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ESCUELA DE BIOLOGÍA
“Estudio de la morfología neuronal de la corteza
prefrontal, el hipocampo y la memoria en ratas de la cepa
Wistar, Sprague Dawley y Long Evans tratados con
cerebrolisina en etapa senil”
Tesis que para obtener el título de:
LICENCIADO EN BIOLOGÍA
PRESENTA:
Luis Ángel Lima Castañeda.
TUTOR: Dr. Gonzalo Flores Álvarez
ASESOR: Dr. Rubén Antonio Vázquez Roque
JUNIO 2016
BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
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ÍNDICE
I. Introducción
1.1 Proceso biológico del envejecimiento
1.1.1 Teorías del envejecimiento: (estrés oxidativo, telomerasas)
1.1.2 Cambios en el Sistema Nervioso relacionados con el envejecimiento
1.1.3 Cambios conductuales relacionados con el envejecimiento
1.2. Hipocampo: Anatomía y funciones
1.2.1 Corteza media prefrontal: Anatomía y funciones
1.3 Memoria y aprendizaje
1.4 Características de las cepas de rata (Sprague Dawley, Wistar y Long
Evans)
1.4.1 Generalidades entre las cepas Sprague Dawley, Wistar y Long Evans
1.4.2 Diferencias conductuales entre las cepas (Long Evans, Sprague-Dawley,
Wistar).
1.5 Cerebrolisina
1.5.1 Generalidades de la cerebrolisina
1.5.2 Efectos neurotróficos de la cerebrolisina
1.5.3 Mecanismos moleculares de la cerebrolisina
1.5.4 Propiedades farmacológicas de la cerebrolisina
1.5.5 Efectos de la cerebrolisina en modelos de envejecimiento
II. Planteamiento del Problema.
III. Justificación
IV. Hipótesis
V. Objetivos
4.1 Objetivo general
4.1.2 Objetivos específicos
V. Metodología
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5.1 Diagrama de trabajo
5.1.2 Cronograma de actividades
5.2 Sujetos de experimentación
5.3 Administración de cerebrolisina
5.4 Laberinto acuático de Morris
5.5.1 Aparato
5.5.2 Fase de adquisición
5.5.3 Fase de retención
5.6 Estudios morfológicos
5.7 Preparación de la solución Golgi-Cox
5.7.1 Revelado de la tinción Golgi-Cox
5.7.2 Dibujo de neuronas
5.8 Análisis de los resultados morfológicos
5.9 Análisis estadístico
VI. Resultados
6.1 Laberinto acuático de Morris
6.2 Morfología neuronal
6.2.1 Corteza media prefrontal
6.2.2 Hipocampo dorsal región CA1
VII. Discusión
VIII. Conclusión
IX. Perspectivas
X. Bibliografía
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Agradecimientos:
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Índice de Tablas y Figuras. Fig. 1 La fuente y las respuestas celulares a
las especies reactivas de oxígeno (ROS). Modificado de Finkel y Holbrook., (2012).
Fig. 2 Comparación morfométrica entre el cerebro de un individuo joven y un individuo en etapa senil con enfermedad de Alzheimer. Modificado de Scahill y cols., (2003).
Fig. 3 Esquema representativo de la anatomía del hipocampo.
Fig. 4 Vías de salida o eferentes del hipocampo.
Fig. 5 Vías de entrada o aferentes al hipocampo.
Fig. 6 Localización y composición de la corteza media prefrontal.
Fig. 7 Esquema representativo de los dos tipos de memoria (implícita y explícita) y la región cerebral en dónde tiene origen. Modificado de Kandel (2000).
Fig. 8 Cepa Long Evans
Fig. 9 Cepa Sprague-Dawley
Fig. 10 Cepa Wistar
Fig. 11 Comparación entre la edad biológica de la rata (en meses) respecto a la edad biológica (en años) en los seres humanos.
Fig. 12 Diagrama de trabajo.
Fig. 13 Cronograma de Actividades.
Fig. 14 Esquema que representa cada uno de los componentes del Laberinto Acuático de Morris.
Fig. 15 Esquema que representa la manera
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en que las neuronas son plasmadas sobre papel para su posterior análisis.
Fig. 16 Esquema que muestra la plantilla de discos concéntricos para el análisis de Sholl.
Fig. 17 Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de latencia de escape (aprendizaje espacial) en la prueba del Laberinto Acuático de Morris de las cepas Sprague – Dawley, Wistar y Long Evans.
Fig. 18 Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de latencia de al primer cruce (Retención de la memoria) en la prueba del Laberinto Acuático de Morris de las cepas Sprague – Dawley, Wistar y Long Evans.
Fig. 19 Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el número de visitas hechas por los animales de las cepas Wistar, Sprague-Dawley y Long Evans a los cuatro cuadrantes (I, II, III y IV).
Fig. 20 Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de permanencia en cada cuadrante de los animales de las cepas Wistar, Sprague-Dawley y Long Evans.
Fig. 21 Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre la morfología neuronal de la corteza prefrontal media (CPFm) en la capa III de las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans.
Fig. 22 Efecto de la administración crónica de la CBL sobre la morfología neuronal de la corteza media prefrontal (CPFm) capa V de las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans.
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Fig. 23 Efecto de la administración crónica de la CBL sobre la morfología neuronal de la región CA1 del hipocampo dorsal.
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RESUMEN.
La continua transición demográfica y epidemiológica prevalece aún en la sociedad
del siglo XXI, generando poco a poco un considerable aumento de la población
senil en los últimos años, considerando además que esté es un proceso biológico
natural entre las especies. Así pues, el creciente interés sobre el estudio del
proceso envejecimiento en la actualidad, se encuentra ligado con las crecientes
demandas en materia de salud que acarrea dicho proceso, es por ello que en años
recientes la investigación se ha centrado en la búsqueda y generación de
tratamientos clínicos y farmacológicos que ayuden a disminuir considerablemente
las alteraciones en el estado de salud físico y mental de los individuos en etapa
senil. El cerebro es uno de los principales órganos en verse afectado durante el
proceso de envejecimiento, al mostrar cambios atípicos a nivel morfológico,
molecular y fisiológico en circuitos o vías neuronales encargadas de la
transducción e interpretación de la información percibida del medio ambiente. Un
ejemplo claro de estos cambios irregulares ocurre en la formación de la memoria y
el aprendizaje los cuales fueron objeto de análisis para este estudio al evaluar
regiones cerebrales cómo la corteza prefrontal, el hipocampo que forman parte del
intrincado circuito cerebral encargado de generar estos procesos cognitivos.
Recientemente se ha discutido el uso de la cerebrolisina en la terapia clínica para
contrarrestar la pérdida gradual y progresiva de la memoria, así como de la
integridad neuronal, ya que actúa como factor neurotrófico endógeno, protegiendo
así la integridad de los circuitos neuronales y mejorando el rendimiento cognitivo.
Así mismo, la constante búsqueda por encontrar el mejor modelo biológico de
estudio para evaluar los efectos adversos del envejecimiento permea una
importante cuestión dentro de la investigación. Los modelos murinos proveen
potenciales herramientas para la investigación de la genética, la biología celular, la
fisiología y la biología del comportamiento del envejecimiento normal y las
enfermedades asociadas a la edad.
Es por ello que el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la
administración crónica de cerebrolisina (CBL) sobre el aprendizaje y la memoria
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espacial, y la morfología de las neuronas piramidales en la corteza prefrontal
media (CPFm) y el hipocampo (HP), así como la densidad de espinas dendríticas
en ratas de las cepas Sprague Dawley, Wistar y Long Evans en etapa senil.
Los resultados de la morfología neuronal mostraron un aumento significativo, en la
arborización, el número de orden dendrítico y la longitud dendrítica total en la capa
III y V de la corteza prefrontal media, así como un aumento en la densidad de
espinas dendríticas de las cepas Sprague Dawley y Long Evans tratadas con
cerebrolisina.
Por otro lado en la región CA1 del hipocampo dorsal se obtuvieron diferencias
significativas en la arborización dendrítica de las cepa Wistar tratada con
cerebrolisina, mientras que en la de la cepa Long Evans tratada con cerebrolisina
se obtuvieron diferencias significativas en el número de orden dendrítico y la
densidad de espinas dendríticas, demostrando con ello claramente las diferencias
en cuanto a la morfología neuronal entre las cepas Wistar, Sprague Dawley y
Long Evans.
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Introducción
El envejecimiento es el proceso biológico que involucra la acumulación de
cambios físicos, psicológicos y sociales en un individuo a través del tiempo, los
cuáles se encuentran regulados genéticamente e influenciados por factores
ambientales, comprometiendo así la capacidad de sobrevivencia, aumentando el
deterioro funcional y la creciente probabilidad de muerte del organismo (Bizon, y
Woods 2008)
Así pues, considerando la importancia del fenómeno del envejecimiento sobre la
población actual y el creciente interés por parte de los neurocientíficos para su
estudio en pleno siglo XX, lo que ha convertido este fenómeno en una de las
nuevas tendencias más significativas de estudio, al evaluar el cómo y el porqué de
ciertos cambios ya sea físicos o mentales durante envejecimiento pueden
repercutir sobre la creciente población de adultos mayores, ya que solo por citar
un ejemplo, la demencia senil se está convirtiendo en el tercer problema de salud
en países desarrollados, al presentar una incidencia de la enfermedad en 10.7 de
cada 1000 personas al año, e incluso se ha visto la incidencia de éstos trastornos
a nivel de género en dónde 13.1 de cada 1000 mujeres y 6.9 de cada 1000
hombres padecen algún tipo de enfermedad senil, con un notable incremento
paralelo a la edad (0.9% de individuos de entre 55-64 años, 25.2% de individuos
de entre a los 80-84 años, y 97.2% de individuos mayores de 95 años que
padecen de algún tipo de trastorno neurodegenerativo (Hofman, 1991).
En México, el envejecimiento de la población se ha hecho evidente a partir de la
última década del siglo XX e inevitablemente será el cambio demográfico más
notorio del siglo XXI. Hasta el 2014 y de acuerdo con la Encuesta Nacional de
Ocupación y Empleo (ENOE), que realiza el Instituto Nacional de Estadística y
Geografía (INEGI), en México la población de 60 años o más es de
aproximadamente 12.9 millones de personas, es decir, 10.8% del total de la
población mexicana. Además, según proyecciones del Consejo Nacional de
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Población (Conapo), para el 2050 alcanzará el 22 por ciento, cifra superior al de la
población infantil (19%).
Tomando en cuenta lo anterior y aún con los grandes avances en materia
tecnológica y clínica aplicada a la investigación, no ha sido del todo posible llegar
a un consenso general acerca de cuáles son los mecanismos específicos que
rigen las alteraciones durante el envejecimiento normal, así como de algunos
trastornos neurológicos como la demencia senil o la enfermedad de Alzheimer los
cuáles parecieran ser patologías propias y recurrentes del envejecimiento humano
(Burke y Barnes, 2006) acrecentando aún más el interés por identificar y buscar el
trasfondo de estas alteraciones que se producen por ejemplo en el sistema
nervioso central de un organismo en proceso senil, puesto que estés desempeña
el papel central del control de la actividad corporal individual, y por lo tanto el
deterioro a daño sobre el sistema nervioso central envejecido, inevitablemente
conlleva a declinar muchas habilidades y procesos conductuales en el organismo.
El envejecimiento normal se encuentra relacionado con la pérdida progresiva de
las funciones cognitivas tal cómo la memoria y el aprendizaje las cuáles se
codifican en regiones cerebrales cómo el hipocampo y la corteza cerebral además
de que participan en funciones ejecutivas y en la toma de decisiones (Bories,
2013). El hipocampo está localizado en la línea media del cerebro y está
críticamente involucrado en la formación y utilización de los "mapas cognitivos", el
análisis del conocimiento, la cognición y la comunicación, morfológicamente es
una estructura compleja dividida en subregiones separadas pero interconectadas
anatómicamente, y cuya regionalización parece mantenerse entre las especies de
mamíferos (Samson y Barnes, 2013).
Cada subregión contiene diferentes tipos de neuronas que expresan perfiles
moleculares propios; tal particularidad parece contribuir a las diferencias en la
susceptibilidad de la disfunción de la memoria durante el envejecimiento; por
ejemplo la región CA1 hipocampal es una de las áreas cerebrales más
susceptibles al proceso de neurodegeneración, y está disminución de la densidad
neuronal podría deberse a la contracción y degeneración de elementos neuronales
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tales como las dendritas, en lugar de la pérdida de células en la senectud (Miller y
O’Callaghan, 2005).
Respecto a la corteza cerebral, la literatura menciona que los procesos cognitivos
que se relacionan con áreas corticales son particularmente vulnerables a los
efectos del envejecimiento, perjudicando el mantenimiento y formación de la
memoria de trabajo. Particularmente la corteza prefrontal dorso-lateral es la más
propensa a la degeneración neuronal (Stranahan y cols., 2012), específicamente,
los circuitos corticales más vulnerables a esta pérdida neuronal son aquellos que
conforman la vía perforante la cuál conecta con el hipocampo encaminando hacía
una pédrdida global de sinapsis y a la regresión de dendritas apicales, así como
una considerable disminución de la densidad de espinas dendríticas entre las
interconexiones de las cortezas de asociación (corteza temporal y corteza
prefrontal) (Morrison y Hoff, 2002; Morrison y Baxter, 2012).
Dentro de las propiedades dinámicas de las neuronas para contrarrestar ciertas
alteraciones en la integridad neuronal, encontramos a la plasticidad neuronal, la
cuál es la propiedad de toda neurona que le permite ajustar su fuerza sináptica
mediante la potenciación o depresión en la sinapsis y el reajuste de sus
conexiones neuronales, en conjunto estos procesos se relacionan directamente
con el refuerzo y la síntesis de la memoria y el aprendizaje. Durante los procesos
de envejecimiento la experiencia adquirida por cualquier organismo mediante el
aprendizaje que da origen a la plasticidad neuronal parece relacionarse
directamente con el deterioro cognitivo (Purves y Klajn, 2008).
1.1 Proceso biológico del envejecimiento
En la mayoría de los mamíferos este es un proceso natural inexorable, puesto que
conforme avanza la edad biológica del individuo, se puede observar una
disminución progresiva en su capacidad fisiológica para responder a las tensiones
medio-ambientales, siendo más susceptible de padecer ciertos trastornos y
enfermedades que comprometen los principales órganos y sistemas corporales.
Desde el momento preciso en el que sucede la fecundación, y durante el proceso
de desarrollo ontogenético hasta el nacimiento de un organismo adquiere todo tipo
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de habilidades indispensables para sobrevivir y adaptarse al medio que le rodea,
puesto que el entorno es un factor primordial que le permitirá al individuo alcanzar
cada una de las etapas posteriores para su desarrollo, rigiendo los cambios
indispensables a partir de los cuales asegura su subsistencia. Posterior a la etapa
postnatal, los seres vivos continúan con su crecimiento de manera continúa hasta
alcanzar el tope de su desarrollo, es decir inicia la etapa de maduración siendo
esté el punto crucial donde se considera que el organismo es apto totalmente para
resistir los constantes cambios de su entorno.
Finalmente cuándo un individuo alcanza su punto máximo de desarrollo, es
entonces cuándo se observa un decline en las habilidades adquiridas a través
tiempo con la experiencia, ralentizando así las capacidades individuales del
organismo para sobrevivir y adaptarse al medio siempre cambiante que le rodea,
es entonces cuándo se acepta que al individuo se encuentra ya en la etapa de
envejecimiento hasta finalizar con su muerte. (Mitchell y cols., 2015)
1.1.1 Teorías del envejecimiento.
El rango máximo del potencial de vida de una especie es una característica
constitucional propia que depende enteramente de las influencias ambientales y
los controles poligenéticos. La enorme heterogeneidad genética que caracteriza a
muchas especies, en particular a los humanos, y la complejidad de las
experiencias ambientales crea variaciones cuantitativas y cualitativas en el
fenotipo de la senectud (Carlson, 2005).
Dada la gran complejidad de cambios en la arquitectura sistémica y corporal que
ocurren en el envejecimiento, no es de sorprender que se propongan numerosas
teorías para explicar el porqué de estos cambios. A continuación se enlistan las
teorías más representativas que buscan dar explicación al fenómeno de
envejecimiento, al englobar ciertas características cómo el descenso progresivo
de los valores máximos de rendimiento fisiológico, disminución del número de
células que se encuentran en los epitelios germinales y los cambios atróficos o
apoptóticos de las células diferenciadas etc. (Miquel y cols., 2006). Desde
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cualquier punto de vista las teorías propuestas acerca de cómo es que se lleva a
cabo esté proceso ofrecen explicaciones de las causas y efectos que ocurren
durante el envejecimiento visto a través los distintos niveles de organización
biológica (tisular, celular y molecular) que conforman a cualquier organismo
multicelular, pero sin embargo ninguna de ellas parece ser totalmente satisfactoria.
Las teorías tradicionales sobre el envejecimiento sostienen que esté es una
adaptación o un proceso genéticamente programado; mientras que las teorías
biológicas modernas del envejecimiento se han dividido en dos categorías
principales Teorías programadas y Teorías por daños o errores (Jin, 2010):
Las teorías programadas. Proponen que el envejecimiento sigue un
calendario biológico, es decir un proceso estrictamente “controlado” y
continuo que regula el crecimiento y desarrollo desde la infancia hasta la
senectud.
Esta regulación dependería únicamente de los cambios en la expresión génica, la
cual perjudica a los sistemas responsables de las respuestas de mantenimiento,
reparación y de defensa celular.
Las teorías por daños o errores. Enfatizan agresiones ambientales a los
organismos induciendo así daño acumulativo a nivel fisiológico, celular y
molecular, catalogando al medio ambiente cómo la causa única del
envejecimiento.
A continuación se describen cada uno de los supuestos de las teorías biológicas
modernas que engloban el proceso de envejecimiento, y las cuáles son
dependientes entre sí:
Longevidad programada. El envejecimiento es el resultado de una conmutación
secuencial dentro y fuera de ciertos genes, la senescencia se define como el
momento en que se manifiestan déficits asociados con la edad.
La mayoría de las células muestran un patrón de división celular altamente
controlado al multiplicarse un número fijo de veces y posteriormente ingresar en
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un período en el cual no pueden volver a dividirse, conllevándolas inevitablemente
hacía la muerte celular. El momento preciso en el cual la célula inicia está etapa
no depende de un tiempo cronológico o metabólico, sino del número de divisiones
que se programen a lo largo del ciclo celular. Durante este proceso la célula es
capaz de duplicar su ADN, pero le es imposible copiar la secuencia de
nucleótidos completa, es aquí donde participan los telómeros que son estructuras
en secuencias de ADN repetitivo (TTAGGG) más proteínas de unión, que se
encuentran en los extremos de los cromosomas, y son los encargados de proteger
estas áreas de los procesos de recombinación, fusión y degradación. Está porción
de ADN se acorta en cada ciclo de división celular perdiendo entre 50 y 200
nucleótidos por cada replicación. Cada acortamiento del telómero disminuye su
función desencadenando el deterioro de sus funciones metabólicas así como una
tasa de división celular menor, lo cual pudiese estar relacionado con la
senescencia y la activación de los mecanismos acelerados de muerte celular
programada (Bass, 2006).
Telómeros y Telomerasa. El argumento de esta teoría sostiene que cuando los
telómeros se acortan por debajo de una longitud mínima, las células interrumpen
su ciclo celular y dejan de regenerar los tejidos, produciéndose así el
envejecimiento de las células y consecuentemente el envejecimiento de todo el
organismo. Cuantos más largos son los telómeros, más puede multiplicarse una
célula (incluidas las células madre que regeneran los tejidos) y por lo tanto el
organismo se mantiene joven durante más tiempo.
Como se mencionó anteriormente, los telómeros (secuencias repetidas de ADN
presentes en los 2 extremos de los cromosomas) se acortan cada vez que una
célula se divide, y este acortamiento se mide en base a el número de mitosis que
ha experimentado una población celular (Goyns, 2005).
Los telómeros protegen a los cromosomas y apoyan la transcripción exacta del
ADN nuclear, y cuando se vuelven demasiado cortos para permitir una nueva
división celular se observa el fin de la capacidad mitótica in vitro (Sun y cols.,
2011). Por el contrario se ha observado en las células inmortales o cancerígenas
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ya que se protegen contra el acortamiento de los telómeros gracias a la actividad
de la telomerasa, que remplaza las secuencias teloméricas perdidas, manteniendo
así los telómeros en un tamaño constante y preservando con ello la capacidad de
división celular in vitro (Kang y Park., 2007). Incluso se han realizado estudios que
han evaluado la acción de la telomerasa en cultivos celulares, observando que la
inducción in vitro de esta enzima otorga a las células humanas “normales” la
capacidad para mantener un estado fenotípicamente juvenil lo que podría tener
importantes aplicaciones en investigación acerca de cómo es que la telomerasa y
el acortamiento de los telomeros parecieran estar involucrados en el proceso de
envejecimiento (Bodnar y cols., 2000), apoyando así la hipótesis cuyo fundamento
principal sostiene que un acortamiento excesivo de los telómeros bloquea la
mitosis y desencadena el envejecimiento celular.
La telomerasa por su parte es la enzima cuya función es imprescindible para
restaurar los telómeros de las células germinales y embrionarias de las que el
organismo no puede prescindir para prolongar indefinidamente su ciclo
reproductivo celular. Por lo tanto está enzima mantiene un papel importante dentro
de los parámetros del ciclo celular preservando la composición tisular y la función
de ciertos sistemas, interviniendo especialmente en el envejecimiento de algunos
tipos celulares del sistema inmunológico (Effros, 2001).
Estrés Oxidativo. Esta teoría propone que el envejecimiento es una
consecuencia de la acumulación de ciertas moléculas conocidas como “radicales
libres” y que se originan en el interior del organismo a causa del metabolismo
celular (productos de desecho). En este sentido los cambios originados por dichos
radicales serían una causa importante que provoca que el organismo envejezca
deteriorando estructural y funcionalmente las diferentes biomoléculas. Estos
radicales libres procederían de una fuente endógena (subproductos del
metabolismo celular) o exógena (fármacos, humos, radiaciones, etc.).
Esta teoría que define como agentes agresores a las especies reactivas en
oxígeno (ROS) así como a los radicales libres (FR) y a la diana fundamental de la
agresión el ADN mitocondrial (mtADN). Los oxidantes se generan de manera
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exógena o cómo resultado del metabolismo intracelular normal en la mitocondria y
peroxisomas, así como de una variedad de sistemas de enzimas citosólicas. Estás
especies reactivas en oxígeno abarcan una amplia variedad de diversas especies
químicas incluyendo aniones super-óxido, radicales hidroxilo y peróxido de
hidrógeno. Algunas de estas especies, como los super-óxidos o radicales
hidroxilo, son extremadamente inestables, mientras que otros, como el peróxido
de hidrógeno, difunden libremente y tienen un periodo de vida relativamente largo
(Finkel y Holbrook, 2012). En condiciones normales las mitocondrias son capaces
de neutralizar estassustancias a través de la producción de enzimas antioxidantes
endógenas, (superóxido dismutasa, catalasa y peroxidasa), convirtiendo los
radicales libres en moléculas energéticamente más estables y disociables, sin
embargo cuando la célula envejece, la mitocondria produce una mayor cantidad
de radicales libres y así mismo provoca que los mecanismos de control para la
regulación en el número de radicales libres se vuelvan deficientes, causando
daños que alteran el proceso de la reparación celular (Ver Fig. 1).
Fig. 1. La fuente y las respuestas celulares a las especies reactivas de oxígeno (ROS). El
aumento en las especies reactivas de oxígeno (ROS) puede ser perjudicial y conducir a la
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muerte celular, además de acelerar el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la
edad. (Finkel y Holbrook., 2012)
Son muchos los trabajos y aportes que apoyan está teoría como causa probable
del envejecimiento, sólo por citar algunos trabajos, Kowald y Kirkwood (2000),
proponen que el estrés oxidativo mediado por los radicales libres aumenta con la
edad, y por lo tanto modifica los sistemas de reparación celular en los ancianos,
aunado también cómo factor asociado con algunas enfermedades que se
presentan durante el envejecimiento. Por su parte, Terman (2010), menciona que
la acumulación natural de residuos biológicos tóxicos dentro de las células
conforme envejecen conlleva a que algunas estructuras celulares tal como las
mitocondrias se vuelvan funcionalmente inútiles originando que las
macromoléculas y orgánulos dañados no puedan ser catabolizados. La
acumulación de "basura" biológica con la edad se produce preferentemente en las
células post-mitóticas con periodos de vida largos, las cuáles rara vez son
remplazadas por células recién diferenciadas, por lo que se asume en años
recientes que la desorganización mitocondrial causante del envejecimiento ocurre
únicamente en las células somáticas diferenciadas (Miquel y cols., 2006).
En contraste a esta afirmación, las células con períodos de vida corta no acumulan
cantidades sustanciales de "basura" y sólo pueden sufrir el efecto de ciertas
mutaciones que se propagan durante la división celular. Es por ello que el papel
de las células post-mitóticas, tales como neuronas y los miocitos cardíacos
subyace a la importancia de la acumulación de "residuos" y su relación con el
proceso general de envejecimiento.
En los últimos años y gracias al gran auge de la biología molecular se han logrado
caracterizar ciertos cambios a nivel molecular en las mitocondrias de las células
en proceso de envejecimiento y su relación con las especies reactivas en
oxígeno; concluyendo que existe una disminución en la cuantificación mitocondrial,
en la masa mitocondrial y del metabolismo de oxígeno. Los radicales libres actúan
como potentes agentes oxidantes que al combinarse con moléculas como el ADN,
proteínas y ácidos grasos insaturados de las membranas fosfolipídicas conllevan
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a su desactivación, precipitación y a la aparición de mutaciones (Stoll y cols.,
2011).
En resumen los radicales libres inducen estrés oxidativo, que se equilibra con
sistemas antioxidantes endógenos del cuerpo con una entrada de co-factores, y
por la ingestión de antioxidantes exógenos. La interacción entre todos estos
elementos es importante tanto para mantener el correcto estado de salud, así
como por su implicación en los procesos de envejecimiento y las enfermedades
relacionadas con la edad. La producción de estas sustancias son resultado tanto
del metabolismo celular normal cómo por factores endógenos ajenos al cuerpo,
después de un número finito de divisiones, las células entran en un estado de
senescencia replicativa deteniendo su crecimiento repercutiendo en el plan
corporal del organismo siendo más vulnerable a su entorno a incrementar el riesgo
de enfermedades o la muerte.
1.1.2 Cambios en el Sistema Nervioso relacionados con el envejecimiento
Como se ha descrito anteriormente, el envejecimiento es un proceso sumamente
complejo que altera y modifica por completo los órganos y sistemas de los
mamíferos; siguiendo premisa fundamental se tiene conocimiento de que uno de
los sistemas en sufrir las mayores afectaciones durante esta etapa es el sistema
nervioso, e general se detectan cambios en todos los niveles de organización
cerebral desde las moléculas, la morfología hasta aquellos relacionados con la
conducta. Por ejemplo, se ha observado que el cerebro sufre una reducción en su
peso y tamaño, ocurre un agrandamiento de los ventrículos (indicativo de la
existencia de atrofia tisular), así como el registro de cambios en la vascularidad
cerebral, reducción del número de sinapsis y neurotransmisores así como sus
respectivos receptores: glutamato, acetilcolina, dopamina y norepinefrina, lo cual
podría influir directamente sobre el comportamiento y algunos procesos vitales
como la memoria y el aprendizaje. En general se detectan cambios en todos los
niveles de organización cerebral desde las moléculas, la morfología hasta aquellos
relacionados con la conducta (Peters, 2006).
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Cambios Neuroanátomicos.
Como se mencionó en el párrafo anterior algunos de los cambios físicos
perceptibles en el cerebro mamífero con el progreso de la edad guardan relación
con disminuciones en el tamaño y peso del cerebro. Scahill y sus colaboradores
(2003), reportaron que el volumen del cerebro y/o su peso disminuye con la edad
a una tasa de alrededor del 5% (por cada 10 años), después de los 40 años de
edad y aumentando posiblemente aún más en los adultos mayores de 70 años de
edad, modificando irremediablemente también la morfología neuronal de algunas
regiones cerebrales tales como, el lóbulo temporal, el vermis del cerebelo, los
hemisferios cerebelosos, la corteza cerebral, el cuerpo estriado el hipocampo; y
que en años recientes muchos estudios han puntualizado que estas tres últimas
regiones sufren el mayor daño durante el proceso de envejecimiento (ver fig. 2).
Fig. 2. Esquema representativo entre comparación morfométrica del cerebro de dos
individuos. El primero (Izq.) es individuo joven (18-26), mientras que el segundo (Der.) muestra
un individuo en etapa senil y con enfermedad de Alzheimer (Scahill y cols., 2003).
La corteza cerebral y el hipocampo son regiones del cerebro que participan en la
formación de los procesos cognitivos, y sin embargo no se encuentran exentas de
padecer ciertas alteraciones las neuromorfológicas durante el envejecimiento, ya
que se ha reportado que en monos Rhesus en etapa senil hay una pérdida de
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“mechones” dendríticos en la arborización apical de las células piramidales de la
corteza motora, acompañada también por una pérdida de espinas dendríticas y la
reducción de entre un 40-55% en el número de sinapsis, mientras que la corteza
prefrontal sufre graves modificaciones en cuánto a su composición estructural
durante el envejecimiento en comparación con la corteza occipital, ya que la
región prefrontal es la zona más interconectada de todas las regiones
neocorticales al recibir fibras aferentes del tronco cerebral, el hipotálamo, el
sistema límbico (amígdala e hipocampo),el tálamo (especialmente de los núcleos
anteriores y dorso-medianos) y otras áreas neocorticales que repercuten en el
razonamiento abstracto y el lenguaje hablado en los seres humanos (Peters y
cols., 2002; Raz 2007).
En 2008, Nakamura y colaboradores demostraron que en las células de la corteza
prefrontal, la corteza temporal y la corteza pre-central superior en seres humanos
hay una pérdida de espinas dendríticas, la retracción de la arborización dendrítica
y la perdida de segmentos dendríticos basales lo cual altera la correcta percepción
y traducción de los estímulos percibidos en el medio interno y externo.
En el hipocampo se ha demostrado que la zona CA3 y en el giro dentado en los
adultos mayores sufren una reducción en su volumen celular, lo que se
correlaciona con la perdida de la memoria, mientras que en la zona CA1 de la vía
perforante del hipocampo, es decir el sitio de sinapsis entrantes y transmisión de
información directa al hipocampo desde la corteza entorrinal, hay una reducción
en el volumen de materia blanca hasta en un 0.8% a partir de los 40 años de edad
(Shing y cols., 2011; Yassa y cols. (2010).
Por otro lado, otros componentes cerebrales encargados de brindar soporte
estructural y comunicación neuronal, tal como la sustancia gris y la sustancia
blanca se ven perjudicados durante el envejecimiento. Bartzokis y colaboradores
(2003) mencionan que el deterioro de la vaina de mielina que rodea a las fibras
nerviosas (materia blanca) que permiten la transmisión de señales nerviosas sufre
un grave deterioro a partir de los 40 años de edad e incluso durante el
envejecimiento normal, mientras que la reducción de la materia gris generalmente
23
ocurre después de los 80 años y es debido a la contracción de cuerpos celulares,
pérdida de las ramificaciones dendríticas (especialmente las más pequeñas así
como sus espinas), pérdida de las ramificaciones axonales y terminales nerviosas.
Resumiendo lo anterior, se observa claramente la fuerte correlación entre el
envejecimiento y el deterioro morfológico cerebral el cuál es observable ya sea en
grado de la perdida celular, reducción en el tamaño del cerebro y la degradación
de la materia gris y la materia blanca de los individuos en etapa de envejecimiento,
alterando así su homeóstasis interna y modificando el comportamiento.
Cambios Neuroquímicos.
Los cambios neuroquímicos que ocurren en el sistema nervioso durante el
envejecimiento, se encuentran estrechamente relacionados con la síntesis de
neurotransmisores, hormonas, la traducción de ciertas proteínas, y al actividad
electrofisiológica de algunos canales iónicos. La literatura menciona que la
participación biológica de estos elementos durante la transmisión de información
nerviosa puede verse severamente dañada durante el proceso de envejecimiento.
Numerosos estudios han evaluado los niveles de síntesis y liberación de algunos
neurotransmisores como la dopamina o la serotonina (importantes e nla capacidad
motriz y en la cognición) durante el envejecimiento, demostrando por ejemplo que
los niveles de los factores de crecimiento neurotrófico cerebral relacionados con la
síntesis de serotonina disminuyen dramáticamente con la edad, alterando los
mecanismos de plasticidad sináptica y la neurogénesis en el cerebro adulto
(Volchegorskii y cols., 2004), mientras que los niveles de dopamina disminuyen
en un 10% por década a partir de la edad adulta (40 años en adelante), lo que se
relaciona también con una disminución considerable en la densidad de receptores
dopaminérgicos D1 en varias regiones del cerebro (circunvolución cingulada
anterior, la corteza prefrontal) perjudicando con ello la relación sinapsis/receptor,
provocando así una disminución en el rendimiento cognitivo y motor (Bäckman y
cols., 2006; MacDonald y cols., 2012).
24
Incluso como se menciónó anteriormente, la incorrecta eliminación de los
productos del metabolismo celular, puede modificar la síntesis de los niveles de
neurotransmisores, tal y como lo menciona Melov., (2004) quién encontró que los
niveles de monoamina oxidasa aumentan con la edad, liberando un gran número
de radicales libres a partir de reacciones que exceden las reservas antioxidantes
inherentes, dificultando su pronta eliminación.
Cambios a Nivel Genético.
Existen una gran variedad de genes que pueden influir potencialmente en el
envejecimiento normal del cerebro. Sin embargo se le ha dado un especial
enfoque de estudio al descubrimiento de los genes que participan en los trastornos
neurodegenerativos relacionados con la edad, tal como la enfermedad de
Alzheimer o el mal de Parkinson. Deary y cols., 2004 observaron que cuándo el
gen de la apolipoproteína E (ApoE) y el gen de la proteína priónica, (PRNP)
muestra variantes en su regulación genética, se relacionan directamente con el
envejecimiento normal del cerebro.
En el mismo año estudios similares llevados a cabo por (Lu y cols., 2004;
Verbitsky y cols., 2004) evaluaron el perfil transcripcional en la región de la
corteza frontal humana en personas de 26 hasta 106 años de edad así como en la
corteza frontal de modelos roedores jóvenes y seniles, encontrando una baja tasa
de expresión progresiva en genes que juegan un papel importante en la función
sináptica y la plasticidad neuronal que subyace el aprendizaje, aquellos
relacionados el transporte vesicular y la función mitocondrial en el envejecimiento
y aquellos que participan en la plasticidad sináptica y cuyos cambios y factores de
edad en conjunto podrían estar involucrados en los déficits de memoria y
aprendizaje durante la etapa de envejecimiento.
Blalock y cols., (2003), compararon el perfil de expresión génica entre roedores
viejos y roedores jóvenes hallando un déficit en la expresión de genes en la región
CA1 del hipocampo y cuya participación se relaciona con la señalización celular, el
metabolismo, la síntesis de factores de transcripción y la plasticidad de las
25
neuritas en ratas de edad avanzada, mientras que los genes que mostraron una
sobre-expresión fueron aquellos que se relacionan con la inflamación, el
crecimiento, la formación glíal, la transducción de señal y los genes que codifican
para la síntesis de proteínas vesiculares.
Por otra parte se ha evaluado también el perfil de expresión génica en la región
del hipocampo, encontrando una sobreexpresión de genes asociados con la
inflamación, la homeostasis del hierro, genes de unión a fosfolípidos dependientes
de calcio y genes regulan la biosíntesis de acetil-CoA en los roedores de mediana
edad.
1.1.3 Cambios conductuales relacionados con el envejecimiento.
Como se ha venido mencionando en los apartados anteriores, el envejecimiento
es un proceso de adaptación a cambios continuos; bajo esta perspectiva los
cambios físicos y químicos ya descritos, que se presentan durante el
envejecimiento tienen cómo consecuencia final modificar el comportamiento.
Los cambios más notorios en el comportamiento de los individuos seniles, son los
que se relacionan con los procesos mentales, tales como la sensación y la
percepción, la memoria, la inteligencia, el lenguaje, el pensamiento y la resolución
de problemas (Joyce y cols., 2008):
La memoria a largo plazo muestra cambios sustanciales con la edad,
mientras que la memoria a corto plazo muestra menos declive relacionado
con la edad.
Retraso en la velocidad de aprendizaje. Debido a que a los adultos mayores
les toma más tiempo codificar, almacenar y recuperar la información, la
velocidad a la que se aprende nueva información puede ser más lenta entre
los adultos mayores.
La mayoría de los aspectos de la capacidad lingüística siguen siendo
fuertes, sin embargo, la capacidad para encontrar o recordar palabras
declina con la edad (Davidson y cols., 2000), de manera que todos estos
cambios relacionados con la memoria durante el envejecimiento normal se
26
producen principalmente en la memoria explícita y el procesamiento
semántico.
Por otro lado las alteraciones en el comportamiento emocional representan uno de
los aspectos importantes del envejecimiento en los seres humanos y son un foco
constante de la literatura gerontológica, ya que es en esta etapa en dónde
identificado tendencias hacía la depresión, el aislamiento, el sedentarismo etc.
Miyagawa y colaboradores (2001) mencionan que el deterioro en el aprendizaje y
la memoria en ratas de edad avanzada, puede disociarse de los cambios en la
actividad motora y el comportamiento emocional. Además, Fahlström y colegas
(2011) muestran que el envejecimiento existe un declive en la actividad
exploratoria relacionada con la capacidad cognitiva, sugiriendo que en los
roedores y en muchos mamíferos el envejecimiento es un proceso continuo que
modula ciertos aspectos del comportamiento básico de una manera continua, al
igual que el comportamiento exploratorio.
1.2. Hipocampo: Anatomía y funciones.
El hipocampo es un componente vital del cerebro humano y de otros mamíferos;
ya que está estructura se encuentra ampliamente relacionada con varios núcleos
del sistema nervioso central, tales como la corteza prefrontal, el núcleo
accumbens, la amígdala y el área ventral tegmental, los cuáles en conjunto forman
el sistema dopaminérgico-mesolimbico encargado de regular las conductas
motivadas, la memoria a largo plazo y la navegación espacial (Vallone y cols.,
2000). Esta región es esencial para la rápida formación de nuevos recuerdos y
para el prolongado proceso de consolidación de los recuerdos recién adquiridos,
de, manera que participa activamente en el proceso de la memoria al formar y
recuperar recuerdos específicos modulando el aprendizaje de “lugar” y la
utilización flexible de los mapas cognitivos (ver figura 3) (Samson y Barnes, 2013).
Amaral e Insausti, (1990) describen que la formación hipocampal consta de tres
divisiones cito-arquitectónicamente distintas: la circunvolución dentada, el
hipocampo y el subículo. A su vez también, el hipocampo se divide en tres
27
regiones separadas, CA1, CA2 y CA3 basándose en el tamaño y las conexiones
de las células piramidales que residen en esta zona (Kandel, 2000) (ver fig. 3). La
corteza de asociación límbica proporciona la principal aportación a la formación
hipocampal. La circunvolución dentada, el hipocampo y el subículo son regiones
separadas que forman parte de una secuencia de conexiones intrínsecas de la
formación hipocampal.
Fig. 3. Esquema representativo de la anatomía del hipocampo. En colores se enmarcan
las diferentes subestructuras que interconectan para procesar la información percibida del
exterior (Amaral e Insausti, 1990).
El flujo de información en el hipocampo es gran medida unidireccional,
comenzando en la comisura hipocampal la cuál proporciona uno de los dos
caminos principales por el cual el hipocampo se comunica entre sí en ambos
hemisferios cerebrales. Después de la comisura del hipocampo se forma un único
haz de fibras eferentes, el cual da lugar al fórnix, un conjunto de haces nerviosos
en forma de “C” y con superficie tubular en el cerebro que lleva las señales desde
el hipocampo al hipotálamo y de un hemisferio al otro. El inicio del fórnix con el
haz de fibras del alveus, forman parte de la sustancia blanca cerebral (fibras
mielinizadas aferentes y eferentes), las cuales se conjuntan medialmente para
formar las fimbrias del fórnix; está estructura continúa extendiéndose hasta dar
origen al arco de la comisura anterior, punto de referencia debido a que es aquí
28
donde el fórnix se divide en tres partes y proyecta conexiones neuronales hacía
diferentes estructuras:
1) La división justo antes de la comisura anterior se llama fórnix pre-comisural y
esta rama va a los núcleos septales, el estriado ventral y la corteza cingulada.
2) Algunas fibras que proyectan del fornix pasan a través de la comisura anterior
hacía el hipocampo contralateral, formando así la segunda vía de
comunicación del hipocampo en ambos hemisferios cerebrales.
3) Por último la división posterior a la comisura anterior se llama el fornix post-
comisural y esta rama proyecta aferencias hacía los cuerpos mamilares del
hipotálamo y los núcleos anteriores del tálamo.
Las eferencias hipocampales se originan en el subículo y el hipocampo, la
circunvolución dentada solo proyecta al hacía el hipocampo. Las principales
aferencias y eferencias neocorticales de la formación hipocampal se conducen a
través de la corteza entorrinal. Las neuronas de la corteza entorrinal transmiten la
información aferente a las células granulosas de la circunvolución dentada,
mediante un haz de axones llamada vía perforante, las cuáles proyectan axones
hacía al campo de neuronas CA3 del hipocampo.
Es importante recordar que los aferentes y eferentes del hipocampo se agrupan en
las mismas vías de comunicación, de tal manera que se conoce ahora que las dos
principales vías de entrada y salida de información en el hipocampo son el fórnix y
la corteza entorrinal, mediante la corteza cingulada, cuya participación en conjunto
de estas estructuras regula los procesos de aprendizaje y memoria. La
ramificación pre-comisural del fórnix se conecta con los núcleos septales, los
núcleos preópticos, el estriado ventral, la corteza orbital y la corteza cingulada
anterior; mientras que la ramificación del fórnix post-comisural conecta
directamente con el núcleo anterior del tálamo y los cuerpos mamilares del
hipotálamo. Debido a que el tracto mamilotalámico conecta con al núcleo talámico
anterior (los cuáles conectan directamente con la corteza cingular), el hipocampo
puede afectar tanto directa como indirectamente las funciones del tálamo. Las
proyecciones de la corteza cingular regresan hacía la corteza entorrinal del giro
29
hipocampal, formando así una especie de “loop” de recepción y transmisión de
información (ver figura 4).
Fig. 4. Vías de salida o eferentes del hipocampo. Se muestra la ruta de transmisión de la
información del subículo a la corteza entorrinal y a la amígdala a través del fornix hacía una
variedad de estructuras anteriores (Wright, 2010).
En contraparte al proceso anteriormente descrito, las rutas de entrada de
información directa al hipocampo son sólo el inverso de las rutas de salida. Es
decir la corteza entorrinal es una importante fuente de insumos para el hipocampo;
mientras que, la corteza cingulada, la corteza del lóbulo temporal, la amígdala, la
corteza orbital, y bulbo olfatorio proyectan axones directamente hacía el
hipocampo a través de la corteza entorrinal (ver figura 5).
En la última década se han realizado numerosos estudios sobre la manera en que
se lleva a cabo la formación y consolidación del proceso de memoria en el
hipocampo, donde algunos investigadores han encontrado que disfunción de esta
estructura produce alteraciones conductuales, lo cual estará determinado también
por el grado en el neurodesarrollo, por ejemplo cuando se lesiona el hipocampo en
30
ratas adultas, se producen alteraciones que se reflejan directamente en los
procesos de memoria y aprendizaje (Grace, 2000).
Fig. 5. Entradas o aferentes al hipocampo. Vías de entrada principales de información
provenientes de la corteza entorrinal, que a su vez se comunican las vías de entra que vienen
de la corteza cingulada y las cortezas olfativas orbitales temporales y la amígdala hacía el
hipocampo (Wright, 2010).
Por otro lado Drapeau y colaboradores (2003) observaron que existe una
correlación cuantitativa respecto al grado de disfunción de la memoria en ratas
seniles y la neurogénesis hipocampal, sugiriendo que las neuronas de esta región
cerebral son importantes para la consolidación de la memoria, además de que en
la senectud se ha observado también que el hipocampo sufre cambios
estructurales y bioquímicos, asumiendo con ello que estos cambios pudiesen
representar un componente importante en relación a la edad y el deterioro de la
cognición hipocampo-dependiente (Driscoll y cols., 2003). Aunado también a éstos
cambios estructurales se ha propuesto particularmente que la perdida de
neuronas hipocampales durante el envejecimiento parece estar restringida
únicamente a la zona CA1 del hipocampo, siendo está una de las primeras
regiones en verse afectadas en la Enfermedad del Alzheimer, además de ser una
31
también región donde se presentan muchos otros cambios relacionados con la
edad y el deterioro cognitivo (West y cols., 2004).
Recientemente en 2013, Wible y colegas, han propuesto que el hipocampo es
vulnerable a una serie de daños debido al aumento de la actividad excito-tóxica,
correlacionando con el deterioro de la memoria y la disfunción hipocampal. Por lo
tanto se asume que los trastornos de la memoria son una característica de las
neuronas envejecidas en la zona hipocampal.
1.2.2 Corteza media prefrontal.
La región prefrontal es la parte más anterior de la corteza cerebral, ubicada en la
parte inmediatamente anterior a la corteza motora y pre-motora, ocupando la
porción más grande de los lóbulos frontales (Sánchez-Navarro y Román, 2004)
(ver fig. 6). Distintos autores señalan que esta corteza prefrontal se puede
distinguir de las restantes regiones frontales atendiendo a diversos indicadores
tales como su composición celular, su inervación dopaminérgica o sus aferencias
talámicas (Davidson y cols., 2000; Fuster, 2001)
En función de su topografía la corteza prefrontal puede dividirse en tres regiones
claramente diferenciadas (Kaufer y Lewis, 2009): prefrontal dorsolateral, órbito-
frontal y medial. De estas tres zonas la corteza órbito-frontal y la corteza medial
se han relacionado de un modo más concreto con la formación y expresión de las
emociones; por su parte la corteza prefrontal medial recibe proyecciones de las
mismas regiones que la corteza órbito-frontal (involucrada en la respuesta
emocional particularmente cuando ésta involucra estímulos aprendidos de
refuerzo, siendo una región de convergencia de información exteroceptiva e
interoceptiva), aunque existen algunas diferencias.
Mientras que la región órbito-frontal recibe una mayor cantidad de proyecciones
amigdalinas, la región prefrontal medial recibe una mayor cantidad de aferencias
hipocámpicas y una mayor cantidad de proyecciones sensoriales auditivas
32
(Barbas, 2000). Así pues está región del cerebro a diferencia de la función que
cumple la corteza órbito-frontal, estaría relacionada con el control emocional
inhibitorio; provocando así modificaciones conductuales en función del significado
emocional de los estímulos, guardando una relación estrecha con la comunicación
emocional, tal y como lo han mostrado estudios realizados en monos (MacLean,
2005). En general se considera que la corteza prefrontal medial se encuentra
relacionada tanto con la experiencia como con la expresión emocional, y es crítica
para el procesamiento de las emociones asociadas con situaciones sociales y
personales complejas.
El deterioro de las funciones cognitivas y emocionales que se encuentran
reguladas por la corteza cerebral, guarda una estrecha relación con el proceso de
envejecimiento. Algunos de los daños más representativos de los cuáles se tiene
registro, van desde la perdida de neuronas en la corteza prefrontal en individuos
con enfermedad de Alzheimer, reducción en la densidad de espinas dendríticas y
alteraciones en la plasticidad de las neuronas en la corteza prefrontal.
Algunos estudios como el de Gómez-Isla y colaboradores (2003) quienes
estudiaron los efectos de envejecimiento normal en las neuronas en la corteza
prefrontal medial y el surco temporal superior, mencionan que no hay una pérdida
significativa neuronas que se relacione con la edad, sin embargo al comparar un
grupo de adultos jóvenes, respecto a un grupo de pacientes con enfermedad de
Alzheimer (EA) señalan que en estos últimos existe una perdida neuronal cortical
de alrededor del 48-53%. Jacobs y colegas (2002) concluyen también que el
envejecimiento tiene efecto sobre la arborización dendrítica basal del cerebro
humano senil reduciendo la longitud dendrítica en las neuronas piramidales y el
número de espinas dendríticas (alrededor del 50%) en la corteza prefrontal y
visual.
Otra alteración morfológica relacionada con el envejecimiento y la corteza se
refiere adelgazamiento de esta región, provocando así patrones de atrofia cortical
regionalizada, siendo más prominentes en la corteza prefrontal y
sorprendentemente en otras áreas cómo la corteza motora primaria y la corteza
33
visual lo que conlleva a disminuir significativamente el número de neuronas
piramidales (Salat y cols. 2004; Stranahan y cols., 2012).
Todas estas observaciones indican que la corteza prefrontal es altamente
susceptible a la pérdida de neuronas con el envejecimiento, e incluso se ha
estudiado el cómo es que el envejecimiento afecta la plasticidad cerebral
relacionadas con las espinas dendríticas, pues según, Dumitriu y colaboradores
(2010) concluyen que en primates ocurre una pérdida del 33% de espinas
dendríticas en las células piramidales además de una disminución del 32% en el
número de sinapsis axo-espinosas; revelando también la alta susceptibilidad de
daño sobre las espinas dendríticas con la edad, sugiriendo una vulnerabilidad
selectiva entre dos tipos de espinas dendríticas (pequeñas y delgadas), y que se
cree, son las que particularmente aquellas que participan en el proceso de
plasticidad neuronal vinculada al aprendizaje y las que median los circuitos
estables vinculados a la memoria.
Existe un número importante de estudios que no sólo se han encargado de
evaluar las alteraciones morfométricas en la corteza prefrontal; sino que también
han optado por definir la manera en que se relacionan los efectos de la edad
sobre las sinapsis de las neuronas piramidales; ya que la corteza prefrontal tiene
una importante participación en la formación de la memoria de trabajo, puesto que
la adecuada consolidación de está, es una de las funciones más complejas que se
lleva a cabo en la corteza cerebral, y no es de extrañar que evolutivamente está
zona se haya desarrollado aún más en los seres humanos y en los primates en
comparación con otros mamíferos, por lo que el alto grado de complejidad en la
ejecución de ciertos procesos cognitivos requiera de circuiterías complejas que
han demostrado ser muy vulnerables en el envejecimiento (Morrison y Baxter,
2012). Estudios de microscopía electrónica en monos Rhesus han demostrado
que hay una pérdida sustancial de sinapsis en la corteza prefrontal,
específicamente de un 30-60% en la capa I y de un 30-35% en la capa III, lo que
sugiere que una pérdida potencial de neuropilo en conjunto en lugar de la pérdida
real de neuronas (Peters y cols., 2002; Dumitriu y cols., 2010; Dumitriu y cols.,
34
2011; Rodriguez, y cols., 2008; Bloss y cols., 2010). Cabe mencionar que la
perdida de sinapsis axo-espinosas en la capa III de la corteza prefrontal se
correlaciona con el deterioro cognitivo, aunque este no es el caso para la capa V,
sugiriendo así que la amplia convergencia cortical que se produce en la capa III la
vuelve más susceptible de ser afectada por el envejecimiento que las
proyecciones descendentes que emanan de la capa V.
Sin embargo, no todas las sinapsis son igualmente vulnerables; las sinapsis
glutamatérgicas axo-espinosas representan la gran mayoría de las sinapsis
pérdidas (Luebke y cols., 2010). Tal es la complejidad y especificidad según la
regionalización de la corteza cerebral, que incluso ha sido posible determinar la
función particular de las espinas dendríticas, y su relación con el grado de
deterioro cognitivo durante el envejecimiento, ya que se propone que la mayoría
de espinas dendríticas que se pierden con la edad son las denominadas “espinas
delgadas”, las cuáles están asociadas con un alto grado de plasticidad neuronal y
el aprendizaje de nueva información (Dumitriu y cols., 2010; Bourne y cols.,2007).
Fig. 6. (A) Localización neuroanatómica de la corteza media prefrontal (Esquema tomado del
Paxinos y Watson, 1998.) (B) Composición estructural de la corteza media prefrontal.
Esquema tomado del libro “Principios de Neurociencia” Kandel (2000).
35
1.3 Memoria y aprendizaje.
Una de las funciones más complejas que realiza en encéfalo de los mamíferos es
la capacidad de almacenar la información prevista por la experiencia y recuperar
gran parte de ella, con el fin de expresar un patrón conductual propio, y el cuál se
encuentra regulado también por la interacción entre genes, y medio ambiente
(Purves y cols., 2008., Kandel, 2000). Cualquier tipo de experiencia ya sea
benéfica, o aquella que modifique ciertas características biológicas para adaptarse
al entorno, inevitablemente provocara cambios en la conducta del individuo,
resultado de la dinámica y plasticidad de nuestro sistema nervioso.
Así pues con lo anterior, el aprendizaje se define cómo el proceso mediante el cual
el sistema nervioso adquiere información del medio (Purves y cols., 2008).
Cuando se aprende a reconocer un estímulo se originan una serie de re-arreglos
sinápticos en la región de la corteza sensorial asociativa, cuyo fin es el de formar
nuevos circuitos neuronales, provocando que las aferencias sensoriales activen
estos circuitos nuevos, los cuales a su vez activan a otros circuitos neurales
generando un “loop” de retroalimentación continua incluso después de que el
estímulo desaparece.
Carlson, (2005) describe cuatro formas básicas de aprendizaje: Aprendizaje
Perceptivo, se refiere a la capacidad de reconocer estímulos que ya se han
percibido antes y en general implica cambios en la corteza sensorial asociativa;
Aprendizaje Estímulo-Respuesta, consiste en la capacidad de aprender a
ejecutar una conducta determinada cuando se presenta un estímulo determinado,
de tal manera que involucra la formación de nuevas conexiones neuronales entre
los circuitos que participan en la percepción y los que ejecutan conductas motoras;
Aprendizaje Motor se relaciona con el aprendizaje estimulo-respuesta y es el
resultado del establecimiento de cambios entre los sistemas sensoriales y
motores. En una circunstancia concreta de aprendizaje, pueden intervenir en
36
diferente grado los tres tipos de aprendizaje. El cuarto tipo de aprendizaje supone
aprender las relaciones que existen entre estímulos individuales, por ejemplo una
forma de aprendizaje perceptivo algo más compleja requiere conexiones entre
diferentes áreas de la corteza asociativa.
De tal manera que las estrategias específicas del sistema nervioso utilizadas para
almacenar información en la memoria a largo plazo afectan la forma en que será
recordada la información. Davis y cols., (2007) mencionan que los humanos
pierden alrededor del 50% de la información que aprenden en un periodo de 24
horas debido a que la memoria a corto plazo 'decae' rápidamente e incluso con la
edad este patrón de declive continua pues según Schoenfeld y colegas (2014) el
aprendizaje espacial se ve afectado con la edad, debido a los altos niveles de
ansiedad que suelen presentar los adultos mayores.
Por otro lado, la memoria se refiere a la codificación, almacenamiento y
recuperación de la información aprendida (Purves y cols., 2008), dicho proceso
cognitivo es relativamente complicado y en consecuencia se presupone que el
sistema neuroanatómico subyacente debe ser sumamente complejo.
Fisiológicamente, la formación de la memoria se produce gracias a la sensibilidad
de transmisión sináptica de una neurona a otra, lo que a su vez origina nuevas
vías para la transmisión de señales por los circuitos neurales del cerebro. Estás
nuevas vías o facilitadas se llaman huellas de memoria y son muy importantes
puesto que una vez establecidas, la mente puede activarlas para reproducir los
recuerdos (Ortega y Franco, 2010).
La experiencia repetida (aprendizaje) consolida la memoria originando dos tipos
de memoria particular: Memoria a corto ya a largo plazo, la cual se subdivide en
dos categorías más: Memoria explicita y Memoria implícita. La primera se
relaciona con el almacenamiento de conocimientos, permite recordar
acontecimientos, números, hechos, en esencia, el recuerdo de los detalles
diversos de un pensamiento integrado, y requiere un esfuerzo consciente.
37
Mientras que la segunda almacena habilidades motoras, se asocia más con
actividades motoras del cuerpo, y es inconsciente (Kandel y cols., 2008) (ver fig.
7).
Así pues existen estructuras importantes, tales como la corteza prefrontal y el
hipocampo los cuáles son importantes para la consolidación del aprendizaje y la
memoria, ya que por ejemplo se sabe que la corteza prefrontal media contribuye a
la memoria a través del control cognitivo o estratégico sobre los procesos de
recuperación de la memoria dentro de otras áreas del cerebro como el hipocampo
(Preston y Eichenbaum, 2013).
Fig. 7. Esquema que representa los dos tipos de memoria (implícita y explícita) y la región
cerebral en dónde se originan. (Kandel y cols., 2000)
Y es precisamente el hipocampo la zona relacionada con la formación de la
memoria a través de un proceso conocido como LTP (Long Term-potentiation), el
cual consiste en un incremento en la fuerza de transmisión sináptica tras
estimular una vía aferente con estímulos de alta frecuencia, estimulando la
38
participación de procesos de expresión génica, nueva síntesis de proteínas, y
crecimiento de conexiones sinápticas. Este fenómeno ha sido estudiado
prominentemente en la sinapsis entre la vía colateral de Schaffer y las células
piramidales CA1, sin embargo, se ha visto que la LTP ocurre en otras regiones
como en la corteza, amígdala, y cerebelo, adjudicándole así ciertas propiedades
para que se lleve a cabo el fenómeno:
1. Estado dependiente: la membrana postsináptica debe estar lo suficientemente
despolarizada para propiciar la LTP.
2. Cooperatitividad: activación de múltiples entradas a la célula nerviosa.
3. Especificidad: cuando la LTP es inducida por la estimulación de una sinapsis,
ésta no va a ocurrir en una sinapsis inactiva que esté en contacto con la misma
neurona.
4. Asociatividad: una estimulación débil no desencadena LTP. Sin embargo, si
una neurona presináptica es estimulada débilmente al mismo tiempo que la
postsináptica, se dará una LTP. Esto constituye la ley de Hebb, en la que hay una
activación simultánea de la neurona presináptica y la neurona postsináptica.
(Popescu y cols., 2007; Casanova-Sotolongo y cols., 2007).
Así pues con todo lo anterior respecto a la alteración en los procesos de
aprendizaje y memoria asociados al envejecimiento los modelos animales
experimentales han fungido como una herramienta fiable y certero para la mejor
compresión de todos estos procesos, ya que por ejemplo, Morris y colaboradores
(1982) idearon una prueba llamada “Laberinto Acuático de Morris” (LAM) evaluar
cuándo existan déficits sobre las capacidades cognitivas espaciales de los
roedores, básicamente la tarea consiste en que los animales localicen una
plataforma sumergida en una piscina llena de agua, basándose sólo en claves
visuales localizadas fuera del instrumento experimental.
Tal ha sido el alcance de dicha técnica que múltiples grupos de investigación han
adoptado está prueba para evaluar las capacidades cognitivas en roedores
39
seniles. Gage y colegas (1984) podrían considerarse uno de los grupos de
investigación pioneros en demostrar los daños cognitivos en modelos animales
senescentes en la fase de adquisición de la memoria al aplicar la prueba del
Laberinto Acuático de Morris”, demostrando con ello que el rendimiento en la
prueba depende de la actividad del hipocampo ya que la memoria precisa para la
localización de la plataforma se ha propuesto que se retiene en esta estructura. Lo
importancia de los hallazgos de esté trabajo sobre el déficit en la memoria, radica
en que se han comparado con las alteraciones en la memoria en pacientes
humanos con demencia senil y la enfermedad del Alzheimer, aunque por otro lado
también se ha evaluado el rendimiento cognitivo en roedores seniles con un
proceso de envejecimiento ausente de patología, encontrando la misma tendencia
en el que los animales seniles tenían mayor dificultad para aprender a localizarla
la plataforma de escape, concluyendo así que este tipo de pruebas exige un
aprendizaje relacional para navegar a través del laberinto, con lo cual los animales
consiguen orientarse por la localización relativa de los estímulos que están fuera
del laberinto (Rapp y cols. 2003).
1.4 Características de las Cepas de ratas: Sprague Dawley, Wistar y Long
Evans.
Las diferentes cepas de ratas de laboratorio son comúnmente utilizadas en la
investigación. Estos modelos animales fueron desarrollados para estudiar algunos
procesos biológicos relacionados con la neuroanatomía, nutrición, endocrinología,
genética y el comportamiento.
Las ratas de laboratorio utilizadas hoy en día cómo modelo de estudio son
descendientes domesticados de la especie de rata conocida como Rattus
norvegicus, criadas especialmente para la investigación científica, una cepa, en
referencia a los roedores es un grupo en el que los miembros pertenecientes son
lo más genéticamente cercanos posible, es decir una cepa de rata es creada
mediante la cría consanguínea para producir ratas genéticamente “similares” entre
sí y por lo tanto controlar de cierta manera la variabilidad inter-especie durante la
investigación.
40
El estudio de las capacidades cognitivas en los roedores ha tenido un gran auge
en los últimos años, en gran parte debido a los constantes avances en el área de
las neurociencias. Un área que ha recibido mucho interés por parte de los
investigadores es la relacionada con el aprendizaje y la memoria en los modelos
experimentales roedores, los cuáles en muchas ocasiones se han comparado con
los procesos cognitivos en mamiferos superiores, puesto que al parecer la
formación de estos procesos se lleva a cabo de manera similar en primates (no
humanos) o el ser humano mismo.
Dentro de las ventajas del uso de roedores cómo modelo biológico de estudio, sin
duda destaca el hecho de su manejabilidad y viabilidad reproductiva, puesto son
animales pequeños, limpios, un modelo económico, ampliamente disponible, con
periodos gestacionales (aproximadamente 21 días) y tiempos de vida
relativamente cortos (2 a 3 años).
1.4.1 Generalidades entre las cepas. (Long Evans, Sprague Dawley, Wistar).
Rata Long Evans: Está cepa de rata es el resultado de un cruce entre una
hembra albina Wistar y un macho silvestre (Rattus norvegicus). Sus
características principales son el de exhibir variedades en el color del pelaje, las
“capuchas” de pelo que cubren la cabeza pueden ser de color gris o negro.
La capucha de pelo generalmente cubre el cuerpo del animal desde la cabeza
hasta la espina dorsal, tienen el iris pigmentado y diferencia de las cepas albinas
su agudeza visual se ve menos afectada que la de estás. La rata Long Evans es
pequeña y resistente a la oncogénesis y es utilizada ampliamente en estudios que
evalúan la conducta, el aprendizaje, el envejecimiento, y cómo modelo para el
estudio de algunas adicciones (especialmente al alcohol) (Mitchell y cols., 2015)
41
Fig. 8. Cepa Long Evans
Boric y colaboradores (2008), observaron que en ratas Long Evans en edad
avanzada se hay una reducción sustancial de receptores NMDA dependientes de
potenciación a largo plazo (LTP) alterando así el proceso de memoria y
aprendizaje y la plasticidad sináptica.
Rata Sprague-Dawley: La cepa fue creada a partir de un macho híbrido
encapuchado (origen desconocido). Es una rata consanguínea albina, con una
cabeza alargada y una cola más larga que su cuerpo, es un roedor de crecimiento
rápido, dócil y fácil de manejar, suelen producir secreciones de los ojos cuando
están estresados que contienen un pigmento que, cuando se seca, tiene la
apariencia de sangre seca.
Fig. 9. Cepa Sprague-Dawley
Son animales muy dóciles, de marcado comportamiento maternal, opacidad
superficial de la córnea que aumenta con la edad y resistente a la inducción de
42
úlceras por estrés. Es un buen modelo experimental en la investigación de la
cirugía Experimental, estudios generales del Metabolismo, Nutrición, Neurología,
Oncología, Farmacología, Fisiología, el envejecimiento, Teratología y la
Toxicología (Mitchell y cols., 2015).
Fisher y colaboradores (2001) encontraron que en ratas Sprague-Dawley de 3-12-,
18-, 24-, y 30 meses de edad se presenta una disminución progresiva en la
memoria espacial a partir de los 24 hasta los 30 meses de edad, al evaluar su
desempeño en el laberinto Acuático de Morris.
Rata Wistar: Se trata de una cepa no consanguínea de ratas albinas de la especie
Rattus norvergicus, y es utilizada en todos los campos de la investigación médica
y biológica. Posee una cabeza relativamente ancha, orejas largas, y una cola
usualmente más corta que el cuerpo. Su longevidad y su alta tasa de incidencia
tumoral espontánea la convierten en una opción ideal para los estudios del
envejecimiento.
Es una cepa albina, fácil de manejar, y su aprendizaje suele ser más lento que el
de la rata Long Evans (Mitchell y cols., 2015), tienden a ser más activas que la
cepa Sprague Dawley y es por eso que la cepa Wistar es utilizada para el estudio
del espectro autista debido a sus altos niveles de ansiedad (Zhang, 2014).
Fig. 10. Cepa Wistar
43
En ratas Wistar macho, Pepeu y colegas (2010) reportaron un deterioro
significativo en la conducta perceptiva de estos roedores, ya que al evaluar su
desempeño en la prueba de reconocimiento de objetos en individuos de 20 a 22
meses de edad, en comparación con ratas de 3 meses de edad cuyos índices de
reconocimiento fueron mayores..
1.4.2. Diferencias conductuales entre las cepas (Long Evans, Sprague-
Dawley, Wistar).
La investigación sobre la biología del envejecimiento y el uso de modelos animales
cómo apoyo para el entendimiento del porque ocurren alteraciones en los
procesos cognitivos y conductuales durante esta etapa, tiene por objeto la
comprensión de cuáles son los mecanismos que causan estas alteraciones, y la
capacidad de adaptación de los individuos ante estas circunstancias.
Ahora bien si el propósito es entender los mecanismos patogénicos de ciertas
enfermedades como el Alzheimer por ejemplo, el modelo animal de estudio debe
imitar lo más cerca posible la sintomatología y los mecanismos propios de la
enfermedad. De tal manera que al puntualizar acerca de las diferencias cognitivas
y conductuales propias de cada cepa de rata durante el envejecimiento, será de
suma importancia considerar la variabilidad de cada individuo, y con ello delimitar
las diferencias en su rendimiento resultado del medio ambiente y el pool genético.
Por ejemplo las cepas no consanguíneas como los son las ratas Wistar y Long
Evans tienen una mayor variabilidad genética que la ratas de cepas endogámicas
y puede ser por tanto, un modelo adecuado para el estudio de las alteraciones
cognitivas observadas en seres humanos de edad avanzada (Bizon y Woods,
2008). Algunos de los estudios que ponen en evidencia las diferencias
conductuales entre las cepas de rata en relación al envejecimiento se enlistan a
continuación:
44
La orientación espacial es uno de los fenómenos a través de los cuales se evalúa
la función cerebral en relación a la conducta, definiendo perfectamente el rol de
estructuras cerebrales y sistemas de neurotransmisión involucrados en ello, por lo
tanto las pruebas diseñadas para evaluar estos parámetros, podrían utilizarse
como herramienta de apoyo para determinar el grado de alteración cerebral en
modelos animales con déficit cognitivo y su uso como modelos de envejecimiento.
Harker y Whishaw, (2002) encontraron diferencias significativas en el rendimiento
cognitivo de las cepas albinas (Sprague-Dawley, Wistar y Fisher-344) para la
prueba de Laberinto Acuático de Morris en comparación de a las cepas
pigmentadas Long Evans, sugiriendo que la agudeza visual influencia
sustancialmente el rendimiento conductual en tareas que requieren de un sistema
visual mucho más desarrollado.
Otros estudios abordan la relación entre la conducta motora y las diferentes cepas
de rata, Entlerova y colaboradores (2013) observaron cambios en la actividad
locomotora mediada por actividad colinérgica, entre la cepa Long Evans y la cepa
Wistar, determinando que es esta última sufre la mayor afectación respecto a la
conducta de evitación activa mediada por bloqueo colinérgico respecto a la cepa
Long Evans en el Laberinto Acuático de Morris, exhibiendo las diferencias inter-
cepa hacia la sensibilidad del bloqueo colinérgico en tareas que requieren
coordinación cognitiva, por otro lado Andrews y colaboradores (2005) observaron
que la respuesta motora y cognitiva de la cepa Long Evans se ve afectada debido
a la administración de agentes anticolinérgicos, medido en términos de precisión
locomotora y en la memoria espacial, evaluado también en la prueba del Laberinto
Acuático de Morris; mientras que la cepa Wistar únicamente mostró déficits en
términos de velocidad de nado. Wu y colaboradores (2008) compararon la pérdida
de neuronas colinérgicas en ratas Wistar (18 y 14 meses de edad) y Sprague
Dawley (18 y 14 meses de edad) con deterioro cognitivo, observando en ambas
que a los 14 meses de edad, se presentan deterioros cognitivos considerables,
mientras que a los 18 meses de edad hay una gran disminución en la liberación de
acetilcolina (ACh) en la región de la corteza cerebral, el hipocampo, y el cuerpo
estriado.
45
Para el caso particular de las tareas de memoria y aprendizaje; Granger y
colaboradores (2006) realizaron pruebas conductuales entre dos cepas, ratas
Long Evans de mediana edad (14 meses de edad) y ratas de la cepa Wistar de
mediana edad (14 meses de edad) demostrando que las cepa Long Evans tuvo el
mayor número de errores al momento de localizar la recompensa dispuesta en
laberinto radial de 8, denotando así déficits cognitivos para elaborar mapas
mentales en la prueba del laberinto radial para optimizar la búsqueda de comida.
Savonenko, (2002) menciona que ratas Long Evans y las ratas Sprague-Dawley
exhiben déficits en el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo, al evaluar
su rendimiento en tareas de referencia espacial.
Aunado a esto las diferencias inter-cepa para la adquisición de la memoria y el
aprendizaje espacial, han sido ampliamente investigadas, Wyss y colaboradores
(2010) por ejemplo compararon ratas Sprague-Dawley, ratas Wistar-Kyoto y ratas
espontáneamente hipertensas (SHR) en la prueba del laberinto acuático de Morris,
encontrando que en las ratas Sprague-Dawley el aprendizaje espacial disminuye
entre los 12 y 18 meses de edad, decayendo dramáticamente entre los 18 y 24
meses de edad.; mientras que en las cepas Wistar-Kyoto y cepas SHR
demostraron un deterioro cognitivo grave a los 12 meses de edad.
En resumen, las diferencias tan notables que se observan en el rendimiento de
las tareas cognitivo-conductuales entre las cepas de rata conlleva inevitablemente
el asumir que existen marcadas diferencias a nivel celular, molecular perceptivas y
en la organización estructural de los circuitos cerebrales y comportamental propias
de cada cepa, reforzando aún más el supuesto de buscar un modelo de estudio
que reduzca en su mayoría las marcadas y complejas variaciones que muestra
cada individuo.
1.5 Cerebrolisina.
La Cerebrolisina es una preparación de péptidos derivados de cerebro de porcino,
y cuyo mecanismo de acción es similar al de los factores neurotróficos, es decir
46
provoca la diferenciación neuronal (surgimiento de axones y dendritas) y mantiene
la integridad funcional y la recuperación de la célula nerviosa. Demostrando así
que tiene efectos benéficos en algunas enfermedades neurodegenerativas y en
accidentes cerebrovasculares.
Esté fármaco es un preparado de neuropéptidos enzimática normalizada de
proteínas cerebrales. Se produce por hidrólisis enzimática estandarizada de un
residuo seco de proteínas cerebrales libre de lípidos y consta de péptidos de bajo
peso molecular y de aminoácidos libres.
Se encuentra disponible en más de cuarenta países como solución lista para
inyectarse o infundirse. Está solución no tiene propiedades antigénicas que se
hayan reportado hasta el momento, y cada mililitro contiene 215.2 mg de
ingrediente farmacéutico activo de cerebrolisina concentrado en solución acuosa.
1.5.1 Efectos neurotróficos de cerebrolisina.
La neuroprotección y la neuroplasticidad, procesos que son aparentemente
independientes y con diferente control, representan, en sí dos secuencias de un
mismo proceso.
Cuándo ocurre una lesión o daño en el sistema nervioso, se desencadena un poco
después un cierto período de latencia que conlleva a generar una reacción de tipo
neuroprotectora endógena. Posteriormente continúa una segunda respuesta (ante
la lesión o alteración neuronal) de reparación endógena, conocida como
neuroplasticidad. Ambos procesos se encuentran regulados por ciertas moléculas
conocidas cómo factores neurotróficos.
Los factores neurotróficos son secretados por el tejido blanco y actúan previniendo
que la neurona asociada a dicho tejido inicie el proceso de apoptosis permitiendo
así que las neuronas sobrevivan.
La Cerebrolisina, es el único medicamento que contiene fragmentos activos de
factores neurotróficos, demostrando su eficacia el beneficio para los pacientes con
accidente cerebrovascular y desordenes neurodegenerativos (Muresanu, 2008).
47
Son varios las estudios que han evaluado el efecto neuroprotector del fármaco
encontrando por ejemplo que esté evita la degeneración de las neuronas,
restablece la estructura neuronal, aumenta la densidad sináptica, y estimula la
neurogénesis favoreciendo el rendimiento de la memoria y la recuperación
funcional (Veinbergs y cols., 2000; Hartbauer, 2001). Álvarez- Buylla y cols.,
(2000); Rockenstein y cols., (2006) abordan el efecto neuroprotector de la
cerebrolisina como atenuante de la disfunción neuronal, y el mantenimiento de la
integridad estructural de las neuronas, por ejemplo en estudios donde se provoca
lesión neuronal ya sea mecánica o farmacológica, se ha visto que la cerebrolisina
promueve la neurogénesis después de dicha lesión.
Cómo promotor de la supervivencia neuronal la cerebrolisina previene la
degeneración y atrofia de neuronas colinérgicas septales alteradas (Akai y cols.,
2002); cómo fármaco neuroprotector la cerebrolisina reduce el daño en las
neuronas y los déficits de comportamiento en ratones transgénicos (tg) que
sobreexpresan la proteína precursora amiloide (APP), inducidiendo mejoría en los
déficits de la memoria en el laberinto de agua y la reducción de la patología 6
meses después del término del tratamiento, sugiriendo así que el uso del fármaco
por periodos prolongados tiende a actuar de manera similar a los factores
neurotróficos (Rockenstein y cols., 2011). La cerebrolisina tiene también efectos
benéficos sobre la neuroplasticidad (conectividad neuronal en el cerebro), ya que
promueve las respuestas adaptativas a los cambios deletéreos, resultantes de
algunos trastornos neurodegenerativos, por ejemplo se han reportado incrementos
inducidos por cerebrolisina en las concentraciones de sinaptofisina en el cerebro
correlacionándose positivamente con mejorías en el desempeño conductual
(Rockenstein y cols., 2003); incluso se ha reportado que la cerebrolisina aumenta
la densidad sináptica (número de terminales presinápticas inmunoreactivas a la
sinaptofisina) en áreas específicas del cerebro en roedores (Windholz y cols.,
2000). La cerebrolisina estimula también la neurogénesis en algunos
padecimientos o daños en el sistema nervioso, al promover la migración de células
progenitoras neuronales. Chohan y cols., (2011) demostraron que la actividad de
algunos péptidos de cerebrolisina ejercen actividad similar a la del factor
48
neurotrófico ciliar (CNTF) el cuál promueve la neurogénesis en neuronas
hipocampales de modelos animales con enfermedad de Alzheimer.
Zhang y colaboradores (2010), encontraron que el uso de cerebrolisina como
tratamiento para pacientes que han sufrido algún tipo de accidente
cerebrovascular, el fármaco promueve la neurogénesis en el cerebro isquémico
aumentando la proliferación, diferenciación y migración de las células progenitoras
neurales en la zona subventricular (sitio dónde se lleva a cabo la neurogénesis y la
formación de neuronas de auto-renovación en el cerebro adulto), 24 y 48 hrs.
después de su administración lo que podría estar relacionado con la mejora del
resultado neurológico, dicho efecto neurogénico también ha sido visto en ratas
Wistar tratadas con cerebrolisina, ya que promueve también el aumento en la
neurogénesis en el giro dentado, correlacionándose con una mejoría en la
memoria espacial y el desempeño en la prueba del Laberinto Acuático de Morris
(Tatebayashi y cols., 2003). En 2015, Zhang y colaboradores reportan que el
tratamiento con cerebrolisina en individuos que han sufrido lesiones cerebrales
traumáticas leves, mejora la función cognitiva a largo plazo, y por ende esta
mejoría podría ser parcialmente relacionada con la disminución de la acumulación
proteína precursora amiloide cerebral (APP), la astrogliosis, y el aumento de los
neuroblastos y la promoción de la neurogénesis.
Finalmente el uso de cerebrolisina ha sido evaluado también sobre la conducta en
modelos animales seniles, donde sea visto mejoría respecto al aprendizaje
espacial y en la reducción de los trastornos de memoria, al ser evaluadas en el
Laberinto acuático de Morris, asegurando así que la cerebrolisina mejora el déficit
en el desempeño cognitivo-conductual en roedores, visto por ejemplo en ratones
deficientes en apolipo-proteína E o ratas con lesiones corticales motoras en,
donde el fármaco mejora la memoria espacial y el aprendizaje, y promueve el
aumento en la expresión del transportador de glucosa (GLUT1), contribuyendo con
ello a mejorar la función cognitiva en tareas cortico e hipocampo-dependientes
(Masliah y cols.,2009; Valouskova y cols., 2003; Gschanes y cols., 2000; Boado,
2001).
49
1.5.2 Generalidades de la Cerebrolisina.
La Cerebrolisina es una preparación de péptidos derivada del cerebro
porcino; y se produce por descomposición enzimática de proteínas
cerebrales purificadas, consta de péptidos de bajo peso molecular y
aminoácidos.
Facilita la actividad neurotrófica, demostrando que la cerebrolisina mejora el
rendimiento cognitivo y la función global en numerosos trastornos
neurodegenerativos y enfermedades mentales.
Potencia la actividad alfa del cerebro, reduce la frecuencias
electroencefalográficas delta bajas y mejora el rendimiento de la memoria
en los ancianos, sugiriendo así que este compuesto activa los mecanismos
cerebrales relacionados con los procesos de atención y memoria.
Mejora el déficit cognitivo y la función global en pacientes con
enfermedades neurodegenerativas leves a moderadas, incluyendo la
esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de
Alzheimer, la demencia, aguda y los individuos que hayan sufrido de algún
accidente cerebrovascular crónico.
Protege contra el daño motor inducido y reduce la muerte de los nervios
periféricos. La cerebrolisina induce la recuperación motora en individuos
que han sufrido de algún daño en la médula espinal o en la raíz nerviosa
espinal.
Ha demostrado ejercer un efecto benéfico sobre el autismo infantil (89%) y
la parálisis cerebral (encefalopatía anóxica leve a moderada).
Tiene actividad neuro-inmunotrófica al reducir la inflamación crónica de las
células nerviosas y la muerte neuronal acelerada en condiciones
patológicas, como se observa en algunas enfermedades
neurodegenerativas progresivas traumáticas agudas y crónicas (artritis
progresiva)
Finalmente la cerebrolisina ha demostrado tener beneficios "anti-
envejecimiento" al mejorar la cognición, la función de la memoria, el
50
metabolismo cerebral, estimulando la regeneración neuronal en el cerebro
de las personas mayores y acelerar el rendimiento de los estados mentales
y físicos.
1.5.3 Mecanismos Moleculares de Cerebrolisina.
Particularmente los mecanismos bioquímicos y moleculares por los cuales la
cerebrolisina ejerce sus efectos neurotróficos no han sido completamente
demostrados. Hasta la fecha se continúa en la búsqueda de terapias clínicas que
ayuden a disminuir o atenuar por completo algunos de los síntomas tanto físicos
como mentales provocados por ciertos trastornos neurodegenerativos, lesiones
cerebrales etc., sin embargo muchas de ellas han fallado debido al uso de
fármacos que consideran únicamente a un solo factor de daño. Sin embargo no
debe obviarse el hecho de que estás enfermedades ahora consideradas
multifactoriales implican múltiples mecanismos celulares y moleculares que que en
consecuencia dificultan la acción eficaz de estas terapias en contra de
patogénesis de este tipo de trastornos cerebrales.
Es por ello que ahora la investigación reciente se ha centrado en la búsqueda de
aquellos fármacos multifuncionales que constituyan la alternativa más adecuada
para el tratamiento de estos padecimientos, dándole un lugar importante al uso
terapia con agentes promotores de la síntesis de factores neurotróficos como la
cerebrolisina en la terapia contra algunas enfermedades como el Alzheimer,
Enfermedad de Parkinson, Ictus cerebral, autismo, esquizofrenia etc. , puesto que
estás moléculas son agentes pleiotrópicos con actividades pluripotenciales que
participan en múltiples vías moleculares y procesos celulares que son relevantes
para la patología y la recuperación de estos padecimientos.
Algunos de los neuropéptidos contenidos en la mezcla de cerebrolisina han
demostrado tener reactividad cruzada con anticuerpos de algunos factores
51
tróficos (factor neurotrófico derivado de la línea celular glial, factor neurotrófico
ciliar, IGF-1 y IGF-, lo que sugiere su potencial capacidad para unirse a receptores
de estos factores que controlan algunas actividades neuronales cómo la
reparación o el crecimiento celular. Álvarez y colaboradores, (2013), demostraron
que los péptidos de cerebrolisina interactúan con los receptores de los
moduladores inhibitorios del cerebro, como Adenosina A1 y GABAB regulando la
actividad colinotrófica (Satou y cols, 2000; Akai y cols, 2002); Kitagishi y
colaboradores (2012) mencionan que los efectos pleiotrópicos que ejerce el
fármaco sobre la activación de la vía de señalización celular PI3K/Akt GSK-3β, la
cual es blanco de alteraciones en algunos trastornos neurodegenerativos al ser
una vía señalización importante en la integración subcelular de la
neurotransmisión sináptica, modula la proliferación celular neuronal, la migración,
y la plasticidad la cuál es blanco de alteraciones en algunos trastornos
neurodegenerativos; Xiong y colaboradores (2006) concluyen que aunque el
efecto de la cerebrolisina no se bloqueó con la aplicación de un antagonista
específico de GABAA, sí lo hizo en forma parcial con un antagonista de GABAB y,
en menor grado, con el antagonista del receptor de opioides, naloxona. Dichos
efectos tuvieron una mediación presináptica al reducir la liberación de
neurotransmisores, según se evaluó con la resistencia del ingreso lo que sugiere
que la cerebrolisina pudiese desempañar un papel importante en la comunicación
celular modulando las corrientes iónicas y la liberación de ciertos
neurotransmisores. Rockenstein y colaboradores (2003) proponen que la
atenuación de los déficits sinápticos y conductuales en ratones transgénicos (APP)
inducida por cerebrolisina se encuentra mediada por una reducción en la
fosforilación de la proteína precursora amiloide (APP) resultante de los cambios en
la actividad de quinasas específicas (glucógeno sintetasa quinasa 3β [GSK3β] y
de la quinasa ciclina-dependiente 5 [CDK5]), que también regulan a la proteína tau
asociada a los microtúbulos.
Por otro lado cerebrolisina posee también efectos inmunomoduladores que
atenúan los mecanismos inflamatorios asociados a las enfermedades
neurodegenerativas; por ejemplo Álvarez y colaboradores (2000) demostraron que
52
la cerebrolisina reduce la expresión de la microglía y la liberación de interleuquina-
1β inducida por lipopolisacáridos (LPS), mediante estudios In vitro determinaron
los mecanismos inmunomoduladores que potencian los efectos neuroprotectores
de la cerebrolisina en modelos murinos que expresan patrones de
neurodegeneración.
1.5.4 Propiedades Farmacológicas de la Cerebrolisina.
Cómo fármaco estimulante de los factores neurotróficos la cerebrolisina posee
propiedades farmacodinámicas que pueden clasificarse en términos de
supervivencia neuronal (p.ej., acciones tróficas y promotoras de la supervivencia),
de neuroprotección (p.ej., limitación de la disfunción neuronal, sobre todo en
condiciones adversas), de neuroplasticidad (p.ej., respuestas adaptativas a
condiciones cambiantes) y neurogénesis (p.ej., promoción de la diferenciación de
las células progenitoras). Aunque no es del todo claro cómo es que el mecanismo
de acción farmacológico de la cerebrolisina ejerce su acción sobre el sistema
nervioso, si se tiene bien establecido que los péptidos y aminoácidos que la
componen actúan como factores de crecimiento y neurotransmisores.
Sin embargo algo que ha causado controversia en los últimos años es la manera
en que la atraviesa la barrera hematoencefálica; puesto que está impide el
movimiento de péptidos y aminoácidos a partir de la sangre hacía el cerebro, lo
que abre un campo de investigación bastante interesante por estudiar.
En la actualidad se ha evaluado la eficacia clínica dela cerebrolisina en la
demencia, en varios estudios hechos en pacientes con enfermedad de Alzheimer
o con demencia vascular entre otros. Flores y Atzori, (2014) mencionan que la
cerebrolisina disminuye los daños en las conexiones sinápticas y la densidad
dendrítica en modelos animales con esquizofrenia mediante el aumento de la
densidad sináptica y la restauración de cito-arquitectura neuronal, este efecto
neuroprotector mejora la integridad de los circuitos neuronales y mejora el
rendimiento cognitivo y conductual. Se han desarrollado diversos modelos
53
animales para investigar los acontecimientos asociados a la aparición de la
enfermedad de Alzheimer y la progresión del progreso neurodegenerativo de está
enfermedad; las ratas seniles por ejemplo son modelos adecuados para estudiar
este tipo de alteraciones conductuales y morfológicas y evaluar la viabilidad
farmacológica de la cerebrolisina en las actividades cogntivo-conductuales ya que
las ratas seniles muestran alteraciones de la memoria y el aprendizaje similares a
las observadas e los humanos. En ratas Long Evans viejas de 24 meses de edad,
la administración de cerebrolisina durante 19 días aumento el número de
terminales presinápticas, cómo lo demuestra el incremento de sinaptofisina, una
proteína marcadora de las vesículas sinápticas, estos efectos se observan en
áreas cerebrales relacionadas con el rendimiento cognitivo, los subcampos del
hipocampo, la circunvolución dentada y la corteza entorrinal (Reinprecht y cols,
2000).
1.5.5 Efectos de la cerebrolisina en modelos de envejecimiento.
Hasta ahora se han descrito algunas de las generalidades, propiedades
farmacodinámicas, moleculares y biológicas de la cerebrolisina, y su inminente
efecto protector, de reparación y modulación sobre las alteraciones y daños
provocados en sistema nervioso de modelos animales experimentales cómo en los
seres humanos a causa de lesiones cerebrales leves o moderadas y algunos
trastornos neurodegenerativos que perjudican la formación de la memoria y el
aprendizaje por ejemplo durante la etapa de envejecimiento.
Y es particularmente esté último fenómeno en el que se han visto muchos de los
efectos pleiotrópicos de la cerebrolisina, asumiendo con ello su potencial
relevancia cómo terapia clínica para el control, prevención y posible cura de
algunos trastornos neurodegenerativos que, sin duda alguna ponen en juego la
calidad de vida de quién los padece. Las demencias tienden a ser algunos de los
principales trastornos que se presentan durante el envejecimiento cómo por
ejemplo el Alzheimer. Juárez y colaboradores (2011) evaluaron el efecto de la
cerebrolisina sobre las dendritas de las neuronas piramidales de la corteza
prefrontal, neuronas CA1 de hipocampo dorsal, células granulares del giro
54
dentado (DG) y las neuronas espinosas medianas del núcleo accumbens de
ratones seniles, encontrando que en los roedores tratados con el fármaco hubo un
aumento significativo en la densidad de la espinas dendríticas y en la longitud
dendrítica de las neuronas piramidales de la corteza prefrontal y de las células
granulares del giro dentado, sugiriendo que la cerebrolisina induce el proceso de
neuroplasticidad en estas regiones cerebrales durante el envejecimiento,
respaldando la hipótesis de que el fármaco tiene un efecto terapéutico en
pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Por su parte, Jacobs y colaboradores (1997, 2001) mediante el uso de la tinción
de Golgi reportan que el análisis tanto de la longitud dendrítica total, la longitud del
segmento principal, el número de segmentos, el número de espinas dendríticas y
la densidad de espinas dendríticas en las capas 10 y 18 de la corteza cerebral,
sufren una pérdida del 50% en de la densidad de espinas dendríticas total, así
como la reducción de entre 9-11% en la longitud dendrítica total.
Particularmente el hipocampo muestra un déficit morfológico muy marcado, y
prueba de ello lo abordan Flood y colaboradores (1997) analizaron la arborización
dendrítica de la región CA1, CA2 y CA3 del hipocampo de humanos envejecidos
sanos y de aquellos que padecían algún tipo de demencia senil, encontrando, que
en la mayoría de los pacientes sanos la arborización dendrítica en la tres regiones
se modifica muy poco, sin embargo en los individuos con demencia senil o
aquellos que muestran síntomas previos se observa una considerable alteración
de la arborización basal y apical en la región CA1 Y CA3 del hipocampo sugiere
preservación relativa del campo CA2 de los cambios degenerativos en la
demencia senil.
Wong y colegas (2000) demostraron mediante una serie de estudios
electrofisiológicos, morfológicos con el uso de la tinción Golgi-Cox, que existe una
reducción tanto en estructuras presinápticas y postsinápticas en la neo-corteza y
en neuronas piramidales de la capa V de la corteza parietal de roedores en etapa
senil reportando afección sináptica generalizada para esta área.
55
Por otro lado se ha investigado también el aumento de la densidad sináptica sobre
el rendimiento cognitivo en el laberinto de agua de Morris, un sistema de análisis
válido para comprobar el procesamiento de la información espacial en roedores,
que en ratas senescentes es equivalente al trastorno de orientación de los seres
humanos con demencia. Los resultados demuestran que las latencias de escape y
por tanto, el rendimiento cognitivo, mejoraron significativa tras el tratamiento con
cerebrolisina, además, la observación de una diferencia significativa ya en primer
día de la prueba indicó un dominio de la tarea (Gschanes y cols., 2003).
Hallazgos en un modelo de ratón transgénico de enfermedad de Alzheimer (mTh1-
hAPP751), en el cual se administró cerebrolisina por seis meses, se asoció a una
reducción en la patología neurodegenerativa (p.ej., carga de amiloide en el
cerebro, menor patología sináptica), sugieren que estos efectos benéficos
pudieran estar mediados por regulación de la maduración de la APP y su
transporte a los sitios donde se genera el péptido β-amiloide (Aβ), producto
proteolítico de la APP. En este modelo, la administración de cerebrolisina por un
corto periodo se acompañó de una reducción de la carga de Aβ en el cerebro
(Rockenstein y cols., 2003). Recientemente Rockenstein y colaboradores (2014)
demostraron que el tratamiento con cerebrolisina reduce los niveles de
fosforilación de la proteína Tau en el giro dentado, así como degeneración de las
neuronas piramidales en la corteza temporal y el hipocampo de ratones
transgénicos (Tau / GSK3) , además la cerebrolisina reduce los altos niveles de la
proteína Drp-1 que expresan los ratones transgénicos (Tau / GSK3) en las
mitocondrias, ya que está enzima reacciona con la proteína tau y proteína beta
amiloide provocando la fragmentación mitocondrial y con ende la
neurodegeneración. Así pues el fármaco mejorar la patología neurodegenerativa
en el modelo de tautopatía lo que implica la reducción de la acumulación de la
proteína Tau hiper-fosforilada, que como se sabe dicha proteína también se
encuentra presente en pacientes ancianos, además se evidenció la capacidad
para disminuir las alteraciones de la actividad mitocondrial asociada con Tau.
56
II. Planteamiento del problema.
Durante el proceso de envejecimiento se experimentan múltiples alteraciones y
cambios en el funcionamiento de los órganos y sistemas corporales, dentro de los
cuáles destaca una disminución de la función cognitiva que, en parte, se explica
por los cambios en la plasticidad neural o alteraciones celulares que afectan
directamente a los mecanismos de plasticidad. Aunque hay varios cambios
neurológicos relacionados con la edad, que han sido identificados durante el
envejecimiento normal, estos tienden a ser sutiles en comparación con las
alteraciones que se observan en los trastornos asociados con la edad, como la
enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson; los cuáles provocan
alteraciones diferentes grados de deterioro neuronal y en consecuencia la
alteración de las funciones cognitivas que modifican drásticamente las condiciones
de vida de quién los padece. Así pues, los cambios tan severos que ocurren a
nivel de los circuitos neuronales en un cerebro envejecido alteran también la
síntesis de moléculas encargadas del mantenimiento y la reparación neuronal
(Bass, 2006).
La conducta humana está caracterizada por tener diferencias individuales en
respuesta a una misma situación y estas diferencias individuales han sido el objeto
de estudio para sentar las bases neurofisiológicas de variedad de enfermedades.
De la misma forma las ratas a pesar de su control tanto en su genotipo como su
fenotipo, también disponen de profundas diferencias individuales que son
relevantes para el entendimiento de gran variedad de condiciones normales y
patológicas (Harker y Whishaw, 2002). Esta es la situación por la cual la selección
de la cepa de rata es crucial para el correcto diseño e interpretación de cualquier
modelo experimental animal.
Wallace y cols., (1980), mencionan que las ratas son el modelo más adecuado
para el estudiar los cambios conductuales y morfológicos neuronales que ocurren
durante el envejecimiento, porque las ratas senescentes muestran las mismas
fallas en los procesos de memoria y aprendizaje que en humanos (ver fig.11).
57
Fig. 11. Edad del humano y la rata: Comparación entre la edad biológica de la rata (en
meses) respecto a la edad biológica (en años) en los seres humanos (Wallace y cols.,
1980).
Bajo este sentido se han realizado un gran número de estudios cuyo fin ha sido el
de explicar con más claridad cuáles son los efectos del envejecimiento sobre la
arquitectura y morfología neuronal en el encéfalo de algunos mamíferos y el ser
humano generando así gran cantidad de información al respecto:
Elston (2000) comparó las neuronas de la capa III en las regiones de la corteza
prefrontal, occipital, parietal, y los lóbulos temporales en el cerebro de macacos
jóvenes y macacos envejecidos, encontrando que particularmente en las
neuronas de la capa III de la corteza prefrontal de individuos envejecidos se
observan cambios en el número de ramificaciones dendríticas y una diminución en
la densidad de espinas dendríticas tanto en la arborización basal cómo en la
apical, respecto a las demás regiones corticales estudiadas (occipital, parietal, y
los lóbulos temporales), sugiriendo que las células piramidales en diferentes áreas
corticales presentan una morfología y composición diferente en función de la
tarea que desempeñan, además y en consecuencia ser capaces de integrar un
número de entradas sinápticas indistinto.
En años recientes la búsqueda de tratamientos clínicos y farmacológicos,
mediante la aplicación de fármacos como la cerebrolisina que incorporan el uso de
factores neurotróficos, han demostrado poseer una gran eficacia terapéutica al
reducir algunos efectos relacionados con los procesos seniles; por ejemplo se ha
visto que ayudan en la restauración celular, la neuroprotección y reparación celular
en algunas regiones cerebrales encargadas de la formación de la memoria y el
aprendizaje. La cerebrolisina parece actuar sobre receptores específicos que
0 13
1 2 5 12 18 20 24
28 40 50 70 80 20
0
Edad Humanos (Años)
Edad Rata (Meses)
58
median el desarrollo cerebral, el mantenimiento neuronal y los efectos
neuroprotectores evitando así la neurodegeneración y así mismo estimular el
crecimiento de terminales dendríticas (Jonhagen, 2000).
Rockenstein y colaboradores, (2007), sugieren que el tratamiento con
cerebrolisina promueve la neurogénesis y la neuroprotección en ratones
transgénicos que sobreexpresan precursor de proteína amiloide (APP), además de
disminuir la tasa de apoptosis y estimulando la proliferación de células mejorado
en el hipocampo de ratones (APP-CBL), pudiendo desempeñar un papel
importante en la mejora de la formación sináptica y la adquisición de la memoria.
Álvarez y colaboradores (2010) evaluaron los efectos neuroprotectores de la
cerebrolisina en tres dosis diferentes 10-, 30 y 60-ml, en pacientes que padecían
enfermedad de Alzheimer moderada a moderadamente grave, encontrando que
mejoró la cerebrolisina mejoró la función clínico global significativamente,
obteniendo resultados dosis-específicos similares tanto para los pacientes con
enfermedad de Alzheimer moderadamente grave, a los reportados para los
pacientes con enfermedad de Alzheimer leve a moderada al inducir mejoras
significativas en la cognición, y el inicio de actividades de la vida diaria; Alcántara-
González y colaboradores (2012), probaron el efecto combinado de la
cerebrolisina y el donepezil (el primero muestra propiedades neurotróficas y
neuroprotectoras, mientras que el segundo es un potente inhibidor de
acetilcolinesterasa) en ratones seniles, demostrando que la administración
combinada de ambos compuestos, modifica la morfología dendrítica en las
neuronas de la corteza prefrontal (PFC), hipocampo dorsal (HD), el giro dentado
(DG), y las neuronas del núcleo accumbens (NACC), reflejándose directamente en
un aumento de la densidad de espinas dendríticas y en la longitud dendrítica total,
además se observó un efecto sinérgico entre la cerebrolisina y donepezil en orden
de ramificación dendrítica y la longitud total de las neuronas piramidales de PFC,
concluyendo que el efecto combinado de los fármacos potencia la neuroplasticidad
en las regiones cerebrales de ratones seniles.
59
III. Justificación.
En años recientes debido a la creciente expansión demográfica, se ha registrado
un aumento considerable en el número de adultos mayores en el mundo, y en
consecuencia se esperaría también que aumenten de manera exponencial el
número de aquellos individuos seniles susceptibles de padecer cierto tipo de
enfermedades o trastornos neurodegenerativos relacionados con el
envejecimiento; cómo la demencia senil ya que estos pueden ocasionar pérdida
total o parcial de la memoria y modificar drásticamente la calidad de vida de quién
las padece. Dado que el comportamiento es la respuesta extrínseca a los
estímulos del medio ambiente, la información que surge a partir de los estudios
conductuales permite detectar ciertas alteraciones neuroanatómicas o
neuroquímicas que alteren la conducta de cualquier organismo en etapa de
envejecimiento
Por lo que un gran número de estudios que han evaluado el papel de la
cerebrolisina como atenuante de los déficits cognitivo-conductuales al promover
mecanismos de crecimiento, sobrevivencia y regeneración neuronal en zonas
específicas del cerebro, demuestra que contribuye sustancialmente a mejorar los
procesos relacionados con la memoria y aprendizaje espacial en ratas en proceso
de envejecimiento; teniendo en cuenta el principio subyacente que el tratamiento
con factores neurotróficos (moléculas reguladoras del desarrollo y funcionamiento
de las células nerviosas), puede ser la opción para mejorar el mecanismo de
reparación neuronal debido a sus efectos pleiotrópicos (Plosker 2009; Álvarez y
Fuentes, 2011; Masliah y Díez, 2012).
Es por ello que el estudio del uso y aplicación de fármacos como la cerebrolisina
para promover la síntesis de factores de crecimiento neurotrófico que potencien
las respuestas cerebrales de protección neuronal, neuroplasticidad y neurogénesis
en el sistema nervioso central de individuos en etapa de envejecimiento, es de
suma importancia en la búsqueda de terapias clínicas eficaces, no invasivas y de
fácil accesibilidad que aminoren los daños físicos y cognitivos causados por
algunos trastornos neurodegenerativos propios del envejecimiento cómo la
demencia senil o la enfermedad de Alzheimer, puesto que además las pruebas
60
conductuales como el laberinto acuático de Morris (Morris, 1981), nos permitirán
sustentar aún más la hipótesis de que el compuesto cerebrolisina ejerce también
un efecto neuroestimulador sobre la conducta relacionada con la memoria espacial
y el aprendizaje en ratas.
IV. Hipótesis.
La administración crónica de cerebrolisina previene las alteraciones morfológicas y
conductuales en regiones cerebrales encargadas de regular la función cognitiva
(Hipocampo y Corteza Prefrontal Media), en ratas macho de las cepas Long
Evans, Sprague Dawley y Wistar en etapa de envejecimiento.
V. Objetivos.
Objetivo general
Evaluar el efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre los
cambios morfológicos neuronales y conductuales en corteza prefrontal e
hipocampo de ratas macho de las cepas Long Evans, Sprague Dawley y
Wistar en etapa de envejecimiento.
Objetivo Particular.
Evaluar el efecto de la administración crónica de cerebrolisina en ratas
macho de 18 meses de edad de las cepas Long Evans, Sprague Dawley y
Wistar sobre:
La memoria y el aprendizaje espacial
Evaluar el efecto la administración de cerebrolisina en ratas macho de 18
meses de edad de las cepas Long Evans, Sprague Dawley y Wistar sobre:
La morfología neuronal y la densidad de espinas dendríticas en:
Las neuronas piramidales de la capa III de la corteza media
prefrontal.
61
Las neuronas piramidales de la capa V de corteza media
prefrontal.
Las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo.
VI. Metodología.
5.1 Diagrama de trabajo.
Wistar (n=10)
Administración = 2 meses
Long Evans (n=10)
Administración = 2 meses
SUJETOS EXPERIMENTALES
Ratas macho de 16 meses de edad
Provenientes del Bioterio
“Claude Bernard” B.U.A.P
Sprague Dawley (n=10)
Administración = 2 meses
Control (n=5) Solución
salina 2 ml/Kg
Tratamiento (n=5)
Cerebrolisina 2 ml/Kg
Control (n=5) Solución
salina 2 ml/Kg
Control (n=5)
Solución salina
2 ml/Kg
Tratamiento (n=5)
Cerebrolisina 2 ml/Kg
Tratamiento (n=5)
Cerebrolisina 2 ml/Kg
Prueba de Aprendizaje y Memoria: “Laberinto Acuático de Morris” (18 meses de edad)
* Sacrificio de los sujetos experimentales.
* Perfusión y extracción de cerebros
62
5.1.2 Cronograma de actividades
Tinción Golgi-Cox: Corte y Revelado de Tejido Cerebral.
Análisis morfológico: Dibujo de neuronas: Corteza Prefrontal (Capas III y V) e
Hipocampo Dorsal (CA1). Evaluación de la densidad de espinas dendríticas
Evaluación de los Resultados
Morfología: Análisis de Sholl
Morfología y Conducta: ANOVA de dos vías con medidas repetidas Pruebas post-hoc de Tukey
63
5.2 Sujetos de experimentación
Para llevar a cabo nuestro estudio se utilizaron ratas macho de 16 meses de edad
de las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans, obtenidas del Bioterio Claude
Bernard de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Los animales se
mantuvieron en jaulas de acrílico transparentes, con acceso de agua y alimento ad
libitum, bajo condiciones de temperatura a 24 ºC, y con humedad del 25%,
además de mantener ciclos de luz/oscuridad de 12x12 horas. El manejo y cuidado
de los animales se realizó bajo los lineamientos establecidos en la norma oficial
NOM-062-ZOO (1999).
5.3 Administración de cerebrolisina.
Una vez que los sujetos experimentales de cada una de las cepas seleccionadas
(Wistar, Sprague Dawley y Long Evans), cumplieron los 16 meses de edad, fueron
agrupadas aleatoriamente en dos grupos, el primero de ellos asignado al
tratamiento con cerebrolisina y el segundo grupo tratado con solución fisiológica
respectivamente.
De manera individual a cada roedor del grupo experimental y de la cepa
seleccionada se le administró cerebrolisina a una dosis de 0.2 ml/Kg por vía
intraperitoneal a lo largo de 2 meses, durante 6 días a la semana; mientras que
para los individuos del grupo control se les administró 20 UI de solución fisiológica
por vía intraperitoneal por el mismo lapso de tiempo a lo largo de 2 meses, durante
6 días a la semana.
Una vez concluidos los tiempos de administración, los animales de ambos grupos
fueron sometidos a las pruebas conductuales de memoria y aprendizaje, al
término de dichas pruebas se procedió al sacrificio de los animales, la perfusión y
extracción del tejido cerebral, y finalmente el corte y revelado del mismo para su
posterior análisis morfológico.
64
5.5 Laberinto Acuático de Morris.
Se han diseñado cierto tipo de paradigmas experimentales que le permiten al
investigador determinar cuán grave es el grado de deterioro de las capacidades
cognitivas. Los más usados son los llamados laberintos, los cuales tienen como
objetivo primordial, evaluar la capacidad de los roedores para aprender y recordar
cuál es la ruta o sitio correcto (previamente determinado por el experimentador)
para obtener una determinada recompensa (normalmente en forma de comida o
agua).
Bajo este principio; la prueba del Laberinto Acuático de Morris es una técnica
diseñada para evaluar la memoria espacial y el aprendizaje en roedores (Vorhees
y Williams, 2006) se utiliza comúnmente, como prueba en los estudios preclínicos
diseñados para evaluar el potencial terapéutico de nuevos tratamientos para los
déficits cognitivos relacionados con la edad (Lindner, 1997).
Es por ello que el objetivo primordial del uso de este tipo de pruebas para la
evaluar la capacidad cognitiva en roedores senescentes radica en una serie de
resultados experimentales que indican que el hipocampo, región crucial para los
procesos de la memoria el aprendizaje (humanos) y la orientación espacial
(roedores), sufre dramáticas modificaciones con la edad, extrapolando
directamente dicha característica con los trastornos cognitivos relacionados con el
envejecimiento en los seres humanos.
Así pues el laberinto acuático de Morris consiste en una piscina circular llena de
agua cuya temperatura oscila entre 18 y 27 °C, en la que se sitúa una plataforma
sumergida que debe ser localizada por el animal. En el procedimiento tradicional,
el agua se tiñe opaca con leche o alguna sustancia no tóxica, aunque se ha
demostrado que no es necesario, ya que el animal nada con la cabeza por encima
del agua, lo que le impide ver la plataforma. Para llevar a cabo está tarea de
memoria, el animal se sirvió de señales espaciales externas (fotografías, dibujos,
marcas coloridas etc.) las cuáles fueron visibles fácilmente para el animal (Morris,
1981; Vicens et al., 2003).
65
Se requirió de una piscina circular de 80 cm de alto y un diámetro de 140 cm.,
dentro de la cual se colocó una plataforma de 20 cm de diámetro y 40 cm de alto.
La piscina se llenó con agua hasta una altura aproximada de 42 cm, es decir
cubriendo casi por completo la piscina, además de que el agua estuvo a una
temperatura de 23 ± 2 °C. Posteriormente la piscina se dividió en cuatro
cuadrantes imaginarios (Norte, Sur, Este y Oeste), los cuales fueron tomados
como puntos de partida. La plataforma se colocó al medio en cada uno de los
cuadrantes seleccionados, manteniendo así una posición constante de entre el
centro y el borde de la piscina durante toda la prueba.
Dicha plataforma se sumergió 2 cm por debajo de la superficie del agua la cual se
tiño con dióxido de titanio (TiO2) al 0.01%, de manera que el agua adquirió una
tonalidad de color blanco.
Durante cada uno de los ensayos, la rata se colocó dentro de la tina, en una de
las cuatro ubicaciones de partida asignadas por el investigador, de tal manera que
el animal quedó justo frente a la pared de la piscina.
Posteriormente se colocaron señales contextuales o elementos espaciales
claramente perceptibles (ventanas, puertas o fotografías (Stewart y Morris, 1993)
en cada uno de los cuadrantes imaginarios de la piscina, con el fin de que el
animal se oriente y memorice los elementos espaciales durante el nado.
Cabe señalar que en cada ensayo se colocó a los roedores en cada punto de
salida establecido, de acuerdo a los 4 puntos cardinales (Norte, Este, Sur y
Oeste).
Los ensayos se registraron y grabaron durante intervalos de tiempo distintos al
comienzo de la fase de adquisición y en la fase de retención de memoria;
utilizando una cámara de video (Sharp VL-WD450 U) montada sobre el centro de
la piscina para grabar el recorrido y tiempos en los que el roedor encontraba la
plataforma (Limón y cols., 2009) (ver fig. 14).
66
Fig. 14. Esquema que representa cada uno de los componentes del Laberinto Acuático de
Morris (Limón y cols., 2009)
5.5.2 Fase de adquisición
En una primera fase llamada adquisición, las ratas realizaron 4 ensayos al día
(uno por cada cuadrante) durante 5 días consecutivos, con un intervalo entre
ensayos de mínimo 60 minutos. Esta fase consistió en introducir al animal en cada
uno de los cuatro cuadrantes con el hocico apuntando hacia las paredes de la
piscina para que buscara la plataforma durante 90s. Únicamente en el primer
ensayo del primer día, si la rata no encontraba la plataforma se le guiaba
manualmente al animal hasta la localización de la plataforma donde debía de
permanecer de 20 a 30 segundos sobre ésta, para los siguientes 3 ensayos de
ese día y de los otros cuatro días restantes sólo se le otorgó al animal los 90s para
encontrar la plataforma. Se consideró que un animal había encontrado la
plataforma cuando permanecía en ella por 10s para luego ser devuelta a su
respectiva jaula. Si la rata no encontraba la plataforma dentro de los 90s de la
sesión, se tomó en consideración los 90s como tiempo máximo.
67
5.5.3 Fase de retención
La fase de retención o también llamada memoria, se realizó sin la plataforma de
escape dentro de la piscina. Se llevó a cabo 7 días después de haber terminado el
último día de la fase de adquisición y fue sólo un día de prueba. Los ensayos se
realizaron de la misma manera como se describió anteriormente en la fase de
adquisición, siendo la única diferencia el que está vez no hubo plataforma. Las
variables a medir fueron el tiempo para encontrar la plataforma (o el tiempo para
cruzar la localización de la plataforma en el caso de la fase de retención), el
número de cruces en la plataforma, tiempo de permanencia en el cuadrante meta
y el número de visitas por cuadrante. Además, se evaluó la trayectoria haciendo
un esquema siguiendo y marcando el recorrido del animal en toda la piscina
5.6 Estudios Morfológicos
Al Finalizar la prueba del Laberinto Acuático de Morris, los animales fueron
sacrificados para la extracción de los cerebros. Para ello se anestesió a los
animales con pentobarbital sódico a una dosis de 60 mg/Kg de peso. Una vez
anestesiados los animales, se realizó una incisión torácica para exponer el
corazón y con ello perfundir con solución fisiológica a través del ventrículo
izquierdo, durante este proceso se realizó un corte en la arteria aorta descendente
con el fin de eliminar los eritrocitos del tejido cerebral. Posteriormente se
removieron los cerebros para fijarlos en 25 ml de solución de Golgi-Cox.
Los cerebros destinados al estudio morfológico de Sholl fueron sometidos a la
tinción de Golgi-Cox.
5.7 Fase de Impregnación con la solución Golgi-Cox
La tinción de Golgi-Cox sirvió para analizar la morfología neuronal. Los cerebros
obtenidos se colocaron en solución de Golgi-Cox (K2Cr2O7 170mM, HgCl2
200mM, K2CrO4 200mM), y se almacenaron por 30 días en total oscuridad.
Transcurrido este tiempo, se remplazó la solución de Golgi-Cox por una solución
de sacarosa al 30%, para otorgarle flexibilidad al tejido, de esta manera los
68
cerebros permanecieron en esta solución durante un periodo de 5 días en total
oscuridad.
5.7.1. Cortes histológicos.
Transcurrida la fase de impregnación se prosiguió a realizar cortes cerebrales en
secciones coronales de 200 μm utilizando un vibrotomo (Instrumento Campden,
MA752, Leicester, Reino Unido). El cerebro completo fue colocado en la parte más
dorsal a la platina de la cisterna del vibrotomo, fijándolo con pegamento de
cianoacrilato, posteriormente se vertió la solución de sacarosa al 6% mezclada
con un poco de agua destilada a la cisterna del vibrotomo hasta cubrir en su
totalidad al cerebro.
Los cortes obtenidos de los cerebros se colocaron en portaobjetos gelatinizados
para microscopio y colocados en rieles de tinción los cuáles se mantuvieron dentro
de una cámara húmeda (recipiente con agua destilada) hasta que se llevó a cabo
el proceso de tinción y revelado.
5.7.2 Revelado de los cortes.
Una vez fijado el tejido en las laminillas gelatinizadas se procedió a realizar el
revelado de los cerebros. Es importante destacar que todo este proceso se
realizó en completa oscuridad.
1- Inicialmente se colocaron las laminillas dentro de un recipiente con un agua
destilada, para realizar el lavado del tejido durante 1 minuto.
2- Posteriormente las laminillas se colocaron las laminillas en hidróxido de amonio
manteniéndose sumergidas durante 30 minutos.
3 Al finalizar los 30 min. se realizó un lavado con agua destilada durante 1
minuto.
4- A continuación las laminillas fueron colocadas y sumergidas en fijador rápido de
Kodak para película fotográfica durante 30 minutos
5- Las laminillas fueron extraídas y nuevamente sumergidas en agua destilada
durante 1 minuto para el lavado del tejido.
69
6- El siguiente paso fue colocar las laminillas en distintas concentraciones de
etanol para su deshidratación:
1 minuto con alcohol al 70%
1 minuto con alcohol al 95%
5 minutos con alcohol al 100%
5 minutos con alcohol al 100%
15 minutos en xileno
7- Al término de este proceso, las laminillas con los cortes ya revelados
fueron montadas con resina sintética y cubreobjetos respectivamente.
8- Finalmente los cortes fueron conservados en oscuridad para su secado y la
observación posterior y análisis de las neuronas contrastadas con la tinción de
Golgi-Cox.
5.7.3 Dibujado de neuronas
Se dibujaron 5 neuronas de la región de interés por hemisferio cerebral de cada
rata (10 en total por cerebro), utilizando una cámara lucida con una ampliación de
400x, adaptada a un microscopio óptico marca Leica modelo DMSL.
El proceso de dibujo consiste básicamente en seleccionar a la neurona y con la
ayuda del objetivo de 400x se procede a calcarla sobre una hoja de papel (ver fig.
15).
Las neuronas estudiadas en este trabajo fueron las neuronas piramidales de la
capa III de la Corteza Media Prefrontal, las cuáles fueron ubicadas mediante el
atlas del cerebro de rata conocido como “The Rat Brain in Stereotaxic
Coordinates” (Paxinos y Watson, 1998).
Finalmente para elegir adecuadamente la célula indicada y posteriormente
dibujarla es importante seguir cuidadosamente los siguientes parámetros:
El soma neuronal debe encontrarse dentro de la región de interés.
70
La neurona debe estar completamente teñida.
Se deben observar por lo menos tres dendritas basales primarias las cuales
se ramifiquen.
Las neuronas deben estar lo más intactas posibles.
Fig. 15. Esquema que representa la manera en que las neuronas son plasmadas sobre papel
para su posterior análisis.
5.8 Análisis de los resultados morfológicos.
Los datos morfológicos obtenidos fueron cuantificados mediante el análisis de
Sholl (Sholl, 1953), el cual consiste en trazar una serie de círculos concéntricos
alrededor del cuerpo neuronal o soma (ver fig. 16) y con ello poder estimar el
número de dendritas que interceptan en cada anillo y así determinar la longitud
dendrítica total (Flores y cols., 2005, Silva-Gómez y cols., 2003; Solis y cols.,
2007).
Las variables analizadas fueron las siguientes:
La longitud dendrítica, representada por el valor promedio de dendritas
(equivalente a 10 μm de distancia entre cada círculo que antecede al anterior),
cuantificando el número de dendritas que cruzan cada círculo, de tal forma que
se registró el número de intersecciones entre las dendritas identificadas contra
el número ordinal asignado a cada circulo.
71
La arborización dendrítica medida, contando el número total de ramificaciones
dendríticas en cada orden de de bifurcación comenzando desde el cuerpo
celular hacía las dendritas más distales.
Fig. 16. Esquema que muestra la plantilla de discos concéntricos para el análisis de Sholl.
Cada disco concéntrico esta calibrado para que el primer círculo corresponda a un radio
de 10 μm, el segundo a 20μm y sucesivamente todos representan 10 μm más.
5.9 Análisis estadístico
Los datos obtenidos en la prueba del Laberinto Acuático de Morris (latencia de
escape y el tiempo en encontrar la plataforma), así como los datos obtenidos del
análisis de la morfología neuronal, presentaron una distribución normal, por lo cual
se analizaron mediante una prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) de dos vías,
posteriormente se aplicó una prueba post-hoc de Tukey para realizar la
comparación entre grupos. Todo el análisis estadístico se realizó en el software
estadístico “Graphpad-Prism 6”.
72
VI. Resultados.
6.1. Laberinto acuático de Morris.
Una vez que las ratas macho de las cepas Sprague Dawley y Long Evans
cumplieron 18 meses de edad, y tras finalizar el periodo establecido del
tratamiento con cerebrolisina, se procedió a realizar la prueba para evaluar las
habilidades de aprendizaje y memoria en el Laberinto Acuático de Morris, descrita
ya en el apartado 5.5. Esta prueba que comprende una primera etapa de
adquisición que consta de 5 días de aprendizaje arrojó, que desde el día uno de
prueba las ratas de la cepa Long Evans mostraron un mejor desempeño para
encontrar la plataforma que las ratas de la cepa Wistar y Sprague Dawley. Así
mismo los animales de cada grupo tratados con cerebrolisina, reflejaron una
tendencia similar en la prueba cuando se cotejaron con sus respectivos controles
(ver Fig. 17).
En la fig. 17 se puede apreciar el tiempo de latencia (aprendizaje espacial) de los
animales en cada grupo para encontrar la plataforma. Desde el 1er día de prueba
de la etapa de adquisición de la memoria (aprendizaje), el grupo de animales de la
cepa Long Evans + Cerebrolisina, mostró el mejor desempeño cognitivo al
encontrar rápidamente la plataforma de escape en comparación al grupo Long
Evans - Control (****p<0.001).
De igual manera al hacer la comparación entre cepas desde el primer día de
prueba se observa claramente que el grupo Long Evans + Cerebrolisina mostró el
mejor desempeño para localizar la plataforma, cotejados con animales de la cepa
Sprague Dawley + Cerebrolisina y Wistar + Cerebrolisina (****p<0.001), aunque
cabe señalar que estos dos últimos grupos (Sprague Dawley + Cerebrolisina y
Wistar + Cerebrolisina) reducen también sus tiempos en para localizar la
plataforma, lo que se traduce en un aumento en el rendimiento cognitivo respecto
a sus grupos control.
Para el 2º día de aprendizaje espacial, el grupo de animales de la cepa Sprague-
Dawley + Cerebrolisina, mostró el mejor rendimiento al encontrar la plataforma, en
comparación a su grupo control (****p<0.001). Mientras que para el 3er. día de
prueba, el grupo de animales de la cepa Wistar + Cerebrolisina, mostró un mejor
73
rendimiento, al encontrar más rápidamente la plataforma (***p<0.001), a la par
cepa Sprague-Dawley, la cual mantuvo una mejora en su rendimiento cognitivo
(p< 0.01).
Hasta este punto, se ha llevado a cabo la mitad del periodo de tiempo de prueba
de adquisición de la memoria, y puede observarse una tendencia aún mayor en la
mejora del rendimiento del grupo Wistar + Cerebrolisina, con respecto a la cepa
Sprague Dawley + Cerebrolisina; mientras que nuevamente la cepa Long Evans
sigue demostrando tener un mejor desempeño con el transcurrir la prueba de
aprendizaje, respecto a los otros dos grupos experimentales, sin embargo
comienza a notarse que los grupos Long Evans + Cerebrolisina y Long Evans -
Control tienden a igualar su desempeño.
Para el 4to. día de prueba no se observan diferencias estadísticas significativas
entre los grupos, así como entre las cepas Sprague Dawley, Long Evans y Wistar.
Sin embargo es importante resaltar que el grupo Wistar muestra una tendencia de
igualar su desempeño, con respecto al grupo Sprague Dawley, mientras que el
grupo Long Evans, continua teniendo el mejor rendimiento en la prueba,
observándose en este grupo que Long Evans + Cerebrolisina continúa mostrando
un mejor rendimiento que el grupo Long Evans - Control.
Finalmente para el último y 5to día de la prueba de aprendizaje, el día 5, no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas, aunque continúa la
tendencia para el grupo Long Evans en mostrar el mejor rendimiento en la prueba,
que los grupos Wistar y Sprague Dawley; incluso el grupo Long Evans +
Cerebrolisina sigue mostrando tener un rendimiento mayor que el grupo Long
Evans - Control. En este punto de la prueba es notorio que el grupo Wistar +
Cerebrolisina mejoró aún más su desempeño en comparación al grupo Sprague –
Dawley tratado también con el fármaco.
74
A P R E N D I Z A J E E S P A C I A L : T I E M P O D E L A T E N C I A
E N E N C O N T R A R L A P L A T A F O R M A
1 2 3 4 5
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
D Í A S
TIE
MP
O D
E L
AT
EN
CIA
AL
ES
CA
PE
(s
)
W T R + C B L
S D + C T R L
S D - C B L
L E + C T R L
L E - C B L
W T R - C T R L
*
*
*
*
**
**
***
*
**
Fig. 17. Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de
latencia de escape (aprendizaje espacial) en la prueba del Laberinto Acuático de
Morris de las cepas Sprague – Dawley, Wistar y Long Evans. Se muestra el tiempo de
cada individuo para encontrar la plataforma de escape durante la fase de adquisición de
la memoria (aprendizaje), realizada en los primeros 5 días de la prueba. Se realizó una
prueba de ANOVA de dos vías con medidas repetidas y una prueba post-hoc de
Bonferroni para evaluar los tiempos de localización de la plataforma (p< 0.001).
A los 7 días posteriores del último ensayo de la etapa de aprendizaje espacial, se
evaluó nuevamente el rendimiento de los animales, con la particularidad de que
está vez se prescindió del uso de la plataforma en la piscina.
Está etapa consistía en cuantificar el tiempo en que el animal tardó en cruzar
completamente por el sitio donde se encontraba con anterioridad la plataforma de
escape, con el fin de observar si el animal recordaba su localización. Los
resultados de la prueba arrojaron que únicamente el grupo de animales de la cepa
Long Evans + Cerebrolisina fueron aquellos que recordaron exactamente la
ubicación de la plataforma, al mostrar los menores tiempos al primer cruce por el
cuadrante meta. (p<0.05) (ver fig. 18).
75
W- C
TR
L
W- C
BL
SD
- CT
RL
SD
- CB
L
LE
- CT
RL
LE
- CB
L
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
M E M O R I A : L A B E R I N T O A C U A T I C O D E M O R R I S
TIE
MP
O (
s)
T I E M P O D E L A T E N C I A A L P R I M E R C R U C E
*
Fig. 18. Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de
latencia de al primer cruce (Retención de la memoria) en la prueba del Laberinto
Acuático de Morris de las cepas Sprague – Dawley, Wistar y Long Evans. Se muestra
el tiempo de cada individuo al primer cruce en el cuadrante en dónde se localizaba la
plataforma de escape durante la fase de adquisición de aprendizaje espacial, realizada en
el día 12 de la prueba de aprendizaje y memoria espacial. Se realizó una prueba de
ANOVA de dos vías con medidas repetidas y una prueba post-hoc de Bonferroni para
evaluar los tiempos en la prueba de memoria ya sin plataforma de escape (p< 0.05).
Continuando con la prueba de memoria, se graficó el número de visitas hechas a
cada uno de los cuatro cuadrantes durante un lapso de 90 segundos, tiempo que
fue asignado desde la prueba de adquisición, así como también se graficó el
tiempo en que permaneció cada individuo de los tres grupos experimentales en
cada uno de los cuadrantes (recordando que para este estudio la plataforma
estuvo en el cuadrante II).
Para el número de vistitas por cuadrante no se obtuvieron diferencias
estadísticamente significativas con respecto al cuadrante II, (lugar donde se ubicó
la plataforma de escape) y con los cuadrantes I, IIl y IV (ver fig. 19).
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Fig. 19. Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el número de
visitas hechas por los animales de las cepas Wistar, Sprague-Dawley y Long Evans
a los cuatro cuadrantes (I, II, III y IV). Se muestra el número de visitas hecha por cada
uno de los animales de los grupos (Sprague-Dawley, Wistar y Long Evans) en cada uno
de los cuadrantes del laberinto acuático de Morris. Se realizó una prueba de ANOVA de
dos vías con medidas repetidas y una prueba post-hoc de Bonferroni para evaluar el
número de visitas por cuadrante de cada individuo (p< 0.05).
Posteriormente al analizar el tiempo de permanencia en cada uno de los
cuadrantes, tampoco se obtuvieron diferencias significativas tanto en los animales
del grupo control respecto a los tratados con cerebrolisina, puesto que se
esperaba que estos últimos mostraran los mayores tiempos de rendimiento en
cuadrante número ll (lugar donde se localizaba la plataforma de escape), sin
embargo se nota cierta tendencia entre los animales de la cepa Long Evans+
Cerebrolisina y Sprague- Dawley+ Cerebrolisina a nadar por lapsos de tiempos
77
largos en el cuadrante número II (plataforma de escape), por los que podríamos
asumir de que a pesar de no haber diferencia estadística significativa, los animales
de estás dos cepas demostraron un mejor desempeño en memorizar el lugar
dónde se hallaba la plataforma de escape (ver fig. 20).
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Fig. 20. Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre el tiempo de
permanencia en cada cuadrante de los animales de las cepas Wistar, Sprague-
Dawley y Long Evans. Se muestra el tiempo de permanencia de los animales de los
grupos (Sprague-Dawley, Wistar y Long Evans) en cada uno de los cuadrantes del
laberinto acuático de Morris. Se realizó una prueba de ANOVA de dos vías con medidas
repetidas y una prueba post-hoc de Bonferroni para evaluar los tiempos de permanencia
por cuadrante para cada individuo.
6.2. Morfología neuronal.
Al terminar la prueba del Laberinto Acuático de Morris para la memoria y el
aprendizaje, se procedió a sacrificar los animales y realizar la extracción de los
cerebros para su colocación en solución de Golgi Cox, para posteriormente llevar
a cabo el análisis de Sholl mediante el procedimiento descrito previamente en el
apartado 5.7. Se dibujaron un total de 920 neuronas para el análisis morfológico
neuronal y su respectivo número de espinas dendríticas de cada neurona de las
78
ratas de la cepa Wistar (n=10), Sprague Dawley (n=10) y Long Evans (n=10). Para
nuestro estudio las regiones morfológicas analizadas fueron: la corteza media
prefrontal (capa III y V) y el hipocampo dorsal CA1. Los parámetros evaluados
para la morfología neuronal comprenden: la arborización dendrítica, la longitud
dendrítica total, el número máximo de orden dendrítico y la densidad de espinas
dendríticas en 30 μm.
6.2.1 Corteza media prefrontal
Los resultados obtenidos para la morfología neuronal de la corteza prefrontal
media, capa III se muestran en la fig. 21, en donde se observa claramente un
aumento significativo en la arborización dendrítica (ver fig. 21A) en los grupos
tratados con cerebrolisina, respecto a los grupos controles. Tal aumento comienza
a notarse a partir de los 20μm de longitud dendrítica hasta aproximadamente los
150μm de longitud. Mientras que al hacer la comparación entre las cepas se
observa que la cepa Sprague Dawley + Cerebrolisina muestra el mayor aumento
en la arborización dendrítica a partir de los 30μm (****p<0.001) hasta los 180μm
(****p<0.001) de longitud dendrítica, mientras que la cepa Long Evans +
Cerebrolisina muestra que las dendritas de las neuronas a partir de los 40μm
(****p<0.001) hasta los 170μm (****p<0.001), continuando con la cepa Wistar quien
mostro un aumento en la arborización de las células a partir de los 60 μm hasta los
160 μm.
Con respecto al número de orden dendrítico (ver fig. 21B) se observa un aumento
en la longitud dendrítica en la cepa Long Evans + Cerebrolisina respecto a su
grupo control, en el número de orden dendrítico 2 (****p<0.001) y 3 (****p<0.001)
respectivamente, mientras que los animales de la cepa Sprague Dawley +
Cerebrolisina mostraron un aumento en el número de orden dendrítico 2
(****p<0.001) y 4 (****p<0.001) respectivamente.
En cuanto a la longitud dendrítica total (ver fig. 21C), únicamente se encontraron
diferencias significativas en la cepa Sprague Dawley + Cerebrolisina (**p<0.05)
respecto a su grupo control; sin embargo a pesar de que en las otras dos cepas
79
estudiadas no hay diferencias significativas, se observa claramente una tendencia
al aumento de la longitud dendrítica por efecto de la administración del fármaco, y
dónde nuevamente los animales de las cepas Long Evans y Sprague Dawley son
aquellos que muestran la mayor tendencia hacía el aumento de la longitud.
Finalmente en cuánto al parámetro de la densidad de espinas dendríticas (ver fig.
21D), se observa un aumento significativo el número de espinas en cada cepa
Sprague Dawley (****p<0.001), Long Evans (****p<0.001) y Wistar (****p<0.001),
de los animales tratados con cerebrolisina, en comparación a sus grupos control.
Así mismo al hacer la comparación de la densidad de espinas dendríticas entre
cada cepa se observa que las cepa Long Evans (****p<0.001) y Sprague Dawley
(p<0.001) emparejan en el número de espinas al ser tratadas con cerebrolisina,
además de presentar una densidad mayor que los individuos de la cepa Wistar.
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Morfología neuronal de la Corteza Prefrontal Media (CPFm) capa III
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Fig 21. Efecto de la administración crónica de cerebrolisina sobre la morfología
neuronal de la corteza prefrontal media (CPFm) en la capa III de las cepas Wistar,
Sprague Dawley y Long Evans. A) Arborización dendrítica. B) Número de orden dendrítico. C)
Longitud dendrítica total. D) Densidad de espinas dendríticas. Cada valor representa la media ±
EEM. Se realizó una ANOVA de dos vía con medidas repetidas y una prueba post-hoc de Bonferroni
para las variables arborización dendrítica, número de orden dendrítico, longitud dendrítica y
densidad de espinas dendríticas (WTR n= 10, SD n=10, LE n=10); (p<0.001).
A
D
C
B
81
Los resultados obtenidos en la capa V de la corteza media prefrontal (fig. 22)
muestran lo siguiente:
Respecto a la arborización dendrítica (ver fig. 22A) se puede observar al igual que
en la capa III una tendencia al aumento de la arborización dendrítica desde los
20μm hasta los 150μm aproximadamente, gracias a la administración crónica de
cerebrolisina en comparación a los grupos control de las tres cepas, sin embargo
al realizar la comparación entre las cepas únicamente se obtuvieron diferencias
significativas en la cepa Long Evans a partir de los 40 μm de longitud (*p<0.05).
En cuanto al número orden dendrítico (ver fig. 22B) se observa un claro aumento
en el número de ramificaciones dendríticas para el grupo Long Evans+
Cerebrolisina en contra de su respectivo grupo control para el número de orden
dendrítico 2 (****p<0.001), de igual manera el grupo Sprague Dawley +
Cerebrolisina se observa un aumento en el número de ramificaciones
pertenecientes al número de orden dendrítico 3 y 4 (***p<0.001).
Respecto a la longitud dendrítica total (ver fig. 22C) se obtuvieron diferencias
significativas únicamente en la cepa Long Evans tratada con cerebrolisina
cotejada también con su respectivo control. Sin embargo a pesar de en qué la
cepa Wistar no se obtuvo una diferencia estadística significativa, nuevamente se
observa una tendencia hacía el aumento de la longitud dendrítica total en los
animales tratados con el fármaco respecto a su grupo control.
Para la densidad de espinas dendríticas obtenida en esta región (ver fig. 22D) se
observa que la cepa Wistar + Cerebrolisina muestra un aumento en su densidad
de espinas dendríticas respecto a su control (****p<0.001), lo mismo se observa
con la cepa Sprague Dawley tratada + Cerebrolisina comparada con su control
(**p<0.05), y para la cepa Long Evans + Cerebrolisina comparada con su grupo
control (****p<0.001). Al realizar la comparación entre cepas, los resultados
indican que la cepa Long Evans y la cepa Wistar son las que presentan la mayor
densidad de espinas con respecto a la cepa Sprague Dawley (****p<0.01)
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Morfología neuronal de la Corteza Prefrontal Media (CPFm) capa V
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Fig. 22. Efecto de la administración crónica de la CBL sobre la morfología
neuronal de la corteza media prefrontal (CPFm) capa V de las cepas Wistar,
Sprague Dawley y Long Evans. A) Arborización dendrítica. B) Número de orden
dendrítico. C) Longitud dendrítica total D) Densidad de espinas dendríticas. Cada
valor representa la media ± EEM. Se realizó una ANOVA de dos vía con medidas
repetidas y una prueba post-hoc Bonferroni para las variables arborización dendrítica,
número de orden dendrítico, longitud dendrítica y la densidad de espinas dendríticas
(WTR n= 10, SD n=10, LE n=10); (p<0.001).
A
B
C
D
83
6.2.2 Hipocampo dorsal región CA1.
Los resultados obtenidos respecto a la región CA1 de hipocampo dorsal (fig. 23)
muestran un aumento en la arborización dendrítica debido al tratamiento crónico
con cerebrolisina (ver fig. 23A) en los individuos de la cepa Wistar, a partir de los
140μm hasta los 170 μm de longitud dendrítica (*p<0.05).
Respecto al número de orden dendrítico en el hipocampo dorsal CA1 (ver fig.
23B), se encontró una diferencia significativa, para las dendritas pertenecientes al
4° orden, en la cepa Long Evans + Cerebrolisna respecto a su grupo control
(*p<0.05), cabe mencionar que a pesar no mostrar una diferencia estadística
significativa, los animales de la cepa Sprague-Dawley tratados con cerebrolisina
mostraron una tendencia al aumento en las ramificaciones dendríticas de 4to.
orden dendrítico al compararlas con su grupo control en las ramificaciones
dendríticas de en la región CA1 del hipocampo.
Concerniente a la longitud dendrítica total (ver fig. 23C), tampoco se obtuvieron
diferencias significativas para las tres cepas. Y en cuanto al parámetro de la
densidad de espinas (ver fig. 23D) en el hipocampo dorsal CA1, la cepa Long
Evans + Cerebrolisina fue la única que mostró un aumento significativo en el
número de espinas dendríticas en comparación a su grupo control (**p<0.05); no
así para las cepas Wistar y Sprague Dawley, ya que no se observa diferencia
significativa alguna, sin embargo se observa un aumento en la densidad de
espinas por efecto del fármaco.
84
Morfología neuronal del Hipocampo Dorsal (CA1).
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Fig 23. Efecto de la administración crónica de la CBL sobre la morfología
neuronal de la región CA1 del hipocampo dorsal. A) Arborización Dendrítica B)
Número de orden dendrítico. C) Longitud dendrítica total D) Densidad de espinas
dendríticas. Cada valor representa la media ± EEM. Se realizó una ANOVA de dos vía
con medidas repetidas y una prueba post-hoc Bonferroni para las variables de
arborización dendrítica, orden dendrítico, longitud dendrítica y densidad de espinas
dendríticas (WTR n= 10, SD n=10, LE n=10); (p<0.05).
A
C
B
D
85
VII. Discusión.
El presente trabajo tuvo como objetivo principal, evaluar el efecto del fármaco
cerebrolisina sobre los cambios morfológicos neuronales y conductuales que
ocurren durante el proceso de envejecimiento normal, comparando dicho efecto
en tres diferentes cepas de rata: La Wistar, la rata albina más comúnmente
utilizada en laboratorio; la Long Evans se caracteriza por ser una rata pigmentada
obtenida del cruce con una rata silvestre, y la Sprague Dawley cuya característica
distintiva es su docilidad lo que permite su fácil manejo como modelo
experimental en líneas de investigación conductual.
En este estudio se buscó emplear un modelo biológico modelo biológico más
completo con características distintivas comunes con las del envejecimiento en los
seres humanos, por este motivo, se propuso realizar la comparación tanto a nivel
conductual en el desempeño de una tarea cognitiva, como a nivel de la morfología
neuronal entre las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans en etapa de
envejecimiento, con el fin de ampliar el panorama y la comprensión acerca de
cómo las alteraciones que se presentan durante esta etapa en el sistema nervioso
central comprometen las funciones corporales del individuo.
El uso de roedores como modelo animal para el estudio de aspectos relacionados
con la edad posee innumerables ventajas; por ejemplo, su tiempo de vida (dos y
tres años) lo que permite evaluar los probables efectos terapéuticos y profilácticos
de la intervención farmacológica en el proceso de envejecimiento en periodos
relativamente cortos.
Además en particular el uso de ratas de laboratorio pueden ser empleadas como
un modelo fiable para evaluar los cambios cognitivos que ocurren en el sistema
nervioso central y que de alguna manera, son muy similares a las alteraciones
propias de los seres humanos envejecidos; por ejemplo numerosos trabajos de
investigación han puesto de manifiesto que el empleo de la rata de laboratorio
para el estudio de la enfermedad de Alzheimer es adecuado ya que al igual que el
ratón de laboratorio, estos animales se encuentran altamente emparentados
genéticamente con los seres humanos, y poseen una pantalla de comportamiento
predecible y multifacético (Mitchell y cols., 2015). Gallagher y cols., (2011),
86
mencionan que existen diferencias en los procesos de memoria y aprendizaje
entre las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans durante la etapa de
envejecimiento, reforzando aún más el hecho de que estas diferencias
conductuales pueden ser explicadas por contrastes entre ellas a nivel neuronal.
El estudio comparativo entre las tres cepas de rata de laboratorio empleadas,
permitió contrastar el impacto de los factores genéticos sobre el efecto de la
administración de cerebrolisina como un posible agente protector y restaurador de
daño neuronal asociado al envejecimiento. Entre algunos de los posibles factores
involucrados en el efecto diferencial de la administración de cerebrolisina,
observado entre las cepas, se puede destacar la sensibilidad farmacológica; Mills
y colaboradores, (2001), plantean que hay una sensibilidad diferencial
farmacológica importante entre las cepas Long Evans y Sprague Dawley. Este
hecho nos permite hacer hincapié en la importancia de considerar los rasgos
genotípicos y fenotípicos del modelo de estudio en investigaciones que involucran
el empleo de fármacos; ya que esto permite extrapolaciones sobre los posibles
efectos positivos o negativos en otros organismos o incluso en humanos, lo que
facilitaría aún más el estudio de numerosas problemáticas biológicas, incluyendo
los estudios en torno al envejecimiento,
El empleo de cerebrolisina como un compuesto capaz de promover una respuesta
de protección y reparación del daño neuronal está fundamentado en diversos
estudios; Plosker y colaboradores., (2009) mencionan que este fármaco es una
preparación de péptidos derivados de cerebros porcinos, exhibe propiedades
farmacodinámicas similares a las de los factores neurotróficos endógenos del
organismo. Por su parte, Chen y colaboradores, (2007) describen que presenta
una similitud con diversas moléculas como las encargadas de promover el
crecimiento celular como CNTF (ciliary neurotrophic factor), GDNF (Glial cell line-
derived neurotrophic factor), IGF-1, e IGF-2 (insulin-like growth factor-1-2);
participando así en procesos de supervivencia neuronal, neuroprotección,
neuroplasticidad y neurogénesis. Todo lo anterior sitúa a la cerebrolisina como una
alternativa terapéutica accesible no invasiva ya que posee los mecanismos
pleiotrópicos que caracterizan a los factores neurotróficos endógenos, resaltando
87
su capacidad potencial para ejercer efectos positivos sobre patologías
relacionadas con proteína tau y la Neuroinflamación; además, es capaz de
disminuir el estrés oxidativo y la excitotoxicidad por una parte, y de potenciar la
neurotransmisión, la neuroplasticidad y la neurogénesis, mostrando incluso en
algunos modelos mejorías considerables en la cognición (Plosker Gauthier y
Gauthier, 2009).
En una primera parte de nuestro estudio se evaluó el efecto del fármaco sobre la
conducta y la cognición (memoria y aprendizaje), esto mediante la administración
crónica de cerebrolisina para cada uno de los individuos de nuestros grupos
experimentales de las cepas Sprague Dawley Wistar y Long Evans en la prueba
del Laberinto Acuático de Morris. Esta prueba se emplea comúnmente para el
estudio de los procesos de aprendizaje y memoria espacial en roedores (Morris,
1984) relacionados con la capacidad de adquirir y retener asociaciones de las
características del entorno al que son expuestos, permitiéndoles desenvolverse en
el espacio mediante la codificación, almacenaje y recuperación de información
acerca de rutas, configuraciones y localizaciones espaciales (Kessels y cols.
2001). Desde hace poco más de una década son varios los grupos que se han
dado a la tarea de investigar los déficits en la memoria y el aprendizaje espacial en
los roedores mediante el uso de la técnica del Laberinto Acuático de Morris, por
ejemplo Norris y Foster, (1999); Rasmussen y colaboradores, (1996); y Lindner,
(1997); muestran que la afección de las habilidades cognitivas espaciales de los
roedores en etapa de envejecimiento se correlaciona con un déficit en el
rendimiento en la prueba de memoria del Laberinto Acuático de Morris.
Los resultados de nuestro estudio en la prueba para evaluar la memoria y el
aprendizaje espacial indican que el tratamiento con cerebrolisina las tres cepas de
rata empleadas (Wistar, Sprague Dawley y Long Evans) muestran una reducción
significativa en el tiempo en encontrar la plataforma del día 1 al día 5, que es la
fase de adquisición de la memoria o aprendizaje. Posteriormente y de manera
gradual se observó una tendencia en reducir los tiempos de latencia de escape
para la ubicación de la plataforma en aquellos animales administrados con el
fármaco, en comparación a sus respectivos animales control, esto concuerda con
88
lo propuesto por Valousková y Gschanes (1999). Vorhees y Williams, 2006;
Drapeau y colaboradores, (2003); y por Rapp y colaboradores., (2002) quienes
aseguran que gracias a la administración del fármaco se atenúa el déficit de
adquisición de la memoria espacial y en consecuencia propicia el aumento de la
actividad motora de ratas seniles en el laberinto acuático de Morris.
En este trabajo se observaron también algunas diferencias respecto a cómo cada
cepa ejecuta la prueba de memoria y aprendizaje, y al respecto hay estudios que
han puesto en evidencia este punto. Lindner y colaboradores, (1997) demostraron
que ratas de la cepa Long Evans de más de 28 meses de edad muestran un mejor
rendimiento en la prueba del Laberinto Acuático de Morris en la fase de
adquisición de la memoria en comparación a la cepa albina Sprague Dawley,
dicho rendimiento puede ser explicado por el hecho de que la cepa Sprague
Dawley tiene menores expectativas en su tiempo de vida que la cepa Long Evans,
asumiendo con ello que la cepa Sprague Dawley muestra un mayor declive en las
funciones de mapeo espacial según la edad, y por ende se consideraría que la
cepa Long Evans es más resistente a los déficits conductuales relacionados con el
proceso de senescencia.
Grauer y Kapon., (1993) compararon el rendimiento cognitivo en la prueba del
Laberinto Acuático de Morris de la cepa Wistar y la cepa Sprague Dawley, y
encontraron que la cepa Wistar no es capaz de mejorar sustancialmente su
desempeño en la prueba; estos hallazgos están en línea con nuestro trabajo en el
que, la cepa Wistar mostro ser más lenta en su velocidad de nado, probablemente
debido a su mayor tendencia a flotar y por su reactividad al estrés, resultado de las
alteraciones en la actividad colinérgica del hipocampo, lo que se ha asociado a
menudo con los déficits en los procesos de memoria en la prueba del Laberinto
Acuático de Morris (Grauer y Kapon, 1993), reduciendo así su velocidad al
momento de localizar la plataforma en comparación con las ratas Sprague Dawley.
En otro estudio McQuail y Nicolle, (2015) en que se realizó una comparación del
rendimiento entre cepas albinas como Fischer-344 y Sprague Dawley de entre 6 y
24 meses, contra cepas pigmentadas de la misma edad se discute que el
89
rendimiento en la prueba del Laberinto Acuático de Morris es directamente
proporcional a la información visual, más que la información que se pueda adquirir
con otros sentidos, ya que las cepas pigmentarias adquieren rápidamente la
habilidad de discriminación espacial en comparación con la cepas albinas, quienes
además presentan un mayor deterioro en la memoria espacial; es por ello que
cepas pigmentarias tienden a mostrar una mejor ejecución en la prueba debido a
su mejor habilidad visual comparada con otras cepas (Abadi y cols., 1990). Esté
mismo hecho fue corroborado por Harker y colaboradores., (2002) y Prusky y
colaboradores, (2002), quienes demuestran que el rendimiento de las cepas
pigmentadas incluida la cepa Long Evans en la prueba es superior a la de otras
ratas de uso común en el laboratorio tales cómo las cepas albinas Wistar o la cepa
Sprague Dawley, debido a que estás últimas por el hecho de presentar albinismo
poseen una menor agudeza visual que las cepas pigmentadas, y en consecuencia
una menor capacidad asociativa que mejore su rendimiento visual-cognitivo. Los
puntos anteriormente expuestos, nos permiten explicar los resultados obtenidos en
este trabajo para la cepa Long Evans. Además nos permiten resaltar que los
efectos de la domesticación y las diferencias en la función visual deben
compaginarse con la selección del modelo de rata a utilizar cuando se requiera
evaluar tareas de comportamiento que involucren la visión; así mismo, que estos
factores deben tomarse muy en cuenta durante la interpretación de los resultados
en estudios que empleen cepas albinas.
Por otro lado durante la segunda fase de la prueba del Laberinto Acuático de
Morris, en la que se puede evaluar para la consolidación de la memoria, se
encontraron diferencias significativas en la cepa , Long Evans lo que podría
correlacionarse con el cambio en la densidad de espinas, explicando así la
consolidación de la memoria y el aprendizaje asociada directamente con la
plasticidad neuronal, sin embargo en la cepa Sprague Dawley no se observaron
cambios significativos en el número de espinas y solo un pequeño cambio en
número de orden, lo que indica que probablemente otros mecanismos estén
participando en el cambio en el aprendizaje y uno de ellos es la neurogénesis ya
que de acuerdo con Drapeau y cols, (2003) este proceso celular está directamente
90
relacionado con el desempeño en la prueba del Laberinto Acuático de Morris ya
que un número elevado de neuronas granulares es necesario para el correcto
desempeño de las tareas de memoria espacial. Además se ha demostrado que la
cerebrolisina es capaz de promover la neurogénesis (Álvarez y Fuentes, 2011).
Este hecho explicaría la mejoría en el aprendizaje de nuestras cepas por
cerebrolisina, sin embargo para el caso de la memoria es posible que se requiera
de la integridad completa de la región CA1 por lo que al no observarse cambios en
morfología de las neuronas hipocampales CA1 (ver resultados), no se observan
cambios en los procesos de evocación de la memoria. De igual manera Dobrossy
y cols., (2003) mencionan que este déficit en la consolidación de la memoria
podría deberse también a que la prueba de memoria per se, no induce un cambio
neto en la proliferación celular en el hipocampo ya que aunque, aumenta durante
la fase inicial del proceso de aprendizaje, posteriormente las células recién
formadas mueren durante la fase tardía del proceso de memoria.
Al término de la prueba conductual proseguimos a evaluar los efectos del fármaco
cerebrolisina sobre la morfología neuronal. En esta parte del trabajo es de suma
importancia mencionar que hasta el momento no existen estudios previos en los
que se haya realizado antes la comparación neuro-morfológica entre las cepas de
rata Wistar, Long Evans y Sprague Dawley en etapa de envejecimiento, por lo que
uno de los aportes de este trabajo consiste en enfatizar las diferencias
morfológicas neuronales en áreas particulares del cerebro implicadas en procesos
cognitivos entre distintas cepas de rata.
Dickstein y colaboradores, (2007) reportaron que los cambios estructurales
neuronales producto de la adaptación ambiental son los responsables del proceso
de envejecimiento neuronal y entre ellos destacan la reducción en la arborización
dendrítica, la longitud dendrítica y el número de espinas dendríticas; ya que son
estás últimas los sitios donde residen la mayoría de las sinapsis excitatorias, y por
ende ocurre una disminución de la frecuencia de respuestas excitatorias mediadas
por receptores glutamatérgicos y una reducción en la expresión de los receptores
NMDA en áreas implicadas en los procesos de memoria y aprendizaje durante la
etapa senil.
91
Una de las áreas cerebrales que participa en la consolidación de estos procesos
es la corteza prefrontal media. La importancia del análisis de la corteza prefrontal
durante el envejecimiento radica en que esta zona regula las funciones ejecutivas
que involucran los mecanismos de control o planificación que median y el
comportamiento dirigido a un objetivo guía (Bizon y cols. 2012).
Nuestros resultados de la morfología neuronal demuestran que la arborización, la
longitud dendrítica, y la densidad de espinas dendríticas entre las cepas Sprague
Dawley y Long Evans en áreas corticales difiere completamente, puesto que en la
capa III y V de la corteza prefrontal se observa un aumento en la arborización
dendrítica en los animales administrados con cerebrolisina respecto a los
animales que no fueron tratados con el fármaco. Esto concuerda con lo expuesto
por Grill y Riddle, (2002) quienes demostraron que en la capa III de la corteza
prefrontal de ratas de la cepa Long Evans, disminuye la longitud dendrítica durante
el envejecimiento, siendo particularmente vulnerable la arborización dendrítica
basal, además mencionan que en la capa III no hay un cambio aparente respecto
al número de ramificaciones dendríticas de cualquier orden; sin embargo nuestros
resultados demuestran que esto cambia al administrar un fármaco promotor del
crecimiento neuronal, ya que aumentan las ramificaciones dendríticas de 2do y 3er
orden es decir aquellas más cercanas al soma neuronal, en la cepa Long Evans, y
por la tanto se observa un aumento en la superficie celular.
Así mismo, estos investigadores examinaron también la morfología en la capa V
de la corteza prefrontal, y mencionan que no hay diferencia alguna entre la
longitud dendrítica y la arborización basal debida al envejecimiento; sin embargo
en nuestro estudio se puede apreciar que el tratamiento con cerebrolisina en la
cepa Long Evans muestra lo contrario, induce un aumento significativo en la
arborización dendrítica, únicamente a partir de los 40 μm y con una tendencia
hacía el aumento compensatorio hasta los 150 μm, lo cual se ve reflejado
directamente sobre la longitud dendrítica total de las neuronas de la cepa Long
Evans + Cerebrolisina.
Una de las probables causas por la que no se observe una diferencia significativa
continua sobre el aumento de la arborización en la capa V según estos autores,
92
podría deberse a que el crecimiento de algunos segmentos dendríticos podrían
compensar la pérdida o reducción de otros segmentos dentro de la arborización
dendrítica basal.
Lo que demuestra que si bien puede haber pérdida permanente y la sustitución de
las ramificaciones dentro de los árboles dendríticos de neuronas piramidales
profundas, la administración de cerebrolisina es capaz de estimular el crecimiento
de nuevos segmentos dendríticos y así promover nuevamente los mecanismos de
plasticidad cerebral.
Como se mencionó anteriormente son muy pocos los estudios que han evaluado
en el efecto de la cerebrolisina sobre la morfología neuronal bajo condiciones de
envejecimiento, entre ellos se encuentra el realizado por Alcántara y
colaboradores., (2012), estos autores reportaron que en el caso de ratones
seniles, la administración de cerebrolisina produce tanto aumento en la
arborización debido a la administración de cerebrolisina, en el número de
ramificaciones dendríticas a partir del 3er orden como en la densidad de espinas
en la capa III de la corteza prefrontal media y únicamente un aumento en la
longitud dendrítica total de la corteza prefrontal media capa V; estos hallazgos son
similares a lo reportado en nuestro trabajo. Sin embargo en nuestro estudio en
nuestro estudio encontramos además diferencias particularmente en el número de
espinas dendríticas y el número de orden dendrítico en la capa V de la corteza
prefrontal media de las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans tratadas con
el fármaco, mientras que Vázquez-Roque y colaboradores., (2011) reportan un
aumento en las ramificaciones dendríticas de 3er y 4to orden en la capa III de la
corteza prefrontal media de ratas Sprague-Dawley tratadas con cerebrolisina.
En lo que respecta a la región CA1 del hipocampo dorsal, el estudio de Alcántara-
González y colaboradores, (2012) no reporta diferencias significativas respecto a
los parámetros morfológicos neuronales de la longitud y arborización dendrítica, o
en la densidad de espinas dendríticas de ratones seniles tratados con el fármaco.
A este respecto nuestro estudio difiere completamente, ya que podemos observar
que el grupo de animales de la cepa Wistar aumenta su ramificación dendrítica a
partir de los 140-170μm, así como el aumento en la densidad de espinas y en el
93
número de ramificaciones dendríticas de 4to orden, en la cepa Long Evans. Esto
podría explicarse también por la contribución de la neurogénesis, ya que las
neuronas recién formadas (jóvenes) durante la adultez para la consolidación de la
memoria, es mucho mayor en ratas que en ratones, ya que la maduración de las
células granulares es más rápida que en ratones (Snyder y cols. 2009). Esto pone
de manifiesto las diferencias sustanciales en la plasticidad neuronal y la función
entre estas dos especies de roedores comúnmente estudiadas.
Por otro lado la ausencia de cambios en la longitud dendrítica total de las
neuronas en el hipocampo de todos los grupos de estudio incluidos en este
trabajo, puede estar relacionada con lo reportado por Pyapali y Turner, (1996) en
ratas seniles albinas (Wistar, Fischer-344, Sprague Dawley) donde se describe
que durante el envejecimiento normal, hay un alargamiento y aumento en la
complejidad de las neuronas CA1 del hipocampo, ellos plantean que esto podría
representar una respuesta intrínseca al envejecimiento o ser una respuesta de
denervación parcial reactiva a una pérdida de entradas aferentes. Por su parte,
Hanks y Flood, (1991) en un estudio realizado en pacientes humanos
senescentes sanos y pacientes con enfermedad de Alzheimer, corroboran está
hipótesis al mencionar que la arborización dendrítica basal y apical en neuronas
CA1 del hipocampo no sufre alteraciones durante el envejecimiento normal, pero
sí en pacientes con la enfermedad.
En lo que respecta a la densidad de espinas dendríticas en esta región, son
consistentes los estudios que afirman que el envejecimiento conlleva una pérdida
significativa de espinas dendríticas en el hipocampo CA1, lo cual se correlaciona
directamente con los déficits en los procesos de aprendizaje y memoria espacial
tanto de ratas como de ratones en etapa senil.
A este respecto, von Bohlen und Halbach y colaboradores, (2006) reportaron una
disminución en la densidad de espinas de las dendritas basales de ratones de 9
meses de edad; Nunzi y colaboradores, (1987) por su parte, mencionan que las
ratas Sprague Dawley sufren una reducción mayor en la densidad de espinas
dendríticas en la arborización basal, respecto a la arborización apical en neuronas
CA1 del hipocampo, mientras que Sametsky y colaboradores, (2010), reportan que
94
las ratas de las cepas pigmentadas sufren una pérdida considerable de espinas
dendríticas en la región CA1 y CA3 del hipocampo. Es por todo esto que es
importante destacar los efectos de la cerebrolisina sobre los mecanismos de
plasticidad neuronal, ya que consigue aumentar la densidad de espinas en las tres
cepas de estudiadas en esté trabajo.
Como se planteó en los antecedentes de este trabajo las propiedades
multidinámicas de la cerebrolisina facilitan la viabilidad neuronal gracias a la
interferencia de muchos procesos como la exicito-toxicidad glutamatérgica, la
formación de radicales libres y las respuestas inflamatorias (Eder 2001; Gutmann
2002); además, el fármaco actúa de tal manera que minimiza los efectos del factor
de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF), puesto que se ha demostrado que durante el envejecimiento ambos
provocan alteraciones que impiden el crecimiento de las dendritas (Ubhi y cols.,
2013; Onose y cols., 2009). Además la cerebrolisina activa la vía de señalización
de PI3K/Akt que esta involucrada en la supervivencia neuronal, el aumento de las
ramificaciones dendríticas el control de la forma del árbol dendrítico (Zhang y cols,
2010; Swiech y cols., 2011).
Adicionalmente el fármaco provoca indirectamente un aumento del factor
neurotrófico ciliar (CNTF), del factor neurotrófico derivado de células gliales
(GDNF), y el factor de crecimiento insulínico tipo 1-2 (IGF 1-2) (Chen y cols.,
2007), desacelerando así el proceso neurodegenerativo y provocando un aumento
en la densidad de receptores glutamatérgicos en el hipocampo resultando en una
mejoría directa y progresiva de los procesos de memoria y aprendizaje espacial de
ratas senescentes (Eder y cols., 2001).
Con todo lo anterior suponemos que el efecto de cerebrolisina en roedores
envejecidos de 8 meses de edad, sobre la morfología neuronal se refleja
directamente sobre la plasticidad cerebral hipocampal y cortical, siendo en la capa
III de la corteza prefrontal en dónde se ve el mayor efecto del fármaco, debido a
que las proyecciones neuronales del hipocampo al conectar directamente con las
capas más superficiales de la corteza prefrontal (como la capa III) y a sus
propiedades de está inervación monoaminérgica ascendente provocando
95
plasticidad sináptica a largo plazo (noradrenérgicos, dopaminérgicos,
serotoninérgicos) y los sistemas colinérgicos (Nakamura y cols., 2010; Dégenètais
y cols., 2002).
Concluyendo, con todo lo expuesto hasta el momento, nos es posible corroborar el
papel de la cerebrolisina como un fármaco involucrado en la neuroprotección, la,
gracias a su acción al atenuar los proceso de neurodegeneración neuronal y
estimular la neuroplasticidad, al ser capaz de aminorar la atrofia dendrítica
ocasionada por el proceso de envejecimiento en la corteza prefrontal media y el
hipocampo, dos áreas cerebrales que forman parte del circuito que participa en la
formación de la memoria y el aprendizaje.
VIII. Conclusiones
1) La administración crónica de la cerebrolisina a dosis de 0.02 ml/Kg mejora la
memoria espacial en el modelo de envejecimiento de las cepa Long Evans en
la prueba del laberinto acuático de Morris.
2) La administración crónica de cerebrolisina a dosis de 0. 02 ml/Kg incrementa la
arborización y la longitud dendrítica y la en las neuronas piramidales de la
corteza prefrontal media capa III así como el aumento en la densidad de
espinas dendríticas en las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans.
3) La administración crónica de cerebrolisina a dosis de 0.02 ml/Kg incrementa la
arborización dendrítica; no así la longitud de las neuronas piramidales de la
capa V de la corteza prefrontal media en las cepas Sprague Dawley y Long
Evans, así como el aumento en la densidad de espinas en la cepa Long Evans.
4) La administración crónica de la cerebrolisina a dosis de 0.02 ml/Kg incrementa
la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la región CA1 de
hipocampo dorsal en la cepa Wistar, mientras que provoca un aumento en la
densidad de espinas únicamente en la cepa Long Evans.
5) Independientemente del tratamiento existen diferencias tanto conductuales
como morfológicas en las cepas Wistar, Sprague Dawley y Long Evans.
96
IX. Perspectivas
En el presente trabajo se han expuesto las ventajas y beneficios del fármaco
cerebrolisina, sobre algunas alteraciones neuromorfológicas y conductuales
durante el envejecimiento.
Sin embargo el alcance de nuestro trabajo a futuro es aún mayor puesto que se
proponen realizar numerosos estudios que evalúen:
Efectos del fármaco a nivel neuromolecular: Acción sobre péptidos y
neurotransmisores durante la etapa senil.
Uso de marcadores moleculares que permitan profundizar aún más
sobre el efecto a niveles de receptores de membrana neuronal
(inhibidores o excitadores).
Uso de electroencefalografía para evaluar la actividad cerebral al
administrar el fármaco.
Tipificación de espinas dendríticas, para puntualizar a que nivel de
sinapsis axo-expinosa actúa la cerebrolisina y su relación con los
procesos de aprendizaje y memoria en los adultos mayores.
Métodos estereológicos para la cuantificación de parámetros
morfométricos cerebrales en estudios de neuroimagen en pacientes
seniles con uso de cerebrolisina.
97
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