Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1)
QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano
D i r e c t o r :D r. D a n i e l E . N o y o l a C h e r p i t e l
A s e s o r e s :D r. C h r i s ti a n A . G a r c í a S e p ú l v e d a D r. F l a v i o M a r tí n e z M o r a l e s
Defensa de Tesis
2
Infecciones Respiratorias Agudas
• IRAS son causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo.• En México
▫ 3° causa de muerte en niños <5años▫ Tasa de mortalidad 2005
18.8 por 100 000 habitantes • En niños menores de 5 años
▫ Tasa de mortalidad 2008 28.8 por 100 000 habitantes
• Los principales virus que causan IRAS son:
Virus de influenza A y BRinovirus VSR hMPVParainfluenza 1-4
Genómica de influenza A
Segmento Nombre de la proteína Longitud (nt)
1 PB2 Subunidad 2 de la polimerasa 2341
2 PB1 Subunidad 1 de la polimerasa 2341
3 PA Subunidad de la polimerasa 2233
4 HA Hemaglutinina 1778
5 NP Nucleoproteína 1565
6 NA Neuraminidasa 1413
7M1 Proteína de Matriz
1027M2 Proteína integral de
membrana
8NS1 Proteína no-
estructural 1 890NS2 Proteína no-
estructural 2
13,588 nt
Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother. 2000; 54:196-209
50-120 nm
Complejo Ribonucleoproteico
4
Variación genéticaDrift Antigénico
Derivación antigénicaShift Antigénico
Desplazamiento antigénico
• Cambios genéticos puntuales que llevan a modificaciones antigénicas menores.▫ Epidemias
• Cambios genéticos por rearreglo que llevan a modificaciones antigénicas mayores. ▫ 10-40 años▫ Rearreglo entre virus de
influenza humana y otras especies
▫ Pandemias
5
Influenza A (H1N1) pandémica• Marzo-abril 2009▫ Neumonías atípicas▫ Adultos jóvenes
• Nueva variante de la influenza A• 11 junio 2009 Nivel 6• Primera pandemia del Siglo XXI
6
Justificación
Problema de salud pública
Infecciones respiratorias y del
virus de influenza A
Cambios y diferencias
7
Objetivo general
•Definir las características epidemiológicas, virológicas y
genómicas de cepas de la nueva variante del virus de
influenza A (H1N1) responsables de pandemia en la
ciudad de San Luis Potosí.
Objetivos particulares1. Realizar un análisis epidemiológico de la nueva
variante del virus de influenza A (H1N1).
2. Conocer las secuencias del genoma completo de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
3. Realizar un análisis de polimorfismos de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
4. Realizar un análisis filogenético de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
9
Materiales y métodos
10
Muestras
Sospecha de infección
Hospital Central “Dr. Ignacio Morones Prieto”
Laboratorio de Virología, departamento de
Microbiología, UASLP.
Exudado faríngeo, nasofaríngeo y lavado
nasofaríngeo
n=706
Extracción RNA viral
High Pure Viral RNA kit; Roche Diagnostics
Síntesis de cDNA
Transcriptasa reversa
Oligonucleótido UniFlu-RT
Detección influenza A(H1N1) pandémica
PCR anidada
8(NS)
Amplicón 429pb
Gómez-Gómez (2010)
11
Diseño de oligonucleótidos• Obtener secuencias “Influenza Virus Resource” NCBI
• Alineamiento Clustal W
• Robinson´s Alignment Reformatting
• Hairpins, homodímeros, heterodímeros y específicidad
12
Oligonucleótidos de amplificación genómica completa
Segmento Nombre Secuencia5’→3’
Tamaño amplicón (bp)
Tm (°C) Referencia
1 (PB2)SwPB2-F ATGGAGAGAATAAAAGAAC
2279 58
(Garcia-Sepulveda,
2009)
SwPB2-R TAATTGATGGCCATCC
2 (PB1)SwPB1-F ATGGATGTCAATCCGA
2273 56SwPB1-R TATTTTTGCCGTCTGAG
3 (PA)SwPA-F ATGGAAGACTTTGTGC
2151 59SwPA-R CTACTTCAGTGCATGTG
4 (HA)SwHA-F ATGAAGGCAATACTAGTAG
1696
56
SwHA-R CATATTCTACACTGTAGAGAC
5 (NP)SwNP-F ATGGCGTCTCAAGG
1496SwNP-R TCAACTGTCATACTCCTC
6 (NA)SwNA-F ATGAATCCAAACCAAAAG
1409SwNA-R TTACTTGTCAATGGTAAATG
7 (M)SwMP-F TAACCGAGGTCGAAA
970SwMP-R TACTCTAGCTCTATGTTGA
8 (NS)SwNS-F ATGGACTCCAACACC
890SwNS-R TTAAATAAGCTGAAACGAG
13
Oligonucleótidos para secuenciación genómica
1 1746
Frg 1Frg 2
Frg 3Frg 4
pb
115 pb83 pb 122 pb
61 pb
55 pb
4(HA)
14
Segmento Nombre Secuencia5’→3’
Tamaño amplicón
(bp)Referencia
1 (PB2)
SwPB2-F1 AAAGAACTGAGAGATCTA 504
(Godoy-Lozano, 2009)
SwPB2-R1 CCACTTCATTTGGGAASwPB2-F2 AGGTTGAAACATGGTACC 740SwPB2-R2 GCTCTTCTCCCAACCASwPB2-F3 GCTAACGGGCAACCT 889SwPB2-R3 CACATTCACAGTCAATGAGGSwPB2-F4 CCTAAGGCAACCAGAAGC 491SwPB2-R4 TGGCTGTCAGTAAGTATGCTAG
2 (PB1)
SwPB1-F1 ATGGATGTCAATCCGACTC 616SwPB1-R1 CTATTGTTCTTTGCGTGACCSwPB1-F2 AGGAAGGCTAATAGATTTCTTA 639SwPB1-R2 AGCATTTCTGCTGGTATSwPB1-F3 GAGTGGTTCAGAAACATC 738SwPB1-R3 TAACTCAAATGATCTTCTCGTSwPB1-F4 CAGATGGCTCTTCAATTGT 639SwPB1-R4 TTTTTGCCGTCTGAGTTC
3 (PA)
SwPA-F1 GGAAGACTTTGTGCGAC 703SwPA-R1 TCCATCTACATAGGCTCTAAASwPA-F2 CAGTAGGAGTCTATGGGAT 607SwPA-R2 TTTGCAGTCATCAAAGTCTASwPA-F3 TTGGAAGCAGGTGCT 700SwPA-R3 GGTTCCATTGGTTCTCACSwPA-F4 TGATGTGGTGAACTTTGTAAG 600SwPA-R4 AGTGCATGTGTGAGGA
4 (HA)
SwHA-F1 CCGCAAATGCAGACACAT 510SwHA-R1 TTAATGTAGGATTTGCTGASwHA-F2 GGCCCAATCATGACTCGA 501SwHA-R2 AGGCTGGTGTTTATAGCACCSwHA-F3 CCGAGATATGCATTCGC 636SwHA-R3 CGTTTCCAATTTCCTTGGCSwHA-F4 TTGATGATGGTTTCCT 387SwHA-R4 TTAGAGCACATCCAGAAA
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Amplificación genómica•PCR anidada•Taq:Pfu•Secuenciación Programa de Termociclaje
Primera y segunda PCR
°C Tiempo Ciclos
95 5 min 1
95 20 seg35Tm 30 seg
72 90 seg72 5 min
14 5 min
16
Secuenciación genómica• Laboratorio Nacional de Genómica para la
Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato•Electroferogramas▫4peaks
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Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos
•Zanamivir▫D-151▫N, G, E o V
•Oseltamivir▫H274Y y E119V
Neuraminidasa
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Análisis bioinformático• Homología▫ BLAST
• dN/dS▫ “Codon-based Z-test of selection”▫ “Position-wise based selection estimation (HyPhy)”▫ MEGA 5
• Recombinación y similaridad▫ SimPlot versión 3.5.1
• Modelo evolutivo▫ FindModel
• Inferencia del ancestro común más reciente▫ BEAST v1.5.4, Tracer v1.5▫ TreeeAnnotator v1.5.4, FigTree v1.3.1
19
Resultados y discusión
20
Epidemiología• 1° marzo 2009- 9 abril 2010• 706 muestras
• 133 (18.8%) positivas• 17 muestras
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Secuencias generadas
• 2 genomas completos• 7 parciales
▫ 8(NS)• 8 parciales
▫ Mas de 1 segmento• Superposición para generar secuencia completa
▫ Sin ambigüedad
Segmento No.
1(PB2) 11
2(PB1) 11
3(PA) 11
4(HA) 9
5(NP) 11
6(NA) 10
7(M) 9
8(NS) 7
99% similitud
22
dN/dS• Hipótesis de neutralidad
▫ dN/dS=0 • Hipótesis de selección
purificadora▫ dN<dS
• Hipótesis de selección positiva▫ dN>dS
1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241 261 281 301 321 341 361 381 401 421 441 461 481 501 521 541 561
-4
-3.5
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0.5
1
Hemaglutinina (HA) dN-dS
Proteína Valor p Hipótesis
PB2 0.001
Selección purificadora
PB1 0.00003
PA 0.004
HA 0.0004
NP 0.0001
NA 0.04
M1 0.008
M2 0.162
NS1 0.341
NS2 0.148
23
•Cepas circulantes en una misma temporada son muy parecidas.
•El virus tiende a la conservación después de venir de una serie de cambios que provocaron que el virus saltara de hospedero a hospedero.
•dN/dS Selección purificante
•Un año de circulación.
24
Análisis de similitud• Secuencias consenso por hospedero
Locales
Porcino
Humano
Aviar
25
Análisis de similitud• Secuencias consenso por subtipo
LocalesH1
H2H5
H9H4H3
26
Análisis de similitud• Secuencias consenso por región geográfica
LocalesNorte América
Asia
Europa
27
Análisis de Bootscan
Norte América
Europa
Asia
• Secuencias consenso por región geográfica
28
Origen geográfico
Segmento Hospedero Origen geográfico1(PB2) porcinos Asia2(PB1) humanos Oceanía3(PA) aves Norte América4(HA) porcinos Asia5(NP) porcinos Asia6(NA) aves Europa7(MP) aves Asia8(NS) porcinos Norte América
29
Fraser C. Pandemic Potencial of a Strain of Influenza A (H1N1): Early Findings. Sciencexpress. 11 Mayo 2009.
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Eventos de recombinación
Segmento Recombinación Similitud Similitud de secuencia restante
1(PB2) 876-1124 porcinos Asia porcinos Norte América
3(PA) 1-2771014-1170
aves Europaaves Oceanía aves Norte América
4(HA) 1-300 porcinos Europa porcinos Norte América
6(NA) 1-2531330-1349
aves Oceaníaaves Sudamérica aves Europa
7(MP) 196-225850-1027
aves Oceaníaaves Europa aves Asia
31
•Mutaciones puntuales•He et al., 2009 ▫Recombinación
▫Diversidad mayor en virus de la influenza aviar.
32
•No existe ningún otro reporte que documente recombinación entre cepas de influenza.
•Nosotros encontramos:▫Recombinación de cepas de distintas regiones.▫Virus de influenza humana.
•Estos datos indican que además de la derivación y desplazamiento antigénico la diversidad genética de influenza también puede generarse por recombinación.
•Se desconoce el impacto de este mecanismo en la generación de nuevas variantes de influenza.
Ancestro común más reciente
JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR 2008 2009
7(M1)
6(NA)
3(PA)
2(PB1)5(NP)
1(PB2)4(HA)
8(NS1)
7(M2)8(NS1)
34
Ancestro común más recienteSegmento Smith (2009) Godoy (2010)
1(PB2) 9 SEP 2008 11 ENE 2009
2(PB1) 24 OCT 2008 16 DIC 2008
3(PA) 7 OCT 2008 2 NOV 2008
4(HA) 28 AGO 2008 30 ENE 2009
5(NP) 27 MAR 2008 20 DIC 2008
6(NA) 8 AGO 2008 19 OCT 2008
7(M1)3 AGO 2008
8 JUL 2008
7(M2) 16 MAR 2009
8(NS1)21 MAY 2008
21 FEB 2009
8(NS2) 22 MAR 2009
35
•El MRCA estima la fecha más probable en que el ancestro putativo comenzó a circular.
•A medida que más información se compara, la estimación se vuelve más refinada.
•Nuestro estudio incluye solamente secuencias mexicanas.
•Periodo de estudio: 30 marzo 2009 - 9 abril 2010
36
Tasas de mutación global
Segmento Tasa de mutación x 10-3(s/s/a) §
1(PB2) 6.32
2(PB1) 5.31
3(PA) 4.22
4(HA) 17.6
5(NP) 6.53
6(NA) 6.30
7(M1) 5.09
7(M2) 49.5
8(NS1) 17.7
8(NS2) 58.5
§ Substituciones nucleotídicas por sitio por año.
37
Mutación por posición codónicaPA
NS1
38
Tasa de mutación•Es mayor a lo anteriormente reportado.•El virus está evolucionando rápidamente.•Etapas tempranas de la evolución del virus hay una
gran diversidad.•Posteriormente predomina la cepa biológicamente
más exitosa.
39
Resistencia a antivirales
•No se encontraron las mutaciones▫Zanamivir 151▫Oseltamivir 119 y 274
•Presión selectiva•Harvala (2010)▫Cepas resistentes a oseltamivir
•OMS▫11 agosto 2010▫120 cepas resistentes a oseltamivir
40
Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
0.0 100 200 300 400
5(NP)
445
41
0.0 100 200 300 400
M1
437
Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
42
•Proceso evolutivo ▫Perpetuarse.
•Al principio de la pandemia se originó un número elevado de experimentos biológicos destinados a generar mucha diversidad con la posibilidad de que alguna de las cepas lograra colonizar a un hospedero y convertirse en una cepa biológicamente exitosa.
43
Conclusión•MRCA es más reciente.• La tasa de mutación global es mayor.•No se encontraron mutaciones que confieren
resistencia a antivirales.• La recombinación de segmentos del virus de la
influenza entre cepas circulantes en diversas regiones y hospederos es una posible manera en la que se puede explicar la diversidad de estos virus.
44
Actividades realizadas durante la maestríaFebrero 2009 SLP,SLPCurso sobre Infecciones Virales: Epidemiología, diagnóstico molecular y aplicación clínica
Junio 2009 SLP,SLPCurso sobre la Tecnología del ADN Recombinante: Producción y purificación de Taq ADN polimerasa
Septiembre 2009 SLP,SLPAsistente a la I Reunión Académica de Enfermedades infecciosas y su prevención y a la 8ª Reunión Internacional de vacunas
Octubre 2009 Guadalajara, JaliscoAsistente al XXXIV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica
Octubre 2009 SLP, SLPParticipación como ponente durante la 16ª Semana de Ciencia y Tecnología
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Noviembre 2009 Merida, YucatánAsistente al VI Congreso Nacional de Virología
Mayo 2010 Guadalajara, JaliscoCartel XXXV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica “Hospitalización asociada a infección por virus de influenza pandémica A(H1N1) 2009 e influenza estacional en pacientes menores de 5 años”. Godoy-Lozano; Contreras-Treviño; Aranda-Romo; Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Hernández-Salinas; Barrios-Compeán; Ochoa-Pérez; García-Sepúlveda; Noyola-Cherpitel. Facultad de Medicina. UASLP. SLP,SLP.
Aportaciones a GenBankGU811749, GU811750, GU811751, GU811752, GU811753, GU811754, GU811755, GU811756, GU811757, GU811758.
46
Manuscritos•Pandemic influenza A(H1N1) 2009 and respiratory
syncytial virus associated hospitalizations. Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Monjarás-Ávila, Godoy-Lozano, Comas-García; Aguilera-Barragán; Durham-González; Contreras-Vidales; Ochoa-Pérez; Gómez-Gómez; García-Sepúlveda; Noyola . En revisión en Journal of Infection.
•Viral DNA Extractions from Blood Using Laudry Detergent. Guerra-Palomares; Godoy-Lozano; Noyola; García-Sepúlveda. En revisión en Nucleid Acid Research.
47
•CONACYT•Asesores• Laboratorio de Virología •Familia•Amigos
Agradecimientos
Gracias
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