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Estudio de la velocidad de las reaccionescatalizadas por enzimas.
Proporciona informacin acerca del mecanismo dela reaccin cataltica y de la especifidad del enzima.
La medida de la velocidad se realiza siempre en lascondiciones ptimas de pH, temperatura, presenciade cofactores, etc, y se utilizan concentracionessaturantes de sustrato.
En estas condiciones, la velocidad de reaccinobservada es Vmax.
La velocidad puede
determinarse bienmidiendo la aparicinde los productos o ladesaparicin de los
reactivos.
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A medida que la reaccin transcurre, la velocidadde acumulacin del producto va disminuyendoporque se va consumiendo el sustrato de lareaccin. Para evitar esta complicacin seprocede a medir la velocidad inicial de lareaccin (v0).
En estas condicionesno es necesarioconsiderar lareaccin inversa, yaque la cantidad de
producto formada estan pequea que lareaccin inversaapenas ocurre.
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Para estudiar la cintica enzimtica se mide elefecto de la concentracin inicial de sustrato
sobre la velocidad inicial de la reaccin,manteniendo la cantidad de enzima constante.
Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial esdirectamente proporcional a la concentracin de
sustrato
primer orden. A altas [S]0, el enzima se
encuentra saturada porel sustrato, y la
velocidad ya nodepende de [S]0 y lavelocidad es mxima(Vmax) orden cero.
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A fines del siglo XIX comenzaron a realizarseestudios del efecto de la concentracininicial del sustrato sobre la actividad
enzimtica. Ya en 1882 se introdujo el concepto del
complejo enzima-sustrato comointermediario del proceso de catlisisenzimtica.
En 1913, Leonor Michaelis y Maud Mentendesarrollaron esta teora y propusieron unaecuacin de velocidad que explica elcomportamiento cintico de los enzimas.
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Mecanismo en 2 etapas: Primero se forma elcomplejo E-S y luego el complejo da lugar a la
formacin del P, liberando la E. k1, k2 y k3: ctes cinticas individuales de cada
proceso
v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES]
v3 = k3 [ES]
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Slo vlido cuando:
[S] [E]
Estado estacionario, o sea que la [ES] = cte.
Un sustrato S, un producto P y una enzima E
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EPESSEkkk
211,
)()( 211 ESkkSEkdt
ESd
)(11 ESkSEkdt
dS
SEkESkkdt
dE
121 )(
Ecuaciones de balance:
ESkdt
dP2
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)(0 ESEE
)()()( 2101 ESkkSESEkdt
ESd
La enzima puede estar en forma libre (E) o
combinada (ES).
Ecuacin de conservacin:
Suponiendo:Estado cuasiestacionario: d(ES)/dt = 0
E0/S0 suficientemente pequeo
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Sk
kk
SEkvESk
dt
dP
dt
dSv
1
21
022
m
mx
KS
SVv
Ecuacin de Michaelis-Menten
02EkV
mx
1
21
k
kkK
m
Velocidad mxima
Constante de
Michaelis-Menten
Parmetroscinticos
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Vmx es la velocidad mxima a concentraciones de Ssaturantes.
KM representa la constante de disociacin (laafinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por elsustrato). Valores bajos indican mayor afinidad.
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1) Lineweaver-Burk
2) Eadie-Hofstee
3) Hanes-Woolf
mxmx
m
VSV
K
v
111
mxV
S
rKr
m
mxmx
1
V
KS
Vr
Sm
Otras formas de representacin grfica
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Hay enzimas que no obedecen la ecuacin deMichaelis-Menten. Se dice que su cintica no esMichaeliana.
Ej: enzimas alostricas, cuya grfica v frente a [S] noes una hiprbola, sino una sigmoide. Pequeasvariaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a laKM) provocan grandes variaciones en la velocidad dereaccin.
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Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos detransformacin enzimtica de un sustrato en un
nico producto.
Sin embargo, la mayora de las reacciones enzimticasimplican a ms de un sustrato.
S + E ES EP E + P
- Por ejemplo:
A + B P + Q
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Adenilato ciclasa
Citrato sintasa
Alcohol-DH
Malato-DH
Ribitol-DH
Lactato-DH
Coenzima-A transferasa
Glutamato-alanina transaminasa
Glucosa oxidasa etc. ....
Estudio cintico:
A) Velocidad inicial
B) Depender la velocidad de la reaccin de uno solo de los
reactantes (Resto saturacin).
Reaccin orden cero con respecto todos los substratos menos uno
SK
SVv
``max
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a) En cuanto al nmero de sustratos y productos:
Reaccin Nombre
A -----> P Uni-Uni
A + B -----> P Bi-Uni
A + B + C -----> P + Q Ter-Bi
A + B -----> P + Q Bi-Bi
b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los
productos:
* Reacciones secuenciales:
- al azar- ordenadas
* Reacciones de desplazamiento:
- Ping-Pong
Nomenclatura
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De acuerdo con la simbologa de Cleland, el progreso de la
reaccin se simboliza por una lnea horizontal.
El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser
bastante complicado a la hora de representar los esquemas de
las reacciones
A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero elque ms xito ha tenido ha sido el propuesto porCleland.
La entrada de sustratos y la salida de productos se representan
porflechas verticales que indican la direccin de entrada o
salida de la reaccin.
- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos
concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos
y se forman 2 productos:
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E EEA E
A P
EB
B Q
E EEA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong
Secuencial: Bi-Bi ordenada
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Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:
A + B --- P + Q-Mecanismos secuenciales
- al azar
- ordenadas
- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento
Reacciones enzimticas de dos sustratos y dos productos
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A) Mecanismos secuenciales,Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se
libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo
ternario EAB o EBA debe formarse como requisitoindispensable antes de que se produzca la formacin de
productos.
La formacin del complejo ternario es independiente del
orden de unin de los sustratos.Este tipo de reaccines se denominan
reacciones secuenciales al azar,
La formacin del complejo ternario debe producirse en un
orden determinado para que el complejo sea productivodesde el punto de vista cataltico.
Este tipo de reaccin se denomina
reacciones secuenciales ordenadas).
A li d d l t d i t ti t d ti
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Analicemos, desde el punto de vista esquemtico, estos dos tipos
de reacciones secuenciales.
Hagmoslo primero de acuerdo con un esquema clsico:
E + A EA
E + B EB
EAB EPQ
EQ E + Q
EP E + P
B
A
P
Q
Bi-Bi al azar
E + A EA + B EAB EPQ EQ + P E + Q
Bi-Bi ordenado
Utilicemos ahora la simbologa o nomenclat ra de Cleland
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Utilicemos ahora la simbologa o nomenclatura de Cleland:
Bi-Bi al azar
E E
A BEA
B A
EB
EAB
Q
QP
P
EP
EQ
EBA
EPQ
EQP
Bi-Bi ordenada
E EEA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
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E EEA
A B
EQ
P Q
- Un caso especial, es el siguiente:
- Este mecanismo se conoce como Mecanismo de Theorell-Chance, y en realidad es
un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB niEPQ
La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrmeroque contiene zinc en
el centro activo y que cataliza la oxidacin de etanol) por el coenzima
nicotinamina adenina dinucltido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido
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B) Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento
E + A EA E+ P +B EB EQ E + Q
- Este tipo de mecanismo es muy comn en las reacciones en las
que un grupo qumico se transfiere desde el sustrato A al B, es
decir en reacciones de transferencias.
En este tipo de mecanismo, tras la unin del primer sustrato se
libera uno de los productos, en una reaccin parcial en la que segenera una forma modificada de la enzima.
(acil enzimas, fosforil enzimas)
Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formacin delsegundo producto con regeneracin de la forma nativa de la
enzima.
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* Utilizando la simbologa de Cleland, en el caso de reacciones
Ping-Pong, tenemos:
E EEA E
A P
EB
B Q
Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong,o tetra-Uni Ping Pong
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Mecanismo Enzima
Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3)
Creatin quinasa (EC 2.7.3.2)
Citrato sintasa (EC 4.1.3.7)
Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)
Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)
Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56)
Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27)
Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7)
Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2)
Glucosa oxidasa (EC 1 1 3 4)
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