ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN CONTROL DE CALIDAD: ASPECTOS RELEVANTES
MSc. María Salas Arruz Gerente General de Hypa6a S.A. Profesora Principal de la UPCH
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN CONTROL DE CALIDAD: ASPECTOS RELEVANTES
Temas:
• Ensayos frecuentes: Control Microbiológico (Limite Microbiano), Esterilidad, Potencia AnIbióIca, Endotoxinas Bacterianas – NormaIva Fundamento e Interpretación de cada ensayo.
• Manejo de Cepas ATCC • Cambios recientes en USP ó BP ó en las BPL de la OMS para
ensayos microbiológicos. • Infraestructura requerida para reallizar los ensayos
microbiológicos Areas, Equipos, personal-‐ Requerimientos mínimos para implementar los ensayos
• Controles ambientales requeridos en las áreas microbiológicas
FUNDAMENTO E INTERPRETACIÓN : • Control Microbiológico (Limite Microbiano), • Esterilidad, • Potencia AnIbióIca, • Endotoxinas Bacterianas –
Cepas Control
Preparación de medios y diluyentes
Promoción de Crecimiento Validación
O Aptitud del método de
prueba
Fase Analítica:
Fase Pre – analítica
Control Microbiológico o Limite Microbiano Objetivo:
Permite determinar el número de bacterias mesófilas
(aerobias) y hongos que pueden desarrollarse en una
muestra así como determinar si en la misma se
encuentran microorganismos de riesgo para la Salud
(patógenos) como:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomona
aeruginosa , Salmonella yBacterias gram negativas
tolerantes a la bilis
Control Microbiológico -‐ FUNDAMENTO:
Mediante medios de cultivos óptimos se evalúa si la muestra tiene gérmenes dentro de los límites establecidos y que éstos no sean patógenos. Medio de cultivo óptimo: se encuentra libre de gérmenes y aptos para que sean capaces de generar el crecimiento de microorganismos si estos estuvieran presenten en la muestra.(Control de medios - Pruebas de Promoción de crecimiento) Se prevee y evalúa si la ausencia de crecimiento en la muestra corresponde a inactivantes que se encuentren en la formulación.(Pruebas de aptitud)
Control Microbiológico o Limite Microbiano Medios de Cultivos: Se debe evaluar que esten libres de gémenes, para lo cual se les incuba por lo menos 48 horas y no debe presentar crecimiento alguno. Se debe evaluar que esten óptimos es decir que se compruebe que puedan crecer microorganismos si la muestra las tuviera, para lo cual se realiza la prueba de promoción de crecimiento
APTITUD DE LA PRUEBA - Validación
• Se debe establecer la apItud del método es decir la capacidad de la prueba para detectar los microorganismos previamente inoculados (en canIdad conocida) en presencia del producto a examinar.
• Permite comprobar que el método sirve para el fin previsto en la formulación a evaluar.
• Para estas pruebas de apItud se deben uIlizar suspensiones
estandarizadas de cepas (ATCC: American Type Culture CollecIon)
Control Microbiológico -‐Partes El ensayo consta de 3 partes:
A. Recuento Total de microorganismos aerobios. (microorganismos aerobios que requieren oxigeno para su desarrollo) TSA ( Tripticasa soya agar)
B. Recuento total combinado de Hongos Filamentosos y
Levaduras. Sabouraud agar C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra
en caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios diferenciales o selectivos.
Control Microbiológico -‐ Partes C. Determinación de patógenos. Se siembra la muestra en caldo TSB tripticas soya borth y luego pasa a medios diferenciales o selectivos. 1 g muestra en TSB 10 g muestra en TSB 10 g muestra en TSB
Manitol salado –Staphylococcus aureus Agar Cetrimide –Pseudomona aeruginosa Mac Conkey -‐ E. Coli
Caldo Mosel/ VRD Bacterias gram negaIvas resistentes a la bilis
Caldo Rappaport / XLD –Salmonella sp
InacIvantes
• En alguno productos con posibles inacIvantes es necesario adicionar un neutralizante. Se requiere evaluar cual es el apropiado previo al ensayo
• LeciIna ó Tween 80 • Hacer inoculo de menos de 100 ufc y la recuperación de ser de la mitad al doble (factor 2)
PRUEBA DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS
Pseudomona aeruginosa
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Salmonella sp.
Especificaciones – USP/BP
Expresión de resultados Ensayo Especificación Resultado
CONTROL MICROBIOLOGICO
• Recuento microbiano de aerobios totales
102 UFC/g (Máximo aceptable 200 UFC/g) Menor de 10 UFC/g
• Recuento combinado de de hongos y levaduras
10 1 UFC/g (Máximo aceptable 20 UFC/g) Menor de 10 UFC/g
• Determinación de patógenos: Salmonella sp Ausente en 1g Ausente en 1g
Pseudomona aeruginosa Ausente en 1g Ausente en 1g
Staphylococcus aureus Ausente en 1g Ausente en 1g
Escherichia coli Ausente en 1g Ausente en 1g
Salmonella sp Ausente en 10g Ausente en 10g
Dec 516-‐ Res 1482 Comunidad Andina(Julio 2011) -‐ CosméIcos
ÁREA DE APLICACIÓN Y FASE ETARIA LÍMITES DE ACEPTABILIDAD
Productos para uso en infantes (hasta 3 años)
Productos para uso en área de ojos.
Productos que entran en c o n t a c t o c o n l a s membranas mucosas.
a. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 5 x 102 UFC/g ó ml.
b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó ml.
c. Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g ó ml.
d. Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml. D e m á s p r o d u c t o s
cosméticos susceptibles d e c o n t a m i n a c i ó n microbiológica.
a. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios totales. Límite máximo 5 x 103 UFC/g ó ml.
b. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g ó ml.
c. Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g ó ml.
d. Ausencia de Escherichia coli en 1 g ó ml. P r o d u c t o s a s e r
utilizados en los órganos genitales externos
a. Ausencia de Candida albicans.
TÉCNICAS Y ESPECIFICACIONES (NormaIva) ENSAYO MEDICAMENTO DISPÓSITIVOS
MÉDICOS COSMÉTICOS PRODUCTOS SANITARIOS
CONTROL MICROBIOLÓGICO (ANTES LÍMITE MICROBIANO)
USP, BP EUROPEA OTRAS
-‐-‐-‐ Técnicas Propias
DECISIÓN 516 RESOLUCION 1482 (JULIO 2011
ESTERILIDAD USP, BP EUROPEA, OTRAS
USP, BP EUROPEA OTRAS
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
ENDOTOXINAS BACTERIANAS
USP, BP EUROPEA OTRAS
USP BP OTRAS
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
POTENCIA ANTIBIÓTICA
USP, BP EUROPEA OTRAS
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
Esterilidad
Consiste en evaluar si la muestra esta libre gérmenes viables. Esta prueba se realiza en medios de cultivo controlados y óptimos (TSB y THIO) También se evalúa la Aptitud de la prueba, es decir si la muestra no es capaz de inhibir el crecimiento (6 gérmenes)
Ensayo de Esterilidad/Inhibidores
Para Antibióticos: Beta-lactamasa ó Penicinilasa PENASA es el nombre comercial, enzima que degrada la estructura de los anIbióIcos conocidos como b-‐lactámicos. Los anIbióIcos de este Ipo son hidrolizados por las b-‐lactamasas, pierden su acIvidad anImicrobiana
Especificación y forma de expresión de resultados
doEnsayo Especificación Resulta Esterilidad Estéril Estéril -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐ Ausencia de crecimiento microbiano El ensayo no se debe repeIr si se verifica que no se ha comeIdo error ó
contaminación
Valoración microbiológica (Potencia anIbióIca)
• Se compara la acIvidad anImicrobiana de la muestra frente a un estándar de concentración conocida.
Potencia AnIbióIca . USP Método Cilindro placa Se emplean 15 placas, de manera que se obIene: S1= 9 lecturas S2= 9 lecturas S3= 45 lecturas S4= 9 lecturas S5= 9 lecturas M3= 9 lecturas
Valoración microbiológica (Potencia AnIbióIca)
USP BP
Emplea curva de 5 concentraciones de estándar y 1 de muestra
Emplea 2 curvas, una del del estándar y otra de la muestra, cada una de 3 concentraciones.
La curva debe tener como máximo factor de dilución 1.25
………..
Se debe realizar 3 repeIciones independientes
Se debe realizar 2 repeIciones independientes
En ambos casos los promedios de las repeIciones se obIene de los logaritmos
Diferencia entre USP y BP Halo
S1
S2
S3
S4
S5
M3
USP
S1
S2
S3
M1
M2
M3
BP
Log de Dosis Log de Dosis
Halo
Endotoxinas Bacterianas
• Son los pirógenos mas toxigénicos. • Es facIble cuanIficar la endotoxina mediante una técnica in vitro denominada LAL
Valoración microbiológica -‐especificación y expresión de resultados
Ensayo Especificación Resultados Valoración Microbiológica
90.0% -‐110.0% de lo declarado
95.2 de lo declarado
Los promedios de las repeticiones se obtiene de los logaritmos Ejm
Forma errada Forma adecuada
Primer Ensayo 97.00 % Segundo Ensayo 99.00 % Promedio 98,00%
Primer Ensayo 1.986771734 (97) Segundo Ensayo 1.995635195 (99) Promedio 1,991203465 97.995%
¿QUE SON LAS ENDOTOXINAS BACTERIANAS?
Son lipopolisacáridos que se encuentran en la
membrana externa de la pared celular de las
bacterias gram negativas, compuestos por un
polisacárido y el lípido A.
Inicialmente se les llamó endotoxinas ya que las
bacterias no la excretan al medio sino son
liberadas durante la lisis de la bacteria
¿QUE ES LAL?
LAL (Limulus Amebocyte Lysate) o Lisado de amebocitos del género Limulus, es un extracto acuoso de amebocitos de la sangre de una especie de cangrejo l lamado “Limulus polyphemus” (“Horseshoe Crab”), animal prehistórico cuyo origen data del periodo Cámbrico, de hace más de 500 millones de años, por lo que se ha considerado como “fósil viviente” encontrados en áreas costeras del este de EE.UU y el Golfo de México.
Curso de Validación de Procesos y Técnicas AnalíIcas, dictado por HypaIa para IPEN-‐
2014
ETAPAS DE LA PRUEBA DE LAL METODO GEL-CLOT
Confirmación de la Sensibilidad del reactivo de
LAL
Prueba de Factores de Interferencia (Inhibición
y magnificación)
Prueba del Límite de endotoxina
LA PRUEBA DE LIMULUS (GEL CLOT)
Fundamento: • Las proteínas
coagulables del lisado de amebocitos de Límulus gelifican en presencia de las endotoxinas baterianas
FOTO: ASSOCIATES OF CAPE COD.
PRUEBA DE LIMITE Y CUANTIFICACIÓN
Ejemplo: Sensibilidad Etiquetada (lambda) 0.25 EU/mL MVD = 64
DILUCIONES DE LA MUESTRATubos D.I. 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Control
Negativo
1 + + + - - - - -2 + + + - - - - -C.P.1 + + + + + + + +C.P.2 + + + + + + + +
Concentración de endotoxinas= λ x IE
Concentración de endotoxinas = 0.25 x 4 = 1EU/mL
D.I.= Dilución inicial C.P.= Control positivo
λ = Sensibilidad del reactivo IE= Inversa de la última dilución positiva
PRUEBA DE INHIBICIÓN Y MAGNIFICACIÓN
Tubos
Concentración CSE en Agua LAL (UE/mL) Agua
LAL
Concentración CSE en la Solución de Muestra (UE/mL) Solució
n de Muestr
a (MDV)
2 λ λ 0,5 λ 0,25 λ 2 λ λ 0,5 λ 0,25 λ
1 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 2 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 3 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐ 4 + + -‐ -‐ -‐ + + -‐ -‐ -‐
Especificación y forma de expresión
Ensayo
Especificación Resultado
Endotoxinas Bacterianas
No mayor de 10 UE/mg
Menor a 10UE/mg
MANEJO DE CEPAS ATCC
Cepas ATCC
• Staphylococcus aureus ATCC 6538
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
• Escherichia coli ATCC 8739
• Salmonella typhimurium ATCC 14028
• Bacillus subtilis ATCC6633
• Candida albicans ATCC 10231
• Aspergillus brasiliensis ATCC 16404
TIPOS DE CEPAS
- Cepas de colección: Microorganismos definidos por lo menos a nivel de género y especie, depositados y mantenidos en una Colección de Cultivos (CC) o Centro de Recursos Biológicos (BRC) y catalogados con el acrónimo de la colección/BRC seguido de un número identificativo.
- En dicho catálogo se reseña el origen de la cepa, sus condiciones de cultivo y, en muchas ocasiones, algunas de sus características, así como la equivalencia, si la hay, con otras colecciones. Es equivalente a cepas de referencia, el proveedor más conocido es ATCC.
CEPAS
- Cepas de reserva: cepas idénticas obtenidas mediante un único subcultivo de una cepa de referencia suministrada por el proveedor, o que proceden directamente del proveedor como tales.
- Cepas de trabajo: subcultivos primarios obtenidos
de una cepa de reserva. La USP indica que la cepa sólo debe ser utilizada hasta la quinta generación.
- Cepas comerciales: cepas suministradas por casas comerciales diferentes de las colecciones de cultivo o Centros de Recursos Biológicos, y que pueden o no proceder de una colección de cultivos.
- Cepas salvajes: No proceden de CC ni de BRC.
Solo es válido hasta el quinto pasaje
LIOFILO DE LA ATCC
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
Primer Pasaje
CEPAS DE RESERVA
Segundo Pasaje
CEPAS DE TRABAJO
Segundo Pasaje
Segundo Pasaje
Las cepas se uIlizan en A Promoción de crecimiento de los
medios
B
C
Prueba de las propiedades inhibitorias de los medios
D
Prueba de las Propiedades indicadoras de los medios
Ensayos de Aptitud del método de prueba
Medio de cultivo
Microorganismo de prueba
Características
C (-) C(+)
Agar VRB S.aureus ATCC 6538
E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027
Colonias rojas con precipitado rojo al rededor
Agar Mac Cokey S.aureus ATCC 6538
E.coli ATCC 8739
Colonias rojas o rosadas, que puede tener precipitado al rededor
Agar Manitol Salado E.coli ATCC 8739
S.aureus ATCC 6538
Colonias amarillas con zona amarilla al rededor
Agar Cetrimide S.aureus ATCC 6538
P.aeruginosa ATCC 9027
Colonias verdosas por formación de piocianina
Agar XLD S.aureus ATCC 6538
Salmonella ATCC 14028
Colonias negras
C a l d o R a p p a p o r t Vasiliadis
S.aureus ATCC 6538
Salmonella ATCC 14028
Turbidez del medio. Se pone ligeramente amarillo
Caldo Mossel S.aureus ATCC 6538
E.coli ATCC 8739 P.aeruginosa ATCC 9027
El medio se enturbia
Infraestructura requerida para realizar los ensayos microbiológicos Areas, Equipos, personal-‐ Requerimientos mínimos para implementar los ensayos
Instrumentos necesarios
PERSONAL Los ensayos microbiológicos deben ser realizados y supervisados por una persona experimentada, calificada en microbiología o su equivalente. El personal debe tener entrenamiento básico en microbiología y experiencia prácIca relevante antes de ser autorizado a realizar el trabajo que implican los ensayos microbiológicos.
INSTALACIONES -‐ Microbiología
Laboratorio de microbiología; Separado de áreas como las de producción Diseñada para sus acIvidades y evitar la contaminación y la contaminación cruzada Materiales de construcción para limpieza, desinfección y minimizar los riesgos de contaminación De acceso a personal autorizado
INSTALACIONES
Personal del laboratorio debe conocer; Procedimientos de entrada y salida El uso de las áreas Las restricciones de trabajo en cada área Razón de las restricciones Niveles de contención
INSTALACIONES
Sistemas de aire acondicionado; Separado de áreas como las de producción Incluir temperatura y humedad controlada El aire no debe ser fuente de contaminación
INSTALACIONES
Clasificación de áreas ; De acuerdo a los productos y acIvidades a desarrollar El ensayo de esterilidad debe ser ejecutada en condiciones de operaciones de manufactura estéril/ asépIca
Equipamiento; NO DEBE SER COMPARTIDO
AREAS –IMPLEMENTACION:
Definir hacer, solo para lo que ha espacio suficiente
Control Microbiológico
Esterilidad Potencia AnYbióYca
LAL
Preparación de medios
X X X …….
Área de lavado de sucio
X X X X
Área de lavado de limpio
X X X x
Áreas clasificadas
-‐-‐-‐-‐-‐-‐ x ……. -‐-‐-‐-‐-‐-‐
Área no clasificada
x x x
Espacio para Incubadoras
2 2 1 a 3 ….,
Validación de métodos de ensayo
Los métodos de ensayo estándares (farmacopeicos) se consideran validados. Sin embargo, se necesita demostrar que el método de ensayo es adecuado para su uso en la recuperación de microorganismos en presencia del producto específico. Los métodos de ensayo que no se basan en las farmacopeas u otras referencias reconocidas deben ser validados antes de su uso. La validación debe incluir, cuando sea apropiado, determinación de la exactitud, precisión, especificidad, límite de de- tección, límite de cuantificación, linealidad y robustez. Los potenciales efectos inhibitorios de la muestra deben tomarse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestra. Los resultados deben evaluarse con métodos estadísticos apropiados,
Equipamiento
Cada equipo, instrumento u otro dispositivo utilizado para el análisis, verificación y calibración debe identificarse individualmente. La validación inicial debe incluir estudios de desempeño (distribución espacial de la temperatura) para cada ciclo operativo y cada configuración de carga usada en la práctica. Se debe repetir este proce- so después de cualquier reparación o modificación significativa
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS
CABINA DE FLUJO LAMINAR HORIZONTAL
ENSAYOS MICROBIOLOGICOS
Cabina de bioseguridad que permite el manejo de cepas y sustancias peligrosas como por ejemplo : citostáIcos
PRINCIPALES EQUIPOS–IMPLEMENTACION: Control
Microbiológico Esterilidad Potencia
AnYbióYca LAL
Incubadoras dedicadas 2 3 1-‐3 …….
Incubadora común para medios
1 1 1
pH metro X X X x
Cabina de flujo laminar ó de bioseguridad
X x
Cabina de bioseguridad
x …… x -‐-‐-‐-‐-‐-‐
balanza x x x
Autoclave de limpio x x x x
Autoclave de sucio x x x
CAMBIOS RELEVANTES USP, BP, BPL
ENSAYO USP BP
CONTROL MICROBIOLÓGICO
………armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
ESTERILIDAD -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada VALORACIÓN MICROBIOLÓGICA
Mayor énfasis estadísIco
-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐
LAL -‐-‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada -‐-‐-‐-‐-‐-‐armonizada
EN EL 2011 SE PÚBLICA BPL DE LA OMS ESPCÍFICA PARA MICROBIOLOGÍA
Buenas pracIcas de la OMS para laboratorios de microbiología farmacéuIca
WHO TRS 961. 2011
7. Instalaciones
Los ensayos microbiológicos, si fueran realizados, deben ser conducidos en una unidad del laboratorio diseñada y construida apropiadamente. Para mayor orientación ver el proyecto del documento de trabajo Guía de la OMS sobre buenas prác4cas para laboratorios farmacéu4cos de microbiología (referencia QAS/09.297)
INSTALACIONES
• CONTROLES AMBIENTALES
CONTROLES AMBIENTALES
• Los controles ambientales permiten evaluar la eficacia de las prácIcas de limpieza y desinfección realizadas y que podrían afectar la biocarga del ambiente.
• Dichos controles deben darse cuando los materiales estén en la zona, se estén desarrollando las acIvidades de procesamiento y este presente el personal operaIvo.
MONITOREO AMBIENTAL
Programa Monitoreo de aire Plaqueo Placas de contacto Temperatura Diferenciales de presión Limites de acción y de alerta Análisis de tendencias
LIMPIEZA, DESINFECCION E HIGIENE
Programa Resultados del monitoreo ambiental Procedimientos en caso de derrame Lavado y desinfección de manos
INSTALACIONES PARA ENSAYO DE ESTERILIDAD
Area clasificada Control y registro de presión posiIva VesIdor
Especificaciones recomendadas por la USP para controles del aire
Clases de Area UFC/m3 de aire
100 Menos de 3
10 000 Menos de 20
100 000 Menos de 100
Especificaciones recomendadas por USP para superficies de equipos o instalaciones
Clase de Area UFC/placa de contacto o en 30 cm2
100 3 (incluido el piso)
10 000 10 (piso)
Especificaciones recomendadas por USP para indumentaria del personal operativo
Clase de Área
Guantes (UFC/placa de contacto )
VesYmenta (UFC/placa de contacto)
100 3 5
10 000 10 20
!Gracias por su atención!
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