PCR Múltiple en infecciones gastrointestinales:
Diagnóstico microbiológico del síndrome diarreico agudo,
experiencia en la Universidad Católica
Dra. Paulette Legarraga
Departamento de Laboratorios Clínicos
Escuela de Medicina
Pontificia Universidad Católica de Chile
Temario
• Definiciones• Diagnóstico microbiológico tradicional• Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple
• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA • Cultivos tradicionales
LO QUE SE SABE
LO QUE HEMOS APRENDIDO
• ¿Cuál es el rol patógenico de ciertos microorgnismos?• ¿Costo-efectividad?
LO QUE AUN NO SE SABE…
Consideraciones del síndrome diarreico
• 1,7 billones de casos de diarrea reportadas al año
• Segunda causa de muerte en <5 años en el mundo
• 2,2 millones de muertes/año
Definición ≥ 3 deposiciones líquidas al día
Clasificación según duración
Aguda ≤14 días
Persistente >14 y <30 días
Crónica >30 días
Clasificación según etiología
Infecciosa Bacterias, Virus, parásitos
No infecciosa Intolerancia alimentaria, reacciones medicamentosas, síndrome de intestino irritable, Enfermedades inflamatorias intestinales
IDSA, American College of Gastroenterology
Consideraciones del Sindrome diarreico
Diagnóstico microbiológico “tradicional”
Bacteriológico: • Hektoen (Salmonella, Shigella) • Mc Conkey Sorbitol (E. coli O157)• TCBS (Vibrio spp)• Cultivo de Campylobacter• CNI Yersinia• AS Plesiomonas shigelloides• (PCR)
Parasitológico: • Observación microscópica• Inmunoensayos• (PCR)
Virus: • Inmunoensayos/Detección antígenos• (PCR)
Diagnóstico microbiológico tradicional
Alto costoBajo
rendimiento(2 a 5% ámbito ambulatorio )
Consenso Síndrome diarreico agudo: recomendaciones para el diagnóstico microbiológico. Rev. Chil. Infectol, 2002; 19(2)
(Coprocultivo)
Rol de los NAAT en el diagnóstico de diarrea
Infectious Diseases Society of America (IDSA). 2013. A guide to utilization of the microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases. Clin Infect
Dis;57(4):e22-e121
Rol de los NAAT en el diagnóstico de diarrea
Infectious Diseases Society of America (IDSA). 2013. A guide to utilization of the microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases. Clin Infect
Dis;57(4):e22-e121
Gray et al. Epidemiol Infect. (2014)
FilmArray® GI (Biofire)
xTAG ®GPP(Luminex)
Verigene® EP(Nanosphere)
N° Patógenosdetectados
Bacterias 13 8 7
Virus 5 3 2
Parásitos 4 3 -
TOTAL 22 14 9
Tiempo procesamiento1 muestra en 80
min24 muestras en 5
horas1 muestra en 2
horas
Equipo
TecnologíaPCR anidado+
curva de meltingPCR+ detección por hibridación perlas
PCR+ hibridación nanopartículas
SistemaCerrado/
automatizadoAbierto/ semi-automatizado
Cerrado/automatizado
Paneles moleculares disponibles(Aprobados FDA)
Otros paneles disponibles no aprobados por FDA: Seeplex® Diarrhea ACE detection; EntericBio Panel ®, RIDA®GENE GI, otros
Plataformas
Temario
• Definiciones• Diagnóstico microbiológico tradicional• Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple
• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA • Cultivos tradicionales
LO QUE SE SABE
LO QUE HEMOS APRENDIDO
• ¿Cuál es el rol patógenico de E.coli?¿C. difficile?• ¿Costo-efectividad?
LO QUE AUN NO SE SABE…
Algunas preguntas…
1. ¿Es necesario tener un examen tan amplio?
2. ¿Son la infecciones gastrointestinales mono opolimicrobiana microbianas?
3. ¿Cuáles son los principales agentes etiológicos del SDAen diarrea aguda en adultos ambulatorios?
4. ¿Cuál es la sensibilidad de los cultivos tradicionales?
5. ¿Cambia conductas?
6. ¿costo?
Nuestra experiencia
• Estudio prospectivo desde diciembre 2014 hasta Octubre 2015
• Descripción etiológica del síndrome diarreico agudo bacteriano en adultos ambulatorios que consultan al servicio de urgencia mediante un PCR múltiple
IDSA Guidelines for the management of infectious diarrhea. Clin Infect Dis 2001; 32: 331-351
Diarrea aguda: 3 o más deposiciones líquidas por día, > 24 horas y < 14 días de duración
Caracterización etiológica del síndrome diarreico agudo en adultos en un hospital universitario mediante un PCR múltiple
Materiales y métodos
Paciente
FilmArray panel GI procesado antes de 48
horas
Coprocultivo + Tinción de Hucker
1 muestra PAF (guardada)
Patógenos estudiados
Nuestro estudio
Salmonella/ShigellaAgar Hecktoen
CampylobacterTinción de Hucker
VibrioAgar TCBS
A. coprocultivo
B. Estudio según resultado de FilmArray
PARÁSITOS Observación microscópica y tinción de Zielh-Neelsen
Clostridium difficile o cultivo negativo
PCR específico ( C. difficile, Salmonella, Campylobacter, Shigella, verotoxina 1 y 2)
BACTERIASBúsqueda en coprocultivo o medio especial (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia, Vibrio, Plesiomonas)
Resultados
1. Positividad de las muestras por PCR múltiple2. Co-infecciones3. Agentes etiológicos: bacterianos (mención de algunos
especiales), virales y parasitarios4. Resultados de los métodos convencionales (sensibilidad)5. Conducta clínica
Resultados FilmArray
174 muestras procesadas
111 muestras positivas(65,3%)
60 muestras negativas(34,3%)
3 Inhibidas(1,7%)
Resultados
174 muestras procesadas
111 muestras positivaspor FilmArray (65,3%)
19 de 22 patógenos
No se detectaron V. cholerae, Cyclospora cayetanesis ni Entamoebahistolytica
Resultados
174 muestras procesadas
111 muestras positivaspor FilmArray (65,3%)
19 de 22 patógenos
No se detectaron V. cholerae, Cyclospora cayetanesis ni Entamoebahistolytica
83 (74,7%) Bacterias
Resultados
174 muestras procesadas
111 muestras positivaspor FilmArray (65,3%)
19 de 22 patógenos
No se detectaron V. cholerae, Cyclospora cayetanesis ni Entamoebahistolytica
83 (74,7%) Bacterias
27 (24,3%) Virus
Resultados
174 muestras procesadas
111 muestras positivaspor FilmArray (65,3%)
19 de 22 patógenos
No se detectaron V. cholerae, Cyclospora cayetanesis ni Entamoebahistolytica
83 (74,7%) Bacterias
27 (24,3%) Virus
14 (12,6%) Parásitos
Distribución co-infecciones
3
1
8
83 (74,7%)BACTERIAS
71
14 (12,6%)PARASITOS
10
27 (24,3%)VIRUS
18
¡¡Parece que se nos contaminó!!
• El 37% de la muestras (41/111) presenta dos o más microorganismos
63
21,6
10,8
1,8 1,8 0,90
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6
Porcentaje de infecciones según número de microorganismos
37%
Co-infecciones
Agentes etiológicos
45,0%
24,3%
20,7%
9,9%
9,0%
9,0%
2,7%1,8% 0,9% 0,9%
E.coli
Virus
Campylobacter
Cryptosporidium
Salmonella
C. difficile
Giardia
Plesiomonas
Vibrio
Yersinia
IDSA Guidelines for the management of infectious diarrhea. Clin Infect Dis 2001; 32: 331-351
Agentes etiológicos
Distribución E. coli
45,0%
24,3%
20,7%
9,9%
9,0%
9,0%
2,7%1,8% 0,9% 0,9%
E.coli
Virus
Campylobacter
Cryptosporidium
Salmonella
C. difficile
Giardia
Plesiomonas
Vibrio
Yersinia
35,6%
31,5%
15,1%
11%
6,8%
EPEC
EAEC
ETEC
EC shiga toxina
EI/Shigella
45%
• 73 E. coli en 50 pacientes• Sólo 11 de ellas como patógeno único
E. coli shiga-toxina positivo
• 8 muestras positivas
• 2 positivas para E. coli O157
• Ambos pacientes hospitalizados
en ambos se suspende la terapia antibiótica
1 de ellos con anemia y hematuria leve
Agentes etiológicos
Agentes etiológicosClostridium difficile
• 10 muestras positivas para C. difficile
• Se obtuvo muestra para confirmación en 6 de ellas
• Resultados GenXpert: – 4 positivas
– 1 negativa
– 1 rechazada por muestra formada
• ¿Falsos positivos?
• ¿Son clínicamente relevantes?– 50% requiere hospitalización (4/5 como patógeno único)
– 70% fue el único patógeno encontrado
Agentes etiológicos
Distribución VIRUS
45,0%
24,3%
20,7%
9,9%
9,0%
9,0%
2,7%1,8% 0,9% 0,9%
E.coli
Virus
Campylobacter
Cryptosporidium
Salmonella
C. difficile
Giardia
Plesiomonas
Vibrio
Yersinia
24,1%
24,1%24,1%
20,7%
6,9% Sapovirus
Rotavirus
Norovirus
Astrovirus
Adenovirus
24,3%
Parásitos
14 (12,6%) Parásitos
11 Cryptosporidium
3 Giardias
En 11 de los 14 casos el parásito fue el único microorganismo aisladoSensibilidad de la microscopía: 64,3%Muestra única!!!
90,9% (10/11)
33,3% (1/3)
Filmarray Microscopía
Rendimiento del coprocultivo174 muestras procesadas
111 muestras (+)por FilmArray (63,2%)
9 coprocultivos (+)→ 6,3% (9/111)
Bajo rendimiento general del coprocultivo
Resultados FilmArray
Resultados Coprocultivo
Sensibilidad cultivos tradicionales
83 (74,7%) Bacterias
17 (+) para Shigella/
Salmonella/Vibrio
53 % coprocultivos (+)
23 (+) Campylobacter
61% cultivo Campylobacter (+)
70% Cultivo
Salmonella
100% Cultivo Vibrio
No detectamos Plesiomonas
No detectamos Yersinia
2 Plesiomonas 1 Yersinia
Comparado con cultivo no se observaron falsos negativos en FilmArray
Algunas preguntas…
1. ¿Es necesario tener un examen tan amplio?
2. ¿Son la infecciones gastrointestinales mono opolimicrobiana microbianas?
3. ¿Cuáles son los principales agentes etiológicos del SDAen diarrea aguda en adultos ambulatorios?
4. ¿Cuál es la sensibilidad de los cultivos tradicionales?
5. ¿Cambia conductas?
6. ¿Alto costo?
¿Cambio en la conducta clínica?
• Ambos pacientes con E. coli O157 fueron hospitalizados (previo a conocer el resultado) y en ambos casos se suspendió tratamiento al conocer los resultados
• Todos los pacientes de esta serie recibieron tratamiento para C. difficile
• Un paciente con FilmArray repetidamente negativo → colonoscopía → cáncer
Costo
• Costo mayor que el de un coprocultivo solo
• ¿Es mayor el costo que un estudio completo?
Impresión global
• Fácil y rápido
• Resultados en 2 horas
• Mejor sensibilidad que los métodos tradicionales y buena especificidad
Entrega más información de la que el clínico pide!!!
Temario
• Definiciones• Diagnóstico microbiológico tradicional• Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple
• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA • Cultivos tradicionales
LO QUE SE SABE
LO QUE HEMOS APRENDIDO
• ¿Tiene algún significado clínico las infecciones polimicrobianas?• ¿Cuál es el rol patógenico de E.coli?¿C. difficile?• ¿Costo-efectividad?
LO QUE AUN NO SE SABE…
Aprendimos algo de nuestra experiencia
pero aún queda mucho por responder…
1. Porcentaje importante de infecciones múltiples• ¿Requieren tratamiento? ¿Son más graves?
2. Cómo interpretar los resultados positivos para C. difficile? Virus? Para E. coli? ¿Cuál es el rol de las E.coli?• Se estima una colonización en paciente asintomático por C. difficile
entre 7 a 15%
• Virus pueden ser eliminados por varias semanas post infección (hasta 8 semanas para Norovirus)
• Portación asintomática en población pediátrica de hasta un 78%
3. Tiene mayor costo pero ¿Es costo-efectivo?
Enserink R, et al. (2014) High Detection Rates of Enteropathogens in Asymptomatic Children Attending Day Care. PLoS ONE 9(2)
Gracias
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