1Bioq
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ica
gD T
ema
4 (U
VEG)
Enzimas
Tema 4
2Bioq
uím
ica
gD T
ema
4 (U
VEG)
Esquema del Tema
•Catalizadores biológicos–Enzimas–Ribozimas
•Centro activo–Especificidad–Complementariedad–Interacciones débiles
•El estado de transición•Modelos del complejoenzima-sustrato
–Llave y cerradura–Ajuste inducido
•Clases de enzimas•Cofactores enzimáticos
•Nociones de cinética química•Cinética de la catálisisenzimática
–Modelo cinético de Michaelis-Menten
•Estado preestacionario•Estado estacionario•Ecuación de Michaelis-Menten•Representaciones gráficas
–Inhibición enzimática•Inhibición irreversible•Inhibición reversible•Análisis gráfico de lainhibición
•Mecanismos moleculares deregulación enzimática
3Bioq
uím
ica
gD T
ema
4 (U
VEG)
Catalizadores Biológicos
• Catalizador:– Aumenta la velocidad de
reacción– No varía ΔG de la reacción– Facilita la reacción en
condiciones no extremas– No se consume durante la
reacción
• Los catalizadoresbiológicos son:
– Casi siempre proteínas(enzimas)
– Excepcionalmente RNAcatalítico (ribozimas)
Ejemplos de reacciones catalizadas
Anhidrasacarbónica
Péptido oproteína
Proteasa
• 1011 veces más rápida• La especifidad depende de R1
• Convierte 6x105 moléculas porsegundo
• 107 veces más rápida que sin enzima
4Bioq
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ema
4 (U
VEG)
El Centro Activo
• Las enzimas sonespecíficas por sussustratos
– Interacción precisa enzima-sustrato
– Sitio de interacción: “centroactivo”
• Hendidura tridimensional• Zona pequeña de la enzima• Propiedades especiales para
la unión y catálisis delsustrato
– Sustrato y centro activotienen formascomplementarias
– Interacción a través deenlaces débiles
Uracilo(parte delSustrato)
Serina
Treonina
Ribonucleasa
Centro activ
o
5Bioq
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4 (U
VEG)
El Estado de Transición
• La reacción transcurrea través de un estadode transición (S*)
– Intermedio entre S y P– Mayor energía que S
• Barrera de energía deactivación
• La enzima facilita laformación de S*
– Reduce la energía deactivación
• Acelera la reacción
– S* es complementariocon el centro activo
Explicación termodinámica
S S* P
Sustrato (S)
Producto (P)
Progreso de la reacción
En
erg
ía l
ibre
Dereacción
(No catali-zada)
Estado de
transición S*
(catalizada)
Energía deactivación
6Bioq
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4 (U
VEG)
Modelos del Complejo Enzima-Sustrato
• La llave y la cerradura(Fischer, 1890)
– Centro activo y sustratoson perfectamentecomplementarios
• Reconocimiento molecular
• Ajuste inducido(Koshland, 1958)
– La unión del sustratoinduce un cambio en elcentro activo que aumentala complementariedad
• Reconocimiento moleculardinámico
Enzima
Complejo ES
Enzima
Complejo ES
Sustrato
Sustrato
Estado detransición
7Bioq
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ema
4 (U
VEG)
Clases de Enzimas
• Oxidoreductasas– Catalizan reacciones de
oxidoreducción• Deshidrogenasas,
oxidasas, oxigenasas,reductasas, peroxidasas
• Transferasas– Catalizan transferencias de
grupos• Fosfotransferasas• Transcarboxilasas,
transaminasas,transmetilasas
• Hidrolasas– Catalizan la rotura de
enlaces por adición de agua• Esterasas, fosfatasas,
peptidasas
• Liasas– Catalizan la ruptura y
formación de enlaces• Descarboxilasas,
deshidratasas,desaminasas
• Isomerasas– Catalizan reordenamientos
moleculares• Epimerasas, mutasas
• Ligasas– Catalizan formaciones de
enlace entre dos sustratos,con energía aportada por lahidrólisis de ATP
8Bioq
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gD T
ema
4 (U
VEG)
Cofactores Enzimáticos
• Componentes no proteicos requeridospara la actividad de la enzima
– Apoenzima + cofactor = holoenzima– Dos tipos
• Iones metálicos– Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ...
• Coenzimas– Moléculas orgánicas pequeñas, muchas son
derivadas de las vitaminas– Su carencia produce enfermedades
9Bioq
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4 (U
VEG)
Nociones de Cinética Química
• Velocidad de reacción • En condiciones deequilibrio
Velocidad
Consumode A
Formaciónde B
Constante develocidad
A Bk1
k -1
En el equilibrio v = 0
[B]
[A]
10Bioq
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4 (U
VEG)
Nociones de Cinética Química
• Reacciones sucesivas– La velocidad depende del paso más lento
A B Ck1 k2
Si k2 << k1, entonces B C es el paso limitante de la reacción,y la velocidad depende sólo de k2
k2
– Cuando la primera reacción es reversible, lallamamos preequilibrio
A B Ck1
k -1
k2
Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, ydecimos que se alcanza un equilibrio rápido
B = Intermediario
11Bioq
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VEG)
Cinética de la Catálisis Enzimática
Producto
Complejoenzima-sustrato(intermediario)
Preequilibrio
E + S ES E + Pk1
k -1
k2
Fase de afinidad: uniónde S al centro activo de E yformación del complejo ES
Fase de catálisis:transformación de S en P yrecuperación de E
Constante dedisociación delcomplejo ES
Es el paso limitante
Constantecatalítica (kcat)
12Bioq
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4 (U
VEG)
Modelo Cinético de Michaelis-Menten
• Relaciona la velocidad de catálisis con laconcentración de sustrato
• Parte de los siguientes supuestos1. P no se convierte en S
– Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de lareacción). Consideramos velocidades iniciales (V0)
2. k2< k-1– Se alcanza el estado estacionario (velocidad de
formación de ES igual a velocidad dedescomposición de ES)
– [ES] se considera constante
3. [E] << [S]– [S] ≈ [S]inicial
13Bioq
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4 (U
VEG)
Estado Estacionario
TiempoEstadoPre-estacionario
Con
centr
ació
n
Equilibrio
Estado estacionario: d [ES] / d t ≈ 0 [E]
14Bioq
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4 (U
VEG)
Ecuación de Michaelis-Menten
E + S ES E + Pk1
k -1
k2
1 Velocidad Inicial:
2 En el estado estacionario:
Ecuación de Michaelis(curva hiperbólica):
Constantede Michaelis
V0 alcanza el valor máximocuando [ES]=[E]total
15Bioq
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VEG)
Representación de la Ecuación de Michaelis
Vel
oci
dad
de
reac
ción
Concentración de sustrato [S]
Equilibrio
Tiempo
Pro
duct
o
[S]1
[S]2
[S]3
[S]4
• Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores deconcentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc
• V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total,sealcanza Vmax)
• KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax
• Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener dela representación hiperbólica
16Bioq
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VEG)
Linealización de la Ecuación de Michaelis
• Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transformaen una función lineal
• Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos)
1/ V0
1/ [S]
Inverso
Recta
PendienteOrdenada enel origen
1/ Vmax
-1/ KM
Pendiente: KM / Vmax
17Bioq
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VEG)
Significado de la KM
• Dos significados– KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax
• Representa la [S] necesaria para que ocurra una catálisissignificativa
– Cuando k2 << k-1, KM ≈ KS (constante de disociación delcomplejo ES)
• Representa la inversa de la afinidad de la enzima por elsustrato
• KM Tiene unidades de concentración (M)
• Para una enzima determinada– KM varía según el sustrato y las condiciones (pH,
temperatura, fuerza iónica, ...)
≈
18Bioq
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VEG)
Significado de Vmax y k2 (kcat)
• Vmax revela el número de recambio de laenzima
– Número de recambio = kcat• número de moléculas de sustrato convertidas en
producto por unidad de tiempo y por cada molécula deenzima, en condiciones de saturación
Unidades: M s-1
Unidades:s-1
Unidades:M
1 / kcat es el tiemponecesario para laconversión de una moléculade sustrato en producto (unciclo catalítico)
E + S ES E + Pk1
k -1
k2
19Bioq
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VEG)
Eficacia Catalítica (kcat / KM)
• En condiciones fisiológicas las enzimasno se encuentran saturadas ([S] < KM)
– En estas condiciones
•Constante de velocidad para la interacción entreE y S
•Representa la eficacia catalítica de la enzima•Sirve para comparar la preferencia de unaenzima por diferentes sustratos
•Unidades: M-1s-1
!
Vo=kcat[E]
o[S]
KM
+[S]
!
Vo=kcat
KM
E[ ] S[ ]
[E]o [E]
[S] despreciable vs KM
20Bioq
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VEG)
Inhibición Enzimática
• Inhibición: Disminución de la actividad deuna enzima por acción de un inhibidor
– Irreversible• El inhibidor se une fuertementa a la enzima
– Ejemplos:» La ampicilina: Modifica covalentemente una
transpeptidasa responsable de la síntesis de la paredcelular bacteriana
» La aspirina: Modifica covalentemente unaciclooxigenasa que produce señales inflamatorias
– Reversible• El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el
complejo EI se encuentra en equilibrio con las formaslibres
21Bioq
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VEG)
Inhibición Reversible Competitiva
• El inhibidor se une ala enzima libre
– Compite con elsustrato
• Puede ser superada a[S] elevada. No afectaa la Vmax (ni a la kcat)
• Afecta a la KM
– Aumenta (KM aparente >KM)
– Suelen ser moléculassimilares al sustratoo análogos del estadode transición
Sin inhibidor
[S]
Vel
ocid
ad d
e re
acci
ón
SustratoInhibidor
competitivo
22Bioq
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VEG)
Inhibición Reversible No Competitiva
• El inhibidor se une tantoal E y como al complejoES
– Se une en un sitiodistinto del sitio activo
• No se supera con [S]elevada
• Vmax disminuye
– Vmax aparente < Vmax
• No afecta a La KM
SustratoInhibidorno competitivo
Vel
ocid
ad d
e re
acci
ón
Sin inhibidor
[S]
23Bioq
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4 (U
VEG)
Análisis Gráfico de la Inhibición
Inhibición competitiva
+ Inhibidor competitivo
Sin inhibidor
+ Inhibidor no competitivo
Sin inhibidor
Inhibición no competitiva
-1/KM
-1/KMap
1/Vmax
-1/KM
-1/Vmaxap
1/Vmax
24Bioq
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VEG)
Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática
• Permiten la adaptación de la actividad anecesidades fisiológicas, estados deldesarrollo o condiciones ambientales
– Regulación temporal/espacial• Utilización de isoenzimas
– Regulación lenta• Control de la disponibilidad y de la vida media de la
enzima
– Regulación rápida• Control alostérico• Modificación covalente
– Reversible– Irreversible
25Bioq
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4 (U
VEG)
Isoenzimas
• Son distintas formas de una mismaenzima
– Enzimas homólogas presentes en unmismo organismo
• Cada isoenzima en un tejido diferente o enun momento del desarrollo diferente
• Catalizan la misma reacción, con pequeñasdiferencias
– Pequeñas diferencias en su secuencia» Diferencias en su estructura» Distintos valores de KM y/o Vmax
» Distintas propiedades reguladoras
26Bioq
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4 (U
VEG)
Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas
• Muchas enzimas presentan una vidamedia corta
– En las células existe un recambioproteico constante
– La concentración de las enzimas seencuentra regulada
• A través de la regulación de su síntesis– Regulación de la transcripción y de la traducción
• A través de la regulación de su degradación– Mediada por ubiquitina y ejecutada por el
proteasoma
27Bioq
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VEG)
Enzimas Alostéricas
• Contienen varios centros yvarias subunidades– Centros activos– Centro reguladores
• Efecto alostérico– A través de cambios
conformacionales
• Efecto homotrópico– Entre centros equivalentes
• Cooperatividad– Curvas sigmoides– No siguen la cinética de
Michaelis-Menten
• Efecto heterotrópico– De centros reguladores sobre
centros activossustrato
[sustrato]
V
VEstado R
Estado T
28Bioq
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VEG)
Ejemplo de Enzima Alostérica
Carbamilfosfato Aspartato
+
N-carbamilaspartato
Aspartatotranscarbamilasa
ATCasa
Citidin trifosfatoCTP
Producto final de la ruta
Primer paso de la ruta de síntesis de nucleótidos de pirimidina
Ruta de 9 pasos
ATP
PurinasProducción energética
Activa
ción
Retro-inhibición
29Bioq
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VEG)
Estructura de la ATCasa
Estructura cuaternaria:dos trímeros catalíticos + tres dímeros reguladores
30Bioq
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4 (U
VEG)
Regulación Alostérica de la ATCasa
Mecanismos de cooperatividady de activación:Los sustratos y los activadoresestabilizan las formas de altaafinidad (o formas R)
Mecanismo de inhibición:Los inhibidores estabilizanlas formas de baja afinidad(o formas T)
Estado T(menos activo)
Estado R(más activo)
Favorecido por la unión delInhibidor (CTP)
Favorecido por la unión delos sustratos y del activador (ATP)
31Bioq
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4 (U
VEG)
Activación e Inhibición Alostérica
ActivaciónInhibición
Menor actividad y curva menossensible a la concentración desustratos
Mayor actividad y curva mássensible a la concentración desustratos
32Bioq
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4 (U
VEG)
Modificación Covalente
• Irreversible– Activación por
rotura proteolíticade precursoresinactivos(zimógenos)
• Enzimas de ladigestión
• Cascada decoagulación
• Activación decaspasas enapoptosis
• Reversible– Unión covalente de
un grupo químicoque altera laspropiedadescatalíticas de laenzima
• Fosforilación-desfosforilación
• Oxidación-reducción• Acetilación-
desacetilación
33Bioq
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ema
4 (U
VEG)
Cascada de la Coagulación
34Bioq
uím
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4 (U
VEG)
Regulación por Fosforilación Reversible
• Fosforilación– Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a
grupos –OH de Ser Thr o Tyr– Catalizada por proteínas quinasa– A menudo desencadenan efectos amplificados
• Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas.A su vez cada una de ellas activará centenares deotras enzimas, ...
• Desfosforilación– Eliminación de grupo fosforilo de proteína
fosforilada– Catalizada por proteína fosfatasa
35Bioq
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4 (U
VEG)
Cascada de Fosforilación Reversible
phosphorylasekinase b
phosphorylasekinase a P
PKA
phosphorylase b phosphorylase a P
glycogen n glycogenn-1 + glucose 1-P
glucose-6-P
glucose(liver)
glycolysis& TCA cycle(muscle)
PP
PP
36Bioq
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4 (U
VEG)
Regulación de rutas Metabólicas
• Control a nivel de sustrato– La acumulación de producto inhibe la acción de
la enzima
• Control por retroinhibición– El producto final de una ruta inhibe el primer
paso de la ruta
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADPHexoquinasaInhibición
A B C D NRetroinhibición
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