Electroforesis Capilar
ElectroforesisDefinición:Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campo eléctrico.
Electroforesis
Fuerza eléctrica Eq = fv
E = campo eléctricoq = partícula cargadaf = coeficiente de fricciónv = velocidad
Movilidad
u = v/E
u = movilidad
q+ -v
Campo eléctrico E
Tamaño y forma de la partícula
Electroforesis
ElectroforesisParámetros que influyen en la movilidad
electroforética
• Campo eléctrico• Temperatura• Viscosidad• Fuerza iónica• pH• Carga del soluto• Forma y tamaño del los iones
Electroforesis
Instrumentación básicaFase estacionaria:
Solutos no iónicos (sacarosa, glicerol)
Soporte semisólido (papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa)
“Fase móvil”: Fuente de poder que suministre voltajes de 20 V/cm - 200 V/cm
Electroforesis
Instrumentación básica
Electroforesis
Aplicaciones
Método de separación de:ProteínasÁcidos nucleicosBiomoléculas (insulina, lipoproteínas,
enzimas)
Permite determinar:Peso molecular de proteínasPunto isoelécticoDistinguir moléculas por su carga neta
Electroforesis Capilar
Desventajas de la electroforesis convencional
Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución
Tiempos de análisis largos
Análisis cuantitativo impreciso
Difícil de automatizar
Voltaje limitado 20 – 200 v/cm
Electroforesis Capilar
Antecedentes Históricos
(1967) Hjerten usa capilares milimétricos para separar iones cargados eléctricamente, favoreciendo así la disipación del calor generado
(1979) Virtamen y Makkers: desarrollan separaciones electroforéticas en capilares de 200 μm
(1980) Jorgenson y Lukacs generan capilares de silica fundida con diámetros 75 μm. Surge la EC la cual opera a voltajes de 400 – 500 v/cm en cámaras refrigeradas con aire.
Electroforesis Capilar
Ventajas frente HPLC
Tamaño de muestra: 1 – 10 nL
Tiempos de análisis cortos, 10 – 40 min
N = 100 000 – 200 000
Mínimo ensanchamiento de picos
Consumo de reactivos reducido
Electroforesis Capilar
Característica HPLC Electroforesisconvencional
EC
Volumen de la celda
2 – 10 μL N/A 2- 10nL
Volumen de la muestra
2 – 50 μL 1 – 150 μL 500 fL - 200 μL
Automatización
Completa Baja Completa
Sensibilidad ng- μg/mil(UV/Vis)
fg – ng/mL(UV/Vis)
μg (azul de Coomassie)
Rendimiento Alto Alto Bajo
Electroforesis Capilar
Definición:Nanotécnica de separación de moléculas cargadas, en el seno de una solución amortiguadora contenida dentro de un capilar.
Electroforesis Capilar
Fundamento:La técnica se basa en la migración diferencial de las partículas cargadas, en sentido y velocidad en un campo eléctrico
Electroforesis Capilar
Velocidad de migración
v = μe · E V = velocidad lineal del ión
μe = velocidad electroforética de un ión
E = campo eléctrico aplicado (V/cm)
Conceptos básicos
Electroforesis Capilar
Velocidad electroforética
μe= qE/6πηr
q= carga de un iónr = radio de un iónE = campo eléctrico aplicado (V/cm)η = viscosidad de la disolución
Conceptos básicos
Electroforesis Capilar
Velocidad electroosmótica
μeo= movilidad electroosmótica
Conceptos básicos
Electroforesis Capilar
Veo = μeo E
3 4 5 6 7 8
V eo
pH
Velocidad electroosmótica
SiO- Doble capa eléctrica
Zona difusa
Electroforesis Capilar
V eo= μeo E
Velocidad electroosmótico
Dependerá de:
pH, a pH altos el flujo será mayor que a pH ácidos
Fuerza iónica, a mayor fuerza iónica se reduce el flujo electroosmótico
V = μeo E
Electroforesis Capilar
Velocidad total del iónVtotal = (μe + μeo )E= Ve + Veo
V electroosmótica
++
+
-
- -
V electroforética
V Total = ve + veo
++
+
-
- -
Electroforesis Capilar
V Total = veo - ve
Electroferograma: Grafico resultante de una electroforesis capilar
Seña
l
Tiempo++ + - - -
Electroforesis Capilar
Tiempo de migración
t = L2/μtotal
L = Longitud de la columna
μtotal = μe + μeo
Electroforesis Capilar
Eficiencia de la Electroforesis Capilar
N = μtotal V/2D
D = coeficiente de difusión del soluto en cm2 s-1
V = voltaje aplicado
> potencial aplicado mayor es N 0 20 3010
1
2
3
KVN
(x10
-5)
Electroforesis Capilar
Resolución
R = 2(t2-t1)/W1 +W2
Electroforesis Capilar
Electroferograma
Representación gráfica de las especias separadas por electroforesis capilar.
Electroforesis Capilar
Instrumentación básica
Capilar de silicie
Electroforesis Capilar
Capilar
Silice fundida recubierto dePoliimida
Longitud: 20 – 100 cm
Diámetro interno: 20 – 200 μm
Electroforesis Capilar
Soluciones llenado del capilar
Buffer de FosfatosBuffer de BoratosSolución de Cromato
Electroforesis Capilar
Sistema de detecciónDetector Limite detección
UV/Vis 10-5 – 10-6 moles
Fluorescencia 10-7 – 10-9
Amperométrico 10-10 – 10-11
Conductividad 10-7 – 10-8
Espectrometría de masas 10-8 – 10-9
Electroforesis Capilar
Tratamiento preliminar de la muestra
Las muestras deben ser previamente centrifugadas y/o filtradas en filtros de 0.22 - 45 μm
Electroforesis Capilar
Métodos hidrodinámicos de inyección
Muestra
Presión
Muestra
Vacío
Muestra
Efecto sifón
Electroforesis Capilar
Método electrocinético de inyección
Muestra
1/3 – 1/5 Voltaje de separación
Electroforesis Capilar
Modos de separación
Electroforesis Capilar de Zona (CZE)
Electroforesis Capilar de Gel (CGE)
Isoelectroenfoque Capilar (CIEF)
Isotacoforesis Capilar (CITP)
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar de Zona (CZE)
El capilar esta lleno con una solución buffer
La separación de los iones esta influenciada por el flujo electroosmótico
Uso de aditivos o modificadores de flujo electroosmótico: detergentes catiónicos
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar de Zona (CZE)
Buffer Buffer Buffer Buffer
1 2 3
Cátodo Ánodo
Electroforesis Capilar
Aplicaciones CZE
Separación de iones
Electroforesis Capilar
Aplicaciones CZE
Antiinflamatorios
Electroforesis Capilar
Aplicaciones CZE
Proteínas
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar en Gel (CGE)
Capilares rellenos con un gel Gel covalentemente unido a la silica(Poliacrilamida, agarosa, polietilenglicol)Gel libre en el capilar
Separación esta basada en el tamaño
Separación de grandes moléculas como fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar en Gel (CGE)
++ ++ +
( - )
Migración
( + )
Gel
Electroforesis Capilar
Isoelectroenfoque (CIEF)
Separación de aminoácidos anfóteros
La matriz presenta un gradiente de pH
Determinación de punto isoeléctrico de proteínas
Orden de migración. 1º proteínas más alcalinas seguidas de las ácidas
Isoelectroenfoque (CIEF)
OH- H+
p1 p2 p3
Cátodo Ánodo
Gradiente de pH
Electroforesis Capilar
Puntos isoléctricos de proteínas
Electroforesis Capilar
Proteína pH Isoeléctrico Proteína pH Isoeléctrico
Pepsina 1.1 Hemoglobina 6.8
Caseina 4.6 Mioglobina 7.0
Albumina de huevo
4.78 Ribonucleasa 9.5
Ureasa 5.0 Citrocromo c 10.65
Insulina 5.3 Lisozima 11.0
Isoelectroenfoque de proteínas
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar
Skoog 5ª Ed .Principios de análisis instrumental QD79 15 S5.68
Galen W. Ewing Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25QH 345 C.527Rubinson and Rubinson.Química Analítica Contemporánea. Cap. 14.
Isotacoforesis Capliar (CITP)
Separación independiente de iones o cationes
Utiliza un buffer discontinúo
La muestra se aplica entre dos buffer
Electroforesis Capilar
Isotacoforesis Capilar (CITP)
Buffer baja movilidad
Buffer elevada movilidad
1 2 3
CátodoÁnodo
Electroforesis Capilar
Aplicaciones
Análisis inorgánicosÁcidos orgánicosAminoácidos, péptidos y proteínasÁcidos nucleicos y oligonucleotidosCarbohidratos y oligosacáridosClínicaFarmacología
Electroforesis Capilar
Electroforesis CapilarPrincipios de análisis instrumental Skoog 5ª Ed QD79 15 S5.68
Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25Galen W. EwingQH 345 C.527
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