar fetal humà normal. També té una
morfologia de Fibroblast, com la WI-38. A diferència d’ella, és destacable que duplica més
ràpidament i que és més resistent. Es duplica entre 60 i 80 vegades abans d’arribar a la
senescència, mantenint-se estables. En producció s’utilitzen PD28-30.
La línia cel·lular HEK293 (Human embryonic kidney) i els seus derivats creixen en suspensió
en absència de sèrum. Aquesta línia cel·lular es fa servir per produir anticossos recombinants,
proteïnes de fusió d’anticossos i proteïnes importants com ara receptors acoblats a proteïnes
G, canals iònics regulats per lligand o canals iònics sensibles a la tensió. Es va utilitzar per
produir Drotrecogin-α, i molècules anti-thrombotic, antiinflammatory, i profibrinolytic que
necessiten unes PTM que les CHO no poden fer. Les cèl·lules HEK293 són unes cèl·lules
fàcilment transfectables i de les que es poden produir virus lentivirus en la seva “soca”
HEK29T.
La línia cel·lular humana HeLa va ser la primera línia cel·lular humana establerta (1951).
Deriva d’un adenocarcinoma de cèrvix uterina humà. Amb una morfologia similar a les
cèl·lules epitelials, les cèl·lules HeLa són susceptibles al virus de la poliomielitis tipus 1 i a
l’adenovirus tipus 3. S’han utilitzat per la producció de proteïnes recombinants no
terapèutiques com la metallothioneina1 de ratolí, superòxid dismutasaCu/Zn humana i de
l'antigen de superfície de la hepatitis B. La seva amplia utilització ha portat a que hagi
contaminat moltes altres línies cel·lulars.
Cases comercials.
Existeixen vàries cases comercials que vénen línies cel·lulars, com ATCC, DSMZ, ECACC o
ICLC. Les empreses de venta de línies cel·lulars poden ser del tipus “Certified Cell Lines” si
les cèl·lules que vénen es troben caracteritzades i certificades que no tenen micoplasma,
bacteris, fongs, protozous i virus citopàtics; o poden ser del tipus “Cell Repository Lines”, on
les cèl·lules compleixen els requisits mínims de caracterització i on es certifica que no hi ha
contaminació microbiana.
Les CCL caracteritzen el creixement de les cèl·lules per fotografies i el cariotip. L’espècie
d'origen de la línia també s’ha testat per anàlisi immunològics i isoenzimàtics. En les CRL,
s’ha verificat l’espècie d’origen i la viabilitat desprès de la congelació.
Tema 12 - Escalat de cultius cel·lulars
Biotecnologia vermella.
La biotecnologia vermella és aquella dedicada a la salut. En aquesta, es poden
aconseguir productes a partir de les cèl·lules, cèl·lules com a producte o es pot intentar
substituir les proves en animals. És sol buscar obtenir glicoproteïnes i vacunes a partir de
cèl·lules; cèl·lules en suspensió per teràpies, teixits funcionals per transplantar i organoides
extracorporis com a producte i es mira de validar els agents i les seves dosis fora dels
animals.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 37
Consideracions per l’escalat.
Quan volem fer un escalat d’un cultiu cel·lular hem de tenir en compte varis factors: la
quantitat de producte que es necessita, el tipus de cultiu cel·lular que serà, quina serà la
limitació d’oxigen i de gasos, quines limitacions de nutrients hi haurà, com eliminarem els
metabòlits tòxics i quines forces hidrodinàmiques estaran presentes en tot moment. També
és important saber que no sempre podrem fer servir un bioreactor de tanc agitat, sinó
que probablement haurem de fer servir Flascons T-175 o sistemes de cultius multitray.
Sistemes d’immobilització de cèl·lules.
Moltes cèl·lules les farem servir més per aconseguir productes cel·lulars que no pas per
obtenir-les a elles mateixes. En aquests casos és necessari mantenir les cèl·lules dins de
la nostra zona de cultiu per poder anar recollint el producte sense perdre el
biocatalitzador. Hi ha diverses opcions per aconseguir-ho. Les cèl·lules es poden trobar
unides a una superfície de forma natural o artificial, poden estar atrapades en una matriu
porosa o poden estar contingudes darrere una barrera. Hi ha un altre procediment que es pot
fer servir: l’autoagregació mitjançant la gota penjant o l’agitació constant, el que també ens
permetrà immobilitzar-les.
Els microcarriers s'utilitzen regularment per cultivar poblacions de cèl·lules adherents en
la producció comercial a gran escala de productes biològics i vacunes. El desenvolupament
dels microcarriers va començar el 1967, quan van Wezel va comprovar que aquests podien
donar suport al creixement de cèl·lules dependents d'ancoratge.
Els microcarriers solen ser esferes de 125 a 250 micròmetres de diàmetre i la seva densitat
permet mantenir-les en suspensió amb agitació suau. Es poden fabricar amb diversos
materials, incloent-hi DEAE-dextran, vidre, plàstic de poliestirè, acrilamida, col·lagen i alginat.
Aquests materials, juntament amb diferents components químics de superfície, poden influir
en el comportament cel·lular, inclosa la morfologia i la proliferació. Els components
químics de superfície poden incloure proteïnes de matriu extracel·lular, proteïnes
recombinants, pèptids i molècules de càrrega positiva o negativa.
El cultiu de cèl·lules en microcarriers se sol realitzar en matrassos de rotatoris, tot i que
altres contingents com ara bioreactors de microgravetat de paret giratòria o bioreactors de llit
fluïditzat també poden donar suport a cultius basats en microcarriers. Els avantatges de la
tecnologia de microcarriers en la indústria de les vacunes inclouen la facilitat d'escalat, la
capacitat de controlar amb precisió les condicions de creixement cel·lular en bioreactors
sofisticats i controlats per ordinador, una reducció global de l'espai i del volum dels
bioreactors necessaris per a una operació de fabricació i una reducció dràstica de la mà
d'obra.
Amb la immobilització cel·lular s’han aconseguit crear les Hollow Fibers, una classe de
membranes artificials que contenen una barrera semipermeable en forma de fibra buida.
Originalment desenvolupada a la dècada de 1960 per a aplicacions d'osmosi inversa, des de
llavors les membranes de fibra buida han prevalgut en el tractament de l'aigua, el cultiu
cel·lular, la medicina i l'enginyeria de teixits. La majoria de les membranes de fibra buida
comercials es troben envasades en cartutxos que es poden utilitzar per a una varietat de
separacions gasoses i líquides3.
Producció de productes cel·lulars.
La producció de productes cel·lulars permet produir proteïnes recombinants. En aquest cas,
el que es fa és cultivar les cèl·lules en hidrogel, un material que es pot polimeritzar de tal
3 Extret de la Viquipèdia tot els microcàrriers i les Hollow fibers. S’hauria de canviar si pots.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 38
manera que situa a les cèl·lules en una estructura on no hi ha estrès hidrodinàmic causat pel
moviment. Sense les tensions hidrodinàmiques, les cèl·lules de mamífers podrien
créixer a alta densitat amb alta productivitat.
Entre els diversos productes cel·lulars que ens pot interessar obtenir hi trobem les vacunes.
Aquestes es solen generar amb virus lentivirus que es poden aconseguir, per exemple, fent
servir un bioreactor de llit empacat en el que hi tenim cèl·lules que infectem amb el virus en
qüestió.
Producció de cèl·lules.
Les cèl·lules que més ens pot interessar cultivar són les cèl·lules mare embrionàries.
Aquestes són cèl·lules totipotents i, de situar-ser en un punt on hi ha hagut una lesió tissular,
podrien diferenciar-se per completar aquell mateix teixit on es troben. Són, per tant, una
esperança en el desenvolupament de la medicina regenerativa.
Una altra possible funció de l’obtenció de cèl·lules seria el seu ús en la immunoteràpia.
Aquesta es sol fer amb limfòcits T adults. Per aconseguir-les, el primer que s’ha de fer és
separar els glòbuls blancs, incloent-hi les cèl·lules T, de la resta de la sang. La bossa de
cèl·lules resultant es transporta a una empresa perquè les reprogramin. En les teràpies CAR-
T aprovades, un vector víric transmet a les cèl·lules T un gen que codifica per un receptor
d’antigen quimèric anomenat CAR. Les cèl·lules transgèniques, ara conegudes com
cèl·lules CAR-T, es multipliquen en un bioreactor.
El pacient rep quimioteràpia per rebaixar la quantitat de glòbuls blancs que tenen disponibles
a la sang, deixant espai per les noves cèl·lules CAR-T. Finalment, les cèl·lules CAR-T
s’introdueixen a la sang del pacient, on proliferen i detecten i destrueixen cèl·lules canceroses.
Les cèl·lules produïdes també es poden fer servir per generar nous teixits. En un
experiment, per exemple, es va valorar la Viabilitat d'utilitzar aorta descel·lularitzada de porcs
fetals (DAFPs) per construir empelts vasculars de gran diàmetre enginyats amb teixits i provar
el rendiment i l'aplicació de DAFPs com a bastides enginyades per teixits vasculars al sistema
arterial caní.
En aquest estudi, es va utilitzar un sistema de bioreactor vascular dissenyat a mida i
produït per a sembres dinàmiques. Aquest sistema de bioreactor vascular pot simular
l'ambient mecànic vascular intern, afavorir l'adhesió i la proliferació de Cèl·lules Endotelials
(EC) i evitar que les EC sembrades es rentin després del trasplantament al sistema arterial.
Els resultats del present estudi van demostrar que la sembra dinàmica va fer que les EC
s'adherissin estrictament als DAFPs.
Els empelts vasculars de petit diàmetre dissenyats amb teixits amb una capa EC intacta es
poden construir amb èxit mitjançant DAFPs. Es poden trasplantar aquests vasos sanguinis
engendrats per teixits per substituir l'artèria caròtida comuna canina. A més, els empelts
s'assemblen estructuralment i funcionalment a l'artèria normal després de remodelar in vivo
en animals. Per tant, els DAFPs poden tenir un potencial d'ús en la construcció d'empelts
vasculars de petit diàmetre dissenyats per enginyeria de teixits.
Una altre aplicació és la generació d’organoides extracorporis. Un organoide és una versió
miniaturitzada i simplificada d'un òrgan produït in vitro en tres dimensions que mostra una
microanatomia realista. Es deriven d'una o poques cèl·lules d'un teixit, cèl·lules mare
embrionàries o cèl·lules mare pluripotents induïdes, que poden autoorganitzar-se en un cultiu
tridimensional a causa de les seves capacitats d'autorenovació i diferenciació.
Cultius Cel·lulars 2020
CEBIO 39
La formació d'organoides requereix el cultiu de cèl·lules mare o progenitores en un medi 3D.
El medi 3D es pot fer mitjançant una matriu extracel·lular hidrogel Matrigel o Cultrex BME,
que és una matriu extracel·lular rica en laminines segregada per la línia de tumor Engelbreth-
Holm-Swarm. Els cossos organoides es poden fer mitjançant incrustacions de cèl·lules
mare en un medi 3D. Quan s'utilitzen cèl·lules mare pluripotents per a la creació
d’organoides, es sol deixar que les cèl·lules formin cossos embrionaris. Aquests cossos són
tractats farmacològicament amb factors de patró per impulsar la formació de la identitat
organoide desitjada. Els organoides també s'han creat utilitzant cèl·lules mare adultes
extretes de l'òrgan objectiu i cultivades en medis 3D4.
Substitució de proves en organismes.
Els organoides derivats del pacient també representen un recurs important per
desenvolupar règims de tractament personalitzats. L'amplificació in vitro d'organoides de
pacients procedents de biòpsies del lloc de la malaltia pot aportar material suficient per a la
seqüenciació profunda que reveli mutacions causals o per a un perfil fenotípic en profunditat
que faciliti els règims de tractament més adaptats.
La capacitat de fer créixer organoides saludables i malalts de pacients humans permet, a
més, pantalles clíniques per a combinacions de medicaments que dirigeixen selectivament el
teixit malalt, ajudant a identificar tractaments més efectius amb efectes secundaris
mínims. Molts efectes secundaris dels medicaments contra el càncer es poden atribuir a la
toxicitat aguda del fetge. Per tant, es podria preveure l'ús d'organoides hepàtics per predir la
toxicitat hepàtica de les combinacions experimentals de medicaments abans de començar
assajos clínics.
Altres aplicacions clíniques inclouen l'ús d'organoides de la malaltia per predir l'adquisició
de resistència als fàrmacs i per desenvolupar fàrmacs que s'orientin efectivament a les
cèl·lules mare potencialment canceroses. A més, en combinació amb la microscòpia 4D, es
poden fer un seguiment del temps amb els organoides per avaluar el comportament i la
viabilitat de les cèl·lules canceroses en resposta a un tractament.
Una estratègia per millorar la taxa d'èxit de nous fàrmacs contra el càncer en transició a la
fase clínica seria alinear els models cel·lulars utilitzats en el seu descobriment
primerenc amb models animals preclínics i tumors de pacients. Per als tumors sòlids,
això requeriria el desenvolupament i la implementació de models tridimensionals (3D) de
tumors in vitro que recollissin amb més precisió l'arquitectura i la biologia del tumor sòlid
humà. Destaquem dos mètodes que produeixen esferoides tumorals multicel·lulars 3D de
mida uniforme i controlada compatibles amb la investigació sobre fàrmacs contra el càncer i
el cribratge d'inhibició de creixement de gran rendiment (HTS): esferoides tumorals formats
en microplaques d'adhesió ultra baixa o en matrius de micropous d'hidrogel de polietilè glicol
dimetacrilat.
4 Això també ha sortit de la Viquipèdia.
Top Related