vii
EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS
ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA
SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN
UNA SOPA COMERCIAL.
JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Cartagena, España.
2008
viii
EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS
ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA
SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN
UNA SOPA COMERCIAL
JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Cartagena, España.
2008
ix
NOTA DE ADVERTENCIA
―La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia‖.
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
x
xi
EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS
ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA
SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN
UNA SOPA COMERCIAL
JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO
APROBADO
__________________ _______________________ Dra. Ingrid Schuler Phd Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc,
Bióloga Bacterióloga
Decana Académica Directora de carrera
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Cartagena, España.
2008
xii
Después de 5 años de dura lucha por fin alcanzo la cima de esta metar. Es uno de los
momentos cumbre anhelado por muchos y hoy soy yo el que vive ese momento, pero esto
no hubiera sido posible sin la presencia de muchas personas (algunas aun hoy presentes,
otras se perdieron y otras fueron llamadas ante el gran jefe), no sé si estaría mal decir que
-―Soy una obra viviente, a la cual muchos contribuyen a darle forma y color, a partir de
pinceladas de sentimientos bellos y cinceladas de palabras de justicia y verdad”- pero es
la única forma de definir lo que quiero expresar. Debido a lo anterior dedico este trabajo
a:
Dios el arquitecto de todo, sin el nada de esto podría ser.
Mi mamita donde quiera estés, ya hemos logrado la segunda gran meta, te extraño y sé
que no estás muy lejos de mi porque estas en mí y a mi lado, protegiéndome y
apoyándome.
Mi padre, gordo gracias por tu amor y tu apoyo, en el momento más crítico de nuestras
vidas asumiste el rol de papa y mamá y como todo lo que haces no te quedo grande, se
cuantos sacrificios has hecho por nosotros se cuantas preocupaciones pasaste y solo por
sacarnos adelante, como te dije delante de más de 50 personas mis metas, sueños, anhelos
y logros son también tuyos este es mi regalo al mejor padre del mundo.
Mi hermano, mijo se que aunque no andamos muy juntos, el sentimiento de amor es muy
grande y siempre estamos como una sombra detrás del otro para protegernos y cuidarnos,
sin usted, aunque no lo crea, esto no se hubiera hecho real, gracias.
Mi abuelita, mi tío y la familia Huertas la mejor familia del mundo, su apoyo
incondicional para con nosotros tres es una bendición, ustedes son más que tíos y primos
padres madres y hermanos, Gustavito y Raulito 5 años y medio después el trato ha sido
cumplido y ese trato más que con ustedes fue conmigo.
Edna, una gran mujer, sin tu presencia en mi camino creo que nada de esto sería lo que es,
pero más que todo te agradezco que AMES A MI PADRE Y LO HAGAS FELIZ creo
que eso es lo que más ánimo me da pues la felicidad de él es la mía y todo es gracias a ti.
Debo agradecer tu apoyo, tus consejos y el ánimo que me das en cada paso para seguir
adelante creo que sin eso no hubiera podido poner esta bandera. Gracias por considerarme
un hijo más estando siempre pendiente de mí, haciéndolo de corazón y no de obligación.
También agradezco a tu familia unas personas que me quieren y los quiero unos amigos y
compañeros geniales una familia que nos adopto en su seno a mi padre y a mí.
Dorita, sin ti este gran sueño hubiera sido un poco imposible, tu eres un ángel que
apareció en mi camino en el momento adecuado sin tu presencia tal vez nada de esto sería
real.
Familia Forero Vargas, mi segunda familia, una familia que ha estado para mí y conmigo
en todo momento, una familia que me tomo como un hijo más creo que solo puedo decir
que los amo mucho.
Mis amigos los cuales no necesito plasmar sus nombres, pues ellos saben quiénes son,
algunos desde el colegio y otros desde la universidad gente que plasmaron su huella, y de
los cuales tuve y tengo el privilegio y el honor de decir son mis amigos y aun mas porque
desde la distancia me lo muestran.
Marta poco tiempo pero tu ayuda y tu apoyo en un mundo desconocido para mí fue y es
muy importante.
Ilusa esto es también gracias a ti, se que la vida pareciera injusta, pero todo posee un
motivo.
xiii
Agradecimientos
Al Dr. Pablo Fernández, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio,
con su grupo de investigación e iniciar una nueva etapa en mi vida. Por confiar en
mí y por toda la ayuda brindada tanto profesional como personal.
A la Dra. Janeth, por decirme donde buscar el pony y darme la oportunidad de
venir a buscarlo. Una persona que desde que la conocí no fue una profesora fue
una amiga, por siempre tener una palabra para iluminar cualquier camino.
A Leymaya, tanto que agradecerle, su apoyo cognoscitivo en el proyecto fue
importante pero su amistad fue esencial, por estar conmigo en todo momento y en
toda situación, por brindarme la mano cuando el mundo quería venirse encima,
por siempre estar ahí para escucharme y darme animo Pieza fundamental en este
proyecto y en mi nueva vida.
Al Dr. Alfredo Palop, por tener su despacho abierto a las miles de dudas que
surgieron durante el proyecto, su ayuda fue de gran valor para comprender
muchas cosas.
A May, Vera, Mª Dolores, Marina y Raquel, sin lugar a dudas el mejor grupo de
laboratorio que existe, ¿que hubiera sido de mi sin su amistad, sin el cotilleo?,
creo que hubiera sido imposible soportar tanto trabajo. Por siempre tener algún
tema para amenizar el día, y bueno por tender la mano ante los miles de
problemas y dudas que surgieron.
A Fermín, (dios mío para el un agradecimiento aparte) por soportar y arreglar
cada cosa que sin querer se dañaba o se averiaba (insisto Fermín yo no fui), por
enseñarme que en la vida toca ser y saber de todo un poco (microbiólogo,
ingeniero, electricista, etc.) e igual que los demás gracias por su amistad.
A todos aquellos que en algún momento trabajaron conmigo en el laboratorio, por
su compañía y amistad, personas que dejaron huella en mi: João, Clementina,
Lola, José, Navarrete, Cifre, Lola y Loli, Sergio, Salva, Caro, Justine, y muchos
más que tal vez se me pasaran pero nunca se les olvidará.
Juan D parce fundamental tu amistad, bacano tener un parcerazo como tú, bacan
gracias.
Alicia & Grillo, 2 grandes amigos, espero su amistad perdure en el tiempo pues
personas con sus cualidades no existen muchas. Gracias por estar en todo
momento un abrazo tios.
A mis amigos de GPR, por brindarme su amistad, un chiste en el pasillo y estar
pendientes de cómo iba todo.
Al personal docente de la PUJ, Martha, María M, Ana K, y todos aquellos que
ayudaron en mi formación.
A la UPCT por brindarme las instalaciones, equipos y medios para la realización
de este proyecto.
xiv
RESUMEN
Los consumidores de hoy en día están exigiendo alimentos mínimamente
procesados sin aditivos químicos y que no sean expuestos a tratamientos agresivos
como las altas temperaturas, los cuales pueden modificar sus características
nutricionales y organolépticas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el
efecto de los aceites A.E. provenientes de las plantas de clavo y tomillo en
combinación con tratamientos térmicos, para el control de uno de los principales
patógenos de interés en la industria alimentaria como lo es L.monocytogenes. Para
poder determinar el efecto de este tratamiento se aplicaron tratamientos
isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC solos y en combinación con los A.E. a
dos concentraciones sobre la cepa L.monocytogenes CETC 4032. Después de cada
tratamiento se recuperó el microorganismo en un medio no selectivo y en uno
selectivo, obteniéndose que al exponer el microorganismo luego de los
tratamientos en un medio de recuperación con un factor de inhibición, se observa
una mayor reducción en la población. A nivel de los aceites esenciales se obtuvo
que el aceite de tomillo inhibió por completo la población inicial del
microorganismo a una concentración de 0.01% desde el tiempo 0 del tratamiento.
Para el aceite esencial de clavo se obtuvo una reducción in vitro de 4-log de 3,29
min en un medio de recuperación no selectivo y de 2,5 en un medio selectivo a
una concentración de 0,01%. Al aplicar el tratamiento anterior con una
concentración de 0,05% del A.E. en una crema de calabacín se obtuvo una
reducción decimal de 3-log en 1 min. Los resultados obtenidos en la investigación
nos permiten concluir que los A.E. evaluados presentan gran eficacia en la
disminución de la población de L.monocytogenes CETC 4032 siendo más efectivo
el aceite esencial de tomillo que el de clavo.
xv
Tabla de Contenido
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 22
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 24
2.1 Generalidades .............................................................................................. 24
2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ................................ 24
2.2 Listeria monocytogenes .............................................................................. 25
2.2.1 Historia ................................................................................................. 25
2.2.2 Morfología ........................................................................................... 25
2.2.3 Factores de crecimiento........................................................................ 26
2.2.4 Clasificación ............................................................................................... 26
2.2.5 Reservorio ............................................................................................ 28
2.2.6 Alimentos ................................................................................................. 28
2.2.6.1 Leche y productos lácteos ................................................................. 30
2.2.6.2 Carne y productos carnicos ............................................................... 31
2.2.6.3 Otros Alimentos ................................................................................ 32
2.2.7 Métodos de detección ............................................................................... 33
2.2.7.1 Métodos de aislamiento .................................................................... 35
2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas .................................................... 36
2.2.8 Virulencia ................................................................................................. 37
2.2.8.1 Entrada a las células del hospedero ................................................... 39
2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. ................................. 39
2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático ................................................. 40
2.2.8.4 Diseminación célula-célula ............................................................... 40
2.2.9 Listeriosis ................................................................................................. 41
2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) ............................................................. 41
2.2.9.2 Invasivo ............................................................................................. 42
2.2.9.3 Tratamiento ....................................................................................... 42
2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos ……43
2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) ............................ 43
2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z ........................................................... 43
2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) .......................................... 44
2.3.2.2 Valor Z .............................................................................................. 45
2.3.3 Termorresistómetro .................................................................................. 46
2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los microorganismos
....................................................................................................................... 47
xvi
2.4 Antimicrobianos naturales ............................................................................... 49
2.4.1 Aceites esenciales..................................................................................... 50
2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales ............................... 50
2.4.1.2 Eugenol (clavo) ..................................................................................... 52
2.4.1.3 Carvacrol y Timol (Tomillo) ............................................................. 54
2.5 Modelo y distribución Weibull ........................................................................ 58
2.6 Factor de exactitud (Af) .................................................................................. 62
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 64
4. OBJETIVOS ................................................................................................... 66
5. HIPOTESIS .................................................................................................... 67
5.1 Predicciones ................................................................................................ 67
6. MATERIALES Y METODOS .......................................................................... 68
6.1 Materiales .................................................................................................... 68
6.1.1 Microorganismo ................................................................................... 68
6.1.2 Medios de cultivo ................................................................................. 68
6.1.3 Aceites esenciales................................................................................. 69
6.1.4 Equipos ................................................................................................. 69
6.1.5 Materiales ............................................................................................. 69
6.2 Metodología ................................................................................................ 70
6.2.1 Activación del microorganismo ........................................................... 70
6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro .................... 70
6.2.2 Recuento inicial .................................................................................... 70
6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC .................... 71
6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC ............... 72
6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites
esenciales de tomillo y clavo......................................................................... 75
6.2.6 Tratamientos sobre el alimento ............................................................ 77
6.3 Análisis Estadístico de los datos ................................................................. 78
7 Resultados y Discusión ...................................................................................... 78
7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC ..................................................... 79
7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC ........................................ 84
7.1.2.1 Predicciones ...................................................................................... 89
7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. ....... 99
7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite
esencial de tomillo....................................................................................... 100
xvii
7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite
esencial de clavo ......................................................................................... 101
7.3 Tratamientos sobre el alimento ................................................................. 107
7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC. .............................................. 108
8. Conclusiones ................................................................................................. 118
9. Recomendaciones .......................................................................................... 119
10. Bibliografia ................................................................................................. 120
xviii
INDICE DE TABLAS
TABLA 1. TIEMPO DE MUESTREO EN LOS TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS POR
TEMPERATURA ................................................................................................................. 71
TABLA 2. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A
55ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72
TABLA 3. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A
60ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72
TABLA 4. PERFIL DE TEMPERATURAS PARA LOS TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. RANGO
DE TEMPERATURAS Y VELOCIDADES POR PERFIL. ............................................................. 73
TABLA 5. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A
SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74
TABLA 6.TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A
SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74
TABLA 7 TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 75
TABLA 8. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.05%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ................... 75
TABLA 9. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO
DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. .......................... 76
TABLA 10. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO
DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. .............. 76
TABLA 11. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 76
TABLA 12. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE
MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ................... 77
TABLA 13. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. TOMILLO 0.01% Y 0.05%,
TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ........................................ 77
TABLA 14. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC. ................................................................................. 80
TABLA 15. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC. ................................................................................. 82
TABLA 16. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS. ................................ 83
TABLA 17. . VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC. ............................................................................ 86
TABLA 18. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC. ............................................................................ 89
TABLA 19. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. ........................... 89
TABLA 20. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO
ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y
PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO
DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN EL MEDIO BHIA. ................................................. 91
TABLA 21. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO
ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y
xix
PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO
DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 92
TABLA 22. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO
ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y
PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO
DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA. ...................................................... 93
TABLA 23. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO
ISOTÉRMICO HASTA 60ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y
PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO
DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 94
TABLA 24. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE
ESENCIAL DE CLAVO. ...................................................................................................... 102
TABLA 25. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN
TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE
ESENCIAL DE CLAVO ....................................................................................................... 104
TABLA 26. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 108
TABLA 27. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE
CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN
TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 109
TABLA 28. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS EN CREMA DE
CALABACÍN. ................................................................................................................... 109
TABLA 29. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE
CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON UNA
CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO. ......................................... 114
TABLA 30. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS
CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE
CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON UNA
CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO ......................................... 115
xx
INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. HABITAT DE L.MONOCYTOGENES Y VIAS DE CONTAMINACIÓN ................................ 28
FIGURA 2. RESUMEN MODIFICADO DE TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES DE
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN PARA LISTERIA SPP. Y LISTERIA
MONOCYTOGENES EN MUESTRAS AMBIENTALES Y DE ALIMENTOS. .................................... 34
FIGURA 3. SISTEMA METODOLÓGICO PARA LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE LISTERIA
SPP. MODIFICADO ............................................................................................................ 37
FIGURA 4. REPRESENTACIÓN ESQUÉMATICA DE LA BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN
INTRACELULAR POR L.MONOCYTOGENES .......................................................................... 38
FIGURA 5. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR
LISTERIA SPP. .................................................................................................................... 41
FIGURA 6. GRÁFICA DE SUPERVIVENCIA .................................................................................. 44
FIGURA 7. GRAFICA DE VALOR D. ............................................................................................ 45
FIGURA 8. GRAFICA DE TERMO RESISTENCIA Y VALOR Z. ........................................................ 46
FIGURA 9. LOCALIZACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE A.E
SOBRE LA CÉLULA BACTERIANA. ...................................................................................... 51
FIGURA 10. EUGENOL .............................................................................................................. 53
FIGURA 11. ESQUEMA SUGERIDO DE ACCIÓN SUGERIDO PARA EL CARVACROL SOBRE LA
MEMBRANA CITOPLASMÁTICA .......................................................................................... 55
FIGURA 12. TIMOL ................................................................................................................... 56
FIGURA 13. CARVACROL .......................................................................................................... 56
FIGURA 14. EJEMPLO MODIFICADO DE CONCAVIDADES. .......................................................... 61
FIGURA 15. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (55ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL ...................... 79
FIGURA 16. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (60ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ..................... 81
FIGURA 17. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO
ISOTÉRMICAS (N.I) A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 85
FIGURA 18. COMPORTAMIENTO DE LA POBLACIÓN DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032
DURANTE EL PERFIL N.I A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL...... 85
FIGURA 19. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO
ISOTÉRMICAS (N.I) A 60ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 88
FIGURA 20. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN
CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA. ............................................. 92
FIGURA 21. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN
CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ................................. 93
FIGURA 22. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE
UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA. ....................................... 94
FIGURA 23. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE
UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ........................... 95
FIGURA 24. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO
BHIA, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL MODELO
DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE
TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. .............................................................................................. 97
FIGURA 25. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO
BHIA+NACL, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL
xxi
MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE
TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. .............................................................................................. 98
FIGURA 26. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO
EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN
DE WEIBULL. .................................................................................................................. 102
FIGURA 27. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO
EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA
DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 103
FIGURA 28. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO
EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN
DE WEIBULL ................................................................................................................... 104
FIGURA 29. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO
EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA
DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 105
FIGURA 30. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (55ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO
SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 108
FIGURA 31. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES
ISOTÉRMICAS (60ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO
SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 109
FIGURA 32. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE
L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 55ºC. .............. 111
FIGURA 33. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE
L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 60ºC. .............. 111
FIGURA 34. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR
DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 113
FIGURA 35. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE
LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 113
FIGURA 36. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 60ºC CON 0,05% DE
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR
DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 114
FIGURA 37. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A
UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 60ºC CON 0,05% DE
ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE
LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 115
22
1. INTRODUCCIÓN
Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del
microscopio por parte de Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), la visión del
mundo tal y como se conocía en ese tiempo cambió drásticamente, las teorías que
formularon investigadores como el filósofo romano Lucrecio (circa 98-55 a.C.) y
el médico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sobre la presencia de ―criaturas vivas
invisibles‖ causantes de enfermedades fueron confirmadas.
Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido y
afectado por los microorganismos. Beneficiado porque aprovecha las cualidades
(metabólicas, genéticas, etc.) de algunos de estos para la elaboración de alimentos
(pan, queso, cerveza, etc.), elaboración de medicamentos (antibióticos, vitaminas,
vacunas, etc.) y en la actualidad como agentes recuperadores de ambientes y
ecosistemas contaminados por la actividad industrial del hombre en una rama de
la microbiología llamada biorremediación. Pero como se dijo anteriormente,
también se ha visto afectado a nivel salubre debido a las enfermedades que estos
provocan y que han generado grandes acontecimientos históricos como la peste
negra en 1347. Con el descubrimiento del microscopio y la creación de la
microbiología, el ser humano se ha preocupado por mejorar los niveles de la salud
desde diferentes puntos, algunos de ellos como la industria farmacéutica, la
industria alimentaria y la medicina entre otros.
Una de las ramas de la microbiología encaminada a asegurar la salud del hombre
y de los animales es la microbiología de alimentos, esta rama es la encargada de
verificar que los alimentos producidos por el sector agroalimentario, sean seguros,
confiables e inocuos para la salud previniendo la generación de brotes
epidemiológicos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), como por
ejemplo: el cólera, la listeriosis, la salmonelosis, entre otras.
Para esto la industria utiliza conservantes químicos como nitritos, benzoato sódico
y meta bisulfito sódico los cuales han demostrado gran eficacia en el control
23
microbiológico de los alimentos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado
que estos compuestos ó sustancias derivadas de estos son peligrosos para la salud,
como por ejemplo las nitrosaminas, compuesto cancerígeno proveniente de la
transformación de los nitritos.
Por otro lado, en la última década, los consumidores reclaman alimentos naturales
mínimamente procesados, es decir, que mantengan sus características
organolépticas y nutricionales intactas, pero que a su vez sean inocuos con un
mayor tiempo de frescura sin la adición de compuestos químicos ó aplicación de
técnicas agresivas, como la exposición a altas temperaturas.
En este sentido, los investigadores han explorado varias alternativas, como la
combinación de tratamientos, por ejemplo: temperaturas moderadas con pH, aw,
entre otros; y lo más reciente es el uso de componentes antimicrobianos naturales
los cuales han sido usados durante décadas para la conservación y sazonamiento.
24
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades
2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs)
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son uno de los mayores
problemas de la salud mundial, pueden causar una enfermedad pasajera o pueden
ser tan graves que pueden llegar a causar la muerte. Estas enfermedades resultan
por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con agentes químicos
(plaguicidas, fertilizantes, etc.) o por agentes biológicos (microorganismos,
parásitos, y/o algunas substancias toxicas que estos producen).
Las ETAs pueden ser de 3 tipos:
Infecciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de alimentos
contaminados por microorganismos perjudiciales (patógenos) vivos (virus,
bacterias, parásitos) Ej.: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, el virus de la
Hepatitis A (Anónimo 1, 2007).
Intoxicaciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de toxinas
formadas en tejidos de plantas o animales, o de productos metabólicos de
microorganismos en los alimentos, o por sustancias químicas que se incorporan a
ellos de modo accidental, incidental o intencional desde su producción hasta su
consumo. Ocurren cuando estas toxinas o venenos de bacterias o mohos todavía
están presentes en los alimentos ingeridos, las toxinas no son detectadas por el
consumidor, pues no tienen olor ni sabor y algunas pueden soportar los
tratamientos térmicos realizados a los alimentos como por ejemplo la cocción, a
estas toxinas se les denomina toxinas termorresisentes. Entre los microorganismos
que producen toxinas se encuentran: Clostridium botulinum (toxina botulínica),
Escherichia coli (toxina shiga), toxinas del pez globo (Michanie, 2007; Anónimo
1, 2007).
Toxi-infecciones: Son enfermedades causadas por la ingestión de una cierta
concentración de microorganismos vivos capaces de causar una enfermedad y
25
poseen la capacidad de producir, sintetizar o liberar toxinas unas vez ingeridas. Ej.
Vibrio cholerae (cólera) (Anónimo 1, 2007).
2.2 Listeria monocytogenes
2.2.1 Historia
La primera descripción de Listeria monocytogenes fue en 1926 debida a un brote
epidemiológico en unos cerdos de guinea y conejos, y no fue reconocida como un
serio problema de salud, hasta que causó un gran brote invasivo con una alta tasa
de mortalidad en las provincias marítimas de Canadá. Este fue el primer brote que
demostró que este microorganismo es un patógeno alimentario y se ha demostrado
que muchos de los casos de listeriosis son producidos por la ingestión de
alimentos contaminados. Después de este brote, se dio un gran interés en
investigar y conocer la epidemiología de este organismo, para proteger a los
consumidores de la manera más efectiva contra el mismo, (Swatiman et al., 2007).
2.2.2 Morfología
El género Listeria está constituido por bacilos Gram positivos cortos y regulares,
de 0.4 a 0.5 m de ancho por 0.5 a 2.0 m de largo que pueden disponerse
individualmente o en cadenas cortas, presentando a menudo formas en ―V‖ en
cultivos viejos. Pueden aparecer en filamentos cortos y la capacidad de coloración
puede perderse (Blanco, 1994), no esporulados, aerobios y anaerobios
facultativos, son catalasa positivos, productores de acido L(+) láctico en el
metabolismo fermentativo de la glucosa, oxidasa negativos, esculina positivos
(Blanco, 1994), L monocytogenes, L.seeligeri y L.ivanovii son hemolíticos en
agar sangre con 5% vol/vol de sangre de caballo o cordero. L.monocytogenes y
L.seeligeri presentan un pequeño halo de hemólisis alrededor de las colonias que,
en numerosas ocasiones, es difícil de observar de tal forma que se hace necesario
retirar la colonia para poder detectarlo, L.ivanovii presenta un amplio doble halo
de β-hemólisis. Para diferenciar más claramente entre estas especies, se utiliza un
test de potenciación de su actividad hemolítica con Staphylococcus aureus
productor de β-hemolisina (esfingomielinasa C) y Rhodococcus equi, denominado
26
test de CAMP (Michanie, 2007). Mientras L. ivanovii presenta un característico
efecto de potenciación en forma de ―pala‖ con R. equi, en L. monocytogenes y L.
seeligeri se observa un efecto en forma de cerilla. Con S. aureus tan sólo L.
monocytogenes y L. seeligeri muestran una potenciación de su actividad
hemolítica (Blanco, 1994).
Son móviles por flagelos perítricos que se expresan mejor a 20-25ºC que a
temperaturas más elevadas, son bastantes resistentes a agresiones fisico-químicas
lo que les confiere una gran resistencia en el medio ambiente y puede sobrevivir
por prolongados periodos de tiempo (15 años) siempre que se encuentren en
presencia de materia orgánica y que las condiciones de pH, temperatura, aw, etc.
Sean favorables. (Blanco, 1994).
2.2.3 Factores de crecimiento
El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC
(Blanco, 1994), otros documentos reportan que la temperatura mínima es de -1.5
(Michanie, 2007), si bien la temperatura óptima es de 37ºC y la temperatura
máxima es de 45ºC, el rango de pH es de 4.3 a 9.4 siendo el pH 7 el óptimo para
su desarrollo y la actividad de agua (aw) mínima que permite su crecimiento es de
0.92 (Michanie, 2007; Anónimo 4, 2007).
La atmósfera ideal para su desarrollo es
de microaereofilia, pero tolera las condiciones aerobias, puede crecer en
concentraciones altas de CO2 (Ej.30%) pero en concentraciones de 100% de CO2
es inhibida.
2.2.4 Clasificación
La clasificación del género listeria ha sufrido muchas variaciones, a lo largo de
más de 30 años, y se le ha incluido en diferentes familias y géneros dentro del
Bergey`s manual of determinative bacteriology. En la séptima edición de 1957,
fue incluido dentro de la familia Corynobacteriaceae debido a sus características
morfológicas. Con el tiempo y gracias a estudios de taxonomía numérica y de
pared celular, evidenciaron la nula o baja relación entre Listeria y las
corinebacterias y evidenciaron su errónea clasificación, (Domínguez, 2001).
27
Los estudios quimiotaxonómicos demostraron que el género Listeria posee un
bajo contenido de Guanina+Citosina (G+C) 36-42%, carencia de ácidos micólicos
y presencia de ácidos lipoteicoicos, presencia de peptidoglicano de la variedad
A1 asociados a ácidos teicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer como
menaquinona principal la MK7. Todo esto, conllevó a la confirmación de la
estrecha relación de este género con los géneros Lactobacillus, Staphylococcus,
Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactococcus gracias a la proximidad que
los estudios de taxonomía numérica presentan y a la semejanza en las propiedades
quimitaxonómicas. Con esto, en 1974 en la siguiente edición del manual Bergey
aparece incluido en la sección 16 como género de afiliación incierta cerca de los
géneros anteriormente mencionados y con los cuales posee relación, (Blanco,
1994; Garcia, 1995; Domínguez, 2001).
Gracias a los avances de tecnologías genéticas (hibridación DNA-DNA, análisis
del ARNr 16S) se demostró la escasa relación filogenética entre el género Listeria
y las corinebacterias y la cercanía con los géneros Brochotrix y Lactobacillus
(Blanco, 1994). Gracias a estos avances, se ubicó este género en la familia
Listeriaceae, que está ubicado en la subrama del genero Clostridium de las
bacterias Gram positivas, basado en el bajo contenido de G+C en su genoma
(Gasanov et al., 2005). Las cuatro secuencias disponibles hasta hoy de
L.monocytogenes (cepas Ende, F6854, F2365, H7858) tienen un tamaño promedio
entre 2,893,921 bp y 2,953,211 bp con un contenido aproximado de G+C del 38%
y cerca de 2900 genes codificadores de proteínas. La cantidad de G+C de
L.welshimeri y de L.innocua son de 36.4% y 37% respectivamente. Los análisis
de los genomas, de estas bacterias del género Listeriaceae permitieron evidenciar
particularidades y semejanzas entre estas, como las diferencias entre las cepas
patógenas y no patógenas. Uno de los rasgos semejantes entre las bacterias
pertenecientes a este género, es la fuerte conservación en la organización
genómica, sin inversiones o cambios de largos segmentos geonómicos. Una casi
perfecta conservación en el orden y en la relativa orientación de los genes
heterólogos fue identificada, demostrando e indicando una gran estabilidad y una
28
filogenia cercana entre los genomas de las bacterias del género Listeria
(Buchrieser, 2007).
Actualmente, el género listeria se halla constituido por seis especies:
L.monocytogenes, L.inonocua,L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi y L.ivanovii con
sus dos subespecies indoniencis e ivanovii (Blanco, 1994).
2.2.5 Reservorio
Listeria monocytogenes es un microorganismo ubicuo, está de modo saprofito en
gran cantidad de nichos medioambientales, considerándose su hábitat principal el
suelo y la materia vegetal en descomposición y en aguas continentales (Fig.1).
También se encuentra normalmente en la flora intestinal de animales y está en las
heces de un 2 a 6% de la población. Se encuentra también en ensilados y en el
entorno de la producción de alimentos (Fig.1) (Blanco, 1994; Michanie, 2007).
Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al.,
1995)
2.2.6 Alimentos
Como se comentó en un apartado anterior una de las principales vías de
contaminación son los alimentos. Algunas investigaciones y reportes proponen
que los alimentos susceptibles y con más probabilidad de encontrar este
29
microorganismo son salchichas, fiambres, leche, leche pasteurizada y derivados
lácteos, carne y productos cárnicos, y debido a su presencia en aguas servidas se
puede encontrar en vegetales regados con agua contaminadas y no tratadas
(Blanco, 1994; Michanie, 2007).
Diversos factores, son un reflejo de los cambios sufridos en el estilo de vida de
los consumidores, entre estos se pueden incluir: (i) progresos médicos que han
producido un cambio demográfico, incrementando la proporción de población de
edad avanzada e inmunocomprometida; (ii) cambios en el sistema de producción
primaria de alimentos (producción a gran escala de materias primas, modificación
de las técnicas de procesado de los alimentos, expansión de la industria
alimentaria y desarrollo de sistemas de almacenamiento en frío); (iii)
modificaciones en los hábitos de alimentación (incremento en la demanda por
parte de los consumidores de alimentos listos para comer, precocinados,
refrigerados o congelados pero con un mínimo requerimiento de tiempo de
cocinado antes de su consumo); (iv) realización de la compra una vez a la semana
(Domínguez, 2001).
Como ya se comentó antes al ser este un microorganismo ubicuo y encontrarse
presente de manera normal en la flora intestinal en algunos organismos, los
enfermos y portadores sanos (animales y humanos) son una de la fuentes más
importantes de contaminación en la industria alimentaria, debido a la
diseminación en el ambiente de L.monocytogenes por parte de estos a través de la
orina, heces y otras secreciones (Fig.1) (Blanco, 1994).
Se han aislado colonias de L.monocytogenes, de agua por la descongelación de
refrigeradores domésticos, gracias a la capacidad de este microorganismo de
soportar bajas temperaturas, lo que puede causar la contaminación cruzada de los
productos refrigerados generando un riesgo para el consumidor (Blanco, 1994;
Michanie, 2007; Farber, 1991; Mena et al., 2003).
30
Otro punto de contaminación de los alimentos, es la contaminación cruzada por la
mala higiene de equipos y personal que laboran en plantas de producción, en seis
plantas de delicatesen en Francia, se identificó contaminación cruzada entre
alimentos crudos y cocinados por los procedimientos inadecuados de limpieza y
desinfección, como fuentes importantes de contaminación (Mena et al., 2003)
2.2.6.1 Leche y productos lácteos
La leche y los productos lácteos son los alimentos en los cuales se han realizado
mas investigaciones, debido a su alta incidencia en relación a los brotes de
listeriosis presentados entre 1983 y 1987 en USA y Suiza.
L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas
lecheras provocándoles mastitis, la cual puede presentarse con ó sin alteración
mamaria y/o de la leche de los animales afectados y Listeria spp. puede seguir
siendo excretada en la leche aun 3 meses después de la desaparición de los
síntomas (Fig.1).
En los demás productos lácteos su presencia se debe a 2 factores: uno es la
utilización de leche contaminada y mal tratada como materia prima para la
elaboración de derivados lácteos (queso, leches achocolatadas, postres, etc.) y dos
a la capacidad que tiene este microorganismo de crecer a temperaturas de
refrigeración, y alcanzar niveles de hasta 107 ufc/mL durante el almacenamiento si
el producto está contaminado (Blanco, 1994).
En estudios realizados por Mena et al. 2003 en Portugal, obtuvieron como
resultado que de 6 muestras de leche cruda 1 estaba contaminada con Listeria
(incidencia del 16.7%), de 28 muestras de leche pasteurizada ninguna presentó
presencia del microorganismo, de 371 muestras de quesos fabricados a partir de
leche pasteurizada 6 resultaron positivas (incidencia 1.6%) y de 50 muestras de
queso fresco 2 dieron positivas en presencia del microorganismo (incidencia del
4.0%) y en España un estudio realizado por Vitas et al., 2003 obtuvieron que de
340 muestras de leche de vaca obtuvieron presencia de: 23 L.monocytogenes, 24
31
L.innocua, 1 L.welshimeri, 1 L.seeligeri. La leche fresca pertenece a los productos
crudos que sufren un proceso de cocción o calentamiento antes de su uso o
consumo (Vitas et al., 2003) lo cual es reflejado por la ausencia de Listeria en
las muestras de la lache pasteurizada, y la presencia de listeria en productos a
partir de este tipo de materias primas es a causa de la contaminación cruzada
durante elaboración de los productos.
La leche cruda permite una presencia medianamente alta de patógenos por el
proceso de obtención, transporte y contaminación cruzada, pero como es un
producto que no se consumirá crudo y sufrirá un proceso de calentamiento
(pasteurización, UHT, entre otros) que asegurara la destrucción del 100% de
patógenos no se tiene mucha relevancia sobre la misma.
2.2.6.2 Carne y productos carnicos
Se ha aislado L.monocytogenes de muy diversos tipos de carne. La carne de ave y
sus derivados, son los mas susceptibles y los que mayor incidencia presentan entre
los diferentes alimentos investigados y la contaminación aumenta a medida que
avanza el procesado y distribución del producto, aunque los recuentos obtenidos
no son superiores a 102 UFC/mL (Vitas et al.,2003; Mena et al., 2003).
Las carnes rojas presentan una mayor presencia de Listeria spp. siendo esta mayor
en la carne de porcino que en las de vacuno y ovino, aunque los recuentos no son
superiores a 5 UFC/mL. En productos derivados como el paté se han llegado a
obtener recuentos de hasta 106 UFC/g (Blanco, 1994).
Mena et al. 2003, analizaron 105 muestras de carne, 15 fueron de pollo crudo
(músculo) de las cuales 9 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria
(incidencia del 60%), 17 de carne roja (músculo) de las cuales 3 dieron positivo
(+) para la de Listeria (incidencia del 17.7%), 4 muestras de jamón de las cuales
solo 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 25%), 44
muestras de jamón curado (presunto) de los cuales 1 dio positivo (+) para la
presencia de Listeria (incidencia del 2.3%) y 25 muestras de pescado crudo de las
32
cuales 3 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 12.0%) y
en España un estudio realizado por Vitas, y col. 2003 obtuvieron que de 295
muestras de carne cruda obtuvieron presencia de: 103 L.monocytogenes, 103
L.innocua, 45 L.welshimeri, 4 L.seeligeri, de 158 muestras de carne de ave de
corral (pollo y pavo) obtuvieron presencia de 57 L.monocytogenes, 106 L.innocua,
6 L.welshimeri, 2 L.seeligeri.
Para las carnes crudas se acepta una presencia moderada de patógenos por los
procesos que sufre el producto para su obtención (matanza, destripado, etc.) y la
preparación de las porciones (picado, troceado, etc.) pero como estos productos
sufrirán un proceso de cocción y su temperatura interna alcanzará los 70ºC y
asumiendo que el proceso es listericida si realiza de manera correcta (Vitas et al.,
2003; Mena et al., 2003).
2.2.6.3 Otros Alimentos
Se han encontrado reportes de L.monocytogenes en productos refrigerados
precocidos, listos para comer, congelados, y verduras y hortalizas crudas. (Blanco,
1994; Domínguez, 2001)
La presencia en alimentos listos para consumo (ALC) ó ready to eat , refrigerados
y congelados se debe a que estos alimentos se consumen, sin ningún tratamiento
térmico o tratamientos muy suaves, que no aseguran la eliminación de
L.monocytogenes (Blanco, 1994).
Las investigaciones de Vitas et al.. 2003 y de Mena et al.. 2003, concuerdan en
que los ALC poseen una alta probabilidad de causar listeriosis en los
consumidores, aunque estos productos sufran procesos de conservación y/o
maduración, y procesos de cocción que aseguren su inocuidad para los
consumidores, el riesgo radica en la contaminación directa ó cruzada por contacto
con superficies de equipos en los cuales se han manipulado alimentos crudos los
cuales presentan una alta probabilidad de contaminación con Listeria spp. Otros
estudios, han demostrado que los refrigeradores pueden ser una fuente potencial
33
de colonización y contaminación de alimentos por parte de Listeria
monocytogenes debido a su capacidad psicotrofa y a la generación de un ambiente
adecuado para su desarrollo y multiplicación debido a la ausencia de
microorganismos patógenos, y valores de pH y aw adecuados (Vitas et al., 2003).
Algunos autores y entidades recomiendan cero tolerancia en 25 g de productos
que posean un tiempo de vida útil mayor a una semana, debido a que
investigaciones en microbiología predictiva han demostrado, que a una
temperatura de almacenamiento de 0-5ºC y por más de 5 días la concentración
final de listeria puede ser de 103 ufc/g partiendo de una concentración de 10
células, y si el almacenamiento es a 10ºC se puede alcanzar una concentración de
107 ufc/g , si el tiempo es menor recomiendan una concentración < 100 ufc/g,
(Vitas et al.,2003).
Para los productos de carne cocinada y ALC, debido a sus cualidades y métodos
de conservación como se ha descrito anteriormente, son un medio idóneo para el
crecimiento de L.monocytogenes en todo el concepto microbiológico y por eso
deben tener un control igual que el de productos que posean duración de más de
una semana (Vitas et al., 2003; Mena et al., 2003).
2.2.7 Métodos de detección
Desde la aparición de ETAs, ha habido una constante investigación, búsqueda y
diseño de métodos más rápidos y más sensibles para la detección de
microorganismos patógenos, sobre todo en la industria alimentaria, debido a las
normas de gobiernos y organismos internacionales de ofrecer, alimentos inocuos
para el consumidor y para mejorar su aceptación en el mercado ofreciendo
tiempos de vida útil más largos.
Existen variados y diferentes procedimientos y protocolos avalados por agencias
internacionales como FDA, ISO, para el aislamiento de Listeria monocytogenes,
igualmente, existe gran diversidad de técnicas para la identificación de colonias
aisladas, métodos de identificación epidemiológica y el futuro para la detección de
34
microorganismos está encaminado a las tecnologías genéticas que se basan en el
análisis del RNA y DNA (Gasanov et al., 2004).
Figura 2. Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales de
aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp. y Listeria
monocytogenes en muestras ambientales y de alimentos (Gasanov et al., 2004).
La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de
microorganismos en la industria alimentaria no diferencian las especies de
Listeria. Estos protocolos son regulados y certificados por agencias
gubernamentales como la FDA (Food and Drug Administration) o la USDA (US
deparment of agricultura) en Estados unidos ó la ANZFA (Australian and New
Zeland food administration) en Australia. Desde la perspectiva de higiene la
presencia de alguna especie no patógenica de Listeria como L.innocua puede
indicar la potencial transmisión o presencia de L.monocytogenes (Gasanov et al.,
2004).
La mayoría de pruebas que se usan en la actualidad en los laboratorios de
microbiología de alimentos para la detección de L.monocytogenes están basados
35
en métodos de cultivo y anticuerpos, pero el reto de la industria alimentaría es
usar métodos moleculares. Algunas de las desventajas de los método moleculares,
es el costo de equipos y reactivos y que es necesario tener personal altamente
entrenado y capacitado para este tipo de pruebas, aparte no diferencia entre células
vivas y muertas, alguna de sus ventajas, es que no se basa en la expresión de
factores antigénicos, enzimáticos o proteicos, es fiable y se basa en las diferencias
entre los genomas y se pueden realizar en la misma fracción de tiempo que toman
los métodos convencionales (Gasanov et al., 2004).
2.2.7.1 Métodos de aislamiento
Históricamente, el aislamiento de Listera spp. de muestras de alimentos y
ambientales ha sido un reto debido a la capacidad de este microorganismo de
crecer a bajas temperaturas. Por lo que, antiguamente se solía aislar de las muestra
clínicas poniéndolo a crecer en medios de cultivo a 4ºC por largos periodos de
tiempo hasta poder evidenciar el crecimiento de colonias. Este tipo de método,
toma demasiado tiempo y no permite la recuperación de células de Listeria spp.
dañadas. Hay tres elementos claves: enriquecimiento, tiempo de aislamiento y
recuperación de células dañadas, los cuales son factores que se han de tener en
cuenta en los procesos de aislamiento si se desean obtener los mejores resultados
para el control de Listeria spp. en la industria alimentaria.
Las pruebas aprobadas por agencias reguladoras, deben detectar por lo menos una
célula de Listeria en 25 g de muestra ó producto a analizar. Esta sensibilidad solo
se puede lograr usando métodos y medios en el cual el microorganismo sea capaz
de llegar a una concentración de 104
UFC/mL el cual es un límite detectable. Dos
de los protocolos más usados para la detección de Listeria spp. en cualquier
alimento y que han sido certificados y avalados por agencias reguladoras son el
método de análisis bacteriológico (BDMA) de la FDA y el de la Organización
internacional de estándares (ISO) 11290, estos dos métodos poseen en común el
uso de 25 g de muestra para enriquecimiento en un medio que sea selectivo e
inhiba la microflora acompañante, y la siembra en medios sólidos selectivos e
identificación bioquímica de las colonias sospechosas (Gasanov et al., 2004).
36
2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas
Los métodos de enriquecimiento, demoran entre 30 y 48 horas y como se dijo
anteriormente, debe continuarse con la identificación de los microorganismos
aislados. Después de seleccionar un método de enriquecimiento validado para
Listeria se debe considerar la extensión en la cual el método ha sido validado, en
pocas palabras continuar usando protocolos validados y aceptados por agencias
reguladoras. Mientras varios países tienen sus propios esquemas de validación, la
AOAC en Washington, es la autoridad más reconocida en el mundo. La AOAC de
métodos oficiales, posee una gran variedad de métodos para la búsqueda de
Listeria que incluye métodos rápidos como inmunoensayos hasta pruebas basadas
en genética
Para la identificación existen varios métodos tales como: Confirmación por
pruebas bioquímicas, la Prueba de CAMP, pruebas de basadas en anticuerpos,
ELISA, inmunocaptura, y a nivel de las pruebas moleculares tenemos:
Hibridación de DNA y la PCR, en los estudios epidemiológicos se llega a la
tipificación del microorganismo (Gasanov et al., 2004).
37
Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp.
modificado (Gasanov et al., 2004)
2.2.8 Virulencia
L.monocytogenes puede invadir el ojo y la piel del hombre después de una
exposición directa, se ha observado en accidentes de laboratorio, veterinario y
personal que labora en mataderos. Pero en la mayoría de casos de listeriosis en
humanos la puerta de entrada es la parte superior del tracto gastrointestinal por el
consumo de alimentos contaminados con dosis muy altas del microorganismos
(106 UFC/mL ó g de alimento consumido) (Garza et al., 2002; Álamo et al.,
2006).
La bacteria luego de entrar por el tracto, atraviesa la barrera mucosa del intestino
probablemente ayudada por la endocitosis de las células endoteliales (placas de
peyer), y crece eficazmente dentro de los enterocitos y mononucleares, lo cual
38
permite que parte de su población alcance el torrente sanguíneo y se disemine por
vía hematógena. Luego de la translocación del intestino el hígado es el primer
órgano blanco donde se multiplica activamente antes de que la infección sea
controlada por la inmunidad mediada por células, luego de alcanzar el hígado los
otros tres órganos blancos de este patógeno son la placenta, el cerebro y el sistema
nervioso, (Álamo et al., 2006; Reguera et al., 1995).
Cuando la bacteria se interna en la célula, sea por fagocitosis o fagocitosis
inducida, queda englobada en un fagosoma monomembranal, del cual luego
escapa asegurando su libertad en el citosol, multiplicándose libremente en el
citoplasma, luego se desplaza por el interior hacia el exterior de la célula
hospedora alcanzando las células subyacentes, quedando nuevamente englobadas
en el nuevo hospedador dentro de un fagosoma bimembranal. En concreto, los
eventos implicados en el proceso infectivo global, son (Vazquez et al., 2001;
Garza et al., 2002) (figura 4):
i) Entrada a las células del hospedador.
ii) Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.
iii) Desplazamiento intracitoplasmático.
iv) Diseminación célula-célula.
Figura 4. Representación esquématica de la biología de la infección intracelular
por L.monocytogenes (Reguera, et al., 1995)
39
2.2.8.1 Entrada a las células del hospedador
La forma en la cual el microorganismo ingresa a las células no fagocíticas es
semejante a la clásica fagocitosis, ya que implica la interacción del ligando del
primero con el receptor de las segundas, como ya se dijo las placas de peyer y las
células M son el primer sitio de invasión, posteriormente el bacilo es englobado
por los macrófagos residentes. Las proteínas que participan en la internalización
inducida de Listeria en la célula, son las internalinas A y B que son codificadas
por los genes InlA e InlB. Luego de su ingreso las células quedan internadas en un
fagosoma constituido de una sola membrana, que luego interactuara con un
lisosoma para la destrucción de las bacterias pero este microorganismo es capaz
de escapar antes que esto suceda (Garza et al., 2002; Domínguez, 2001).
2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.
Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el
caso de L.monocytogenes, el fagosoma se acidifica rápidamente por medio de
ATPasas de protones. La supervivencia bacteriana y su posterior multiplicación
en el citosol van a ser el resultado de una competición entre la fusión del
fagosoma-lisosoma y la exposición oxidativa de las células hospedadoras
(Domínguez, 2001), los mecanismos para evitar esto son la expresión de los genes
(hly) de las toxinas líticas (listeriosina O con interacción sinérgica de fosfolipasas)
para la destrucción del fagosoma y la expresión de dos enzimas, catalasa y
superóxido dismutasa, que la protegen de la oxidación fagolisosómica (Garza et
al., 2002).
Una vez que se concreta la lisis del fagosoma (en el fagosoma monomembranal
solo interfiere la listeriosina O y en el fagosoma bimembranal intervienen las
fosfolipasas junto con la listeriosina) el microorganismo se libera al citosol donde
se multiplica en un tiempo de 50 minutos (Garza et al., 2002).
40
2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático
Dentro del citoplasma la bacteria expresa otro gen de virulencia denominado
ActA, que es una proteína que manipula los componentes del citoesqueleto de la
célula hospedadora para su tránsito intracelular e intercelular. Durante la
internalización, el microorganismo absorbe varios filamentos cortos de actina
(Garza et al., 2002), y durante su división se observa una densa nube de actina que
la rodea. Asociada con la replicación bacteriana se va a producir una
redistribución de los filamentos de actina, concentrándose en uno de los polos de
la bacteria (Domínguez, 2001), formándose estructuras (actínicas) semejantes a la
cola de una cometa.
Posteriormente, se produce una polimerización continua de la actina en dicho polo
que mediante un mecanismo similar al de los cohetes, propulsa las bacterias por el
citoplasma (Domínguez, 2001), aportando una fuerza locomotora que logra
velocidades de 0.05 a 0.3 m/seg (Garza et al., 2002).
2.2.8.4 Diseminación célula-célula
La adquisición de movilidad asociada a la polimerización de los filamentos de
actina alcanza la membrana plasmática de la célula infectada para poder invadir a
las células vecinas (Garza et al., 2002; Álamo et al., 2006).
Los bacilos se desplazan a través del citoplasma hacia la membrana
citoplasmática, utilizando los filamentos de actina polimerizados, una vez logran
este objetivo, la empujan progresivamente provocando que se produzcan
prolongaciones alargadas llamadas filópodos o protruciones, desde cuyo interior
continúan ejerciendo presión, de esta manera dichas proyecciones terminan siendo
fagocitadas por las células adyacentes (Garza et al., 2002). Como consecuencia de
esto, las bacterias quedan atrapadas en una vacuola rodeada por una doble
membrana, la interna constituida por la membrana citoplasmática de la primera
célula y la externa por la membrana de la nueva célula invadida (Domínguez,
2001; Vazques et al., 2001).
41
2.2.9 Listeriosis
A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es
frecuente y afecta principalmente a adultos inmunocomprometidos, mujeres
embarazadas, recién nacidos, granjeros, veterinarios y enfermos crónicos
(Michanie, 2007).
La listeriosis presenta dos tipos de cuadros: invasivo y no-invasivo, el cuadro
invasivo suele ocurrir en personas con sistemas inmunes muy débiles (VIH
positivos, gerontes, embarazadas, fetos y neonatos, personas que padecen cáncer,
diabetes, cirrosis, y en las que reciben medicamentos inmunodepresores o han
sido sometidas a transplantes), y la no invasiva ocurre en cualquier persona que
haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al., 2002).
Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por
Listeria spp. (Vasquez et al., 2001)
2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis)
Los síntomas son diarrea, fiebre, dolor muscular, dolor de cabeza, dolor
abdominal y vomito en casos menos frecuentes, la incubación del microorganismo
y reflejo de los síntomas se dan entre la primera hora y los 7 días.
42
2.2.9.2 Invasivo
Las infecciones invasivas tienen un tiempo de incubación de 1 a 90 días, se
presentan síntomas parecidos a una gripe, diarrea con presencia de vomito, tiene
una mortalidad del 30% y una tasa de hospitalización del 92%, la concentración
de microorganismo para causar la enfermedad es de 100-1000 células.
Las enfermedades que puede causar son (Garza et al., 2002; Michanie, 2007) :
I. Infecciones durante el embarazo.
II. Granulomatosis linfatiséptica.
III. Sepsis de origen desconocido (septicemia).
IV. Meningoencefalitis, cerebritis, y romboencefalitis.
V. Infecciones focales.
2.2.9.3 Tratamiento
L.monocytogenes es susceptible a gran cantidad de antimicrobianos y su
resistencia es ocasional, excepto a las tetraciclinas, estudios han comprobado que
es capaz de adquirir genes de resistencia provenientes de Enterococcus spp. y
Streptococcus spp. entre otros, lo cual puede aportarle resistencia a gentamicina,
estreptomicina, eritromicina y sulfametoaxol (Michanie, 2007).
Algunos autores reportan que la combinación de penicilina, ampicilina y
opcionalmente un amino glucósido (ej.gentamicina) es el más efectivo, algunos
otros adicionan el tratamiento con quinolonas, macrolidos y trimetropim-
sulfametaxol, y otros recomiendan que la asociación ampicilina-cotrimoxazol,
subrayando que es superior a la combinación de ampicilina-penicilina-
gentamicina, ya que reduce la mortalidad y las secuelas cerebrales (Garza et al.,
2002).
43
2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos
2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor)
La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes
microorganismos (bacterias, levaduras, mohos), y estos alimentos pueden resultar
perjudiciales para la salud del consumidor.
El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar
desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos
más comunes para la destrucción de microorganismos (Prescott et al., 1999),
debido a que los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a
temperaturas superiores a las de su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar
altas temperaturas para eliminarlos por termodestrucción, la sensibilidad de los
microorganismos a los tratamientos térmicos es diferente, las esporas son más
termorresistentes que las células vegetativas y los microorganismos Gram-
positivos lo son más que los Gram-negativos (Anónimo 2, 2007).
2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z
Al someter a una población bacteriana a la acción del calor, a una temperatura
constante, el número de supervivientes es una función exponencial del tiempo de
tratamiento: a intervalos iguales de calentamiento la población se reduce en igual
proporción. La cinética de destrucción microbiana es, por tanto, una cinética de
reacción de primer orden (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007):
Nt = N0 e-kt
Siendo:
Nt: número de microorganismos trás ―t‖ minutos de tratamiento.
N0: número inicial de microorganismos.
k: constante de inactivación.
t: tiempo de tratamiento.
Así pues, al representar el logaritmo del número de supervivientes a un
tratamiento térmico, realizado a temperatura constante, frente al tiempo, se
44
obtiene una línea recta. Esta representación se denomina gráfica de supervivencia
(Palop, 2007).
Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007)
2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D)
Para definir la termorresistencia microbiana se creó un parámetro al que se
denominó ―tiempo de reducción decimal o valor DT‖ que se definió como el
tiempo que es preciso tratar a una población microbiana a la temperatura T para
reducir su recuento a la décima parte, o lo que es lo mismo, para que la línea de
supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Si consideramos N0 como el número
de células al inicio del tratamiento y NX el número de células sobrevivientes
después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el valor D se
calcula:
𝐷𝑡 =𝑋
𝑙𝑜𝑔 𝑁0 𝑁𝑥
DT= x/Log(N0/NX) ó DT=-1/m (donde m es la pendiente de la grafica de
supervivencia (Prescott et al., 1999; Palop, 2007).
45
Figura 7. Grafica de valor D (anónimo 1, 2007).
2.3.2.2 Valor Z
Si aumentamos la temperatura del tratamiento, el valor D disminuye de forma
logarítmica. Por tanto, representando el logaritmo de los valores DT frente a la
temperatura de tratamiento, obtendremos una línea recta denominada gráfica de
termodestrucción. La gráfica de termodestrucción permite conocer la
termorresistencia que presentará el microorganismo a cualquier temperatura de
tratamiento y su pendiente indica la termodependencia de las reacciones que
conducen a su destrucción. A partir de la gráfica de termodestrucción se define el
valor z como el número de ºC que hay que aumentar a la temperatura de
tratamiento para reducir el valor DT a la décima parte, es decir, para que la línea
de termodestrucción atraviese un ciclo logarítmico, el valor z se calcula:
ΔT
z =
log DT2 – log DT1
o simplemente Z=-1/m (donde m es la pendiente de la gráfica de
termodestrucción) (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007, Palop, 2007).
46
Figura 8. Grafica de termorresistencia y valor Z. (Anónimo 2, 2007).
2.3.3 Termorresistómetro
El termorresistómetro es un instrumento diseñado para la determinación de la
resistencia de los microorganismos al calor. Este instrumento permite la
aplicación directa de un tratamiento térmico preestablecido, durante un tiempo
determinado en condiciones controladas, a una muestra de alimento o a un medio
sintético. (Palop, 2007)
El termorresistómetro consiste en un tanque de acero presurizado, calentado por
una resistencia eléctrica y homogeneizado mediante una hélice de agitación. La
temperatura del instrumento se controla mediante un autómata programable. Está
dotado de un puerto para adicionar los microorganismos, por medio de una jeringa
y una aguja estéril. En este instrumento se pueden realizar tratamientos
isotérmicos (temperatura constante a través del tiempo) y no isotérmicos (rampas
de temperatura, la temperatura aumenta de manera gradual y constante durante el
tiempo deseado hasta una temperatura final) (Fernández, 2007).
47
2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los
microorganismos.
En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean
dañadas pero no mueran debido a que algunas células sean más termorresistentes
que las demás por la producción de proteínas de choque térmico ó HSP (Heat
Shock Proteins) u otros mecanismos (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006).
Aparte de esto, la resistencia de los microorganismos al calor esta supeditada a
una serie de factores, entre los cuales están:
-Tipo de microorganismos: Las bacterias esporuladas son las formas mas
resistentes, llegando algunas de ellas, a sobrevivir a tratamientos de varios
minutos a 120ºC, seguido están las bacterias vegetativas, levaduras y hongos
presentan una termorresstencia similar, la mayoría mueren tras estar unos minutos
a una temperatura entre 70 y 80ºC (Anonimo 3, 2007; Garza, 2007).
-Temperatura: Algunas investigaciones han demostrado que la termorresistencia
de las esporas está influenciada por la temperatura de esporulación, así si la
esporulación tiene lugar a la temperatura óptima de crecimiento, o superior, su
termorresistencia será mayor que si el crecimiento hubiera tenido lugar en
temperaturas más bajas. Las formas vegetativas presentan un comportamiento
similar a las esporuladas pues en general, cuanto más se aproxima a la
temperatura óptima de crecimiento durante la fase de crecimiento más elevada es
su termorresistencia (Garza, 2007; Der Lin et al., 2003).
-pH del medio de tratamiento: Quizás el factor más importante que afecta la
termorresistencia sea el pH. La resistencia de los microorganismos es
generalmente máxima a valores de pH próximos a la neutralidad, entre 6.0 y 8.0, y
decrece cuando el medio es ácido (Garza, 2007). Investigaciones de Hassani et al.
2003 y de Hassani et al. 2007, demostraron que a un pH ácido la termorresistencia
disminuía y conforme aumentaba el pH la termorresistencia también aumentaba.
-Actividad del agua: La reducción en la actividad del agua en el medio de
tratamiento aumenta considerablemente la termorresistencia tanto en los esporos
48
como en las células vegetativas, lo que se refleja en la necesidad de utilizar
temperaturas de tratamiento más elevadas o tiempos más prolongados (Garza,
2007). Fernández, y col. 2006, realizaron un modelo en el cual el efecto del aw
sobre la termorresistencia de L.monocytogenes varía dependiendo de la
temperatura del tratamiento.
-Composición del medio: El contenido de azúcares, la adición de conservantes,
la presencia y el tipo de ácidos orgánicos y la presencia de sales, tienen un efecto
importante sobre la termorresistencia de los microorganismos. El azúcar en
concentraciones altas protege a las células contra la inactivación térmica pero no
solo la concentración influye, sino también el tipo de azúcar interviene
significativamente en el efecto protector (Garza, 2007). La sal en los alimentos
juega un rol importante pues el primer efecto que tiene sobre las células es la
plasmolisis, luego tiene otros efectos como deshidratación, interferencia
enzimática, retiro de oxígeno y la toxicidad de los iones, cloro y sodio, cuando el
cloruro de sodio es ionizado (Der lin et al., 2003). Schultze, et al.. 2006,
determinaron en su investigación que el D60 de L.monocytogenes en una mezcla
de frankfurter con una concentración de 8.5% es de 2.2 minutos y a
concentraciones de 11 y 23% fue de 1.7 minutos, lo que desmiente que una
mayor concentración de grasas produce un aumento de la termorresistencia de los
microorganismos.
Listeria spp. es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas debido al cambio de
composición que realiza en su membrana (Gandhi et al., 2006). Según la teoría de
membrana fluida, la membrana en los organismos, al estar a temperaturas altas
aumenta su proporción de ácidos grasos saturados, y a bajas temperaturas las de
ácidos grasos insaturados y hopanoides. Listeria spp. a bajas temperaturas,
aumenta la proporción de C15:0 a expensas de C17:0 cuando la temperatura es
reducida de la ideal (7ºC), todo esto con el objeto de mantener la fluidez adecuada
de la membrana (Gandhi et al., 2006) ajustándose al modelo de mosaico fluido de
Singer y Nicholson.
49
Las condiciones conocidas que afectan la resistencia a los tratamientos térmicos
por parte de Listeria spp son, entre otros, el estado en el ciclo de crecimiento,
temperatura alta (19 ò 37ºC) durante el crecimiento (debido a que afecta la
biosíntesis de lípidos), la composición membranal y síntesis de proteínas,
exposición a otros estreses y las células que se encuentran en fase estacionaria,
influyen en la resistencia a la inactivación térmica por parte de este
microorganismo. La termotolerancia tiende a aumentar significativamente después
de un shock térmico (30 minutos a 48ºC) en células crecidas a 4ºC. El caldo de
crecimiento juega un papel importante, pues afecta la tasa de crecimiento y la
composición de constituyentes celulares que determinan la termotolerancia de las
células bacterianas. (Doyle, 1999; Doyle et al., 2000).
2.4 Antimicrobianos naturales
Los antimicrobianos son sustancias que pueden inhibir o detener el crecimiento de
microorganismos, estos pueden ser de origen natural (animal, vegetal y
microbiano) ó sintético (ácidos orgánicos y ésteres) (Raybaudi et al., 2006).
Se estima que en la parte aérea de las plantas, la filosfera y especialmente en las
hojas, existen alrededor de 106-10
7 células/cm
2 (10
8 células/g) de
microorganismos, principalmente bacterias. Globalmente las plantas producen
más de 100.000 productos naturales de bajo peso molecular, también conocidos
como metabolitos secundarios. Esta diversidad tan rica resulta de un proceso
evolutivo para la adquisición de defensa mejorada frente a los ataques de
microorganismos, insectos y otros animales (Domingo et al., 2003).
Desde tiempos antiguos y en la actualidad se conocen y reconocen las propiedades
antimicrobianas de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. Se han
realizado investigaciones y se ha encontrado que los compuestos presentes en
estas plantas son derivados simples y complejos del fenol, los cuales son volátiles
a temperatura ambiente (Marcén, 2000; Raybaudi et al., 2006).
50
2.4.1 Aceites esenciales
Los aceites esenciales (A.E.) son compuestos lipídicos muy olorosos obtenidos
mediante la extracción de diferentes partes de plantas (flores, yemas, semillas,
hojas, ramas, corteza, hierba, madrea, frutos, raíces, etc.) usando solventes
orgánicos ó técnicas como la destilación. Estos aceites están compuestos por
mezclas de ésteres, aldehídos, cetonas, terpenos, hidrocarburos cíclicos y
alcoholes. Además son compuestos muy solubles en alcohol pero poco solubles en
agua (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).
Los A.E que contenían un aldehído o un fenol como principal componente fueron
los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, seguido por los alcoholes
y, con una menor acción antimicrobiana, los aceites que contenían
mayoritariamente cetonas, ésteres o hidrocarburos. La actividad de un aceite
esencial está relacionada con sus constituyentes principales (estos pueden
constituir hasta un 85% del total, mientras que el resto se presentan como trazas),
la configuración estructural y grupos funcionales de sus compuestos, y con
posibles sinergias entre los compuestos. En consecuencia hay que diferenciar
entre la mezcla total del aceite esencial de una planta y cada uno de sus
componentes activos (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).
La composición de los aceites esenciales puede variar mucho dependiendo de la
variedad (propiedades determinadas genéticamente), la zona geográfica o
climatología (medio ambiente), la edad de la planta, la parte utilizada en la
extracción, y el método de secado y extracción del aceite (Castillejos, 2005).
2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales
Los aceites esenciales al tener un gran número de compuestos, su acción
antimicrobiana no se atribuye a un único mecanismo, sino a varios debido a los
múltiples blancos en la célula. Una característica importante de los aceites
esenciales es su hidrofobicidad, característica que les permite unirse a los lípidos
de la membrana celular desestabilizando su estructura y aumentando su
51
permeabilidad, generando la salida de iones, metabolitos y demás moléculas que
pueden conllevar a la muerte (Burt, 2004; Castillejos, 2005). Estudios demuestran
que la mayoría de las propiedades antibacterianas frente a microorganismos
patógenos por parte de los A.E se debe en un alto porcentaje a los compuestos
fenólicos como el timol, el carvacrol y el eugenol presentes en estos (Burt, 2004).
Según algunos estudios señalan, la localización y la cantidad de grupos hidroxilo
sobre los grupos fenólicos de estas moléculas está relacionado con su toxicidad:
una mayor oxidación es responsable de una mayor capacidad bactericida
(Castillejos, 2005). Es razonable pensar que sus mecanismos de acción sean
parecidos a los de otros compuestos fenólicos, generalmente se consideran la
desestabilización de la membrana citoplasmática, la interrupción en la fuerza
protón motriz (FPM), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación
de componentes celulares, (Burt, 2004). También pueden actuar sobre las
proteínas de la membrana citoplasmática. Los hidrocarburos lipofílicos pueden
acumularse en la bicapa lipídica e interferir en la interacción lípido proteína.
Además, también es posible una interacción directa entre los compuestos
lipofílicos con la parte hidrofóbica de la proteína. Como consecuencia, pueden
modificar la actividad de las enzimas que regulan la producción de energía o la
síntesis de compuestos estructurales (Castillejos, 2005).
Figura 9. Localización y mecanismo de acción de los componentes de A.E sobre
la célula bacteriana. (Burt, 2004; Castillejos, 2005)
52
Aparentemente los componentes de los A.E. interaccionan con las ATPasas que
están presentes en la membrana citoplasmática (Burt, 2004), Gill y col. 2006, en
su investigación determinaron que el eugenol, el carvacrol, y el cinemaldehido,
componentes de aceites esenciales, inhibían la obligada actividad de la ATPasa de
membrana de E.coli y L.monocytogenes. Las membranas bacterianas contienen un
alto número de diferentes enzimas con función ATPasa incluyendo aquellas
involucradas en el transporte activo de proteínas, como la ATPasa F1F0 que es la
encargada de la regulación del pH celular. La inhibición de estas funciones puede
afectar la sobrevivencia celular, las concentraciones para inhibir la actividad de
las ATPasas es la misma que se necesita para la desestabilización de la membrana
celular, lo que sugiere que la interrupción de las funciones de estas enzimas es una
causa secundaria más que una primaria de la muerte celular.
Otra investigación de Gill et al. 2005, permitió evidenciar que el carvacrol y el
eugenol aumentan la permeabilidad de la membrana afectando la movilidad de
E.coli y L.monocytogenes ofreciendo gran evidencia que la desestabilización de la
membrana es la causa primaria de la muerte celular por acción de estos
compuestos. El flagelo de estas bacterias esta estructuralmente integrado a la
membrana y el cual recibe energía proveniente del gradiente de protones más que
por los intermediarios fosforilados del ATP.
2.4.1.2 Clavo (Eugenol)
El clavo es una especia proveniente de las plantas del género Syzygium spp, esta
ha sido usada desde tiempos antiguos en la medicina tradicional, teniendo usos de
expectorante, estimulante, analgésico, anti flatulento, etc, y en la odontología
como antiséptico, por lo cual es común encontrarlo en gomas y en cremas dentales
para el tratamiento y prevención de la caries (Chaieb et al., 2007).
El aceite esencial proveniente del clavo está constituido por 36 componentes
(Chaieb, K, et al., 2007) y con altas concentraciones de: eugenol (figura 12), -
caryophyleno, -humuleno, epóxido de humuleno, etil hexanoato, 2-heptanona,
53
humulenol, calacoreno y calameneno (Chaieb et al., 2007; Raina et al., 2001; Fu
et al., 2007).
Figura 10. Eugenol
El eugenol pertenece al grupo de los fenilpropanos que son sustancias
ampliamente distribuidas entre los vegetales y se caracterizan por un anillo
aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del
ácido shikímico 2-metoxi-4-(2-peopenil) fenol (bolilla, 2007), los compuestos con
estructura fenólica demostraron tener una actividad antimicrobiana superior
debido a su carácter hidrofóbico. Estudios dan importancia al grupo hidroxilo y su
localización en la estructura fenólica para obtener una mayor capacidad
antimicrobiana (Castillejos, 2005).
Se teoriza sobre la posible interacción del grupo hidroxilo con proteínas
inhibiendo su acción, concentraciones subletales de eugenol inhibieron la
producción de las amilasas y proteasas de B.cereus. El deterioro de la pared
celular y el alto grado de la lisis celular también se comprobó en otras
investigaciones (Burt, 2004).
Estudios han comprobado la eficacia del aceite esencial del clavo como
antimicrobiano pero todavía no se conoce muy bien su forma de acción, pero se
sabe que el componente responsable de esta actividad antimicrobiana es el
eugenol. Kamel y col. 2007, determinaron la acción antibacteriana del eugenol
54
extraído del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, L.monocytogenes,
E.fecalis, P.aureginosa, S.typhimurium y M.luteus, y determinaron que el menor
diámetro de inhibición fue de 8 mm. Para L.monocytogenes el halo de inhibición
por parte del A.E fue de 15 mm con una DS (desviación estándar) de 0, dando un
resultado muy bueno al compararlo con la gentamicina que dio como resultado un
halo de 38mm sobre este mismo microorganismo.
En otro estudio Fu y col. 2007, realizaron un estudio de la actividad
antimicrobiana del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, P.aureginosa,
B.subtilis y P.vulgaris encontraron que a menor halo de inhibición fue de 9mm
para P.aureginosa y el mayor fue de 18.2mm para P.vulgaris lo cual fueron
resultados óptimos teniendo como control la estreptomicina.
2.4.1.3 Tomillo (Carvacrol y Timol)
El tomillo es una especia proveniente de las plantas del género Thymus spp, y se
le atribuyen propiedades antiespasmódica, expectorante, antiséptica,
antiinflamatoria y otras más (Ettayebi et al.,1999; López, 2006; Bounatirou et al.,
2007). El tomillo es usado en la industria alimentaria como agente saborizante y
aromático y en las preparaciones farmacológicas su aceite esencial esta en le
ranking de los 10 aceites esenciales más usados en el mundo (Solomakos et al.,
2007; Rasooli et al., 2005).
Se sugiere que la presencia y el número de grupos hidroxilo sobre el grupo fenol
de estas moléculas está relacionado con su toxicidad: una mayor hidroxilación es
responsable de una mayor capacidad bactericida. La presencia del grupo hidroxilo
en la molécula de carvacrol, al igual que en el timol, provoca la entrada y el
escape de iones potasio (Figura 13), que conlleva a la disminución del pH, el
aumento en el gasto de energía (ATP) y, finalmente, la muerte celular del
patógeno. (Castillejos, 2005).
55
Figura 11. Esquema sugerido de acción sugerido para el carvacrol sobre la
membrana citoplasmática (Castillejos, 2005)
El aceite esencial que se obtiene del tomillo esta compuesto por 60 componentes
(Solomakos et al., 2007) de los cuales 32 fueron identificados por Bounatirou, y
col. 2007. Los componentes mayoritarios y a los cuales se les atribuye la
capacidad antibacteriana son el timol y el carvacrol y se da alguna responsabilidad
minoritaria a los componente minoritarios como lo son el p-cimeno, -terpineno y
-caryphyleno los cuales pueden actuar de manera sinérgica con el timol y el
carvacrol aumentando su capacidad antimicrobiana (Bounatirou et al., 2007;
Solomakos et al., 2007). Muchos autores discrepan sobre cual es el componente
mayoritario del tomillo (timol ó carvacrol) y dan diferentes porcentajes de
presencia de cada uno. Burt, 2004, en su revisión da que el timol esta entre un 10
a un 64%, el carvacrol está entre un 2 a 11%, el -terpineno entre un 2 a 31% y
que el p-cimeno esta entre un 10 a 56%, por otro lado Bounatirou, y col. 2007,
comentan que el p-cimeno está en mayores cantidades cuando el carvacrol está en
menores cantidades y esto se presenta cuando la parte de la planta que se usa para
la extracción del aceite esencial es muy joven, y aseveran que este aceite es el
precursor del carvacrol.
El timol (figura 14) y el carvacrol (figura 15), son compuestos fenólicos que son
similares estructuralmente difiriendo en la posición del grupo hidroxilo. Como ya
56
se dijo en el apartado anterior, los compuestos con estructura fenólica poseen una
mayor actividad antimicrobiana que los que no la poseen y la presencia y
localización del grupo hidroxilo es un factor importante en esta actividad,
Algunos investigadores, observaron que el carvacrol y el timol actuaban de forma
diferente frente a microorganismos Gram positivos y negativos, también en otros
estudios no se observó la importancia de la posición del grupo hidroxilo, y la
capacidad antimicrobiana del timol y carvacrol fue similar (Castillejos, 2005).
Figura 12. Timol
Figura 13. Carvacrol
El carvacrol y el timol aumentan la permeabilidad de la membrana celular
desintegrando la membrana externa de las bacterias Gram negativas, liberando los
lipolisacáridos (LPS) y aumentando la permeabilidad de la membrana
citoplasmática a ATP (Castillejos, 2005; Burt, 2004). Las mediciones de ATP
57
interno y externo revelaron que el ATP celular interno disminuía mientras que no
había un aumento proporcional en el exterior celular, de acuerdo a esto se
presume que la tasa de síntesis de ATP disminuyo o que la tasa de hidrólisis de
ATP incrementó. En un estudio, se evidenció que las toxinas diarreicas de
B.cereus se vieron inhibidas por la presencia de carvacrol tanto en medio de
cultivo como en sopa y esto puede deberse a que la excreción de la toxina es un
proceso activo, y de acuerdo a las dos presunciones anteriores no hay suficiente
ATP o fuerza protonmotriz (FPM) para exportarla fuera de la célula.
Alternativamente el crecimiento específico da a teorizar que la célula usa la
energía (ATP) para mantener las funciones vitales para sostener su viabilidad,
dejando a un lado la producción de toxinas (Burt, 2004).
El carvacrol interactúa con la membrana uniéndose a la bicapa de fosfolípidos,
provocando la desestabilización de la misma, aumentando su fluidez e
incrementando la permeabilidad pasiva. También, se ha observado el paso de
metabolitos celulares a través de la membrana celular. El potencial de membrana
también disminuye, debilitando la FPM y el gradiente de pH a través de la
membrana (Catillejos, 2005). Se concluye por tanto que el carvacrol crea canales
a través de la membrana empujando las cadenas de ácidos grasos de los
fosfolípidos, permitiendo que los iones abandonen el citoplasma (Burt, 2004).
Por otro lado, el timol se une a las proteínas de membrana de manera hidrofóbica
y por puentes de hidrogeno, lo que cambia las características de la permeabilidad
de la membrana. Estudios demostraron, que el timol tiene un efecto más
inhibitorio en un pH de 5.5 que en uno de 6.5. Al estar en un pH acido la molécula
de timol se vuelve más indisociable y por tanto mas hidrofóbica, y por tanto se
puede unir mejor a las aéreas hidrofóbicas de las proteínas disolviéndose mejor en
la fase lípida (Burt, 2004) lo que puede apoyar la confirmación de la salida de
iones intracelulares de K+
(Castillejos, 2005) por el cambio de la permeabilidad de
la membrana.
58
2.5 Modelo y distribución Weibull
El método convencional para calcular la eficiencia de la inactivación térmica de
los microorganismos en seguridad alimentaria, se basa en el método clásico de los
valores D y z, desarrollado por Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo,1973), el cual se
basa en la hipótesis de que las curvas de supervivencia microbianas y de esporas
bacterianas siguen una cinética de primer orden, apoyándose en el postulado de la
teoría mecanística en la cual la muerte celular es causada por la inactivación de
enzimas vitales ó de complejos enzimáticos.
En consecuencia, el valor D es estimado a partir de la relación lineal que existe
entre el logaritmo de la reducción decimal del número de microorganismos
supervivientes y el tiempo del tratamiento a una temperatura dada. En muchos
casos, en las curvas de supervivencia obtenidas a partir de tratamientos térmicos
no se observa una relación lineal, y por tanto no obedece una cinética de primer
orden, siendo normalmente observado los fenómenos de hombros (concavidades
hacia abajo) y colas (concavidades hacia arriba).
Se han desarrollado y propuesto gran variedad de modelos para la descripción de
las curvas de supervivencia no lineales, algunos de tendencia mecanística o
pseudo-mecanistica o simplemente empíricos. La teoría mecanística postula que
todos los microorganismos de una misma población tienen la misma probabilidad
y por tanto existe una homogeneidad en la población. En contraposición a esta
teoría, está la teoría probabilística, la cual asume que ―en una población, aunque
esta sea pura, existe una variación biológica, en otras palabras, una
heterogeneidad entre las células microbianas‖ (van Boekel, 2002) por tanto, la
muerte celular por la inactivación térmica no está gobernada por modelos
cinéticos de primer orden, hallándose más relacionada a una distribución
exponencial.
Existen gran variedad de modelos para sustentar esta teoría; entre estos el modelo
Weibull es el que gana en popularidad debido a su simplicidad y flexibilidad. Su
59
uso se debe a la aplicación del principio de la parsimonia, el cual postula: que para
un problema existen dos ó más respuestas y entonces la más simple será la
correcta, argumentándose lo anterior en la teoría de la navaja de Ockham la cual
se fundamenta en dos premisas muy simples: ―en igualdad de condiciones la
solución más sencilla es probablemente la correcta” y ―No ha de presumirse la
existencia de más cosas que las absolutamente necesarias”, indicado lo anterior
las explicaciones nunca deben multiplicar las causas sin necesidad. Lo anterior en
pocas palabras indica que el modelo presenta mayor flexibilidad, robustez y
simpleza entre los demás modelos (Mafart et al., 2002; van Boekel, 2002).
El modelo proviene de ingeniería donde se usa para describir el tiempo de fallo en
sistemas mecánicos y electrónicos y es igualmente útil para el análisis de datos de
supervivencia en microbiología, como por ejemplo, el tiempo de muerte luego de
la aplicación de un estrés.
La forma acumulativa de la distribución de Weibull para el análisis de curvas de
supervivencia no lineales (Eq.1) fue empleada (Ruiz et al., 2002):
𝐿𝑛 𝑁
𝑁𝑜 = −
𝑡
𝛼 𝛽
(1)
La cual fue modificada por Mafart et al., 2002 (Eq.2) y esta última es la que se
aplicará en la investigación para la modelización:
𝐿𝑜𝑔 𝑁
𝑁𝑜 = −
𝑡
𝛿 𝑝
(2)
Donde No es el número inicial de microorganismos (CFU/mL), N el número de
supervivientes luego de un tiempo de exposición en un tratamiento térmico t
(CFU/mL), t tiempo del tratamiento (min), δ tiempo de la primera reducción
decimal o factor de escala, p factor de forma (Mafart et al., 2002).
La distribución de Weibull puede ser:
60
a. Cóncava hacia arriba si p<1 (Fig.16B), lo que indicaría que las células
supervivientes tienen menos probabilidad de morir, indicando que estas últimas
son las más resistentes ó tal vez se adaptan al tratamiento.
b. Cóncava hacia abajo si p>1 (Fig.16A), que indicaría que las células supervivientes
se volverían mas termosensibles, en otras palabras; el daño acumulado provocado
haría más difícil que las células sobrevivan.
c. Y seguiría una distribución exponencial si p=1 (Fig.16C), lo que indica que la
probabilidad de muerte de las células no depende del tiempo, o en otras palabras,
cada célula es igualmente susceptible no importando cuanto dure el tratamiento.
La hipótesis implícita es que no existe variación biológica, por lo que se ajustaría
a una cinética de primer orden clásica (valores D y z). (Mafart et al., 2002; Van
Boekel, 2002; Chen and Hoover, 2004).
61
Figura 14. Ejemplo Modificado de concavidades (A) Concavidad hacia abajo
p>1, (B) Concavidad hacia arriba p<1 (C)Distribucion exponencial p=1. (Van
Boekel, 2002).
62
2.6 Factor de exactitud (Af)
La microbiología predictiva (M.P.) comprende el estudio de la respuesta de
crecimiento o de inhibición de microorganismos patógenos o alteradores
presentes en alimentos en función de factores que la afecten (ºT, pH, aw, etc.), y a
partir de estos datos predecir lo que sucederá durante el almacenamiento,
procesado, etc.
La M.P. es una tecnología de vanguardia para el aseguramiento de la inocuidad
alimentaria, la optimización de procesos y recursos, y mejoramiento de sistemas
de gestión de la calidad; permite evaluar objetivamente y cuantitativamente el
efecto de las operaciones de procesamiento, distribución y almacenamiento en la
calidad microbiológica de los alimentos, usando modelos matemáticos y técnicas
computacionales.
La M.P. combina la matemática, la estadística, los sistemas de información y la
tecnología. Esto conduce al desarrollo de modelos, los cuales reducen el tiempo
de experimentación, los costos, el recurso humano y el material.
En la microbiología predictiva, es necesario que los modelos y las predicciones
realizadas sean lo más seguras posibles, y para esto es necesario tener un índice o
un valor que evalue los modelos indicando si el modelo es seguro y no tiende a
fallos o por el contrario es un modelo inseguro y con tendencia a fallar. Para esto
Ross, 1996 sugirió el Factor de exactitud (Af) (Eq.3) como índice de evaluación
de los modelos:
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 𝐴𝑓 = 10 Σ log (𝐺𝑇𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑐 𝑜 𝐺𝑇𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 )/𝑛) (3)
La ecuación 3 esta generada para modelos de crecimiento, y para esta
investigación se usara el modelo de exactitud modificado por Ruiz et al., 2002
(Eq.4):
63
𝐴𝑓 = 10 Σ 𝐿𝑜𝑔 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 −𝐿𝑜𝑔 𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑐 𝑜𝑠
𝑛 (4)
La ecuación 4 es más útil para la aplicación a modelos de inactivación térmica y
proporciona una medida de la media de precisión de las estimaciones, si el Af>1
existe una correlación pero con cierta desviación, es decir, existe una buena
correlación entre los valores predichos y los experimentales pero no es exacta, si
Af=1 existe una correlación exacta, denotando que los valores experimentales y
los de la predicción encajan perfectamente, en ambos casos los modelos son
seguros y la probabilidad de fallo es mínima; no obstante si Af<1 indica que no
existe correlación entre los valores predichos y los experimentales, y el modelo
puede ser inseguro, con tendencia a fallos.
64
3. JUSTIFICACIÓN
La integración de los mercados gracias a la globalización, y la nueva tendencia del
consumo de alimentos listos para consumir (precocinados, refrigerados o
congelados) que demanden un tiempo mínimo para su preparación y cocción antes
de su consumo, han incrementado el riesgo de las ETAs.
Uno de los principales patógenos de interés en la industria alimentaria es Listeria
monocytogenes, causante de la listeriosis. La mayor incidencia de esta enfermedad
en humanos está asociada al consumo de alimentos contaminados con el
microorganismo debido a su presencia en gran cantidad de productos, gracias a su
capacidad de crecimiento y supervivencia a distintos tratamientos y en diversas
condiciones de almacenamiento.
En la actualidad, para la conservación de alimentos se utilizan tratamientos
térmicos, los cuales afectan su calidad organoléptica y conservantes químicos que
son potencialmente peligrosos para la salud humana. Por lo anterior, los
consumidores de esta nueva era, demandan alimentos mínimamente procesados y
tratados, que posean sus características organolépticas intactas en lo posible, y
sean seguros para su salud. Por tanto, las técnicas de conservación a usar para
satisfacer las demandas del consumidor no deben ser agresivas y los conservantes
aplicados deben ser naturales; con la capacidad de prolongar la vida útil de los
alimentos en las despensas por un tiempo igual o mayor que los conservantes
químicos, salvaguardando principalmente la salud del consumidor.
Los tratamientos térmicos han demostrado ser efectivos para el control de
microorganismos patógenos alimentarios, pero el empleo de un único tratamiento
no es suficiente para asegurar su eliminación, por ende la combinación de 2
tratamientos es precisa para garantizar la inocuidad del alimento. Separadamente,
la exigencia de alimentos mínimamente tratados y procesados por parte de los
consumidores, ha contemplado la necesidad de disminuir el tiempo y/o la
potencia de los tratamientos térmicos junto con la eliminación de los conservantes
químicos, para proporcionar alimentos naturales con la mayoría de sus
65
características organolépticas intactas, por lo que se ha hecho urgente la
innovación de nuevas técnicas de conservación.
Desde tiempos antiguos, se conocen y reconocen las propiedades antimicrobianas
de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. La aplicación de los
diversos componentes antimicrobianos naturales, que han sido usados en los
alimentos para su conservación y sazonamiento, son el blanco y el objetivo de
muchas investigaciones, para determinar el efecto de éstos, sobre los
microorganismos patógenos de interés industrial, y su efectividad como
conservantes alimentarios.
Por estos motivos, se ha estudiado el efecto de los tratamientos térmicos,
isotérmicos y no isotérmicos, por separado y en combinación con los aceites
esenciales de tomillo y clavo para el control de Listeria monocytogenes (in vitro),
determinando el mejor tratamiento o la mejor combinación de tratamientos para
su aplicación sobre un alimento (in vivo), determinando el efecto y dando un gran
avance para el uso de estas sustancias en la industria alimentaria.
66
4. OBJETIVOS
General
Evaluar y determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos,
de manera individual y en combinación con los aceites esenciales de tomillo y
clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes.
Específicos
Determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a
60ºC en la supervivencia de L.monocytogenes in vitro.
Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC
en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de tomillo en la
supervivencia de L.monocytogenes in vitro.
Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC
en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de clavo en la s
supervivencia de L.monocytogenes in vitro.
Aplicar y evaluar las mejores combinaciones de tratamientos térmicos y aceites
esenciales de tomillo ó clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes en un
alimento.
67
5. HIPOTESIS
La supervivencia de Listeria monocytogenes no se verá afectada
significativamente por los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, ni por la
combinación de estos con los aceites esenciales de tomillo y clavo.
5.1 Predicciones
H0= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC no afectarán de
manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.
Ha= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC afectarán de
manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.
H0= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación
con los aceites esenciales de tomillo y clavo, no afectarán de manera significativa
la supervivencia de Listeria monocytogenes.
Ha= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación
con los aceites esenciales de tomillo y clavo, afectarán de manera significativa la
supervivencia de Listeria monocytogenes.
68
6. MATERIALES Y METODOS
6.1 Materiales
6.1.1 Microorganismo
Se utilizó la cepa de Listeria monocytogenes CETC 4032, procedente de la
Colección española de cultivos de tipo CECT (Valencia, España), la cual se activo
en caldo B.H.I y luego se realizo aislamiento en placas de agar Oxford, estas
placas se mantuvieron en refrigeración durante la experiencia, y se criopreservó el
microorganismo en tubos ependorf a -80ºC, garantizando su pureza.
6.1.2 Medios de cultivo
Los medios de cultivos utilizados pertenecen a la casa comercial Scharlau Chemie
S.A. (Barcelona, España)
Agua de peptona tamponada: peptona 10 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfato
disodico 9 g/L, fosfato potásico 1.5 g/L.
Caldo infusión cerebro corazón (B.H.I.): extracto de cerebro 12.5 g/L, extracto
de corazón 5 g/L, peptona 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfato
di-sodio 2.5 g/L.
Agar infusión cerebro corazón (B.H.I.A.): extracto de cerebro 12.5 g/L,
extracto de corazón 5 g/L, peptona de proteasa 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de
sodio 5 g/L, fosfato di-sodio 2.5 g/L, agar 15 g/L.
B.H.I.A. 5% NaCl: agar B.H.I.A suplementado con cloruro de sodio en
porcentaje m/v (el cloruro de sodio que se usara es de la casa comercial Panreac
química S.A.).
69
6.1.3 Aceites esenciales
Los aceites esenciales de tomillo y clavo usados en esta investigación provinieron
de la casa comercial IBERCHEM y se conservaron a temperatura de refrigeración
(2-5ºC aprox.) para evitar su evaporización.
6.1.4 Equipos
Termorresistómetro Mastia (patente española 200302529)
Centrifugadora: Heraeus labo fuge 400R. (Kendro laboratory products)
Incubadora
Vortex
Autoclave
Baño termostatado.
Nevera
Dataloger
6.1.5 Materiales
Cajas de petri 14 x 90 mm
Frascos tapa rosca de 500 mL
Frascos tapa rosca de 100 mL
Tubos de 16 x 150 mm
Tubos 12 x 75 mm
Asa.
Balanza
Microscopio
Pipeta automática de 10 a 100L y de 100 a 1000L
Puntas para pipetas automáticas
Gradillas
Mechero
70
Jeringa de 5 mL
Aguja hipodérmica para jeringa de 5 mL
Dispensador
Tubos falcon
6.2 Metodología
6.2.1 Activación del microorganismo
En condiciones de esterilidad, se tomó una colonia del microorganismo del medio
Oxford refrigerado, procedimiento descrito en el apartado 6.1, y se inoculó en 50
mL de medio de cultivo BHI estéril, y posteriormente se incubó a 37ºC por 24h.
Luego del cultivo anterior, en condiciones de esterilidad, se traspasaron 100L a
50mL de medio líquido BHI estéril y se incubó a 37ºC por 24h. De este último
cultivo se realizaron hasta tres pases a nuevos medio de cultivo, y luego fue
necesario realizar una nueva activación.
6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro
En condiciones de esterilidad se tomaron los 50 mL del cultivo activado, se
transvasaron a tubos falcón (25 mL de cultivo por tubo), y se centrifugaron a 3500
rpm durante 20 minutos a 5ºC. Luego en condiciones de esterilidad se descartó el
sobrenadante y se adicionó 1 mL (por tubo) de agua peptonada estéril, y se agitó
en vortex hasta que la suspensión estuvo homogénea. Luego se recuperaron estas
suspensiones (2 mL de suspensión final) en una jeringa estéril de 5mL con aguja
hipodérmica estéril.
6.2.2 Recuento inicial
De la suspensión del termorresistómetro, en condiciones de esterilidad, se
tomaron 100L y se pasaron a un tubo con 9 mL de agua peptonada estéril,
teniendo como resultado una dilución de 10-2
.
71
Luego se realizaron diluciones seriadas, en agua peptonada estéril, hasta la
dilución 10-9
, y se sembraron en profundidad las diluciones 10-5
, 10
-6, 10
-8, 10
-9
en medio sólido BHIA y se incubo durante 24h a 37ºC. Pasado este tiempo se
realizó el recuento de las placas para determinar la concentración del inoculo.
6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC
Se adicionaron 350 mL de medio de cultivo líquido BHI al vaso del
termorresistómetro, y se esterilizó en el mismo a 135ºC durante 30 segundos, con
agitación de 10 rpm (que se mantuvo constante), seguido se programó el
termorresistómetro para que automáticamente descendiera y estabilizará la
temperatura a 55 ó 60ºC durante todo el experimento. Cuando la temperatura
estuvo estabilizada se adicionaron los 2mL de la suspensión preparada para el
termorresistómetro y las muestras se tomaron en los tiempos que indica la tabla 1.
Tabla 1. Tiempo de muestreo en los tratamientos isotérmicos por temperatura
ºT: 55ºC
t(min) muestreo 0 5 10 15 20 25 30
ºT: 60C
t(min) muestreo 0 0.5 1 1.5 2 3 5
En condiciones de esterilidad se tomaron 4mL de muestra en tubos de ensayo
estériles, e inmediatamente se pusieron en hielo para cortar el efecto de la
temperatura sobre el microorganismo.
Las muestras se sembraron en medio sólido BHIA para la recuperación de las
células supervivientes y lesionadas, y en medio BHIA+NaCl 5%, medio selectivo
para la recuperación de las células supervivientes. Las diluciones que se
sembraron de las muestras con tratamiento isotérmico a 55ºC, en medio BHIA y
BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 2.
72
Tabla 2. Diluciones a realizar y sembrar para el tratamiento isotérmico a 55ºC
(en base 10)
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 -5, -6, -7
5 -5, -6, -7
10 -4, -5, -6, -7
15 -4, -5, -6, -7
20 -4, -5, -6, -7
25 -2, -4, -6
30 -2, -4, -6
Las diluciones que se sembraron de las muestras con tratamiento isotérmico a
60ºC, en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 3.
Tabla 3. Diluciones a realizar y sembrar para el tratamiento isotérmico a 60ºC (en
base 10)
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 -5, -6, -7
0.5 -3, -4, -6
1 -2, -3, -4, -5
1.5 -2, -3, -4, -5
2 -1, -2
3 0, -1, -2
5 0, -1
Las placas de medio BHIA fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC, y las de
BHIA+NaCl 5% durante 48h a 37ºC. Los tiempos y las diluciones se han
especificado de acuerdo a trabajos realizados por el grupo investigador de
microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los experimento se realizó
por triplicado.
6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC
Se adicionaron 350 mL de medio de cultivo líquido BHI al vaso del
termorresistómetro, y se esterilizó en el mismo a 135ºC durante 30 segundos, con
73
agitación de 10 rpm (que se mantuvo constante), seguido se programó el
termorresistómetro para que automáticamente descendiera y estabilizará la
temperatura a 24ºC, cuando la temperatura estuvo estable se programo el
termorresistómetro para que realizará el perfil de temperaturas deseado. Cuando la
programación estuvo lista, se adicionaron los 2mL de la suspensión para el
termorresistómetro, y se inició el programa. Cada tratamiento tuvo 2 rampas de
calentamiento (preestablecidas de acuerdo a investigaciones previas realizadas por
el grupo de investigación de microbiología de alimentos de la UPCT) y la
temperatura final se mantuvo durante un cierto periodo de tiempo. Con ayuda de
registrador Almemo 3290, se registró la temperatura del medio cada segundo
durante el tratamiento. Los valores de las rampas se aprecian en la tabla 4.
Tabla 4. Perfil de temperaturas para los tratamientos no isotérmicos. Rango de
temperaturas y velocidades por perfil.
N.I 55ºC N.I 60ºC
Rampa Rango ºT Velocidad (ºC/min) Rango ºT Velocidad (ºC/min)
1 24-44ºC 30 24-49ºC 30
2 44-55ºC 12.5 49-60ºC 12
En condiciones de esterilidad, se tomaron 4mL de muestra en tubos de ensayo
estériles, e inmediatamente tomadas se colocaron en hielo para cortar el efecto de
la temperatura sobre el microorganismo.
Las muestras se sembraron en medio sólido BHIA para la recuperación de las
células supervivientes y lesionadas, y en medio BHIA+NaCl 5%, medio selectivo
para la recuperación/identificación de las células dañadas. Los tiempos de
muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento no isotérmico a
55ºC, en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 5.
74
Tabla 5. Tratamiento no isotérmico a 55ºC, tiempo de muestro y diluciones a
sembrar (en base 10).
Tiempo (min)
muestra
Diluciones a sembrar
(10x) sin NaCl
Diluciones a sembrar
(10x) con NaCl
0 -5, -6, -7 -5, -6, -7
1 -5, -6, -7 -5, -6, -7
2 -5, -6, -7 -5, -6, -7
3 -5, -6, -7 -5, -6, -7
13 -5, -6, -7 -2, -3, -4
23 -2, -4, -6 -2, -4, -6
33 -2, -4, -6 -2, -3, -4
43 -2, -3, -4 -2, -3, -4
53 0, -1, -2 0, -1, -2
63 0, -1, -2 0, -1, -2
Para el tratamiento no isotérmico a 60ºC, los tiempos de muestreo y las
diluciones que se sembraron en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en
la tabla 6.
Tabla 6.Tratamiento no isotérmico a 60ºC, tiempo de muestro y diluciones a
sembrar (en base 10).
Tiempo (min)
muestra
Diluciones a sembrar
(10x) sin NaCl
Diluciones a sembrar
(10x) con NaCl
0 -5, -6, -7 -5, -6, -7
1 -5, -6, -7 -5, -6, -7
2 -5, -6, -7 -2, -4, -6
3 -2, -4, -5 -2, -4, -5
4 0, -2, -4 0, -2, -4
5 0, -2, -4 0, -2, -4
6 0, -2, -4 0, -2, -4
7 0, -2, -4 0, -2, -4
8 0, -2, -4 0, -2, -4
Las placas de medio BHIA, fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC y las de
BHIA+NaCl 5% durante 48h a 37ºC. Los tiempos y las diluciones, se
especificaron de acuerdo a trabajos realizados por el grupo investigador de
microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los experimentos se realizó
por triplicado.
75
6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites
esenciales de tomillo y clavo.
El procedimiento utilizado para esta prueba, fue el mismo que el descrito en el
apartado 6.3.3, adicionando los aceites esenciales a las concentraciones de 0.01%
y 0.05%, cada aceite esencial será evaluado por separado. Las concentraciones a
trabajar se han especificado de acuerdo a trabajos realizados por el grupo
investigador de microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los
experimento se realizara por triplicado.
Los tiempos de muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento
isotérmico a 55ºC con A.E. clavo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y
BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 7 y 8.
Tabla 7 Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de
muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA.
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, -5
1 -1, -2, -3
2 0, -1, -2
3 0, -1, -2
4 0, -1, -2
Tabla 8. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.05%, tiempo de
muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, 5
3 0, -1, -3, 5
6 0, -1, -3, 5
9 0, -1, -2
12 0, -1, -2
15 0, -1, -2
76
Los tiempos de muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento
isotérmico a 55ºC con A.E. tomillo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y
BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 9 y 10.
Tabla 9. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de tomillo al 0.01%, tiempo
de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, -5
1 0, -1, -2
2 0, -1, -2
3 0, -1, -2
4 0, -1, -2
.
Tabla 10. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de tomillo al 0.01%, tiempo
de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, -5
3 0, -1, -3, -5
6 0, -1, -3, -5
9 0, -1, -2
12 0, -1, -2
15 0, -1, -2
Los tiempos de muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento
isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y
BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 10 y 11.
Tabla 11. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo
de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA.
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 -1, -2, -3
10 -1, -2, -3
15 0, -1, -3
30 0, -1, -2
60 0, -1, -2
90 0, -1, -2
77
Tabla 12. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo
de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, -5
10 0, -1, -3, -5
15 0, -1, -3
30 0, -1, -2
60 0, -1, -2
90 0, -1, -2
Los tiempos de muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento
isotérmico a 60ºC con A.E. tomillo 0.01% y 0.05% en medio BHIA y
BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 13.
Tabla 13. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de tomillo 0.01% y 0.05%,
tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10).
t(min)
muestra
Diluciones a
sembrar (10x)
0 0, -1, -3, -5
10 0, -1, -3, -5
15 0, -1, -3
30 0, -1, -2
60 0, -1, -2
90 0, -1, -2
6.2.6 Tratamientos sobre el alimento
Se evaluaron 3 diferentes tipos de sopa comercial a las cuales se les determino pH
y sólidos solubles, eligiendo la crema que ofreciera el pH más cercano a la
neutralidad para ser utilizada para aplicar los tratamientos. Al alimento
seleccionado se le determino la carga microbiana inicial realizando siembra de las
diluciones 100,10
-1, 10
-2 y 10
-3. El procedimiento utilizado para la realización de
los tratamientos fue el mismo que el descrito en la sección 6.3.5.
Para el tratamiento con los antimicrobianos se utilizo el doble de la concentración
efectiva en los tratamientos in vitro de acuerdo la bibliografía consultada y a
78
trabajos realizados por el grupo investigador de microbiología de alimentos de la
UPCT. Cada tratamiento se realizo por triplicado.
6.3 Análisis Estadístico de los datos
A los datos obtenidos se les realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) utilizando
el software estadístico Statgraphics para establecer las diferencias significativas
entre las diferentes combinaciones probadas y sus replicas.
Las curvas obtenidas en los diferentes tratamientos (temperatura, aceites
esenciales y su combinación), se generaron graficando el Log de los
supervivientes contra el tiempo de tratamiento. Los parámetros obtenidos fueron
evaluados a partir de la distribución de Weibull.
Si la inactivación del microorganismo por la exposición a los tratamientos sigue
una distribución de Weibull, la función de supervivientes podría ser:
𝑆 𝑡 = 𝑒− 𝑡𝑎 𝑛
Donde: S(t) = fracción de supervivientes
t = tiempo
a = parámetro escala
n = parámetro de forma (describe la forma de la curva).
7 Resultados y Discusión
Los resultados obtenidos que se presentarán y discutirán a continuación se les
realizo un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software estadístico
Statgraphics. Obteniéndose como resultado que no existieron diferencias
estadísticamente significativas (p>0,05) entre las diferentes combinaciones
probadas y sus replicas.
79
7.1 Tratamientos térmicos
Se realizaron tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, para observar el
comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 utilizando las graficas de
supervivencia, con el propósito de determinar el tratamiento que presentaba las
mejores condiciones y así evaluar el efecto producido sobre el patógeno al
combinarlo con aceites esenciales de clavo y tomillo.
7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC
Luego de aplicar el tratamiento isotérmico a 55ºC por un tiempo de 30 minutos, se
obtuvo una disminución de un ciclo logarítmico (4,43x107 UFC/mL) en el medio
BHIA con respecto a la población inicial (8,93x108 UFC/mL) y de 4 ciclos
logarítmicos (8x104 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl con respecto a la
población inicial (6,8x108 UFC/mL) (figura 15). En la tabla 14, se muestran los
valores D, junto con los intervalos de confianza (IC), R2 y coeficiente de
correlación (r0).
Figura 15. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones
isotérmicas (55ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 10 20 30 40
Lo
g u
fc/m
l
Tiempo (min)
55º ISO
NaCl 55ºC
80
Tabla 14. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a
55ºC.
D(a) ICs ICi R
2
Sin NaCl 23,19 48,83 2,02 0,99
NaCl 7,30 16,33 1,17 0,97
(a) Media de tres réplicas
Como puede observase en el medio de recuperación no selectivo, el cual permite
el crecimiento de todas las células (tanto lesionadas como no lesionadas), se
obtuvo un D55=23,19, indicando que la población de Listeria monocytogenes
CETC 4032 disminuye un ciclo logarítmico tras 23 minutos de tratamiento en
promedio, y permite deducir que el microorganismo posee una alta
termorresistencia a estas condiciones
En comparación, en el medio de recuperación selectivo, que solo permite el
crecimiento de células no lesionadas letalmente por el tratamiento térmico, se
obtuvo un D55NaCl=7,30, indicando que la exposición del microorganismo a un
factor adicional reduce en más de 10 veces el tiempo necesario para disminuir la
población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico. En la figura
15, se puede observar que casi la mitad de la población sufre daños sub-letales por
el tratamiento térmico aplicado, corroborándose así uno de los principios de la
teoría probabilística, el cual postula que “en un cultivo puro existe una
heterogeneidad entre las células” (Van Boekel, 2002). Los resultados anteriores,
se asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación, en la cual
determino que el D55 para Listeria innocua en un medio selectivo es de 10,66
minutos con un R2 de 0,97.
Los resultados anteriores, conllevan a deducir que la población de
L.monocytogenes CETC 4032 después de aplicarle un proceso isotérmico a 55ºC
81
durante 30 minutos se reduce en: i) un 50% si el microorganismo posteriormente
del tratamiento se recupera en un medio que contenga un elemento de inhibición
adicional y ii) en un 10% si el medio carece de este componente. Esto sugiere,
que el daño causado a la población es a nivel de factores vitales de crecimiento y
de recuperación, pudiendo ser estos enzimas o proteínas.
Cuando se aplico el tratamiento isotérmico a 60ºC por un tiempo de 5 minutos, se
obtuvo una disminución de 6 ciclos logarítmicos (1,92x103 UFC/mL) con
respecto a la población inicial (1,25x109 UFC/mL) en el medio BHIA y de 7
ciclos logarítmicos (4,83x101 UFC/mL) con respecto a la población inicial
(6,32x108 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl. Cabe resaltar, que la población
inicial en el medio de recuperación selectivo se encontraba 1 ciclo logarítmico
por debajo con respecto a la población inoculada (4,8x109 UFC/mL) y a la del
medio de recuperación no selectivo, como se observa en la figura 16, evento que
no sucedió en el tratamiento a 55ºC. En la tabla 15, se especifican los valores D
junto con los IC, R2 y r0.
Figura 16. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones
isotérmicas (60ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6
Lo
g U
FC
/mL
Tiempo (min)
60ºC NaCl
60ºC
82
Tabla 15. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a
60ºC.
D(a) ICs ICi R2
BHIA 0,87 2,02 0,16 0,96
BHIA+NaCl 0,78 2,39 0,26 0,83
(a) Media de tres replicas
Como puede notarse, el valor D60 en el medio de recuperación no selectivo fue de
0,877, lo que sugiere que es necesario un tiempo de 0,88 minutos, para disminuir
la población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico, y que el
microorganismo bajo esta condición no presenta una alta resistencia al
tratamiento.
Sin embargo, en el medio de recuperación selectivo se obtuvo un D60NaCl= 0,783,
indicando que son necesarios 0,78 minutos para disminuir la población 1 ciclo
logarítmico, pero como se comento anteriormente, la población inicial fue 1
unidad menos en comparación con la del cultivo inoculado y con la población
inicial del medio no selectivo. Este resultado, apunta a que un 10% de la
población sufrió un daño letal con el simple hecho de ponerla en contacto con el
medio a la temperatura de tratamiento, sugiriendo, que el daño producido pudo
haber sido sobre componentes celulares, los cuales son importantes para la
recuperación y crecimiento de L.monocytogenes CETC 4032. Estos valores, no se
asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación con Listeria
innocua donde obtuvo un D60 de 2,73 en un medio no selectivo y de 1,08 en un
medio selectivo, apuntando esto a que posiblemente L.monocytogenes es menos
termorresistente que L.innocua en un tratamiento isotérmico a 60ºC.
Estos resultados, señalan que el daño recibido por L.monocytogenes CETC 4032 a
causa de un tratamiento isotérmico a 60ºC es letal, logrando una termodestrucción
de más del 50% de la población, tanto en el medio selectivo como en el no
selectivo tras 5 minutos de tratamiento. Si el medio en el cual el microorganismo
83
se encuentra, no contiene un factor de inhibición adicional menos del 50% de la
población podrá recuperarse, pero si el medio presenta un factor de inhibición
adicional solamente un 10% de la población sería capaz de recuperarse.
A partir de los resultados obtenidos se calcularon los valores z que se presentan en
la tabla 16.
Tabla 16. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos.
D55 D60 Z
BHIA 23,19 0,88 3,51
BHIA NaCl 7,30 0,78 5,16
De acuerdo, con los resultados anteriores, se puede deducir que aplicar un
tratamiento isotérmico a 55ºC no es efectivo para la termodestrucción de
L.monocytogenes CETC 4032, pues el D obtenido es demasiado alto y sería
necesario un mayor tiempo para una disminución significativa de la población,
opción que no es muy favorable, si el tratamiento se quisiera evaluar sobre un
alimento. Pero si el alimento tratado, contiene otros factores de inhibición de
crecimiento como: pH, aw, atmosfera modificada, entre otros, puede que el
tratamiento sea más efectivo, produciendo una reducción significativa en el
tiempo de tratamiento, siendo muy interesante su evaluación.
En el caso de un tratamiento a 60ºC, los resultados obtenidos son destacables,
pues en un tiempo relativamente corto se reduce la población en casi el 50% y en
presencia de un factor de inhibición adicional se destruye cerca del 90%, con una
disminución de casi un 10% al contacto del microorganismo con el medio, siendo
el tratamiento propicio para ser evaluado en un alimento y observar el
comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032, incluso también podría
evaluarse si el alimento ó alguno de sus componentes influyesen en un aumento o
disminución del efecto del tratamiento sobre el microorganismo.
84
7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC
El estudio del comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 bajo condiciones
de inactivación no isotérmicas (55ºC y 60ºC), asemejan las condiciones reales
durante un proceso de pasteurización, tratamiento que es empleado en la industria
alimentaria, lo cual concibe un mayor interés en su evaluación e investigación.
Los tratamientos se realizaron conforme a los perfiles de aumento de temperatura
establecidos en la metodología (ver tabla 4) presumiendo una disminución del
valor D y en consecuencia un incremento en la reducción de la población,
partiendo de la suposición, de que un tratamiento no isotérmico es más letal que
un tratamiento isotérmico. Al efectuar el tratamiento a 55ºC, exclusivamente con
el aumento de temperatura establecido en la metodología, no se observó una
reducción importante en la población de L.monocytogenes CETC 4032, durante el
tiempo que requirió el termorresistometro para lograr que el medio de evaluación
alcanzase la temperatura final de tratamiento, el cual fue de 3 minutos
aproximadamente. Resultados similares, se obtuvieron en el tratamiento a 60ºC.
Al ver que los resultados obtenidos eran contrarios a los esperados se adicionó un
perfil isotérmico, el cual tenía como temperatura establecida la temperatura final
de cada tratamiento, de acuerdo con lo propuesto por Conesa et al., 2003 en su
investigación.
En la figura 17, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC
4032 elaborada a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 55ºC en
ambos medios:
85
Figura 17. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no
isotérmicas (N.I) a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.
Si se amplía lo sucedido durante el periodo no isotérmico (0-3 min) del
tratamiento se observa lo siguiente (fig. 18):
Figura 18. Comportamiento de la población de L.monocytogenes CETC 4032
durante el perfil N.I a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
7,000
8,000
9,000
0 10 20 30 40 50 60 70
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
N.I 55
N.I 55 NaCl
7,000
7,200
7,400
7,600
7,800
8,000
8,200
8,400
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
55ºC
55ºC NaCl
86
Estos resultados apuntan a que durante el periodo del aumento gradual de
temperatura, la población del microorganismo no disminuye, lo cual ya ha sido
comentado, dándose la disminución durante el perfil isotérmico (60 minutos).
En la tabla 17, se muestran los valores D, IC, r0 y R2 calculados para este
tratamiento. No obstante, se podría sugerir que estos resultados pertenecen más a
un tratamiento isotérmico que a uno no isotérmico y por tanto los valores D
calculados son fiables, debido a la disminución exponencial de la población.
Tabla 17. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no
isotérmico a 55ºC.
D ICs ICi R2
DNI55 13,16 28,92 1,86 0,96
DNI55NaCl 10,52 23,97 1,87 0,93
Si se detallara el comportamiento del microorganismo durante los 63 minutos de
duración del tratamiento, podría decirse, que en el medio de recuperación no
selectivo durante los 3 primeros minutos la población se mantuvo en el mismo
nivel, a los 10 minutos siguientes la población disminuyo 2 ciclos logarítmicos
(3,67x106 UFC/mL) y al minuto 63 la población había disminuido 5 ciclos
logarítmicos (3,63x103 UFC/mL), todo lo anterior con respecto a la población
inicial en el mismo medio (1,67x108 UFC/mL). Mientras, en el medio de
recuperación selectivo durante los 3 primeros minutos, la población disminuyo un
ciclo logarítmico (1,33x107 UFC/mL), a los 10 minutos siguientes, se observó una
disminución de 3 unidades logarítmicas, y al minuto 63, la población había
disminuido 6 ciclos logarítmicos (1,36x102 UFC/mL) con respecto a la población
inicial (1,47x108 UFC/mL) en el mismo medio.
De acuerdo con lo anterior, se podría inferir varios comportamientos de
L.monocytogenes CETC 4032 frente al tratamiento y la repercusión del mismo
sobre el microorganismo. En la grafica 17, se puede observar que la disminución
87
de la población luego de los 3 primeros minutos sucedió de manera exponencial,
pero desde el minuto 33 hasta el 43 la población de L.monocytogenes CETC 4032
generó una resistencia al tratamiento térmico de casi 10 minutos en ambos
medios. Lin, et al., 2003 en su investigación con L.monocytogenes encontró que
luego de aplicar un tratamiento térmico al microorganismo, este incremento su
tolerancia a otros factores de inhibición, como el NaCl, a modo de efecto
secundario, resultado que concuerda con lo observado en nuestra investigación.
Aunque el microorganismo incremento su resistencia al tratamiento durante un
corto periodo de tiempo, se puede presumir que durante la fase de calentamiento,
el microorganismo experimento un daño letal, posiblemente al aumento rápido de
la temperatura, lo cual se vio reflejado en la disminución de la población y en la
reducción de casi 10 veces el valor D en comparación con el obtenido en el
tratamiento isotérmico.
En la figura 19, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC
4032 a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 60ºC en ambos
medios. Se puede observar, que durante los primeros 2 minutos de tratamiento se
produce la aparición de hombros, apuntando esto a una acumulación de daños
letales por parte del microorganismo debido al efecto de la temperatura, lo cual
provocó una reducción en la población, confirmándose lo anterior en los tiempos
subsiguientes, donde se detalla una disminución exponencial de casi la mitad de la
población a los 4 minutos en el medio no selectivo y de casi un 90% al quinto
minuto en el medio selectivo; sin embargo, posteriormente se evidencia la
presencia de colas que de acuerdo con los resultados obtenidos por Mafart et al.,
2002; Aragao et al., 2007 y van Boekel, 2002, indica que la población
superviviente ha generado una resistencia tal al tratamiento que su eliminación es
complicada.
88
Figura 19. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no
isotérmicas (N.I) a 60ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.
La fase de calentamiento ocasionó daños letales en L.monocytogenes CETC 4032,
resultados similares se obtuvieron en el tratamiento a 55ºC, sin embargo, a
diferencia del anterior, este tratamiento no fue más eficaz que el isotérmico a la
misma temperatura. En la grafica de inactivación térmica del microorganismo
durante el tratamiento, se observó la presencia de los fenómenos de hombros y
colas, a consecuencia de esto, los valores D calculados empleando el método
tradicional propuesto por Bigelow, no son fiables, ver tabla 18. Fernández et al.,
1999, sugirieron que en este tipo de resultados el valor D debe ser determinado,
considerando la sección lineal de la curva, lo cual no se pudo llevar a cabo en este
caso, dado que tan solo se tomarían en cuenta 3 datos lo que no es un número de
datos estadísticamente representativo.
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
6,000
7,000
8,000
9,000
0 2 4 6 8 10
N.I 60ºC
N.I 60ºC NaCl
89
Tabla 18. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no
isotérmico a 60ºC.
D ICs ICi R2
DNI60 1,32 3,27 0,32 0,88
DNI60NaCl 0,92 2,15 0,18 0,92
A partir de los resultados obtenidos de los tratamientos se calcularon los valores Z
que se presentan en la tabla 19.
Tabla 19. Valores Z obtenidos para tratamientos no isotérmicos.
D55 D60 Z
N.I 13,16 1,32 5,00
N.I NaCl 10,52 0,92 4,72
El aumento de la termorresistencia por parte de L.monocytogenes CETC 4032
durante los tratamientos no isotérmicos, puede deberse a la activación de genes
que producen cambios en la composición de su membrana y/ó producción de
proteínas de shock térmico (HPS) (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006)
dándose esta activación durante la fase de calentamiento.
7.1.2.1 Predicciones
Con los resultados experimentales obtenidos a partir de los tratamientos no
isotérmicos, se aplicó el valor F para la predicción del comportamiento del
microorganismo. Las predicciones se realizan, con objeto de poder extrapolar los
tratamientos a medios ó alimentos con características parecidas ó similares al
medio utilizado, dando un avance en el conocimiento de la cinética de muerte de
L.monocytogenes CETC 4032 frente a los tratamientos aplicados.
90
De acuerdo a Periago et al., 2004, la eficacia de un proceso de preservación
térmica tiende a ser evaluado en términos de valores F. Los valores F, son
calculados utilizando la integración del efecto acumulativo del cambio de
temperatura durante el tratamiento del organismo blanco o espora incorporándolo
en la formula (Eq.5).
𝐹 = 10T−TR
Z (5)
Donde T es la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la
temperatura de referencia (ºC) y Z es el incremento de temperatura necesario para
reducir en un ciclo logarítmico el valor D a la temperatura de referencia (TR) en
un tratamiento isotérmico.
El valor F puede definirse como el efecto equivalente de f minutos a TR
(asumiendo un calentamiento y enfriamiento instantáneo), sumando todos los
efectos letales producidos durante todas las combinaciones de tiempo y
temperaturas durante el tratamiento (Stumbo, 1973). Los tratamientos no
isotérmicos, se pueden considerar como tratamientos isotérmicos de muy corta
duración a temperaturas progresivamente altas (Conesa et al., 2003)
A partir de los datos obtenidos por el registrador de temperaturas, se realizó la
integración de las temperaturas (Valor F) utilizando la ecuación 5 en todos los
tiempos; con los resultados obtenidos se aplico la ecuación 6 (Eq.6) para la
obtención de la población superviviente teórica (tablas 20, 21, 22 y 23).
𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔 𝑁0 – 𝐹
𝐷 (6)
Donde N es el número de células supervivientes, N0 es la población en el tiempo
0, F es la letalidad integrada y D es el tiempo de reducción decimal isotérmico a la
temperatura final del tratamiento no isotérmico evaluado.
91
Los resultados obtenidos a partir de la ecuación 6 se graficaron (figuras 20, 21, 22
y 23) junto con los resultados experimentales, para obtener una mejor
interpretación de las predicciones y su ajuste frente a los resultados reales,
sustentando esto último con el factor Af (tabla 20, 21, 22 y 23).
Tabla 20. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico
hasta 55ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los
microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC
4032 en el medio BHIA.
Tiempo
(min)
Temperatura
(ºC)
Letalidad
Acumulada
(min a 55ºC)
Supervivientes
Log UFC/mL
(Predicción)
Supervivientes
Log UFC/mL
(experimentales)
0 24,96 4,87E-11 8,22 8,22
1 38,7 1,37E-06 8,22 8,02
2 46,93 0,002 8,22 8,10
3 57,01 0,85 8,18 8,23
13 55,81 18,17 7,44 6,56
23 55,9 35,33 6,70 5,90
33 55,85 52,58 5,95 4,93
43 55,84 69,90 5,20 4,74
53 55,71 87,30 4,45 4,27
63 55,88 104,70 3,70 3,56
Af 1,07
92
Figura 20. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un
calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA.
Tabla 21. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico
hasta 55ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los
microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC
4032 en medio BHIA+NaCl.
Tiempo
(min)
Temperatura
(ºC)
Letalidad
Acumulada
(min a 55ºC)
Supervivientes
Log UFC/mL
(Predicción)
Supervivientes
Log UFC/mL
(experimentales)
0 24,96 2,48E-08 8,16 8,16
1 38,7 5,71E-05 8,16 8,07
2 46,93 0,02 8,16 7,47
3 57,01 0,72 8,06 7,12
13 55,81 15,20 6,08 5,44
23 55,9 29,66 4,10 4,60
33 55,85 44,17 2,11 3,56
43 55,84 58,71 0,12 3,46
53 55,71 73,31 -1,87 2,65
63 55,88 87,90 -3,86 2,13
Af 1,70
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 20 40 60 80
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
prediccion
experimentales
93
Figura 21. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un
calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA+NaCl.
Tabla 22. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico
hasta 60ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los
microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC
4032 en medio BHIA.
Tiempo
(min)
Temperatura
(ºC)
Letalidad
Acumulada
(min a 60ºC)
Supervivient
es Log
UFC/mL
(Predicción)
Supervivientes
Log UFC/mL
(Experimentales)
0 25,08 2,00E-12 8,43 8,43
1 28,34 1,98E-10 8,43 8,23
2 50,3 0,0002 8,42 7,89
3 56,32 0,01 8,41 7,09
4 61,2 1,56 6,65 4,08
5 60,99 3,50 4,43 4,20
6 61,09 5,65 1,98 4,11
7 61,16 7,79 -0,46 3,57
8 61,11 9,95 -2,91 3,19
Af 1,30
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0 20 40 60 80
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
prediccion NaCl
experimentales
94
Figura 22. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de
un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA.
Tabla 23. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico
hasta 60ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los
microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC
4032 en medio BHIA+NaCl.
Tiempo
(min)
Temperatura
(ºC)
Letalidad
Acumulada
(min a 60ºC)
Supervivientes
Log UFC/mL
(Predicción)
Supervivientes
Log UFC/mL
(Experimentales)
0 25,08 2,81E-09 8,19 8,20
1 28,34 2,27E-07 8,19 7,77
2 50,3 0,002 8,19 7,58
3 56,32 0,045 8,14 5,57
4 61,2 1,33 6,49 3,26
5 60,99 2,90 4,48 1,90
6 61,09 4,59 2,33 1,26
7 61,16 6,27 0,18 1,38
8 61,11 7,96 -1,97 0,77
Af 1,105
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
Prediccion
Experimentales
95
Figura 23. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de
un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA+NaCl.
Los resultados obtenidos de las predicciones realizadas a partir de la integración
de la temperatura para 55ºC se ajustan mucho mejor que para 60ºC.
Para 55ºC, el modelo en el medio de recuperación no selectivo se ajusta de
manera ideal, notándose un comportamiento similar entre los datos
experimentales y los predichos, apoyando esta presunción con el valor Af, el cual
fue de 1,06 para este medio. Para el medio de recuperación selectivo, se obtuvo un
valor de 1,7 lo cual sugiere, que la predicción obtenida se ajusta, pero se desvía
de los resultados experimentales, debido a que se encuentra considerablemente
alejado de 1. Si se detalla la figura 21, se puede observar que los resultados
experimentales siguen la misma tendencia de los resultados predichos, pudiendo
ser que los valores negativos obtenidos en la predicción causen un aumento en el
Af. En general, el modelo para este tratamiento se ajusta muy bien. Por otro lado,
el microorganismo no presentó un comportamiento irregular, observándose una
misma tendencia de destrucción del microorganismo entre los datos reales y
predichos.
-4
-2
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
Prediccion
Experimentales
96
A 60ºC, el microorganismo presentó un comportamiento irregular como se
observa en la figura 19, lo cual ya se discutió en un apartado anterior, conllevando
esto a que los resultados experimentales no se ajusten de manera exacta, aunque
los valores Af calculados indiquen lo contrario debido a su cercanía a 1. Es
interesante observar, que para el medio de recuperación selectivo a 55ºC el Af sea
mayor que los obtenidos a 60ºC cuando a esta condición (ver figuras 22 y 23) las
curvas de supervivencia experimentales no se asemejan ni siguen un
comportamiento similar a los predichos, caso contrario en el medio de
recuperación selectivo a 55ºC (ver figura 21). Sería muy interesante el estudio de
este fenómeno, pero en esta investigación no se realizó debido a que no era el
objetivo.
El comportamiento irregular del microorganismo a 60ºC y las inconsistencias en
la modelización con el valor F, nos condujo a la búsqueda de otro modelo para la
predicción del comportamiento del microorganismo. Se optó por utilizar el
modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos el cual se basa en la
aplicación de la siguiente ecuación (Eq.7):
𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔𝑁0 −𝑧
𝐷𝑅×𝐿𝑛 10× 10
𝑇0−𝑇𝑅𝑍
×10
𝑇−𝑇0
𝑍
𝑎 (7)
Donde N es la población final predicha, No la población inicial experimental, T es
la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la temperatura de
referencia (ºC), T0 la temperatura inicial del tratamiento (ºC), Z es el incremento
de temperatura necesario para reducir en un ciclo logarítmico el valor D calculado
en el tratamiento, DR el valor D a una temperatura de referencia y a la velocidad
de incremento de temperatura durante el tratamiento (ºC/min).
Al aplicar la ecuación 7, a los datos obtenidos a partir del tratamiento isotérmico a
60ºC se estableció que el modelo no se ajustaba (resultados no se muestran) como
se presumía. De acuerdo con lo propuesto por Cunha et al., 1997, para que este
modelo ajuste de manera correcta y la eficiencia este cerca al 100% debe cumplir
97
con los siguientes 2 factores: i) el aumento de temperatura debe estar entre
1ºC/min y 10ºC/min, y ii) la temperatura mínima de inicio debe estar oscilando los
40ºC.
Con los factores anteriormente nombrados aplicamos la formula a nuestros
resultados pero con una velocidad de aumento de 2ºC/minuto obteniendo un
modelo que se ajusta perfecto a los 2 medios a 60ºC como se observa en las
figuras 24 y 25. Por lo tanto si en esta experiencia se hubiese utilizado una
velocidad de calentamiento de 2ºC/min los resultados esperados podrían haber
sido diferentes.
Figura 24. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio
BHIA, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow
para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7
log U
FC
/ m
l
Tiempo (min)
Gráfica de supervivencia Real
Calculada
98
Figura 25. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio
BHIA+NaCl, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de
Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de
3ºC/min.
De acuerdo con los resultados obtenidos por la aplicación del modelo de Bigelow,
se determina que el comportamiento inusual del microorganismo es debido a las
velocidades de incremento de temperatura utilizadas en la investigación. Lo
anterior deja como resultados importantes que: i) dependiendo de las condiciones
de tratamiento, se pueden aplicar diferentes modelos buscando el que mejor se
ajuste a los resultados obtenidos, siendo un factor muy importante el incremento
de temperatura el cual debe ser constante y lineal (de acuerdo a los modelos
utilizados en la investigación) y no se debe superar los 10ºC/min, para una
eficacia óptima de los modelos, ii) El inicio de un tratamiento isotérmico a una
temperatura tan baja como 24ºC, puede ser un factor que ayude al aumento en la
resistencia a los tratamientos térmicos por parte del microorganismo y iii) la
exposición del microorganismo, a un aumento de temperatura rápido hasta 55ºC
(3min) y su posterior mantenimiento en condiciones isotérmicas, es más efectiva
en la termodestrucción de L.monocytogenes CETC 4032 que el tratamiento
isotérmico solo, obteniéndose una reducción de 4 unidades en el medio no
selectivo a los 30 minutos del tratamiento y de 5 en el medio selectivo.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7
log U
FC
/ m
l
Tiempo (min)
Gráfica de supervivencia Real
Calculada
99
Los tratamientos térmicos, en su mayoría, producen un efecto sub-letal en
L.monocytogenes CETC 4032, pues necesito de un mayor tiempo de incubación
para su crecimiento y recuperación, tanto en el medio BHIA y BHIA+NaCl,
observándose, tiempos de crecimiento de 48 horas y en algunos casos de 72 horas
para el medio selectivo, en comparación con el tiempo de crecimiento del
microorganismo, sin ningún tratamiento en medio BHIA el cual es de 24 horas.
Resultado semejante al obtenido por Miller et al.,2006 y por Jasson et al., 2007 en
sus investigaciones, los cuales obtuvieron que luego de los tratamientos térmicos
aplicados sobre L.monocytogenes y L.innocua los microorganismos presentaron
un incremento en el tiempo de crecimiento.
El BHIA+NaCl 0.5% (medio selectivo), solo permite el desarrollo de las células
que no fueron afectadas letalmente por el tratamiento, y pueden recuperarse sin
ser inhibidas por la concentración de sal. El NaCl causa alteraciones en la pared
celular a nivel de permeabilidad, incrementando el estrés osmótico y promoviendo
la plasmólisis celular. Algunos otros efectos de la sal para inhibir el crecimiento
de las células afectadas, son deshidratación, remoción de oxigeno y la toxicidad
de los iones sodio cuando se da la ionización del NaCl (Miller et al.,2006).
Del mismo modo, estos resultados corroboran la efectividad de los tratamientos
para el control de microorganismos patógenos en los alimentos y que la
combinación de estos con otros tratamientos ofrece mejores resultados asegurando
la inocuidad del alimento tratado.
7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales.
Se realizaron las pruebas con los aceites esenciales en los tratamientos
isotérmicos, debido a que fueron los tratamientos en los que menor reducción de
población se presentó y el comportamiento del microorganismo en estos
permitiría observar de una manera más clara el efecto de los aceites esenciales.
100
7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite
esencial de tomillo.
Los resultados obtenidos en la investigación, no fueron los esperados de acuerdo
con la bibliografía consultada. Las investigaciones de Bounatirou et al., 2007,
Periago et al., 2001 A, Periago et al., 2001 B y Ettayebi et al., 2000, han
demostrado que los componentes mayoritarios del aceite esencial de tomillo
(carvacrol y timol) y el propio aceite esencial, no tienen un efecto listericida muy
amplio. En nuestra investigación, el A.E de tomillo a concentraciones de 0,01% y
de 0,05% en las 2 temperaturas evaluadas inhibió por completo el crecimiento de
L.monocytogenes CETC 4032 (los resultados no se indican). La inhibición total a
una concentración de 0,01%, la cual es considerablemente inferior a la empleada
en la bibliografía consultada, es un resultado muy importante e interesante, pues si
se observa la figura 15, pasados 30 minutos de tratamiento a 55ºC la disminución
de la población en el medio no selectivo fue de 1 unidad logarítmica, mientras que
con la adición del A.E de tomillo a una concentración de 0,01% en el tiempo 0 el
microorganismo no presento crecimiento, y aplicando el tratamiento por 15
minutos. Se realizaron réplicas acortando los tiempos de muestreo y del
tratamiento pero el resultado en todos los casos (no se presentan los resultados)
fue el mismo.
Periago et al., 2001 en su investigación con Bacillus cereus, obtuvo que los
componentes de aceites esenciales carvacrol y timol por separado a
concentraciones de 0,3 mmol/L, no presentaron efecto inhibitorio sobre las células
vegetativas de B.cereus, ni aun luego de haber expuesto el microorganismo a un
shock térmico, pero la combinación de estos junto con la nisina exhibieron un
efecto inhibitorio destacable. En otra investigación con dos diferentes cepas de
L.monocytogenes (STCC4031 y NCTN4032), Periago et al., 2001, obtuvieron
como resultados que el incremento de la concentración de carvacrol aumenta el
efecto antimicrobiano sobre el microorganismo y por otra parte, que la resistencia
a los efectos antimicrobianos varía entre cepas de un mismo microorganismo,
siendo este un factor importante en el estudio de estos.
101
Rasooli et al., 2005 en su investigación evidenciaron que el A.E de tomillo afecta
a L.monocytogenes a nivel de su pared celular, y dependiendo de la concentración
puede causar su ruptura, generando daño en organelos y hasta lisis celular. Los
resultados anteriores concuerdan con el efecto de los dos componentes
mayoritarios del tomillo (carvacrol y timol) propuestos por Burt 2004.
Los resultados obtenidos junto con la revisión bibliográfica realizada nos hacen
suponer que una concentración de 0,01% genera un debilitamiento y/o ruptura de
la pared celular, dejando la membrana expuesta a los efectos del calor (aumento
en la fluidez de la membrana, aumento en la permeabilidad y desnaturalización de
enzimas y proteínas) y a los efectos del propio A.E.
Parece ser que la temperatura, potencia el efecto del A.E. sobre L.monocytogenes,
pues de acuerdo con lo planteado por Moreira et al., 2005 en su investigación, la
actividad antimicrobiana de los compuestos principales con mayor actividad
antimicrobiana, mostraron su efecto máximo cerca a los 60 minutos de
incubación, teniendo en cuenta que no se aplico tratamiento térmico, mientras que
en nuestra investigación el efecto de los A.E sobre L.monocytogenes CETC 4032
fue casi inmediato, puesto que el tiempo transcurrido entre la inoculación del
microorganismo y la toma de la muestra de la población inicial fue
considerablemente corto. Se descarta, la posibilidad que el cultivo hubiera sufrido
daños letales durante la incubación, estuviera inviable ó presentará contaminación,
ya que antes del tratamiento se realizo el recuento del cultivo obteniéndose un
cultivo axenico con una concentración de 108 UFC/mL tras 24 horas de
incubación.
7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite
esencial de clavo
Los resultados obtenidos con el A.E de clavo a una concentración de 0,05% son
similares a los obtenidos con el A.E de tomillo, pues desde el tiempo 0 no se
observo crecimiento en ninguna de las 2 temperaturas (los resultados no se
102
indican). Sin embargo, con una concentración de 0,01% si se observó crecimiento.
Los datos obtenidos fueron analizados utilizando la ecuación de Weibull (eq.2).
En la Tabla 24 se presentan los parámetros δ (tiempo de la primera reducción) y p
(factor de forma) para un tratamiento a 55ºC y las curvas de los supervivientes en
las figuras 26 y 27.
Tabla 24. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas
de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento
isotérmico a 55ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo.
δ p
BHIA 0,04 0,32
BHIA+NaCl 0,13 0,47
Figura 26. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio
BHIA. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5
Log U
FC
/mL
Tiempo (min)
Log UFC/ml
LogNpred
103
Figura 27. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio
BHIA+NaCl. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.
Los resultados tanto en medio BHIA y BHIA+NaCl presentan una concavidad
hacia arriba (p<1) indicando que las células supervientes presentan una mayor
resistencia al tratamiento aplicado y una probabilidad muy baja de morir (Fig.26).
Los valores obtenidos del parámetro δ, permitieron determinar que la presencia de
un factor de inhibición adicional en el medio de recuperación el cual permite la
disminución de 4 unidades logarítmicas en un tiempo de 2,5 minutos mientras que
en un medio no selectivo seria de 3,29 minutos siendo estos mucho menores a los
observados en un tratamiento isotérmico.
En la Tabla 25 se presentan los parámetros δ (tiempo de la primera reducción) y p
para un tratamiento a 60ºC y las curvas de los supervivientes en las figuras 28 y
29.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5
Log U
FC
/mL
Tiempo (min)
Log UFC/ml
LogNpred
104
Tabla 25. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas
de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento
isotérmico a 60ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo.
δ* p
BHIA 2,97 0,43
BHIA+NaCl 1,43 0,25
*Valor en segundos
Figura 28. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico a 60ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio
BHIA. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.
-1
0
1
2
3
4
5
0 20 40 60 80 100
Log U
FC
/mL
Tiempo (seg)
Log UFC/ml
LogNpred
105
Figura 29. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico a 60ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio
BHIA+NaCl. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.
Los resultados tanto en medio BHIA y BHIA+NaCl, presentan una concavidad
hacia arriba (p<1) indicando que las células supervientes presentan una mayor
resistencia al tratamiento aplicado y una probabilidad muy baja de morir. El valor
del parámetro δ, nos permite observar que la primera reducción logarítmica se da
a los 0,024 minutos en un medio selectivo y a los 0,050 minutos en un medio no
selectivo, siendo menores estos a los determinados en el tratamiento isotérmico.
A nivel experimental a 55ºC se obtuvo una disminución de 2 unidades
logarítmicas en el medio BHIA y de 3 unidades logarítmicas en el medio
BHIA+NaCl en el tiempo 0 con respecto a la población inicial (108 UFC/mL), y
durante los 4 minutos de tratamiento se observo crecimiento del microorganismo
en los dos medios de recuperación.
A 60ºC en el tiempo 0 la disminución fue de 4 unidades logarítmicas en el medio
BHIA y de 6 unidades logarítmicas en el medio BHIA+NaCl con respecto a la
población del cultivo inoculado (108 UFC/mL). En el medio de recuperación no
selectivo, se observó crecimiento durante los 90 segundos del tratamiento
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 20 40 60 80 100
Log U
FC
/mL
Tiempo (seg)
Log UFC/ml
LogNpred
106
mientras en el medio de recuperación selectivo se obtuvieron recuentos hasta el
tiempo 15 y en los restantes 75 segundos los resultados fueron <10 UFC/mL lo
que conllevó a reportar los resultados en unidades enteras, debido a que el modelo
de Weibull necesita de números naturales para su aplicación.
El modelo Weibull se ajusta de manera adecuada a los resultados obtenidos
permitiendo una estimación más precisa para la determinación de la inactivación
del microorganismo bajo las condiciones evaluadas. Como se observa en las
figuras 26, 27, 28 y 29, la curva predicha de supervivientes obtenida a partir del
modelo Weibull pasa por en medio de los datos experimentales demostrando un
ajuste que no es perfecto pero si muy bueno para nuestros resultados.
El A.E. de clavo presenta una concentración mínima inhibitoria (CMI) desde
0,062% (v/v) hasta 0,5% (v/v) (Fu et al., 2007) y un efecto listericida a una
concentración del 1% (v/v) (Oussalah et al., 2005; Chaieb et al., 2007) ó de 800µg
mL-1
, generando una disminución significativa de la población desde el contacto
y con un tiempo de 15 minutos para el efecto bactericida máximo (Moreira et al.,
2005) sin la aplicación de tratamientos térmicos. De acuerdo a lo anterior, los
resultados obtenidos en esta investigación son muy prometedores, pues el efecto
obtenido de la combinación del A.E y tratamientos térmicos es sinérgico,
disminuyendo la CMI a 0,01%, con una disminución significativa de la población
inoculada en el tiempo 0 y con un tiempo de efecto bactericida máximo menor de
15 minutos, de acuerdo con los resultados obtenidos por Moreira et al., 2005,
Oussalah et al., 2005 y Chaieb et al., 2007 en sus investigaciones.
Los resultados anteriores se pueden atribuir en gran parte al eugenol, componente
mayoritario del A.E de clavo, el cual tiene su blanco sobre los lípidos de
membrana, deterioro de la pared celular e inhibición de acción enzimática (Gill et
al., 2006; Filgueiras et al., 2006).
Gill et al., 2006 A y Gill et al., 2006 B, en sus investigaciones establecieron que
los componentes de los aceites esenciales eugenol y carvacrol tienen efectos de
107
inhibición sobre la acción enzimática de la ATPasa, la cual está presente en la
membrana bacteriana apoyando al desarrollo de funciones vitales tales como
producción de ATP, regulación de pH, transporte de proteínas y motilidad. Por
otra parte, apuntan a que la perturbación sobre la membrana celular es la causa
primaria de la muerte celular, y que la inhibición enzimática es un efecto
secundario, el cual disminuye la capacidad de crecimiento del microorganismo
luego de la exposición al A.E.
Los resultados obtenidos a partir del uso de los dos aceites esenciales, permiten
observar claramente que el A.E de clavo posee un efecto listericida mucho menor
que el que exhibe el A.E tomillo, concordando con los resultados obtenidos por
Oussalah et al., 2007 y Rasooli et al., 2005 en sus investigaciones. La
combinación de los componentes mayoritarios de estos aceites produce un efecto
aditivo (Burt, 2004), pero no se descarta la idea que los componentes minoritarios
tengan un papel importante sobre el efecto bactericida. El efecto listericida
reportado, se ve potenciado con la combinación de tratamientos térmicos,
corroborando los postulados propuestos por Gandhi et al., 2007 y Periago et al.,
2001, los cuales indican que la temperatura modifica en ciertas instancias la
sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos.
7.3 Estimación de la supervivencia de Listeria monocytogenes CETC 4032
durante un tratamiento térmico en combinación con el A.E. de clavo sobre
una sopa de calabacín
El alimento seleccionado para el ensayo fue una sopa de calabacín comercial
pasteurizada, el producto presentó un pH de 5,85 y un valor de 4,67 de sólidos
solubles y al sembrarlo en agar nutritivo no se observó el crecimiento de ningún
tipo de microorganismo tras 48 horas de incubación a 37ºC. Los tratamientos
seleccionados fueron los isotérmicos en combinación con el A.E de clavo por
presentar resultados propicios y mesurables para la experiencia.
Se aplicaron los tratamientos térmicos sin A.E., para determinar si algún
componente intrínseco del producto afectaba la supervivencia de
L.monocytogenes CETC 4032 luego de someterlo al tratamiento.
108
7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC.
Los tratamientos isotérmicos se realizaron de manera similar al procedimiento,
utilizado en el medio de referencia (BHI), se utilizo la velocidad igual a 20 rpm
para lograr una adecuada homogenización y transferencia del calor, debido a la
densidad de la sopa. A partir de los resultados obtenidos se obtuvieron las graficas
de supervivencia, figuras 30 y 31, y se calcularon los valores D (tablas 26 y 27) y
el valor z (tabla 28).
Figura 30. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones
isotérmicas (55ºC) en crema de calabacín y crecimiento en medio selectivo y no
selectivo.
Tabla 26. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no
isotérmico a 55ºC sobre crema de calabacín.
D ICs ICi R2
BHIA 10,51 25,66 2,46 0,93
BHIA+NaCl 7,34 16,46 1,19 0,97
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 15 20 25 30 35
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
55ºC
55ºC NaCl
109
Figura 31. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones
isotérmicas (60ºC) en crema de calabacín y crecimiento en medio selectivo y no
selectivo.
Tabla 27. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación
(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no
isotérmico a 60ºC sobre crema de calabacín.
D ICs ICi R2
BHIA 1,14 3,23 0,35 0,86
BHIA+NaCl 1,04 2,83 0,30 0,88
Tabla 28. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos en crema de
calabacín.
D55 D60 Z
BHIA 10,51 1,14 5,19
BHIA+NaCl 7,34 1,04 5,89
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
60ºC
60ºC NaCl
110
Si se comparan los valores D obtenidos a 55ºC in vitro (tabla 16) y los obtenidos
en el producto (tabla 28), aunque no presentan una gran diferencia, permiten
inferir que el pH del alimento puede influir en el aumento del efecto bactericida
aumentando los daños letales sobre L.monocytogenes CETC 4032 en el medio de
recuperación no selectivo. En el medio de recuperación selectivo, los valores D
son similares y las poblaciones remanentes se encuentran en la misma
concentración (104 UFC/mL), viéndose un incremento en la resistencia al calor y
un nivel de daño similar. Fernández et al.,1994, en su investigación observaron
que a temperaturas más leves el efecto del pH sobre la inhibición del
microorganismo es mucho mayor que a temperaturas más altas, pudiendo inferir
que existe una relación entre el pH y la temperatura en la inhibición de
microorganismos. Además, determinaron que el tiempo de contacto es un factor
importante para el efecto inhibitorio, teniendo que a mayor tiempo de contacto
mayor efecto bactericida.
Los resultados obtenidos a 60ºC, apoyan los resultados obtenidos por Fernández
et al., 1994, pues al comparar los valores D in vitro (tabla 16) y los del producto
(tabla 28), aunque no presenten gran diferencia, permiten observar que el pH no
tuvo una mayor influencia en la inhibición del microorganismo pues el tiempo de
contacto fue de 5 minutos en comparación con los 30 que sufrió en el tratamiento
a 55ºC. Evidenciándose estos hechos, al comparar las poblaciones supervivientes
de los tratamientos; en el producto la población se encuentra un ciclo logarítmico
encima que en la población a la cual se le aplico el tratamiento in vitro, no
obstante hay que tener en cuenta que la población inicial de esta última se
encontraba 1 ciclo por encima en el medio no selectivo y 2 en el selectivo.
En las figuras 32 y 33, se pueden observar las diferencias anteriormente
nombradas entre los tratamientos isotérmicos in vitro y en el producto a las 2
temperaturas evaluadas.
111
Figura 32. Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes
CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 55ºC.
Figura 33. Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes
CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 60ºC.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 10 20 30 40
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
55ºC in vitro
Sopa 55ºC
55ºC in vitro NaCl
sopa 55ºC NaCl
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6
Log
UFC
/mL
Tiempo (min)
60 in vitro
60 sopa
60 in vitro NaCl
60 sopa NaCl
112
7.3.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con el A.E. clavo.
De acuerdo con los resultados obtenidos en el tratamiento isotérmico, se esperan
obtener 3 posibles efectos: aditivo, sinérgico ó antagónico, entre los componentes
del producto y el A.E.
De acuerdo a la revisión bibliográfica realizada y la experiencia del grupo
investigador de microbiología de alimentos de la UPCT, se determinó usar el
doble de la concentración del A.E. evaluado (0,01%), en el alimento. Al realizar
el tratamiento con esta concentración (los resultados no se muestran), no se
evidencio reducción de la población del microorganismo luego del tratamiento y
se determino usar la concentración máxima evaluada (0,05% v/v).
Los tratamientos a las dos temperaturas evaluadas se realizaron de manera
idéntica a los tratamientos in vitro, y las curvas de supervivencia, figuras 34, 35,
36 y 37, se determinaron aplicando el modelo Weibull. Los parámetros δ y p
calculados se presentan en las tablas 29 y 30.
113
Figura 34. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite
esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo. Resultados obtenidos
con la distribución de Weibull.
Figura 35. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite
esencial de clavo en medio de recuperación selectivo. Resultados obtenidos con la
distribución de Weibull.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5
Log U
FC
/mL
Tiempo (min)
Log UFC/ml
LogNpred
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5
Log U
FC
/mL
Tiempo (min)
Log UFC/ml
LogNpred
114
Tabla 29. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas
de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta
a un tratamiento isotérmico a 55ºC con una concentración de 0,05% de aceite
esencial de clavo.
δ p
BHIA 0,17 0,52
BHIA+NaCl 0,08 0,44
Figura 36. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 60ºC con 0,05% de aceite
esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo. Resultados obtenidos
con la distribución de Weibull.
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60 80 100
Log U
FC
/mL
Tiempo (seg)
Log UFC/ml
LogNpred
115
Figura 37. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a
un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 60ºC con 0,05% de aceite
esencial de clavo en medio de recuperación selectivo. Resultados obtenidos con la
distribución de Weibull.
Tabla 30. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas
de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta
a un tratamiento isotérmico a 60ºC con una concentración de 0,05% de aceite
esencial de clavo.
δ* p
BHIA 14,51 0,59
BHIA+NaCl 18,79 0,62
(*Valor en segundos)
Las curvas de supervivencia a 60ºC se ajustan de forma correcta, pudiéndose
observar una concavidad hacia arriba que coincide con el parámetro p obtenido
(p<1). Si se comparan los resultados de la tabla 30 con los de la tabla 25, se puede
establecer que la primera reducción decimal se da en un tiempo mayor en el
producto que en el tratamiento in vitro. A partir de lo anterior, se puede presumir
sobre la posibilidad de que algún(os) componente(s) del producto ofrece(n) cierto
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 20 40 60 80 100
Log U
FC
/mL
Tiempo (seg)
116
tipo de protección al microorganismo frente al tratamiento. Es necesario señalar
que en el tiempo 0 se obtuvo una reducción de 4 unidades logarítmicas en el
medio no selectivo y de 5 en el medio selectivo con respecto a la población inicial
inoculada (108 UFC/mL).
Cabe destacar que la población inicial en el producto se encontraba un ciclo
logarítmico por debajo, si se compara con la población inicial del tratamiento in
vitro. Para evidenciar esto de una manera más objetiva y apartando esta
diferencia, se calculo el tiempo de reducción de 3-Log, obteniéndose un tiempo
de 36,48 segundos en el tratamiento in vitro y de 1,5 minutos en el producto, la
recuperación del microorganismo se realizo en ambos casos en el medio de
recuperación no selectivo. Si se determina el tiempo de la misma reducción en un
medio selectivo, se obtiene que en el tratamiento in vitro se demora 1,86 minutos
y en el producto 1,82 minutos los cuales son valores muy semejantes, lo que
conlleva a suponer que el mecanismo de incremento en la termorresistencia en los
dos casos es similar, produciéndose el mismo efecto sobre el microorganismo; lo
cual es coherente con la teoría de la distribución de Weibull la cual indica que al
presentarse un valor p<1 la población superviviente aumenta su resistencia al
tratamiento disminuyendo la probabilidad de ser eliminadas (Van Boekel, 2002).
A 55ºC las curvas de supervivencia obtenidas por el modelo Weibull se ajustan
casi de una manera perfecta, y mucho mejor que las obtenidas a 60ºC. Las células
supervivientes, de acuerdo al parámetro p calculado, aumentaron su
termorresistencia durante el tratamiento, siendo su eliminación mas difícil (p<1).
Si se comparan los valores δ, se observa una amplia diferencia, pudiéndose inferir
resultados inexactos, debido a lo anterior se calculó el tiempo de reducción de 3-
Log, de manera semejante a lo obtenido a 60ºC.
Para el medio no selectivo los tiempos fueron semejantes con una diferencia
mínima (resultados no se muestran), indicando que el efecto sobre la población
fue el mismo en los dos casos y que el daño fue sub-letal permitiendo la
recuperación del microorganismo, caso contrario en el medio selectivo donde la
117
diferencia fue amplia obteniéndose una reducción en un tiempo de 1,36 minutos
in vitro y de 1 minuto en el producto, conllevando a deducir que los daños sobre
el microorganismo pudieron ser a nivel de inhibición enzimática lo cual afectó la
capacidad de crecimiento del microorganismo luego del tratamiento.
Periago et al., 2001 en su investigación con L.monocytogenes, indica que en
alimentos mínimamente procesados es necesaria una disminución de 6-log en los
patógenos alimentarios, nuestros resultados permiten proponer una aplicación de
un tratamiento isotérmico a 55ºC en combinación con A.E de clavo al 0,05%
logrando la reducción propuesta en un tiempo de 5,8 minutos, si el medio no
contiene ningún otro factor de inhibición y de 4,7 minutos si el medio contiene un
factor adicional de inhibición (factor de inhibición como la sal común o el pH). La
aplicación de un tratamiento térmico leve por un corto periodo de tiempo, no
producirá cambios significativos en las propiedades nutricionales del producto, y
la concentración de A.E. al ser tan baja disminuye el efecto de este en los cambios
de las propiedades organolépticas (olor, sabor, etc.), lo cual es uno de los
problemas prioritarios de los consumidores actuales.
118
8. Conclusiones
Los tratamientos isotérmicos a 55ºC no afectan de manera significativa la
población de L.monocytogenes CETC 4032.
La exposición de L.monocytogenes CETC 4032 a un aumento de temperatura
rápido hasta 55ºC y su posterior mantenimiento en condiciones isotérmicas fue
más efectiva en la termodestrucción que el tratamiento isotérmico.
El incremento de temperatura en los tratamientos no isotérmicos, debe ser
constante y lineal y debe estar en el rango de 1ºC/min y 10ºC/min, si se sobrepasa
este rango y/o se usa más de una velocidad de aumento de temperatura la
modelización de los resultados es más compleja y está expuesta a cometer
mayores errores de cálculo.
El aceite esencial de tomillo, presentó un alto efecto listericida en las dos
temperaturas ensayadas en base a la concentración mínima evaluada (0,01% v/v).
El aceite esencial de clavo presentó un efecto listericida igual que el de tomillo a
una concentración de 0,05% pero menor a una concentración de 0,01% en las dos
temperaturas evaluadas.
Los alimentos por sí mismos, pueden contener agentes bactericidas o inhibidores
de crecimiento, que dependiendo de las condiciones de tratamiento pueden aportar
efectos de adición, sinergismo ó de antagonismo.
Los alimentos en determinadas condiciones, como la crema de calabacín en un
tratamiento isotérmico a 60ºC, pueden ofrecer protección al microorganismo
frente a los efectos de los tratamientos térmicos y de los aceites esenciales.
La presencia de otro agente inhibidor como NaCl, pH, aw, entre otros incrementa
el efecto de los tratamientos al inhibir la recuperación y su posterior crecimiento
de las células dañadas térmicamente.
119
9. Recomendaciones
Sería interesante realizar los tratamientos no isotérmicos con velocidades de
aumento entre 1ºC/min y 10ºC/min y una temperatura inicial no inferior a 40ºC
para observar el comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 frente a los
tratamientos por separado y en combinación de los aceites esenciales para la
determinación del efecto y determinar que tratamiento es más efectivo si uno
isotérmico o uno no isotérmico.
Se debería estudiar el comportamiento del aceite esencial de tomillo, sobre los
alimentos para determinar si los resultados tan efectivos obtenidos in vitro se
mantienen a nivel in vivo.
Es necesario adicionar otro factor aparte del Af, para determinar el ajuste del
modelo predicho con los resultados experimentales para poder asegurar que el
modelo es aprueba de fallos y su extrapolación es segura.
Es necesario aplicar más de un modelo para determinar cual se ajusta mejor a los
resultados experimentales y su elección debe ser en base a los fenómenos que
presente el microorganismo en el tratamiento, como los hombros y las colas.
120
10. Bibliografia
Álamo Solis, C., Rondón Cunyas, A. Meningoencefalitis por Listeria
monocytogenes.<http://sisbib.unmsm.edu.pe/bVrevistas/Paediatrica/v08_n1/pdf/a
07.pdf> Online 05/10/2007.
Aragao, G.M.F., Corradini, M.G., Normand, M.D., Peleg, M.2007. Evaluation
of the weibull and log normal distribution functions as survival models of
Escherichia coli under isothermal and non isothermal conditions. International
journal of food microbiology 119, 243-257.
Anónimo 4 http://www.nzfsa.govt.nz/science/data-sheets/listeria-
monocytogenes.pdf (visto 15/11/2007)
Ánónimo1http://www.alimentosargentinos.gov.ar/programa_calidad/ME%2
0%20ETA%20INPPAZ.pdf. (visto 2/11/2007)
Ánonimo2 http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-5.htm. (visto 8/10/2007)
Ánonimo3http://www.eueti.uvigo.es/files/material_docente/478/conservacion
dealimentos.pdf. (visto 17/11/2007)
Blanco, M.M. 1994. Recuperación de Listeria monocytogenes dañada
subletalmente por el efecto de la congelación. Tesis doctoral. Universidad
complutense de Madrid. Facultad de veterinaria. Departamento de patología
animal.
Bounatirou, S., Smiti, S., Miguel, M.G., Faleiro, L., Rejeb, M.N., Neffati, M.,
Costa, M.M., Figueiredo, A.C., Barroso, J.G., Pedro, L.G. 2007. Chemical
composition, antioxidant and antibacterial activities of the essential oils isolated
from Tunisian Thymus capitatus. Food Chemistry 105, 146–155.
Brewer, R., Adams, M.R., Park, S.F. 2002. Enhanced inactivation of Listeria
monocytogenes by nisin in the presence of ethanol. Letters in Applied
Microbiology 34, 18-21.
Brul, S., Coote, P.1999. Review: Preservative agents in foods mode of action and
microbial resistance mechanisms. International journal of food microbiology 50,
1-17.
Buchrieser, C. 2007. Biodiversity of the species Listeria monocytogenes and the
genus Listeria. Microbes and Infection 9, 1147-1155.
Burt, S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential
applications in foods—a review. International Journal of Food Microbiology 94,
223– 253.
121
Castillejos, L. 2005. Modificación de la fermentación microbiana
ruminalmediante compuestos de aceites esenciales. Tesis doctoral. Universidad
autónoma de Barcelona. Departamento de ciencia animal y de los alimentos.
Barcelona, España.
Chaieb, K., Hajlaoui, H., Zmantar, T., Kahla-Nakbi, A.B., Rouabhia, M..,
Mahdouani, K., Bakhrouf, A. 2007. The Chemical Composition and Biological
Activity of Clove Essential Oil, Eugenia caryophyllata (Syzigium aromaticum L.
Myrtaceae): A Short Review. Phytotherapy research 21, 501-506.
Chen, H., Hoover, D.G.2004. Use of Weibull model to describe and predict
presuure inactivation of L.monocytogenes Scott A in whole milk. Inn. Food
science and emerging technol. 5, 269-276.
Conesa., R., Periago, P., Esnoz, A., Lopéz, A., Palop, A. 2003. Prediction of
Bacillus subtilis spore survival after a combined non-isothermal-isothermal heat
treatment. Eur food res tecchnol 217, 319-324.
Cunha, L., Oliveira, F., Brandão, T., Oliveira, J. 1997. Optimal experimental
design for estimating the kinetic parameters of the bigelow model. Journal of food
engineering 33, 111-128.
De Ancos B, B., Muñoz, M., Gómez, R., Sánchez-Moreno, C., Cano, P.M.
2006. Nuevos sistemas emergentes de higienización en el procesado mínimo de
alimentos vegetales. Online
http://www.ciad.mx/dtaov/XI_22CYTED/images/files_pdf/brasil/begona.pdf
Revisado 10/10/2007.
Domingo, D., Lopéz-brea, M. Plantas con acción antimicrobiana. 2003. Revista
española quimioterap vol.16 (Nº4), 385-393.
Dominguez, G. 2001. Caracterización de lipi-2, una nueva isla de patogenicidad
de ―listeria‖. Tesis doctoral. Universidad complutense de Madrid. Facultad de
veterinaria. Departamento de patología animal.
Doyle, M., Mazzotta, A.S., Wang, T., Wiseman, D.W., Scott, V.N. 2001.
Review: Heat Resistance of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection,
Vol. 64, No. 3, 2001,410–429.
Doyle, M.1999. Literature survey of the various techniques used in Listeria
intervention. Food research institute. Version online
http://www.wisc.edu/fri/bries.html. Revisado 14/10/2007
Ettayebi, K., El Yamani, J., Rossi-Hassani, B. 2000. Synergistic efects of nisin
and thymol on antimicrobial activities in Listeria monocytogenes and Bacillus
subtilis. FEMS Microbiology Letters 183, 191-195.
122
Faleiro, M.L., Miguel, M.G., Ladeiro, F., Venâncio, F., Tavares, R., Brito,
J.C., Figueiredo, A.C., Barroso, J.G., Pedro L.G.2003. Antimicrobial activity
of essential oils isolated from portuguese endémic species of Thymus. Letters in
applied microbiology 36, 35-40.
Farber, J. M., Peterkin, P. I. 1991. Listeria monocytogenes, a Food-Borne
Pathogen. Microbiological reviews, Sept. 1991, p. 476-511.
Fernández, A., López, M., Bernardo, A., Condón, S., Raso, J. 2006. Modelling
thermal inactivation of Listeria monocytogenes in sucrose solutions of various
water activities. Food Microbiology 24, 372–379.
Fernández, A., Salmerón, C., Fernández, P.S., Martínez, A. 1999. Application
of a frequency distributión model to describe the thermal inactivation of two
strains of Bacillus cereus. Trends in food science & technology 10, 158-162.
Fernández, P.S., Ocio, M.J., Sanchez, T., Martinez, A. 1994. Thermal
resistance of Bacillus stearothermophilus spores heated in acidified mushroom
extract. Journal of food protection, Vol. 57, No. 1, 37-41.
Filgueiras, C.T., Vannetti, M.C.2006. Effect of eugenol on growth and
listeriolysin O production by Listeria monocytogenes. Brazilian archives of
biology and technology, vol.49 n.3, 405-409.
Fu, Y., Zu, Y., Chen, L., Shi, X., Wang, Z., Sun, S., Efferth, T. 2007. Short
communication antimicrobial activity of clove and rosemary essential oils alone
and in combination. Phytotherapy research, phytother. Res. 21, 989–994.
Gandhi, M., Chikindas, M.L.2007. Review: Listeria: a food borne pathogen that
knows how to survive. International journal of food microbiology 113, 1-15.
Garcia, J.A. 1995. Estudio de la influencia de la deficiencia del selenio y
vitamina E en la listeriosis murina. Tesis doctoral. Universidad complutense de
Madrid. Facultad de veterinaria. Departamento de patología animal.
Garza-Velasco, R., Silva-Monzuazo, T., Hernández-Gómez, L. La listeriosis
humana y el ciclo infectivo asociado a su agente etiológico. Online
<http://depa.pquim.unam.mx/bacteriologia/pdfs/ART%CDC-Listeria.pdf> visto
10/08/2007.
Gasanov, U., Hughes, D., Hansbro, P.M. 2005.Methods for the isolation and
identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes: a review. FEMS
Microbiology Reviews 29, 851–875.
Gill, A.O., Holley R.A. 2005. Disruption of Escherichia coli, Listeria
monocytogenes and Lactobacillus sakei cellular membranes by plant oil
aromatics. International Journal of Food Microbiology 108, 1 – 9.
123
Gill, A.O., Holley R.A. 2006. Inhibition of membrane bound ATPases of
Escherichia coli and Listeria monocytogenes by plant oil aromatics. International
Journal of Food Microbiology 111, 170–174.
Hassani, M., Álvarez, I., Raso, J., Condón, S., Pagán R. 2004. Comparing
predicting models for heat inactivation of Listeria monocytogenes and
Pseudomonas aeruginosa at different pH. International Journal of Food
Microbiology 100, 213– 222.
Hassani, M., Álvarez, I., Raso, J., Condón, S., Pagán R. 2007. Effect of a
previous heat shock on the thermal resistance of Listeria monocytogenes and
Pseudomonas aeruginosa at different pHs. International Journal of Food
Microbiology 116, 228–238.
Jasson, V., Uyettendaele, M., Rajkovic, A., Debevere., J.2007. Establishment
of procedures provoking sub-lethal injury of Listeria monocytogenes,
Campilobacter jejuni and Escherichia coli O157 to serve method performance
testing. International journal of food microbiology 118, 241-249.
Lin, Y., Chou, C. 2003. Effect of heat shock on thermal tolerance and
susceptibility of Listeria monocytogenes to other environmental stresses. Food
Microbiology 21 605–610.
Lis-balchin, M., Deans, S.G. 1996. Bioactivity of selected plant oils against
Listeria monocytogenes. Journal of applied microbiology 82, 759-762.
Low, J. C., Donachie, W. 1997. A Review of Listeria monocytogenes and
Listeriosis. The I"eterinau.]ournal 153, 9-29.
Mafart, P., Coucert, O., Gailard, S., Leguerinel, I. 2001. On calculating
sterility in thermal preservation methods: application of the Weibull frequency
distribution model. International journal of food microbiology 72, 107-113.
Mena, C., Almeida, G., Carneiro, L., Teixeira, P., Hogg, T., Gibbs, Paul A. 2003. Incidence of Listeria monocytogenes in different food products
commercialized in Portugal. Food Microbiology 21, 213–216.
Michanie, S., 2004. Listeria monocytogenes la bacteria emergente de los 80.
Ganados & carnes. Mayo 2004. Buenos Aires, Argentina. Online
<http://www.bpm-haccp.com.ar/index_archivos/pdf/Listeria-onocytogenes.pdf>.
Revisado 30/10/2007
Miller, F.A., Brandão, T.R.S., Teixeira, P.., Silva, C.L.M. 2006. Recovery of
heat-injured Listeria innocua. International Journal of Food Microbiology 112,
261–265.
Moreira, M.R., Ponce, A.G., del Valle, C.E., Roura, S.I. 2004. Inhibitory
parameters of essential oils to reduce a foodborne pathogen. LWT 38, 565–570.
124
Murphy, R.Y., Marks, B.P., Johnson, E.R., Johnson M.G.2000. Thermal
inactivation kinetics of Salmonella and Listeria in ground chiken breast meat and
liquid medium. Journalof food science, Vol.65, No.4.
Mytle, N., Anderson, G.L., Doyle, M.P., Smith, M.A. 2004. Antimicrobial
activity of clove (Syzgium aromaticum) oil in inhibiting Listeria monocytogenes
on chicken frankfurters. Food control 17, 102-107.
Nair, S., Derré, I., Msadek, T., Gaillot, O., Berche, P.2000. CtsR controls class
III heat shock gene expression in the human pathogen Listeria monocytogenes.
Molecular microbiology 35(4), 800-811.
Oussalah, M., Caillet, S., Saucier, L., Lacroix, M. 2005. Inhibitory efects of
selected plant essential oils on the growth of four pathogenic bacteria: E. coli
O157:H7, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus and Listeria
monocytogenes. Food Control 18, 414–420.
Palop, A. 2007. Cuaderno de prácticas ingeniería de la esterilización, asepsia e
higiene. Ed. Alfredo Palop. Universidad politécnica de Cartagena-etsia Cartagena.
Cartagena, España.
Peleg, M. 1999. On calculating sterility in thermal and non-thermal preservation
methods. Food research international 32, 271-278.
Peleg, M., Penchina, C.M., Cole, M.B. 2001. Estimation of the survival curve of
Listeria monocytogenes during non-isothermal heat treatments. Food research
international 34, 383-388.
Periago, P.M., Conesa, R., Delgado, B., Fernández., P.S., Palop. A.2006.
Bacillus megaterium spore germination and growth inhibition by a treatment
combining heat with natural antimicrobials. Food technol. Biotechnol. 44(1), 17-
23.
Periago, P.M., Delgado, B., Fernández, P.S., Palop, A.2004. Use of carvacrol
and cymene to control growth and viability of Listeria monocytogenes cells and
predictions of survivors using frequency distribution functions. Journal of food
protection vol.67 No7, 1408-1416.
Periago, P.M., Moezelaar, R.2001 A. Combined effect of nisin and carvacrol at
different pH and temperature levels on the viability of different strains of Bacillus
cereus. International Journal of food microbiology 68, 141-148.
Periago, P.M., Palop, A., Fernández, P.S.2001 B. Combined effect of Nisin,
Carvacrol and Thymol on the viability of Bacillus cereus heat-treated vegetative
cells. Food sci tech int, 7(6), 487-492.
125
Pol I.E., Smid, E.J. 1999. Combined action of nisin and carvacrol on Bacillus
cereus and Listeria monocytogenes. Letters in Applied Microbiology 29, 166–
170.
Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A., Agud, J.D.1999. Microbiologia.
Primera edición. Ed. McGraw-Hill interamericana. Madrid, España. Pág. 113-115.
Raina, V. K., Srivastava, S. K., Aggarwal, K. K., Syamasundar, K. V. ,
Kumar, Sushil. 2001. Essential oil composition of Syzygium aromaticum leaf
from Little Andaman, India. Flavour and fragrance journal Flavour Fragr. J.
2001; 16, 334–336.
Rasooli, I., Bagher Rezaei, M., Allameh, A. 2005. Ultrastructural studies on
antimicrobial efficacy of thyme essential oils on Listeria monocytogenes.
International Journal of Infectious Diseases 10, 236-241.
Raybaudi-Massilia, R.M., Soliva Fortuny, R., Martín Belloso, O. 2006. Uso de
agentes antimicrobianos para la conservación de frutas frescas y
frescascortadas.Online<http://www.ciad.mx/dtaov/XI_22CYTED/images/files_pd
f/brasil/olga.pdf> Revisado 10/10/2007.
Reguera, J.I., Nieto, J.C., Eiros, J.M., González sánchez, Z., Oeriz de
lejarazu, R., Rodriguez Torres, A. 1995. Infección alimentaria por Listeria
monocytogene. Rol Pediatr 1995 vol.36, 215 – 224.
Ross, T. 1996. Indices for performance evaluation of predictive models in food
microbiology. Journal of applied Bacteriology 81, 501-508.
Ruíz, P., Ocio, M.J., Cardona, F., Fernández, A., Rodrigo, M., Martínez, A.
2002. Nature of the inactivation Curves of Bacillus pumilus spores heated using
non isothermal and isothermal treatments. Journal of food science, Vol.s7, Nr.2.
Schmid, M.W., Eva, Y.W., Lampidis, R., Emmerth, M., Walcher, M., Kreft,
J., Goebel, W,, Wagner, M., Schleifer, K. Evolutionary history of the genus
Listeria and its virulence genes. Systematic and Applied Microbiology 28, 1–18.
Schultze, K.K., Linton, R.H., Cousin, M.A., Luchansky, J.B., Tamplin, M.L. 2006. Effect of preinoculation growth media and fat levels on thermal inactivation
of a serotype 4b strain of Listeria monocytogenes in frankfurter slurries. Food
microbiology 24, 352-361.
Selby, T.L., Berzins, A., Gerrard, D.E, Corvalan, C.M., Grant, A.L., Linton
R.H. 2006. Microbial heat resistance of Listeria monocytogenes and the impact
on ready-to-eat meat quality after post-package pasteurization. Meat Science 74,
425–434.
Smith-palmer, A., Stewart, J., Fyfe, L. 1997. Antimicrobial properties of plant
essential oils and essences against five important food borne pathogens. Letters in
applied microbiology 26, 118-122.
126
Solomakos, N., Govaris, A., Koidis, P., Botsoglou, N. 2008. The antimicrobial
effect of thyme essential oil, nisin, and their combination against Listeria
monocytogenes in minced beef during refrigerated storage. Food Microbiology
25, 120-127.
Stumbo, C.R. 1973. Thermobacteriology in food processing. Segunda edición.
Ed. Academic press. New York and London. Páginas 130-133.
Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. 2007. The epidemiology of human
listeriosis. Microbes and Infection 9, 1236-1243.
Van Boekel, Martinus a.j.s. 2002. On the use of the Weibull model to describe
thermal inactivation of microbial vegetative cells. International journal of food
microbiology 74, 139-159.
Vitas, A.I., Aguado, V., Garcia-Jalon, I. 2003. Occurrence of Listeria
monocytogenes in fresh and processed foods in Navarra (Spain). International
Journal of Food Microbiology 90, 349– 356.
Recursos electrónicos
http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lia/hernandez_p_ld/capitul
o4.pdf Revisado 14/11/2007
http://external.doyma.es/pdf/4/4v25n01a13083626pdf001.pdf Revisado
18/11/2007
http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/bolilla4.pdf Revisado
27/11/2007
http://www.alimentosargentinos.gov.ar/programa_calidad/ME%20%20ETA
%20INPPAZ.pdf Revisado 15/12/2007
http://www.bvsops.org.uy/pdf/listeria.pdf Revisado 04/11/2007
http://www.calier.es/pdf/Microsoft_Word__Aceites_esen_como_promotores.
pdf Revisado 10/11/2007
http://www.neuquen.gov.ar/org/defensa_del_consumidor/menu_novedades/e
nfermedades_transmitidas_por_alimentos.pdf Revisado 06/11/2007
http://www.seimc.org/control/revi_Bacte/listeria.htm Revisado 09/12/2007
http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-5.htm Revisado 30/11/2007
http://www.unavarra.es/genmic/microclinica/tema07.pdf Revisado 13/11/2007
127
http://es.wikipedia.org/wiki/Navaja_de_Occam Revisado 29/01/2008
http://www.acta.org.co/documentos/MEMORIAS%20SIMPOSIO/12/12.pdf Revisado 04/02/2008
Top Related