CULTIVO Y
APLICACIONES
DE LAS ALGAS
Biotecnología de los
microorganismos eucariotas
2013
Dra. Silvina M. Rosa
ALGAS
Organismos normalmente acuáticos, autótrofos con fotosíntesis
oxigénica (con algunas excepciones) generalmente más pequeños
y estructuralmente más simples que las plantas terrestres
Algas no son un grupo
monofilético
- no hay características que
definan el conj. completo
-no se puede asignar un
nombre formal
Pero algas incluye grupos
monofiléticos
Secuencia del 18S rDNA
provee evidencias de la
existencia de 8 o 9 grupos de
clados (divisiones) de algas
Filogenia molecular se
corresponde con las
relaciones establecidas por
las características celulares y
bioquímicas
DIVISIÓN OCHROPHYTA
Clase Bacillariophyceae
(diatomeas)
Clase
Phaeophyceae
(algas pardas)
DIVISIÓN
EUGLENOPHYTA
DIVISIÓN DINOPHYTA
MACROALGAS: APLICACIONES
Abonos y fertilizantes
(Chondrus)
Medicina tradicional y
actual (Gigartina)
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Ficocoloides
Compuestos coloidales producidos por macroalgas
Función estructural (componentes de la pared celular) en
las algas
Polisacáridos hidrofílicos (propiedades gelificantes,
emulsionantes y estabilizantes)
Mercado mundial: producción de 100.000 tn/año
equivalentes a 1 billón de dólares anuales (Kraan 2012)
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Carragenanos
Polímero de unidades de
galactosa sulfatada
Fuertemente aniónico Chondrus
Algas rojas
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Carragenanos
Aplicaciones
Helados, leche, comidas instantáneas,
dulces; panadería; cosméticos; pastas
dentales (80% de producción mundial
utilizado por la industria alimenticia)
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Agar
Polímero de agarobiosa,
un disacárido compuesto
de D-galactosa y 3,6-
anhidro-L-galactosa
No iónico
Algas rojas
Gracillaria
Aplicaciones
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Agar
Microbiología
Conservas de carne y pescado
Dulces (“gomitas”)
Espesante de mermeladas y jaleas
(80% de producción mundial
utilizado por la industria
alimenticia)
Farmacología (cubierta de pastillas
y emulsionante de laxantes)
Industria textil
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Alginatos
Polímero de ácido manurónico
y ácido gulurónico
Aniónico
Algas pardas
Laminaria
MACROALGAS: APLICACIONES
Producción industrial de ficocoloides
Alginatos
Aplicaciones
En industria textil, papelera y colorantes,
estabilizantes de pintura
Medicina: emulsionante y
excipiente de fármacos
Odontología: obtención de
impresiones de los dientes
Perfumería: cremas para el
cuerpo, shampoo
Alimentación (30%
de producción
mundial:
Producción de
frutas artificiales y
comidas
semiartificiales
Espesante de
helados, sopas y
aderezos
MICROALGAS: APLICACIONES
Biomasa para
alimentación
Productos químicos de
alto valor agregado
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Recipientes-Bolsas de polietileno (20 l)
Estanques en serie/ Fotobiorreactores (150 a 1000 l)
Estanques (5, 10, 50 T) Canales de alta velocidad Fotobiorreactores
Cultivos al
interior
Cultivos al
exterior
Escalas de cultivo
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Cultivos al interior
Iluminación: lámparas 40 W
Temperatura: 20-25 ºC
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Aireación: funciones
Homogeneización de nutrientes
Movimiento hacia superficie
Aporte de CO2
FOTOBIORREACTORES
Ventajas
Ocupan espacio reducido
Reducen las pérdidas por evaporación (sistema cerrado)
Mantienen condiciones axènicas
Optimizan el proceso de cosecha y reutilizan el medio
de cultivo
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
FOTOBIORREACTORES
Fotobioreactor
tubular
Ventajas:
-Mejor control de
la transferencia de
gases
- Mayor relación
superficie volumen
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
FOTOBIORREACTORES
Columna Anular
Tredici, Universidad de Florencia (Italia)
Dos cilindros (40 y 50 cm de diámetro) de
2 m de alto; capacidad 120 l
Mayor productividad total por área que
fotobiorreactores horizontales
Ubicación de las unidades tiene fuerte
incidencia en la productividad
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Cultivos al exterior
Utilización de luz solar Condiciones no controladas
(variaciones en iluminación, temperatura, etc.)
Canales de alta velocidad
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Cultivos al exterior
Canales de alta velocidad
Cultivo abierto:
económico y
fácil operación
Para
sustancias de
bajo valor
agregado
Agitación y
aireación:
motobombas
o paletas
Adición
de CO2
(control de
pH)
MICROALGAS: APLICACIONES
CULTIVO MASIVO DE MICROALGAS
Cultivos al exterior : Fotobiorreactores
Ventajas:
Esterilización del sistema
Mejor control de la transferencia de
gases
Iluminación efectiva
Mayor relación volumen: superficie
Productividad elevada
MICROALGAS: APLICACIONES
Producción de biomasa con fines de
alimentación animal y humana
Suplemento alimentario (fuente de proteína)
(Spirulina, Chrorella, Scenedesmus)
Acuicultura (Dunaliella)
Altos costos (10-300 є/kg) y mercado reducido (10-50 kTn/año)
(Fernández et al. 2012)
Obtención de moléculas de importancia económica
MICROALGAS: APLICACIONES
Ficobiliproteínas
Clasificadas según su espectro de
absorción: ficocianina,
aloficocianina y ficoeritrina. Se
ensamblan formando ficobilisomas.
Función: almacenar energía
lumínica.
Aplicaciones: Marcadores fluorescente
Colorantes naturales (ficocianina)
Obtención de moléculas de importancia económica
MICROALGAS: APLICACIONES
Carotenoides
Pigmentos liposolubles: Amarillo,
naranja o rojo. 2 tipos:
Carotenos: sin oxígeno (b-caroteno)
Xantofilas: con oxígeno
(fucoxantina)
Función: Pigmentos accesorios
colectores y fotoprotectores
b- caroteno: Aplicaciones: Antioxidante lipídico
Colorante natural
Acuicultura (pigmentación peces y crustáceos)
Purificación de aguas
residuales (Chrorella,
Scenedesmus)
Acondicionadores del suelo
(Nostoc)
MICROALGAS: APLICACIONES
Biodiesel
Transesterificación de
un triglicérido con un
alcohol, utilizando
hidróxido de sodio
como catalizador.
MICROALGAS: APLICACIONES
Las algas presentan
mayores rendimientos de
aceite por hectárea que las
plantas
Biodiesel
MICROALGAS: APLICACIONES
Sin embargo la producción de
biodiesel a partir de microalgas
es económicamente prohibitiva
(valor aceptable: 0,01-0,50 є/kg) Cepas con alto contenido de aceite
Estrategias:
- Acoplar la producción de
biodiesel al tratamiento de
efluentes (Lundquist et al.
2010)
- Mejoramiento genético y
metabólico de cepas
- Diseño de nuevos
sistemas de cultivo
Ácidos grasos con cadenas de más de 18 C y dos o más dobles enlaces
clasificación
omega 3 (3 o n-3)
primer doble enlace en la posición 3
desde extremo metilo
omega 6 (6 o n-6)
primer doble enlace en la posición 6
desde extremo metilo
18: 3 (9,12, 15) ác. -linolénico
20: 5 (5,8,11,14,17) ác. eicosapentaenoico
22: 6 (4,7, 10, 13, 16, 19) docosahexaenoico
18: 2 (9,11) ác. linoleico
18:3 (6,9 11) ác.g linoleico
20: 4 (5,8,11,14) ác. araquidónico
22:5 (4,7,10,13,16) ác. docosapentaenoico
ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS (PUFAs)
►Efectos benéficos de los PUFAs sobre la salud humana
MERCADO DE LOS PUFAS
Son componentes esenciales de membranas celulares
Controlan la expresión de ciertos genes
Son precursores de prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos
Reducción de riesgo de enfermedades cardiovasculares
Efectos positivos en hipertensión, artritis, arteriosclorosis y trombosis
Esencial para el desarrollo de cerebro y retina en niños
Demanda mundial de PUFAS (especialmente DHA) aumenta rápidamente
Las principales consultoras nutricionales y de la salud
recomiendan la utilización de DHA y ARA como
suplemento dietario, incluso en fórmulas infantiles
►Aplicaciones en acuicultura
Table 1: Milestone advisories related to use of DHA, EPA and ARA as dietary supplements (Ward, O. P. & Singh, A., 2005)
FAO and WHO recommend that infant formula should mimic breast milk 1975
Menhaden oil has Generally Recognized as Safe (GRAS) status from US FDA
as a source of PUFAs for use in certain adult foods 1987
European Society of Pediatric Gastroenterology recommends that infant formula,
both pre-term and term, should include ARA and DHA 1991
The British Nutrition Foundation recommends that infant formula, both pre-term
and term, should include ARA and DHA 1992
A joint expert committee of FAO and WHO recommends that infant formula,
both pre-term and term, should include ARA and DHA 1993
A successful regulatory review was completed in by the Ministry of Health in
Holland which allowed infant formula makers to use specific commercial
supplements of DHA and ARA in infant formulae 1995
An independent panel of experts in the US concluded that specific ARA and DHA
supplements could be considered as GRAS for use in pre-term and term infant
formulas by adults 1995
An independent panel of experts in the US concluded that a specific DHA oil could be
considered as GRAS for use by adults, including pregnant and nursing women 1996
A meeting sponsored by the NIH and the International Society for the Study of Fatty
Acids and Lipids in Washington DC recommended that infant formula be supplemented
with DHA and ARA 1999
A Child Health Foundation panel recommended in Acta Paediatrica that infant formula
contain both DHA and ARA 2001
The Canadian Government’s Health Canada completed a favourable review of a submission
supporting use of DHASCO and ARASCO oils in infant formulas in Canada
* Las principales consultoras nutricionales y de la salud recomiendan la utilización
de DHA, EPA y ARA como suplemento dietario, incluso en fórmulas infantiles.
* FDA (Food and Drug Administration, USA) ha conferido el estatus de GRAS
(Generally Regarded as Safe) a numerosos productos que contiene PUFAs
VÍA METABÓLICA DE SÍNTESIS DE PUFAs
Vía biosintética de ácidos grasos
en la mayoría de los
microorganismos oleaginosos es
la misma que en las especies no
oleaginosas
Desarrollo de SCO requiere el entendimiento de las vías de síntesis y
acumulación de ácidos grasos.
1) Síntesis de ácidos grasos de 16C
o 18C mediante el complejo FAS
(Fatty acid synthasa)
2) Secuencia de desaturasas y
elongasas
En Thraustochytriales, la síntesis
de PUFAs parece seguir otra vía
(PKS, poliketide synthasa)
VÍA METABÓLICA DE SÍNTESIS DE PUFAs
Hombre
Acidos grasos omega 3 y 6 no son
interconvertibles una vez ingeridos
La dieta primaria consiste en 18:2n-6
principalmente y 18:2n-3
Los precursores de 18 C pueden ser
elongados y desaturados a otros miembros
de sus familias: 22:4n-6 y 22:6n-3
Microorganismos oleaginosos
Habilidad para proveer contínuamente
acetil-CoA directamente en el citosol
Habilidad para proveer suficiente NADPH
(1 mol de 18-C requiere 16 moles de
NADPH)
FUENTES DE PUFAs
Fuente tradicional: pescado problemas: variaciones en la calidad,
contaminación, olor y gusto desagradable, compleja purificación
Fuente alternativa: Microorganismos
Microorganismos oleaginosos marinos (algas, hongos “inferiores” y bacterias)
serían los principales productores de PUFAs 3 en la cadena alimentaria marina
FUENTES MICROBIANAS DE PUFAs (Single Cell Oil – SCO)
* Producción de aceites con
mayor % de PUFAs, en gral, de
un tipo en particular y no una
mezcla.
* Mayor estabilidad oxidativa
(almacenamiento)
* Producción a partir de
materiales sustentables
* Nuevas posibilidades:
desarrollo de nuevos sistemas de
producción
* Producción bajo condiciones
controladas (fermentación)
Mercado para SCO
Table 7: Partial list of companies reported to be researching,
developing, manufacturing or marketing SCO PUFAs or
PUFA-containing products (Ward, O. P. & Singh, A., 2005)
Aventis S.A.
BASF A.G.
Friesland Brands A.G.
Gist-brocades
Heinz-Wattie’s
Hoffmann-LaRoche A.G.
Jamieson
Laboratorios Ordesa
Maarbarot
Martek Inc.
Mead Johnson Nutritionals
Nagase and Co.
Nestle S.A.
Novartis
Nutricia
Nutrinova Celanese A.G.
Pronova
Ross Products (Div of Abbott)
Suntory Ltd.
Walmart
Wyeth
Ventajas
Costo elevado ( no competitivo) Actualmente
involucra a varias empresas, dedicadas a
productos de alto valor agregado
Su desarrollo requiere la selección de microorganismos apropiados y la
optimización de las técnicas de cultivo
A) Algas
Isochrysis galbana
(Haptophyta)
Cultivos masivos fototróficos
presentan muchas desventajas:
*lagunas abiertas (dependencia
del clima, contaminación, auto
somberado, alto costo de
cosecha)
*fotobiorreactores (altos
costos)
PRODUCCIÓN DE DHA UTILIZANDO MICROORGANISMOS MARINOS
Crypthecodinium
cohnii
Thraustochytrium
Schizochytrium
B) Algas heterotróficas
(Dinoflagelado)
C) Thraustochytriales
DCW dry cell weight, S Shake-flask cultivation, B bioreactor
*** Glucosa 9% o Glicerol 12%, CSL, biorreactor 3l por 5 dias.
Strain
De
vic
e
Carbon
source
Cell concentration
(g DCW l–1)
DHA
concentration
(g l–1)
DHA productivity
(mg l–1 h–1) Reference
C. cohnii B Glucose 27.7 1.4 19 de Swaaf et al.
(1999)
C. cohnii B Acetic
acid 109.0 19.0 48
de Swaaf et al.
(2003a)
C. cohnii B Ethanol 83.0 11.7 53 de Swaaf et al.
(2003b)
Thraustochytrium
strain G13 B Glucose 14.0 1.6 38
Bowles et al.
(1999)
Schizochytrium sp. S Glucose 13.3 2.8 53 Fan et al.
(2001)
Schizochytrium sp.
SR21 S Glucose 36.0 4.2 35
Yokochi et al.
(1998)
Schizochytrium sp.
SR21*** B Glucose 48.1 13.3 138
Yaguchi et al.
(1997)
Capacidad de algunas cepas de Thraustochytriales (Schizochytrium) para
producir altos niveles de biomasa en cultivo, con una alta proporción de
lípidos/biomasa y de PUFAs/lípidos → aplicación actual en el mercado SCO
Productividades de DHA utilizando microorganismos marinos (Extraído de Sijtsma
L. & Swaaf, M. E., 2004. Appl Microbiol Biotechnol 64: 146-153)
Diseño de un bioproceso para la optimizacion de la producción por
fermentación de DHA utilizado la cepa A. limacinum SR21
Cepa modelo Aurantiochytrium limacinum SR21
Condiciones de cultivo para acumulación de PUFAs
Fuente de C (Glucosa, Glicerol), Fuente de N y vitaminas (CSL,
YE), Sal de mar, Agitación, Temperatura (25 -28 ºC)
0
5
10
15
20
25
10:1 50:1 100:1 150:1
Relación C:N del medio
Pro
teín
as (
g
) y
(g
)
ll
-1-1
Líp
ido
s
1) Optimización de la
producción de biomasa
2) Optimización de la
acumulación de ácidos
grasos, a partir del
material obtenido en la
primera.
Bioproceso en dos etapas
Determinación de las condiciones óptimas de crecimiento
aplicando metodologías estadísticas (DOEs, ANNs y GA)
Ensayo Nivel del factor * Peso
seco Glucosa
(X1)
pH
(X2)
CSL
(X3)
SW
(X4)
1 +1 9,0 +1 7,0 1 1,1 1 0,35 6,30
2 +1 9,0 +1 7,0 +1 11,0 1 3,50 38,36
3 1 2,0 +1 7,0 1 1,1 1 0,35 5,34
4 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 21,66
5 1 2,0 +1 7,0 +1 11,0 1 0,35 6,40
6 +1 9,0 +1 7,0 +1 11,0 +1 3,50 38,56
7 1 2,0 1 4,5 +1 11,0 +1 3,50 9,20
8 +1 9,0 1 4,5 +1 11,0 1 0,35 32,40
9 +1 9,0 1 4.5 1 1,1 1 0,35 5,16
10 1 2,0 +1 7,0 +1 11,0 +1 3,50 8,28
11 1 2,0 1 4,5 1 1,1 1 0,35 5,04
12 1 2,0 1 4,5 1 1,1 +1 3,50 4,14
13 +1 9,0 1 4,5 +1 11,0 +1 3,50 32,28
14 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 20,70
15 +1 9,0 1 4,5 1 1,1 +1 3,50 8,94
16 1 2,0 1 4,5 +1 11,0 1 0,35 6,12
17 1 2,0 +1 7,0 1 1,1 +1 3,50 4,18
18 0 5,5 0 5,7 0 6,0 0 1,92 21,44
19 +1 9,0 +1 7,0 1 1,1 +1 3,50 9,10
1) Diseños de selección:
Estudiar en forma numérica
los factores del medio de
cultivo que tienen influencia
sobre el crecimiento para
descartar los menos
significativos
Diseño Factorial Fraccional
Diseño Plackett-Burman
2) Diseños de optimización
Diseños Estadísticos
Experimentales (DOEs)
FFr1
Diseños Estadísticos Experimentales (DOEs)
Análisis estadístico 1) Diseños de selección:
Término Coeficiente de
Regresión
Valor de P
Intercepto 14,926 0,00255 **
Glucosa 7,650 0,02149 *
pH 0,827 0,66518
CSL 7,712 0,02102 *
SW 0,597 0,75266
Glucosa: pH 0,865 0,65151
Glucosa: CSL 6,300 0,03572 *
pH: CSL 0,622 0,74287
Glucosa: SW 0,235 0,90057
pH: SW -0,132 0,94378
CSL: SW 0,032 0,98619
* P<0,05; ** P<0,005; R2: 0,9472
Parámetro estimativo:
pendiente de la recta
que conecta la media de
la respuesta de los 2
extremos (el valor
absoluto indica el
impacto)
FFr1
Variables del medio de
fermentación no significativas
para la producción de biomasa:
pH, SW, YE y KH2PO4
Variables residuales: fuentes
carbonada y nitrogenada (Glucosa
y CSL), tamaño del inóculo,
interacción entre Glucosa y CSL
Resultados de 2 FFr y 3 PB
Agrupamiento de datos de los distintos experimentos: verificación de la
validez combinando el algoritmo de K-medias y el análisis de varianza
Análisis de datos para el proceso de optimización
El conjunto de datos experimentales se dividió en dos subconjuntos, uno de
entrenamiento y otro de validación. Se ajustaron dos regresiones (una lineal y
otra cuadrática) y un modelo de Redes Neuronales Artificiales con el primer
subconjunto y a partir de ellos se realizaron predicciones sobre el segundo
Se utilizó un Algoritmo Genético (GA) acoplado a
la ANN entrenada para encontrar la combinación de
los componentes críticos del medio que rindieran un
máximo valor de biomasa
Suma media de los
cuadrados de los
errores (mse)
5.8 modelo lineal
4.2 modelo cuadrático
2.6 ANN
log (tamaño del inoculo)
5,2 5,4 5,6 5,8 6,0
80
85
90
95
100
Glu
cosa
(g
)l
-1Gráfico de contorno producido a partir de 336
predicciones. El círculo blanco muestra el punto
máximo de biomasa determinado por el GA, y el
círculo negro representa el punto operativo elegido
Predicción: 8% (m/v) glucosa, 12% (v/v) CSL y
inóculo de 4 x 10 5 cells ml1 para obtener 38g l-1
de biomasa seca
Validación
Perfil de crecimiento de A. limacinum SR21 en
Medio Optimizado de Crecimiento (MOC)
m máx = 0,12 h -1
T duplicación = 6 h
Entrada en fase
estacionaria = 40 h
Glucosa (), amonio (NH4) (), biomasa () y lipidos ()
32 69 108 168
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
100
120
140
Glu
cose
(gl-1
),D
CW
(gl-1
)and
Lipi
ds(g
l-1)
Time (h)
NH
4(m
gl-1
)
Tiempo (h)
Am
on
io (
mg
)l
-1
Bio
mas
a (
g
), L
ípid
os
y G
luc
osa
(g
)
l-1
l-1
(g
)l
-1
Bio
ma
sa
, lí
pid
os
y g
luc
osa
(g
l-1
)
Am
on
io (
mg
l-1
)
El valor de biomasa obtenido (40,3 g de peso celular seco l-1) empleando las
condiciones optimizadas coincidió con el predicho por el modelo
Optimización de la producción de DHA (segunda etapa) a partir
de cultivos propagados en medio de crecimiento (primera etapa)
Relación C:N Edad del
inóculo (d)
Peso seco (g l-1
) Lípidos (g l-1
) DHA(g l-1
)
10:1 2,0 5,20 ± 0,01 1,10 ± 0,42 0,14 ± 0,01
10:1 5,0 9,65 ± 0,49 0,75 ± 0,21 0,29 ± 0,03
55:1 3,5 45,8 ± 0,85 29,25 ± 2,47 7,00 ± 0,50
100:1 2,0 42,05 ± 0,92 29,40 ± 0,71 5,00 ± 0,50
100:1 5,0 44,05 ± 1,20 28,50 ± 0,75 6,50 ± 0,50
Efecto de la edad del inóculo y de la relación molar C:N del medio de
producción sobre la producción de biomasa (peso seco), lípidos y DHA
Tratamiento anterior a la
transferencia a MP
Centrifugación Lavados
Peso seco
(g l-1
)
Lípidos
(g l-1
)
DHA
(g l-1
)
Transferencia completa (100%)
Si Si 43,70 ± 0,28 26,60 ± 0,71 9,50 ± 1,00
Si No 44,95
± 0,78
26,90
± 0,42
9,75 ± 1,00
Transferencia parcial (10%)
No No 37,80 ± 0,01 25,65 ± 0,07 7,75 ± 1,00
Efecto del tratamiento y del tamaño del cultivo en MOC antes de la
transferencia a MP sobre la producción de biomasa (peso seco), lípidos y DHA
Reproducción de las condiciones óptimas en un fermentador
Perfil de crecimiento de A. limacinum SR21 en un
biorreactor de 3.5 l con Medio de Producción (MP)
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
60
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
DC
W(g
l-1)
and
Lip
ids
(gl-1
)
Time (h)
Glu
cose
(gl-1
)
Tiempo (h)
Bio
masa
(g
)
y L
ípid
os
l-1
(g
)l
-1
Glu
co
sa
(g
)l
-1
Bio
ma
sa
y l
ípid
os
(g
l-1
)
Glu
co
sa
(g
l-1
)
Glucosa (), biomasa (), lipidos () y DHA (x).
Bioproceso optimizado:
Primera etapa: 8% (m/v)
glucosa, 12% (v/v) CSL
y inóculo de 4 x 105 cel
ml-1, 3,5 días
Segunda etapa: tamaño
de inóculo de 10% (v/v)
obtenido en la primera
etapa optimizada y
relación molar C:N del
medio de producción de
55:1 (10% m/v glucosa,
acetato de amonio)
Productividad de DHA de 3,7 g l-1 d-1
Top Related