UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE E
ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DERIVADOS DE COLINA DE
ÁCIDOS CAFEICO, CINÂMICO E ROSMARÍNICO.
METABOLISMO IN VITRO DESTES COMPOSTOS.
Susana Isabel Pólvora Santos
Mestrado Em Bioquímica (Área De Especialização: Bioquímica Médica)
2009
Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante por derivados de Colina de Ácidos
Cafeico, Cinâmico e Rosmarínico. Metabolismo in vitro destes compostos.
ii
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE E
ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DERIVADOS DE COLINA DE
ÁCIDOS CAFEICO, CINÂMICO E ROSMARÍNICO.
METABOLISMO IN VITRO DESTES COMPOSTOS.
Susana Isabel Pólvora Santos
Mestrado Em Bioquímica (Área De Especialização: Bioquímica Médica)
Dissertação orientada pela Prof. Doutora Maria Luísa Serralheiro
2009
Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante por derivados de Colina de Ácidos
Cafeico, Cinâmico e Rosmarínico. Metabolismo in vitro destes compostos.
iii
Agradecimentos
Agradeço à Professora Doutora Luísa Serralheiro pela orientação, compreensão e apoio em
todos os momentos.
À Professora Doutora Amélia Seabra e Sérgio, do Centro de Química Estrutural do Instituto
Superior Técnico, pela ajuda na técnica de NMR e na ajuda da síntese do composto. À Doutora
Catarina Madeira do Instituto Superior Técnico pelo apoio na formulação da elaboração dos
lipossomas.
Aos membros do Centro de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de
Lisboa, pela amizade, colaboração e apoio. Em especial ao Doutor Rodrigo Almeida e seus
estagiários, Joaquim e André, pela ajuda imprescindível na elaboração dos lipossomas e ao
Professor Doutorado Manuel Matos Lopes pela ajuda na determinação dos tamanhos destes.
Ao Mestre Pedro Falé por toda a ajuda, como na técnica de HPLC, no manuseamento das
células Caco-2 e entre outros, mas acima de tudo pela compreensão e disponibilidade, sem os
quais seria difícil a concretização deste projecto.
À Inês, Rita e Sara, as melhores colegas de laboratório, sempre prestáveis e divertidas,
tornando o trabalho laboratorial alegre e motivante, mesmo nos momentos difíceis.
À minha família, ao Daniel e aos meus amigos por todo o apoio, motivação, confiança e
principalmente por acreditarem em mim.
A todos os que, de vários modos, me ajudaram no decorrer deste trabalho, os meus sinceros
agradecimentos.
Resumo
iv
Resumo
A doença de Alzheimer (AD) é considerada a forma mais comum de demência na população
idosa. O cérebro de um doente de AD é caracterizado por uma deficiência na
neurotransmissão colinérgica central, principalmente pela diminuição de acetilcolina. Um dos
tratamentos para esta doença é a utilização de inibidores de acetilcolinesterase, enzima
responsável pela degradação da acetilcolina. Por outro lado, a inflamação e o stress oxidativo
são algumas das causas desta doença, pelo que pensa-se que a acção de antioxidantes poderá
contribuir também para o seu tratamento.
Neste trabalho estudou-se a actividade inibidora de acetilcolinesterase e a actividade
antioxidante de compostos fenólicos, devido às suas propriedades antioxidantes, e respectivos
ésteres de colina sintetizados, com o intuito de encontrar compostos mais eficazes.
De todos os compostos fenólicos estudados (ácidos cafeico, cinâmico, rosmarínico, 3,4-
dimetoxicinâmico e trolox), o ácido rosmarínico apresentou maior actividade antioxidante,
EC50 = 6,38 µM, e melhor capacidade de inibir o enzima, IC50 = 1,2 mM. Contudo, observou-se
que a introdução do grupo colina, aumentou o poder de inibição do enzima, obtendo-se IC50
mais baixos. Assim, de todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina exibiu
melhor capacidade de inibir o enzima, IC50 = 7,3 µM.
O estudo do metabolismo pelo tracto digestivo evidenciou que, à excepção do trolox, nenhum
composto é degradado no suco gástrico. No suco pancreático, ao contrário dos ácidos, os
ésteres de colina são degradados, sendo o 3,4-dimetoxicinamato de colina o que apresenta
uma biodisponibilidade maior. Dadas as propriedades apresentadas do 3,4-dimetoxicinamato
de colina, estudou-se o metabolismo deste em células Caco-2, juntamente com o
correspondente ácido. Por fim, foram realizados estudos preliminares para permeação do 3,4-
dimetoxicinamato de colina pela barreira intestinal, usando lipossomas para encapsular o
ácido cafeico como modelo inicial.
Palavras-chave: Doença de Alzheimer, inibidores da AChE, actividade antioxidante, compostos
fenólicos, biodisponibilidade.
Abstract
v
Abstract
Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in the elderly. The brain of a
patient with AD is characterized by a deficiency in cholinergic neurotransmission, caused by
the decrease of acetylcholine. One of the treatments for this disease consists of using
acetylcholinesterase inhibitors, an enzyme responsible for the degradation of acetylcholine.
Furthermore, it is known that, due to inflammation and oxidative stress, the action of
antioxidants may help in treating the disease.
In order to find more effective compounds, this work focused on the activity of
acetylcholinesterase inhibitory and antioxidant activity of phenolic compounds (mostly due to
its antioxidant properties), as well as synthesized esters of choline.
Of all the studied phenolic compounds (caffeic, cinnamic, rosmarinic, 3.4-dimethoxycinnamic
acid and Trolox), the rosmarinic acid showed higher antioxidant activity, EC50 = 6,38 μM, and a
better ability to inhibit the enzyme, IC50 = 1,2 mM. However, it was observed that the
introduction of the choline moiety increased the power of the enzyme’s inhibition, resulting in
a reduction of IC50. Thus, from all the compounds studied, it was the 3,4-
dimethoxycinnamoylcholine which exhibited a better ability to inhibit the enzyme, IC50 = 7,3
μM.
A metabolism study using the digestive tract has shown that, except for Trolox, no other
compound is degraded in the gastric juice. In the pancreatic juice, and contrary to what
happens to acids, choline esters are degraded, which also makes 3,4-
dimethoxycinnamoylcholine the most bioavailable of these. Duo to the properties found in
3,4-dimethoxycinnamoylcholine, it was further studied the metabolism of cells Caco-2,
together with its corresponding acid. Finally, preliminary studies have been performed for the
permeation of 3,4-dimethoxycinnamoylcholine through the intestinal barrier, using liposomes
to encapsulate the caffeic acid as initial model.
Keywords: Alzheimer’s disease, inhibitors of AChE, antioxidant activity, phenolics compounds,
bioavailability.
Índice
vi
Índice
Agradecimentos ........................................................................................................................... iii
Resumo ..........................................................................................................................................iv
Abstract ......................................................................................................................................... v
Índice .............................................................................................................................................vi
Lista de Abreviaturas e Siglas ...................................................................................................... viii
Capítulo I – Introdução e Objectivos ............................................................................................. 1
1. Doença de Alzheimer ........................................................................................................ 2
1.1. Sintomas e Factores de Risco .................................................................................... 2
1.2. Fisiopatologia ............................................................................................................ 3
1.2.1. Proteína β-amilóide e Proteína tau ................................................................... 3
1.3. Inflamação, Stress Oxidativo e Antioxidantes ........................................................... 6
1.4. Neuroquímica ............................................................................................................ 7
1.4.1. Acetilcolina ........................................................................................................ 7
1.4.2. Acetilcolinesterase ............................................................................................ 9
1.5. Tratamento .............................................................................................................. 12
1.5.1. Antioxidantes .................................................................................................. 13
1.5.2. Inibidores da Acetilcolinesterase .................................................................... 13
2. Polifenóis ......................................................................................................................... 15
3. Objectivos ........................................................................................................................ 17
Capítulo II – Materiais e Métodos ............................................................................................... 18
1. Materiais ......................................................................................................................... 19
1.1. Reagentes Químicos ................................................................................................ 19
1.2. Linhas Celulares ....................................................................................................... 20
1.3. Equipamentos ......................................................................................................... 20
2. Métodos .......................................................................................................................... 20
2.1. Determinação da Actividade Antioxidante (método do DPPH) .............................. 20
Índice
vii
2.2. Inibição da Actividade da Acetilcolinesterase ......................................................... 21
2.3. HPLC Analítico ......................................................................................................... 23
2.4. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro ................................................................. 23
2.4.1. Digestão pelo Suco Gástrico Artificial ............................................................. 23
2.4.2. Digestão pelo Suco Pancreático Artificial ........................................................ 24
2.5. Ensaios em células Caco-2 ....................................................................................... 24
2.5.1. Ensaio de Citotoxicidade em Células Caco-2 ................................................... 24
2.5.2. Ensaio de Metabolismo pelas Células Caco-2 ................................................. 25
2.6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas ................................................ 26
2.7. Dispersão Dinâmica de Luz ...................................................................................... 26
2.8. Análise Estatística .................................................................................................... 27
Capítulo III – Resultados e Discussão de Resultados ................................................................... 28
1. Propriedades Antioxidantes ............................................................................................ 30
2. Inibição da Actividade de Acetilcolinesterase ................................................................. 33
3. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro ......................................................................... 36
4. Síntese do 3,4-Dimetoxicinamato de Colina ................................................................... 41
5. Metabolismo pelas células Caco-2 .................................................................................. 45
6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas ........................................................ 49
Capítulo IV – Conclusão ............................................................................................................... 53
Bibliografia .................................................................................................................................. 56
Anexos ......................................................................................................................................... 62
1. Determinação dos EC50 .................................................................................................. 63
2. Determinação dos IC50 ................................................................................................... 64
3. Cromatograma do Trolox após digestão gástrica ........................................................... 65
4. Espectros UV detectados por HPLC ................................................................................. 66
5. Espectro de 1H-NMR do Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico .................................................... 69
6. Ensaio de biodisponibilidade pelas células Caco-2 ......................................................... 70
Lista de Abreviaturas e Siglas
viii
Lista de Abreviaturas e Siglas
Aβ
ABS
ACh
AChE
AChI
AD
AGEs
Ala
APOE
APP
AS
ChAT
CoA
DEMEM
DMSO
DPPH
DTNB
EC50
EPP
ES
FDA
Gly
Glu
His
HPLC
β-amilóide
Local de Ligação ao Acilo (do inglês Acyl Binding Site)
Acetilcolina
Acetilcolinesterase
Acetilcolina Iodada
Doença de Alzheimer (do inglês Alzheimer Disease)
Produtos Finais de Glicação Avançada (do inglês Advanced Glycation Endproducts)
Resíduo de Alanina
Apolipoproteína E
Proteína Precursora Amilóide
Local Aniónico de Ligação ao Substrato (do inglês Anionic Substrate Binding Site)
Colina Acetiltransferase (do inglês Choline Acetyltransferase)
Coenzima A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
Dimetilsulfóxido
2,2-Di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl
5,5’-dithiobis [2-nitrobenzoic acid]
Concentração a que corresponde 50% de extinção
Placa Motora Terminal (do inglês End-Plate Potential)
Local Catalítico (do inglês Ecstatic Site)
Food and Drug Administration
Resíduo de Glicina
Resíduo de Glutamina
Resíduo de Histidina
High Precision Liquid Chromatography
Lista de Abreviaturas e Siglas
ix
IAChE
IC50
J
LUV
MCT
MLV
MTT
NMR
OH
Phe
PSEN1
PSEN2
RNS
ROS
RT
PAS
PBS
Ser
SNC
SNP
SUV
TcAChE
THF
Trp
Trolox
Tyr
UV-Vis
Inibidores de Acetilcolinesterase
Concentração a que corresponde 50% de inibição
Constante de Acoplamento
Large Unilamellar Vesicles
MonoCarboxylic acid Transporter
MultiLamellar Vesicles
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide
Nuclear Magnetic Resonance
Cavidade Oxianiónica (do inglês Oxyanion Hole)
Resíduo de Fenilalanina
Presenilina-1
Presenilina-2
Espécies Reactivas de Azoto (do inglês Reactive Nitrogen Species)
Espécies Reactivas de Oxigénio (do inglês Reactive Oxygen Species)
Tempo de Retenção (do inglês Retention Time)
Local Aniónico Periférico (do inglês Peripheral Anionic Site)
Phosphates Buffer Solution
Resíduo de Serina
Sistema Nervoso Central
Sistema Nervoso Periférico
Small Unilamellar Vesicles
Acetilcolinesterase de Torpedo californica
Tetrahidrofurano
Resíduo de Triptofano
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid
Resíduo de Tirosina
Ultravioleta-Visível
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 1
Capítulo I – Introdução e Objectivos
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 2
1. Doença de Alzheimer
A idade da população mundial está claramente a aumentar e, consequentemente, há um
aumento na probabilidade de declínio da saúde mental ou de demência. A forma mais comum
de demência é a doença de Alzheimer (AD) e a sua incidência aumenta com a idade (Scarpini et
al., 2003; Racchi et al., 2003; Blennow et al., 2006; Sugimoto et al., 2008; García-Ayllón et al.,
2008).
1.1. Sintomas e Factores de Risco
Um sinal inicial da doença é a perda da memória. À medida que a memória recente se
deteriora, o doente pode recordar eventos de há muito tempo, sendo incapaz de recordar
coisas que sucederam nesse mesmo dia, ou mesmo horas antes. Com a progressão da doença,
a perda de memória agrava-se e a própria linguagem, compreensão e reconhecimento do
indivíduo degeneram-se. Também são característicos os distúrbios comportamentais, que
interferem com o humor, a razão e o julgamento (LaFerla & Oddo, 2005; Scarpini et al., 2003;
Citron, 2004). Os doentes tornam-se confusos e, por vezes, agressivos, passando a apresentar
alterações de personalidade. Nas fases tardias da doença, existem anormalidades motoras e
sensoriais, iniciando-se as dificuldades de locomoção e comunicação. Com o evoluir da doença,
começam os distúrbios funcionais em que há alterações nas actividades básicas do quotidiano,
como alimentação, higiene pessoal e vestuário, pelo que se vão tornando totalmente
dependentes de terceiros (Cummings, 2004; Citron, 2004). A psicose e agitação são
características das fases de evolução e final da doença (Mega et al., 1996).
De um ponto de vista etiológico, AD pode ser definida como uma doença multifactorial. A
maioria dos casos de AD são esporádicos, com uma ocorrência tardia na vida, mas a
manifestação precoce da doença tem sido associada a factores genéticos (Frank & Gupta,
2005; Rossi et al., 2008; Singh et al., 2008). Actualmente, quatro genes foram ligados à AD:
proteína precursora da β-amilóide (APP) e proteínas envolvidas no processamento de APP,
como presenilina-1 (PSEN1) e presenilina-2 (PSEN2), sendo que estas últimas compõem o
núcleo catalisador da γ-secretase (Hardy et al., 1997; Frank & Gupta, 2005). Além disso, a
forma tardia da AD, que representa a grande maioria de todos os casos, tem um factor de risco
genético comum, o alelo ε4 do gene da apolipoproteína E (APOE) (Singh et al., 2008).
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 3
Por outro lado, os factores ambientais e comportamentais também parecem contribuir para a
ocorrência de AD. Alguns estudos sugerem que a falta de interacções sociais e “educação”,
bem como um estilo de vida sedentário podem aumentar o risco de AD (Fratiglioni et al.,
2004). Muitas evidências sugerem que factores do estilo de vida, e especialmente a dieta,
podem neutralizar danos oxidativos que contribuem para o aparecimento de muitas doenças,
incluindo as cardiovasculares, o cancro ou doenças neurodegenerativas. Actualmente, muitas
plantas e frutos são considerados “alimentos funcionais”, porque, quando consumido
regularmente, eles protegem o aparecimento ou atrasam a progressão de uma doença. É
possível que o aparecimento de doenças cerebrais durante o envelhecimento seja
parcialmente devido à falta de factores de protecção, especialmente nos mais fracos – os
idosos –, à alimentação inadequada e a deficiências alimentares (Rossi et al., 2008).
1.2. Fisiopatologia
A AD é caracterizada por dois tipos de agregados proteicos: depósitos extracelulares esféricos,
compactos (placas amilóides), compostos por uma pequena proteína designada péptido β-
amilóide (Aβ) e por depósitos intracelulares (novelos neurofibrilhares) constituídos,
principalmente, pela proteína tau associada a microtúbulos (La Ferla & Oddo, 2005).
Mutações nos genes da APP, PSEN1 e PSEN2 aumentam a produção de Aβ que está presente
nas placas, enquanto o alelo ε4 da apoliproteína E não só aumenta a produção de Aβ, mas
inibe a sua eliminação, aumentando a sua deposição nas placas amilóides. Contudo, estes
genes não são a causa desta doença, uma vez que estão ligados a apenas 10% do total de AD
(Frank & Gupta, 2005).
1.2.1. Proteína β-amilóide e Proteína tau
APP é uma proteína transmembranar tipo I com vários domínios, em particular o domínio Aβ
que se encontra parcialmente incorporado na membrana plasmática e inclui apenas 28
resíduos fora da membrana e os primeiros 12/14 resíduos no domínio transmembranar
(Blennow et al., 2006). APP pode ser processada por duas vias principais (figura 1). Na via α-
secretase (também designada via não-amiloidogénica), α-secretase cliva APP no domínio Aβ,
prevenindo desse modo a formação de Aβ, resultando na libertação de uma porção
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
extracelular grande e solúvel de APP (
resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior po
com libertação do péptido p3, que é considerado não amiloidogénico, embora se deposite nas
placas difusas. Na via β-secretase (também designada via amiloidogénica),
APP imediatamente antes do domínio A
um fragmento C-terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma
transformação posterior por
Este fragmento sofre uma mudança conformacional para
poderá resultar na agregação em oligómeros solúveis e grandes fibrilhas insolúveis. Neste
processo, a isoforma amiloidogénica A
péptidos Aβ (Blennow et al., 2006).
Figura 1 A proteína precursora da
uma série de clivagens proteolíticas por secretases. Quando é clivada por
domínio β-amilóide (Aβ), não é amiloidogénica. No entanto, quando APP é
são libertados péptidos Aβ, que se podem acumular em agregados oligom
(adaptado de Patterson et al., 2008)
Recentemente descobriu-se que o péptido A
metabolismo normal das células, no entanto, em condições normais, o péptido A
degradado por alguns enzimas, pelo que é extinta do cérebro. A hipótese central para a causa
da doença de Alzheimer é a hipótese da cascata amilóide (figura 2), que afirma que um
desequilíbrio entre a produção e a eliminação do péptido A
iniciação, levando à degeneração neuronal e demência (Blennow
esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópi
DQB – FCUL
extracelular grande e solúvel de APP (α-sAPP) e um fragmento C-terminal constituído por 83
resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior po
com libertação do péptido p3, que é considerado não amiloidogénico, embora se deposite nas
secretase (também designada via amiloidogénica),
APP imediatamente antes do domínio Aβ, libertando um fragmento solúvel de APP (
terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma
transformação posterior por γ-secretase com libertação do péptido Aβ (LaFerla e Oddo, 2005).
Este fragmento sofre uma mudança conformacional para uma estrutura rica em folhas β, que
poderá resultar na agregação em oligómeros solúveis e grandes fibrilhas insolúveis. Neste
processo, a isoforma amiloidogénica Aβ42 desencadeia o misfolding de outras formas de
, 2006).
A proteína precursora da β-amilóide (APP) é uma proteína transmembranar que pode sofrer
uma série de clivagens proteolíticas por secretases. Quando é clivada por α-secretase no meio do
ão é amiloidogénica. No entanto, quando APP é clivada por β
β, que se podem acumular em agregados oligoméricos.
, 2008)
se que o péptido Aβ é produzido constitutivamente durante o
mal das células, no entanto, em condições normais, o péptido A
degradado por alguns enzimas, pelo que é extinta do cérebro. A hipótese central para a causa
da doença de Alzheimer é a hipótese da cascata amilóide (figura 2), que afirma que um
io entre a produção e a eliminação do péptido Aβ no cérebro é o evento de
iniciação, levando à degeneração neuronal e demência (Blennow et al., 2006). O suporte para
esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópi
Introdução
4
terminal constituído por 83
resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior por γ-secretase
com libertação do péptido p3, que é considerado não amiloidogénico, embora se deposite nas
secretase (também designada via amiloidogénica), β-secretase cliva
nto solúvel de APP (β-sAPP) e
terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma
β (LaFerla e Oddo, 2005).
uma estrutura rica em folhas β, que
poderá resultar na agregação em oligómeros solúveis e grandes fibrilhas insolúveis. Neste
de outras formas de
amilóide (APP) é uma proteína transmembranar que pode sofrer
secretase no meio do
clivada por β- e γ-secretases,
éricos. ↑ = Aumento
é produzido constitutivamente durante o
mal das células, no entanto, em condições normais, o péptido Aβ é
degradado por alguns enzimas, pelo que é extinta do cérebro. A hipótese central para a causa
da doença de Alzheimer é a hipótese da cascata amilóide (figura 2), que afirma que um
érebro é o evento de
, 2006). O suporte para
esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópias
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
do gene APP, desenvolvem características neuropatológicas da doença de Alzheimer nos
primeiros anos de vida; Aβ é neurotóxico
com sobre-expressão de APP humana têm evidências de deficiência de apren
memória, em combinação com a acumulação de A
semelhantes aos observados em humanos com AD (Butterfield
1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada po
evidências de que a perda de sinapses também ocorre em regiões onde não existem placas
amilóides.
Os eventos descritos conduzem não só à
alterações na actividade cinase/fosfatase. Estas alterações são
aparecimento de novelos neurofibrilhares que são constituídos por proteína tau
hiperfosforilada. Num estado normal, tau é uma proteína solúvel que promove a junção e
estabilização dos microtúbulos. A proteína tau patológica, pelo contr
de solubilidade alteradas, estrutura com forma filamentosa e está anormalmente fosforilada
em certos resíduos (LaFerla & Oddo, 2005). A hiperfosforilação da tau na AD começa
intracelularmente, levando à captação da tau normal e out
microtúbulos, o que provoca disjunção dos microtúbulos axonais e assim prejudica o
transporte axonal, comprometendo a função neuronal e sináptica (Iqbal
outro lado, a tau também torna
comprometendo ainda mais a função neuronal (Braak
DQB – FCUL
do gene APP, desenvolvem características neuropatológicas da doença de Alzheimer nos
é neurotóxico in vitro e leva à morte celular; ratinhos transgénicos
expressão de APP humana têm evidências de deficiência de apren
memória, em combinação com a acumulação de Aβ, resultando em placas neur
semelhantes aos observados em humanos com AD (Butterfield et al., 2002; Mesulam
1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada po
evidências de que a perda de sinapses também ocorre em regiões onde não existem placas
conduzem não só à disfunção neuronal como também provocam
alterações na actividade cinase/fosfatase. Estas alterações são relevantes uma vez que leva ao
aparecimento de novelos neurofibrilhares que são constituídos por proteína tau
hiperfosforilada. Num estado normal, tau é uma proteína solúvel que promove a junção e
estabilização dos microtúbulos. A proteína tau patológica, pelo contrário, exibe propriedades
de solubilidade alteradas, estrutura com forma filamentosa e está anormalmente fosforilada
em certos resíduos (LaFerla & Oddo, 2005). A hiperfosforilação da tau na AD começa
intracelularmente, levando à captação da tau normal e outras proteínas associadas a
microtúbulos, o que provoca disjunção dos microtúbulos axonais e assim prejudica o
transporte axonal, comprometendo a função neuronal e sináptica (Iqbal et al.
outro lado, a tau também torna-se vulnerável a agregar em fibras insolúveis em novelos,
comprometendo ainda mais a função neuronal (Braak et al., 1999).
Figura 2 Hipótese da cascata amilóide. A
cascata é iniciada através da geração de
péptidos Aβ. Oligómeros podem agredir
directamente as sinapses e neurites dos
neurónios do cérebro, além de activarem
microglia e astrócitos, conduzindo à morte
neuronal. O péptido Aβ desencadeia ainda
a hiperfosforilação da tau, originando
novelos neurofibrilhares, o que contribui
substancialmente para a doença. (adaptado
de www.gladstone.ucsf.edu)
Introdução
5
do gene APP, desenvolvem características neuropatológicas da doença de Alzheimer nos
e leva à morte celular; ratinhos transgénicos
expressão de APP humana têm evidências de deficiência de aprendizagem e de
β, resultando em placas neuríticas
, 2002; Mesulam et al.,
1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada porque há
evidências de que a perda de sinapses também ocorre em regiões onde não existem placas
disfunção neuronal como também provocam
uma vez que leva ao
aparecimento de novelos neurofibrilhares que são constituídos por proteína tau
hiperfosforilada. Num estado normal, tau é uma proteína solúvel que promove a junção e
ário, exibe propriedades
de solubilidade alteradas, estrutura com forma filamentosa e está anormalmente fosforilada
em certos resíduos (LaFerla & Oddo, 2005). A hiperfosforilação da tau na AD começa
ras proteínas associadas a
microtúbulos, o que provoca disjunção dos microtúbulos axonais e assim prejudica o
et al., 2005). Por
fibras insolúveis em novelos,
Hipótese da cascata amilóide. A
cascata é iniciada através da geração de
ómeros podem agredir
directamente as sinapses e neurites dos
neurónios do cérebro, além de activarem
microglia e astrócitos, conduzindo à morte
β desencadeia ainda
a hiperfosforilação da tau, originando
novelos neurofibrilhares, o que contribui
mente para a doença. (adaptado
de www.gladstone.ucsf.edu)
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 6
Estima-se que a neurodegeneração na AD começa 20-30 anos antes dos sintomas clínicos.
Durante essa pré-fase, há um aumento das placas e dos novelos até um certo limite e os
primeiros sintomas aparecem (Blennow et al., 2006).
1.3. Inflamação, Stress Oxidativo e Antioxidantes
Ao longo dos anos têm surgido evidências que as placas amilóides podem desempenhar um
papel central na cascata inflamatória, uma vez que Aβ não só é capaz de activar microglia e
astrócitos (células glias residentes do sistema nervoso central) como também é um alvo de
alteração por produtos finais de glicação avançada (AGEs), que são capazes de amplificar as
vias inflamatórias (Stuchbury & Münch, 2005). Como uma parte inevitável do envelhecimento,
estes produtos ligam-se covalentemente a proteínas de longa vida e por isso encontram-se em
concentrações elevadas nas placas amilóides, devido à longevidade dos depósitos de Aβ (Smith
et al., 1994). O péptido Aβ é capaz de agravar ainda mais a inflamação na AD, através de uma
série de efeitos secundários, tais como: aumento da permeabilidade da barreira
hematoencefálica (Zlokovic, 1997) e aumento da vasoconstrição das células musculares lisas
vasculares (Crawford et al., 1998; Suo et al., 1998). O excesso de inflamação na AD resulta em
neurodegeneração, que causa a demência observada em doentes de Alzheimer.
Vários passos na via inflamatória da AD envolvem ainda a produção de radicais, tais como
superóxido e óxido nítrico, ambos produtos da microglia e astrócitos estimulados por Aβ
(Stuchbury & Münch, 2005). Assim, outro fenómeno ligado ao declínio cognitivo e perda
neuronal associado à idade em doenças neurodegenerativas é o stress induzido por espécies
reactivas de oxigénio (ROS) e de azoto (RNS). Quando estes são produzidos em excesso podem
oxidar lípidos, proteínas e ácidos nucleicos, perturbando as suas estruturas e as suas funções,
interferindo, assim, com o metabolismo celular normal – stress oxidativo e nitrosativo (Rossi et
al., 2008). Este processo pode ser especialmente importante no sistema nervoso central, dado
que é vulnerável a danos de ROS e RNS como resultado do alto consumo de O2, alto teor
lipídico e baixas defesas de antioxidantes no cérebro quando comparado com outros tecidos
(Frank & Gupta, 2005). Sabe-se ainda que proteínas que foram modificadas com AGEs
produzem quase 50 vezes mais ROS do que as proteínas que não foram glicadas (Stuchbury &
Münch, 2005), contribuindo, assim, para a neurotoxicidade da proteína Aβ.
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 7
1.4. Neuroquímica
Para além destes agregados proteicos, o cérebro de um doente de AD é também caracterizado
por atrofia, perda de sinapses e deficiência na neurotransmissão colinérgica central,
designadamente a degeneração dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal, baseada
principalmente na hipótese colinérgica (Kasa et al., 1997; Racchi et al., 2004; LaFerla & Oddo,
2005). A disfunção celular e morte celular de neurónios, que são responsáveis pela
manutenção de sistemas de transmissão específicos, conduz a deficiências de acetilcolina,
noradrenalina e serotonina – hipótese colinérgica (Cummings, 2004). Estes acontecimentos
foram comprovados por vários autores que demonstraram que a diminuição na actividade
colinérgica afecta a actividade dos enzimas responsáveis pela síntese e degradação da
acetilcolina (Racchi et al., 2004; Mukherjee et al., 2007).
1.4.1. Acetilcolina
Acetilcolina (ACh) encontra-se em vertebrados e artrópodes e é um dos principais compostos
responsáveis pela sinalização do nervo para o músculo nas sinapses especializadas designadas
junções neuromusculares (Houghton et al., 2006). No entanto, para além da sua função no
sistema nervoso periférico (SNP), também tem um papel importante no sistema nervoso
central (SNC), no qual está envolvida na memória e aprendizagem.
Existem dois receptores neuronais sensíveis a ACh, muscarínicos e nicotínicos, que estão
distribuídos no SNC e no SNP (Houghton et al., 2006). Os receptores muscarínicos estão
principalmente associados com o SNP e com músculo liso e cardíaco. O efeito da ligação com
ACh está geralmente associado com a estimulação do sistema nervoso parassimpático
(Houghton et al., 2006). Pelo contrário, os receptores nicotínicos encontram-se no SNC e na
placa motora terminal (EPP), que são as sinapses entre os nervos e músculos esqueléticos. A
perda progressiva dos receptores nicotínicos durante o desenvolvimento da AD também tem
sido descrita e há evidências de um papel destes receptores na deficiência de cognição e
memória (Silman & Sussman et al., 2005; Scarpini et al., 2003).
A ACh é, quimicamente, um éster de colina e é sintetizada no terminal pré-sináptico a partir de
colina e acetil-coenzima A (acetil-CoA), sendo a reacção catalisada pelo enzima colina
acetiltransferase (ChAT). O mecanismo do processo está representado na figura 3.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana
liberta o seu conteúdo na fenda sináptica. A libertação da ACh no nervo terminal pode ser
efectuada através dos canais de Ca
nervoso. Uma acção potencial que chega ao terminal do neurónio pré
abertura dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem. O Ca
vesículas com a membrana do nervo terminal e estas libertam grandes quantidades de ACh
por exocitose. As moléculas de ACh difundem
nicotínicos, localizados na membrana pós
nicotínicos resulta na difusão de Na
libertada tem um tempo de meia
do enzima acetilcolinesterase (
sintetizada no retículo endoplasmático da célula neuronal e é transportado para a membrana
terminal pré-sináptica (local de
degrada rapidamente a ACh em acetato e colina, o que provoca uma perda de actividade
estimuladora. A colina é retomada pelo terminal pré
(Greenstein, 2000; Shen et al.
DQB – FCUL
A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana
liberta o seu conteúdo na fenda sináptica. A libertação da ACh no nervo terminal pode ser
efectuada através dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem, existentes no terminal
nervoso. Uma acção potencial que chega ao terminal do neurónio pré-sináptico desencadeia a
dependentes da voltagem. O Ca2+ intracelular estimula a fusão das
vesículas com a membrana do nervo terminal e estas libertam grandes quantidades de ACh
por exocitose. As moléculas de ACh difundem-se através da fenda e activam os receptores
nicotínicos, localizados na membrana pós-sináptica. A ligação de ACh com os receptores
nicotínicos resulta na difusão de Na+ e K+ em toda a membrana e despolariza a célula. A ACh
libertada tem um tempo de meia-vida muito curto, devido à presença de grandes quantidades
do enzima acetilcolinesterase (AChE) na superfície externa do nervo terminal. A AC
sintetizada no retículo endoplasmático da célula neuronal e é transportado para a membrana
sináptica (local de actividade) através de microtúbulos axonais. Este enzima
degrada rapidamente a ACh em acetato e colina, o que provoca uma perda de actividade
estimuladora. A colina é retomada pelo terminal pré-sináptico para nova síntese de ACh
al., 2002; Houghton et al., 2006; Siegel & Sapru, 2006).
Figura 3 Passos envolvidos na
síntese e libertação de
acetilcolina (ACh). Após o
estímulo, há libertação da ACh
na fenda sináptica, por exocitose.
ACh difunde e liga
receptores e, posteriormente, é
hidrolisada em c
acetato (A) através da acção de
acetilcolinesterase (AChE). Ch é
retomada para re
e armazenada em vesículas.
(adaptado de
2006).
Introdução
8
A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana celular e
liberta o seu conteúdo na fenda sináptica. A libertação da ACh no nervo terminal pode ser
dependentes da voltagem, existentes no terminal
ptico desencadeia a
intracelular estimula a fusão das
vesículas com a membrana do nervo terminal e estas libertam grandes quantidades de ACh
da fenda e activam os receptores
sináptica. A ligação de ACh com os receptores
em toda a membrana e despolariza a célula. A ACh
rto, devido à presença de grandes quantidades
externa do nervo terminal. A AChE é
sintetizada no retículo endoplasmático da célula neuronal e é transportado para a membrana
actividade) através de microtúbulos axonais. Este enzima
degrada rapidamente a ACh em acetato e colina, o que provoca uma perda de actividade
sináptico para nova síntese de ACh
Sapru, 2006).
Passos envolvidos na
síntese e libertação de
acetilcolina (ACh). Após o
estímulo, há libertação da ACh
na fenda sináptica, por exocitose.
ACh difunde e liga-se aos seus
receptores e, posteriormente, é
hidrolisada em colina (Ch) e
acetato (A) através da acção de
acetilcolinesterase (AChE). Ch é
retomada para re-síntese de ACh
e armazenada em vesículas.
(adaptado de Siegel & Sapru,
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 9
1.4.2. Acetilcolinesterase
Todo o ciclo de transmissão de sinal – ou seja, a libertação de ACh, a sua difusão através da
fenda sináptica, a sua interacção reversível com o receptor nicotínico e, finalmente, a sua
hidrólise pela AChE – ocorre em alguns milisegundos. Portanto, todo o processo deve ser
perfeitamente integrado, no espaço e no tempo (Silman & Sussman, 2005).
Actualmente, os conhecimentos relativos à estrutura de AChE (EC 3.1.1.7) baseiam-se
principalmente em estudos realizados sobre o enzima TcAChE, obtidos a partir da enguia
eléctrica Torpedo californica. No entanto, a estrutura de AChE de mamíferos é muito
semelhante ao de TcAChE in vitro (Houghton et al., 2006) e a sua elucidação permitiu uma
abordagem estrutural para desenvolvimento de fármacos anticolinesterases (Silman &
Sussman, 2005). Foi demonstrado que AChE pertence à família de hidrolases α/β, embora este
enzima apresente um número de turnover muito superior ao das serinas hidrolases que fazem
uso da mesma tríade catalítica, Ser200-His440-Glu327 (Shen et al.,2002; Silman & Sussman,
2005; Houghton et al., 2006).
AChE é codificada a partir de um único gene, mas existe uma variedade de formas moleculares
que varia de tecido para tecido. Estas formas são geradas por splicing alternativo do exão C-
terminal seguidos por modificação pós-transducional. As subunidades catalíticas, que podem
variar em glicosilação, podem oligomerizar em dímeros ou tetrâmeros, dando origem a formas
globulares (G): G1, G2 e G4. Os monómeros (G1), dímeros (G2) e tetrâmeros (G4) podem ser
secretados como formas solúveis ou ancoradas à membrana por um domínio hidrófobo (Shen
et al., 2002; Silman & Sussman, 2005).
Na figura 4 está apresentado um diagrama da subunidade catalítica de TcAChE. Uma maneira
de ver a sua estrutura é como uma plataforma de folhas β que suporta a maquinaria catalítica
e, nas suas características gerais, é bastante semelhante a todos os membros da família. Na
verdade, os três membros da tríade catalítica aparecem na mesma ordem ao longo da cadeia
polipeptídica em todos os enzimas hidrolases α/β. Por outro lado, as hélices α e loops têm a
função de lidar com a especificidade do elemento, daí os substratos dos diferentes membros
da família ser tão variada (Silman e Sussman, 2008).
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
Inesperadamente para um enzima tão rápido, o seu centro activo está localizado numa
profunda e estreita fenda, denominada geralmente por cavidade, com cerca de 20Å de
profundidade, ladeado por 14 resíduos aromáticos conservados (Shen
Sussman, 2005; Houghton et al.
cavidade, a ligação inicial da ACh sucede no bordo exterior numa r
aniónico periférico (PAS). Esta ligação inicial é
de o substrato prosseguir para o centro activo. No fundo da cavidade, onde ocorre a
verdadeira hidrólise, existem quatro principais sublocais, sendo estes
cavidade oxianiónica, o local aniónico de ligação ao substr
O local catalítico (ES) contém a tríade catalítica Ser200
utilizam esta tríade catalítica Ser
uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser at
nucleofilicamente o substrato, enquanto Glu estabiliza o catião histidinium do estado de
DQB – FCUL
Inesperadamente para um enzima tão rápido, o seu centro activo está localizado numa
profunda e estreita fenda, denominada geralmente por cavidade, com cerca de 20Å de
profundidade, ladeado por 14 resíduos aromáticos conservados (Shen et al.
et al., 2006). Apesar do processo de hidrólise ocorrer na base da
cavidade, a ligação inicial da ACh sucede no bordo exterior numa região denomina
). Esta ligação inicial é essencial, uma vez que aumenta a probabilidade
de o substrato prosseguir para o centro activo. No fundo da cavidade, onde ocorre a
verdadeira hidrólise, existem quatro principais sublocais, sendo estes o local catalít
cavidade oxianiónica, o local aniónico de ligação ao substrato e ao acilo (figura 5).
) contém a tríade catalítica Ser200-His440-Glu327. As colinesterases
utilizam esta tríade catalítica Ser-His-Glu para reforçar a nucleofilicidade da serina catalítica,
uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser at
nucleofilicamente o substrato, enquanto Glu estabiliza o catião histidinium do estado de
Figura 4 Estrutura tridimensional de
TcAChE com ACh, exibido como
bolas, ancorada no centro activo.
(retirado de Silman e Sussman, 2008)
Figura 5 Esquema do centro activo e local aniónico
periférico (PAS) de AChE. Os números dizem
respeito às posições dos resíduos na
local aniónico de ligação ao substrato; ABS = local
de ligação ao acilo; OH = cavidade oxianiónica; ES =
local catalítico.
Introdução
10
Inesperadamente para um enzima tão rápido, o seu centro activo está localizado numa
profunda e estreita fenda, denominada geralmente por cavidade, com cerca de 20Å de
et al.,2002; Silman &
, 2006). Apesar do processo de hidrólise ocorrer na base da
egião denominada local
nta a probabilidade
de o substrato prosseguir para o centro activo. No fundo da cavidade, onde ocorre a
o local catalítico, a
ato e ao acilo (figura 5).
Glu327. As colinesterases
Glu para reforçar a nucleofilicidade da serina catalítica,
uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser atacar
nucleofilicamente o substrato, enquanto Glu estabiliza o catião histidinium do estado de
Estrutura tridimensional de
AChE com ACh, exibido como
bolas, ancorada no centro activo.
(retirado de Silman e Sussman, 2008)
Esquema do centro activo e local aniónico
periférico (PAS) de AChE. Os números dizem
respeito às posições dos resíduos na TcAChE. AS =
local aniónico de ligação ao substrato; ABS = local
igação ao acilo; OH = cavidade oxianiónica; ES =
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 11
transição. A cavidade oxianiónica (OH) consiste em Gly118, Gly119 e Ala201. Estes três
resíduos peptídicos contêm dadores de ligação de hidrogénio e estabilizam o intermediário
tetraédrico de ACh, intermediário acil-AChE, que é formado durante o processo catalítico. O
local aniónico de ligação ao substrato (AS) é na maioria composto por resíduos aromáticos,
como Trp84 e Phe330, que possuem uma pequena carga negativa onde se ligam a ligandos
amónias quaternárias por interacções π-catião. A carga positiva do grupo amina quaternária
de ACh pode formar uma interacção estável com os sistemas ricos em electrões π dos anéis
aromáticos. O local de ligação ao acilo (ABS) é composto por Phe288 e Phe299, ao qual se liga
o grupo acilo da ACh, desempenhando um papel importante na limitação da dimensão de
substratos que são capazes de entrar no centro activo (Houghton et al., 2006; Zhou et al.,
2008). Uma molécula de água, em seguida, desloca o grupo acilo para regenerar o enzima e
libertar acetato.
Como já foi referido anteriormente, o centro activo deste enzima está embebido numa
cavidade, com cerca de 20Å de profundidade pelo que se coloca a grande questão: como é que
um enzima tão activo tem o seu centro activo imerso numa cavidade? Para além deste enigma,
existe ainda uma constrição no meio da cavidade produzida pela justaposição de Phe330 e
Tyr121, cuja distância entre si, aproximadamente 5Å, é substancialmente mais reduzido do
que o diâmetro do grupo quaternário de ACh que é 6,4Å (Silman & Sussman, 2008). Uma
recente publicação, por Hulme et al. (2006) tornou evidente que a fraca hidratação de ACh em
solução aquosa favorece a sua interacção com o local de ligação de ACh ao receptor
muscarínico. Do mesmo modo, a fraca hidratação de ACh deve favorecer a interacção π-catião
com os resíduos aromáticos, principalmente Trp279 e Tyr70, na parte superior da cavidade,
bem como as interacções subsequentes ao longo da cavidade para o centro activo, incluindo
os dois resíduos do estrangulamento, Phe330 e Tyr121. Em termos gerais, a superfície
aromática da cavidade poderá servir como uma espécie de coluna de fraca afinidade que o
substrato poderia deslizar para o centro activo através de sucessivas interacções π-catião
(Silman & Sussman, 2008). Para além deste facto, AChE tem um grande momento dipolar e o
eixo do momento dipolar da AChE está orientado, aproximadamente, ao longo do eixo do
centro activo da cavidade. Assim, Silman & Sussman (2008) propuseram que o momento
dipolar pode ajudar a atrair os substratos carregados positivamente de AChE para dentro e
para baixo do centro activo na cavidade, sendo esta uma forma de superar a dificuldade do
centro activo estar imerso. No entanto, devido ao elevado turnover do enzima e do forte
dipolo electrostático causado pela distribuição assimétrica da carga, é pouco provável que a
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 12
colina produzida por hidrólise saia do centro activo pelo mesmo caminho que entrou a ACh
(Houghton et al., 2006). Com este indício, coloca-se uma nova questão: como é que os
produtos da reacção catalisada por este enzima são eliminados a partir da cavidade, uma vez
que a colina também possui carga positiva? Tem sido proposto, baseado em estudos de
dinâmica molecular e mutagénese dirigida, o mecanismo da “porta traseira” (figura 6) em que
o processo ocorre através da abertura da parte inferior da cavidade de AChE proporcionando
um canal através do qual os produtos podem passar (Gilson et al., 1994).
Grande interesse tem sido gerado quanto à expressão alterada de AChE no cérebro AD. Uma
série de estudos têm demonstrado que, apesar da diminuição geral na actividade de AChE no
cérebro AD, os níveis desse enzima aumenta em torno das placas amilóides e nos novelos
neurofibrilhares. Curiosamente, a actividade da AChE associada com placas neuríticas no
cérebro AD exibe propriedades enzimáticas especiais e sensibilidade a inibidores (García-
Ayllón et al., 2008). É de notar ainda que, nos últimos anos, deparou-se que AChE está
envolvido numa série de outras funções para além do seu papel clássico na transmissão
nervosa. Estas incluem um papel como uma proteína de adesão, uma proteína da matriz óssea,
no crescimento da neurite e na produção de fibrilhas amilóides. Alguns estudos evidenciaram
que AChE acelera a associação de péptidos Aβ em fibrilhas amilóides, provavelmente através
de um pool de aminoácidos localizados na proximidade do PAS do enzima (De Ferrari et al.,
2001).
1.5. Tratamento
Para melhorar a neurotransmissão colinérgica, diferentes estratégias têm sido investigadas,
incluindo a redução da placa amilóide através da administração de vacina anti-Aβ42 (Scarpini
Figura 6 Libertação dos produtos de
hidrólise de ACh do centro activo do
enzima. (adaptado de Houghton et al.,
2006)
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 13
et al., 2003; Citron, 2004), diminuição da inflamação com drogas anti-inflamatórias (Scarpini et
al., 2003; Cummings, 2004; Blennow et al., 2006), a redução de ROS e RNS com antioxidantes
(Cummings, 2004; Frank & Gupta, 2005; Stuchbury & Münch, 2005; Blennow et al., 2006; Rossi
et al., 2008), bem como a diminuição da degradação sináptica de acetilcolina com inibidores
da colinesterase. Só serão relatados os tratamentos com antioxidantes e inibidores da
colinesterase.
1.5.1. Antioxidantes
O stress oxidativo em sistemas biológicos é contra-balançado por um grande conjunto de
antioxidantes endógenos bem como compostos de baixo peso molecular. Embora alguns
estudos sugerem que não há conexão entre antioxidantes e um risco reduzido de AD
(Luchsinger et al., 2003), vários ensaios com antioxidantes e scavengers de radicais livres,
incluindo vitamina E (Sano et al., 1997) e ácido α-lipóico (Hager et al., 2001) apresentam
vantagens em doentes com Alzheimer. A produção de ROS pode ocorrer muito cedo no
processo da doença, antes mesmo do surgimento das placas e novelos neurofibrilhares,
levando ao dano tecidual através de várias vias celulares. Portanto, o tratamento com
antioxidantes auxilia no impedimento da propagação do dano tecidual e no melhoramento da
sobrevivência neurológica (Stuchbury & Münch, 2005).
Ensaios iniciais com antioxidantes têm demonstrado a sua promessa como um tratamento
para a AD, mas devem ser realizados mais estudos clínicos para confirmar a sua eficácia. Dada
a baixa toxicidade dos antioxidantes e da grande variedade disponível, como ácido α-lipóico,
vitaminas C e E, presentes no chá verde, Ginkgo biloba, frutas e vinho tinto, podem não
fornecer apenas um efeito protector para a AD, mas pode ser uma alternativa importante para
os doentes que são incapazes de utilizar agentes com efeitos secundários tóxicos (Stuchbury &
Münch, 2005).
1.5.2. Inibidores da Acetilcolinesterase
Uma estratégia terapêutica para aumentar a neurotransmissão colinérgica é aumentar a
disponibilidade de acetilcolina através da inibição da acetilcolinesterase. Inibidores da AChE
(IAChE) são aprovados para o tratamento de leve a moderada AD e estes devem ser a primeira
linha de tratamento (Doody et al., 2001). Quatro inibidores da colinesterase estão aprovados
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 14
pela Food and Drug Administration (FDA) – tacrina, donepezil, rivastigmina e galantamina.
Destes quatro, a tacrina é raramente usada, pois tem efeitos hepatotóxicos em,
aproximadamente, 40 por centro das pessoas expostas ao composto (Cummings, 2004; Racchi
et al., 2004). A segunda geração de inibidores, ao qual pertence os restantes, são menos
tóxicos e a sua duração de acção permite uma dose mais conveniente (Cummings, 2004).
Embora donepezil, rivastigmina e galantamina façam parte da mesma classe terapêutica, eles
diferem na sua farmacologia e farmacocinética. Donepezil é um derivado da piperina, que
inibe não-competitivamente e reversivelmente a AChE, sendo altamente selectivo para este
enzima (Scarpini et al., 2003; Racchi et al., 2004; Sugimoto, 2008). Galantamina é um alcalóide
terciário com duplo modo de acção: inibidor competitivo e reversível da AChE, bem como
modulador alostérico de receptores nicotínicos de ACh (Scarpini et al., 2003; Racchi et al.,
2004). Pelo oposto, a rivastigmina é um inibidor pseudo-irreversível da AChE.
Metabolicamente, tanto o donepezil e a galantamina são metabolizados no fígado pelo
citocromo P450, no entanto a rivastigmina não é metabolizada (Scarpini et al., 2003). Em
termos de biodisponibilidade, o donepezil tem um tempo de meia-vida plasmática longo pelo
que permite um regime posológico de uma vez por dia (Scarpini et al., 2003; Racchi et al.,
2004; Sugimoto, 2008). Inversamente, a galantamina e rivastigmina têm um curto tempo de
meia-vida de eliminação, o que requer uma posologia de duas doses diárias (Scarpini et al.,
2003; Racchi et al., 2004). Globalmente, estes fármacos são seguros e os efeitos secundários
são geralmente limitados a sintomas gastrointestinais, como náuseas, vómitos e diarreia. A
ocorrência de efeitos colaterais geralmente pode ser reduzida com uma dose baixa no início
do tratamento, que é aumentada lentamente. A co-administração com alimentos atrasa a
absorção dos fármacos e pode também reduzir os efeitos secundários gastrointestinais
(Blennow et al., 2006).
Considerando o mecanismo de acção dos IAChE’s, não se espera que alterem o curso natural
da doença, mas apenas atenuar, temporariamente, alguns dos sintomas. Esta abordagem
prevê alguma melhoria cognitiva a curto prazo, mas não previne o aparecimento da doença.
No entanto, alguns estudos têm demonstrado que os IAChE’s podem ser eficazes até 2 anos e
a extensão dos estudos sugerem que alguns doentes podem ter benefícios a longo prazo, até 5
anos (Blennow et al., 2006).
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 15
Como foi referido anteriormente, pensa-se que AChE promove a associação de péptidos Aβ em
fibrilhas amilóides, através da ligação do PAS do enzima. Alguns estudos demonstraram que
moléculas que interagem quer, exclusivamente, com PAS ou com os dois locais catalítico e
periférico, podem impedir a pró-agregação de AChE com Aβ (Inestrosa et al., 1996; Fallarero et
al., 2008). Esta pesquisa está a resultar na produção de novas classes de IAChE’s, com dupla
especificidade, sendo direccionado tanto para o centro activo como para o PAS. Assim, podem
desempenhar duplos papéis no contexto da AD, pela inibição da hidrólise de ACh e pelo atraso
da associação de péptidos Aβ nas fibrilhas amilóides (Silman & Sussman, 2005).
É certo que a AD se tornará na doença mais prevalente com o envelhecimento da população
mundial. Sendo assim é importante encontrar métodos eficazes de não só tratar a doença,
mas prevenir a neurodegeneração antes dos sintomas clínicos serem observados.
2. Polifenóis
Polifenóis encontram-se em plantas comestíveis e não-comestíveis, sendo importantes para o
normal crescimento das plantas e defesa contra infecções e lesão (Amorati et al., 2006). Isto é,
são metabolitos secundários de plantas, essenciais para a fisiologia vegetal, contribuindo para
a sua pigmentação, crescimento, reprodução e resistência a patogénios e predadores.
Também são responsáveis pela acidez dos alimentos e de bebidas derivados das plantas, bem
como pela oxidação dos mesmos produtos quando são produzidos ou armazenados (Rossi et
al., 2008).
Polifenóis dietéticos têm sido amplamente considerados como sendo benéficos para a saúde
humana, exercendo diversos efeitos biológicos, tais como scavenging de radicais livres,
quelação de metais metálicos de transição prooxidantes, modulação da actividade enzimática,
e alteração de vias de transdução de sinal (Konishi & Kobayashi, 2004; Amorati et al., 2006).
Estudos epidemiológicos também destacaram a associação entre o consumo de alimentos e de
bebidas ricas em polifenóis na prevenção de diversas doenças humanas (Konishi & Kobayashi,
2004).
Um grande grupo de compostos fenólicos é formado pelo ácido cinâmico e seus derivados,
que se encontra, principalmente, no reino vegetal (Ekmekcioglu et al., 1998; Konishi &
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 16
Kobayashi, 2004). As estruturas deste grupo podem ser encontradas com diferentes níveis de
hidroxilação (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008) e existem principalmente numa forma esterificada
com ácidos orgânicos, açúcares, e lípidos (Konishi & Kobayashi, 2004). Ácido cinâmico e seus
derivados hidroxilados são ingeridos pelo Homem e animais em variadíssimas quantidades
através da dieta (Ekmekcioglu et al., 1998). Os derivados de ácidos cinâmicos são
representados principalmente pelos ácidos cafeico, ferúlico, sinapínico e p-cumárico – figura 7
(Lafay & Gil-Izquierdo, 2008).
Figura 7 Estruturas de alguns derivados do ácido cinâmico.
Ácido cafeico é o mais comum, representando até 70% do total de ácidos hidroxicinâmicos nos
frutos (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008) e surge, principalmente em alimentos, na forma de ácido
clorogénico (Konishi & Kobayashi, 2004). O ácido cafeico tem dois grupos hidroxilos adjacentes
a um resíduo aromático, apresentando actividade antioxidante e efeitos anti-mutagénico e
anti-cancerígenos in vitro (Konishi & Kobayashi, 2004). Outro composto presente nesta classe é
o ácido rosmarínico que é um éster do ácido cafeico e ácido 3,4-dihidroxifenilacético (Konishi
& Kobayashi, 2005). O ácido rosmarínico encontra-se em várias ervas Lamiaceae usadas
nomeadamente como ervas aromáticas, tal como a erva cidreira, Melissa officinalis L (Konishi
& Kobayashi, 2005). Tem sido relatado que este ácido tem uma série de actividades biológicas
in vitro, incluindo actividade anti-viral, anti-bacteriana, antioxidante, anti-inflamatória, e anti-
alérgica (Konishi & Kobayashi, 2005). Mas, a actividade biológica in vivo após administração,
Ácido Cafeico
Ácido Ferúlico
Ácido Clorogénico
Ácido p-cumárico
Ácido Sinapínico
Ácido Rosmarínico
Introdução
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 17
tanto do ácido cafeico como do rosmarínico, é dependente da absorção intestinal e posterior
interacção com os tecidos-alvo (Konishi & Kobayashi, 2004; Konishi & Kobayashi, 2005).
Vários estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que os polifenóis dietéticos
contribuem para a protecção contra diversas doenças degenerativas, devido principalmente às
suas propriedades antioxidantes (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Como referido anteriormente, a
inflamação é um componente de doenças neurodegenerativas. Assim, é concebível que os
efeitos positivos dos polifenóis sobre neurodegeneração e envelhecimento podem também
ser mediado pelo seu papel anti-inflamatório (Rossi et al., 2008).
3. Objectivos
Vários estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que polifenóis dietéticos contribuem
para a protecção contra diversas doenças degenerativas (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Em
estudos anteriores, observou-se que alguns ácidos fenólicos, nomeadamente o ácido
rosmarínico (Falé et al., 2009), conseguiam inibir a actividade de AChE. Dadas as propriedades
antioxidantes dos ácidos fenólicos, estes poderão apresentar potencial terapêutico na
aplicação à AD.
O objectivo da investigação aqui exposta foi sintetizar novos e específicos inibidores de AChE
com baixa toxicidade e alta estabilidade química. Foi decidido que os compostos a serem
sintetizados teriam de ter uma funcionalidade semelhante à funcionalidade do grupo éster da
ACh, ou seja, que eles conteriam a fracção colina. Assim, uma série de derivados de colina de
ácidos fenólicos foram sintetizados para analisar se seriam melhores antioxidantes que os
ácidos fenólicos que os deram origem e se tinham alguma actividade inibidora do enzima
AChE.
Para além da determinação das propriedades biológicas dos ésteres de colina sintetizados,
pretende-se determinar o seu metabolismo e biodisponibilidade no tracto gastrointestinal com
vista a avaliar a estabilidade dos compostos sintetizados.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 18
Capítulo II – Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 19
1. Materiais
1.1. Reagentes Químicos
Todos os reagentes químicos utilizados no trabalho foram pro analysis.
Enzima acetilcolinesterase tipo VI-S, isolado de enguia eléctrica contendo 349 U/mg sólido e
411 U/mg de proteína; 5,5’-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] (DTNB); iodeto de acetiltiocolina
(AChI); 2,2-Di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl (DPPH); tampão Hepes; tampão Tris;
pancreatina, isolada de pâncreas de porco; Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide
(MTT); colina clorada; dimetilsulfato [(MeO)2SO2]; colesterol; Dipalmitoylphosphatidylcholine
(DPPC) foram adquiridos à Sigma. Sais de fosfato de potássio, ácido trifluoroacético (TFA),
ácido fosfórico, acetonitrilo, carbonato de potássio (K2CO3), tetrahidrofurano (THF),
clorofórmio (CHCl3), dioxano, Thionyl chloride (SOCl2) e acetato de etilo foram adquiridos à
Merck. Sais de cloreto de sódio, cloreto de magnésio hexahidratado, ácido clorídrico (HCl) e
dimetilsulfóxido (DMSO) foram obtidos na Riedel – de Haën; sulfato de sódio (Na2SO4) foi
obtido na Panreac; pepsina contendo 0,53 U/mg foi adquirida à Fluka; hidróxido de sódio
(NaOH) foi obtido à Absolve; butanol foi adquirido ao BDH Biochemicals. DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium), HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution), PBS (Phosphates Buffer
Solution), tripsina, FBS (Foetal Bovine Serum), glutamina e Pen-Strep (penicilina e
estreptomicina) foram adquiridos à Lonza (Merck). O metanol utilizado no decorrer de todo o
trabalho era HPLC grade e foi adquirido à Fisher Scientific.
Os ácidos cafeico (Fluka), cinâmico (Fluka), rosmarínico (Aldrich) e Trolox (Sigma) foram
obtidos comercialmente.
Os ésteres de colina – cafeato de colina, cinamato de colina, 3,4-dimetoxicinamato de colina,
rosmarinato de colina e trolox de colina – e o Trolox foram gentilmente cedidos pela
Professora Doutora Amélia Santos, pertencente ao Centro de Química Estrutural do Instituto
Superior Técnico.
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 20
1.2. Linhas Celulares
A linha celular utilizada foi Caco-2 (ATCC#HTB-37), uma linha de células epiteliais de
adenocarcinoma colorrectal. As células foram gentilmente cedidas pelo Professor Doutor
Carlos Farinha, pertencente ao Centro de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa.
1.3. Equipamentos
As absorvências foram lidas num espectrofotómetro de feixe duplo UV-Vis M350 da Camspec e
num leitor de microplacas Tecan Sunrise. A análise de HPLC (High Precision Liquid
Chromatography) foi realizada num cromatógrafo líquido Finnigan™ Surveyor® Plus Modular
LC System equipado com uma coluna Purospher® STAR RP-18 da Merck e software Xcalibur. Os
ensaios celulares foram realizados numa câmara de fluxo laminar Esco Class II Biohazard Safety
e as células guardadas numa estufa Shel Lab CO2 Series da Sheldon Mfg. Inc. As reacções
químicas foram monitorizadas por TLC usando placas de alumínio revestidas com sílica gel 60
F254 (Merck) e para as suas detecções usou-se UV 254nm. Os compostos foram secos num
liofilizador Heto Power Dry LL 3000. Os espectros de NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
foram realizados num Bruker AVANCE III 300MHz. A formação de lipossomas foi efectuada
num Ultrasonic Processor UP200S da Hielscher e num Mini-Extruser Avanti® da Polar Lipids,
Inc., utilizando membranas Whatman® Shleicher & Schuell de poro 0,1µm. Para a secagem dos
lipossomas usou-se um excicador Nalgene™ da Nalgene ® Brand Products.
2. Métodos
2.1. Determinação da Actividade Antioxidante (método do DPPH)
A actividade antioxidante foi determinada através de um teste clássico, o teste do DPPH (Tepe
et al.2006). Este método baseia-se na capacidade dos compostos para extinguir radicais livres,
neste caso o DPPH, através da transferência de um átomo de hidrogénio (figura 8).
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 21
Figura 8 Esquema reaccional de extinção do DPPH. O radical DPPH apresenta uma cor púrpura mas
quando é reduzido deixa de ter cor, pelo que não absorve a 517 nm.
Adicionou-se 15µl de solução de composto a 1,5ml de solução metanólica de DPPH 0,02%
(2mg em 100ml de metano destilado). Esta mistura incubou durante 30 minutos e mediu-se a
absorvência a 517 nm contra o branco correspondente (sem DPPH). Uma reacção controlo,
utilizando água/metanol (dependendo do composto) no lugar da solução do composto, foi
considerada como 100% da actividade antioxidante. O ensaio foi realizado em várias
concentrações de cada composto e em triplicado para cada uma das concentrações.
��%� � 100 � ��� �� ��������⁄ � � 100
Em que E(%) é a percentagem de extinção de DPPH, Acontrolo é a média da absorvência da
reacção controlo e Aamostra é a absorvência da reacção com determinada concentração de
composto. A concentração de composto, cuja extinção de DPPH é 50% (EC50) foi determinada
através da regressão obtida pela representação gráfica da percentagem de extinção versus
concentração de solução de composto.
2.2. Inibição da Actividade da Acetilcolinesterase
A actividade enzimática de AChE foi quantificada através da adaptação do método descrito por
Ingkanian et al. (2003). Neste método a acetiltiocolina foi usada como substrato para o AChE,
originando acetato e tiocolina. Da reacção de tiocolina com o 5,5’-Ditiobis(2-ácido
nitrobenzóico) (DTNB) resulta 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e o ião 5-tio-2-
nitrobenzoato (TNB) que tem um pico de absorvência a 405 nm. Estas reacções estão
apresentadas na figura 9.
Radical DPPH (púrpura – 517nm) DPPH reduzido (sem cor)
Materiais e Métodos
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Figura 9 Reacção química de Ellman’s usada para determinar a actividade colinesterase (adaptado de
Frasco et al., 2005).
Adicionou-se, numa cuvette, 325µl de solução tampão Tris/Hepes (50 mM a pH 8,0), 100µl de
solução de composto e 25µl de solução de AChE contendo 0,26 U/ml. Esta mistura incubou
durante 15 minutos e adicionou-se 75µl de solução de AChI (0,023 mg/ml) e 475µl de 3 mM de
DTNB. Noutra cuvette fez-se o branco correspondente (sem AChE) e mediu-se a absorvência a
405 nm. Uma reacção controlo, utilizando água/metanol (dependendo do composto) no lugar
da solução de composto, foi considerada como 100% da actividade enzimática de AChE. O
ensaio foi realizado em várias concentrações de cada composto e em triplicado para cada uma
das concentrações.
��%� � 100 � ��� �� ��������⁄ � � 100
Em que I(%) é a percentagem de inibição enzimática, Acontrolo é a média da absorvência da
reacção controlo e Aamostra é a absorvência da reacção com determinada concentração de
composto. A concentração de composto, cuja inibição da actividade enzimática é 50% (IC50) foi
determinada através da regressão obtida pela representação gráfica da percentagem de
inibição versus concentração de composto.
Acetiltiocolina
Tiocolina Acetato
5,5’-Ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB)
5-tio-2-nitrobenzoato (TNB)
Materiais e Métodos
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2.3. HPLC Analítico
Os compostos foram analisados por HPLC com um volume de injecção de 25µl e o fluxo de
injecção de 1,0 ml/min. Foram realizados vários gradientes de eluição com solução A composta
por acetonitrilo, solução B por metanol e solução C por ácido trifluoroacético 0,05% (v/v),
excepto para o ácido cinâmico. Para este composto a solução C foi composta por ácido
fosfórico 0,3% (v/v).
O gradiente G1 consistiu em inicialmente 10% de solução A e 90% de solução C; 50min, 80% de
A, 15% de B e 5% de C; 52min, 10% de A e 90% de C; 60min, 10% de A e 90% de C.
O gradiente G2 consistiu em inicialmente 10% de solução A e 90% de solução C; 40min, 66% de
A, 12.38% de B e 21.62% de C; 42min, 10% de A e 90% de C; 45min, 10% de A e 90% de C.
O gradiente G3 consistiu em inicialmente 30% de solução B e 70% de solução C; 20min, 90% de
B e 10% de C; 25min, 90% de B e 10% de C; 28min, 30% de B e 70% de C.
2.4. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro
A degradação dos compostos foi efectuada através do método descrito por Yamamoto et al.
(1999). O volume reaccional é de 5mL, no entanto no caso do Cafeato, Rosmarinato e Trolox
de Colina foi usado um volume reaccional de 1mL (500µL de suco artificial, 400µL de H2O e
100µL de amostra a 10 mg/mL) devido à escassa quantidade dos compostos. Todos os ensaios
foram feitos em duplicado e, quando necessário, em triplicado.
2.4.1. Digestão pelo Suco Gástrico Artificial
O suco gástrico artificial consistiu em 320mg de pepsina e 200mg de NaCl em 100mL, a pH 1,2.
Juntou-se 2,5mL de suco gástrico artificial e 2,0mL de H2O, num tubo de ensaio. Para iniciar a
reacção, adicionou-se 0,5mL de amostra a 10 mg/mL ao tubo e colocou-se a 37°C. Para parar a
reacção, juntou-se 100µL de mistura reaccional a 900µL de metanol num vial de HPLC nos
tempos 0h, 1h, 2h, 3h e 4h e manteve-se em gelo. Por fim, injectou-se cada tempo no HPLC
para análise.
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 24
2.4.2. Digestão pelo Suco Pancreático Artificial
O suco pancreático artificial consiste em 25mg de pancreatina de porco para 1mL de tampão
K-fosfatos 50 mM a pH 8,0.
Juntou-se 2,5mL de suco pancreático artificial e 2,0mL de H2O, num tubo de ensaio. Para iniciar
a reacção, adicionou-se 0,5mL de amostra a 10 mg/mL ao tubo e colocou-se a 37°C. Para parar
a reacção, juntou-se 100µL de mistura reaccional a 900µL de metanol num eppendorf nos
tempos 0h, 1h, 2h, 3h e 4h. Faz-se um short spin de 30s para precipitar a proteína, recolheu-se
o sobrenadante para um vial de HPLC e manteve-se em gelo. Por fim, injectou-se cada tempo
no HPLC para análise.
2.5. Ensaios em células Caco-2
O crescimento de células Caco-2 foi feito recorrendo ao método descrito por Kern et al. (2003).
Semearam-se células Caco-2 em meio de cultura DMEM suplementado com 10% soro bovino
(FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina e 2 mM L-glutamina, a 37°C em
atmosfera com 5% de CO2. O meio foi substituído a cada 48h e as células foram recolhidas
depois do processo de tripsinização.
2.5.1. Ensaio de Citotoxicidade em Células Caco-2
Este ensaio foi realizado de acordo com o método descrito por Chen et al. (2008).
Os ensaios de citotoxicidade celular foram realizados pelo método do MTT, indicador da
actividade do desidrogenase mitocondrial, reflectindo a actividade metabólica de células
viáveis. As células vivas têm capacidade para reduzir o MTT a azul de tripano, através da acção
do succinato desidrogenase mitocondrial, enzima que só está activo em células com
metabolismo da cadeia respiratória intacto. Ao adicionar DMSO vai solubilizar o produto roxo
insolúvel (azul de tripano), permitindo a obtenção de uma solução corada que pode ser
quantificada espectrofotometricamente. Assim, é possível determinar a
viabilidade/citotoxicidade celular através da redução do MTT – figura 10.
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 25
Figura 10 Esquema reaccional da redução do MTT. Apenas as células viáveis conseguem reduzir o MTT
(570nm) através do succinato desidrogenase mitocondrial.
Semearam-se as células tripsinizadas em caixas de 96 poços (0,31 cm2), cerca de 1200 células
num volume de 100µL de meio, até atingir cerca de 90% de confluência (aproximadamente 15
dias). Após atingida a confluência, aspirou-se o meio e adicionou-se 100µL de meio
suplementado com diferentes concentrações de composto (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 mg/mL). Ao
fim de 48h, aspirou-se o meio suplementado e adicionou-se 50µL de PBS para lavar as células.
Adicionou-se meio suplementado com 10% (v/v) solução de MTT 5 mg/mL e incubou-se a caixa
a 37°C durante, aproximadamente, 1h30. Retirou-se o meio e adicionou-se 100µL de DMSO a
cada poço (solubilização do produto da reacção). Após 3h de incubação, leu-se a 570 nm
(referência 630 nm), num leitor de microplacas.
2.5.2. Ensaio de Metabolismo pelas Células Caco-2
O metabolismo pelas células Caco-2 foi adaptado através do método descrito por Kern et al.
(2003).
Para este ensaio, semearam-se cerca de 2 x 104 células em caixas de Petri de 4 cm de diâmetro
e deixaram-se crescer, durante 15 dias, até atingir 80-90% confluência. Após atingida a
confluência, removeu-se o meio e adicionou-se 2,5mL de HBSS suplementado com 0,5 mg/mL
de composto (5% DMSO no final). Às 0h, 1h, 2h, 4h e 6h recolheu-se 300μL do meio e juntou-
se 300μL de MeOH. Seguiu-se uma centrifugação a 9000 rpm durante 10 minutos e recolheu-
se o sobrenadante para análise por HPLC. Ao fim das 6h removeu-se o meio e lavaram-se as
células com 1mL de HBSS novo. Durante 30 minutos deixou-se as células com 1mL de solução
1:10 TFA 0,05%/MeOH para precipitarem e, de seguida, fizeram-se 5 ciclos de 2 minutos de
ultrasons. Por fim, centrifugou-se a 9000 rpm, durante 10 minutos, para precipitar restos
Célula viável
Succinato Desidrogenase Mitocondrial
MTT (amarelo) MTT reduzido (púrpura)
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 26
celulares e recolheu-se o sobrenadante, o qual foi injectado no HPLC para análise. Este ensaio
foi realizado em triplicado.
Em paralelo a este ensaio, realizou-se um ensaio controlo, exactamente idêntico mas na
ausência de células Caco-2. O objectivo do ensaio foi verificar que o composto não era
degradado pelo meio.
2.6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas
A formação de LUV’s com um diâmetro médio de 100 nm foi adaptada do método descrito por
Coutinho et al. (2004).
Os componentes da mistura lipídica foram Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) e colesterol
(Ch) numa razão molar de 7:3 e preparou-se uma solução apropriada da quantidade de lípidos
em clorofórmio. Evaporou-se o solvente num fluxo de azoto, havendo formação de um filme
lipídico fino e, de seguida, colocou-se o resíduo lipídico numa bomba de vácuo durante 2h.
Para preparar lipossomas contendo o ácido cafeico, o filme lipídico, aquecido a 50°C num
banho, foi hidratado com 1mL de 0,1mg/mL de ácido cafeico em tampão PBS (150 mM NaCl,
2,70 mM K2HPO4 e 1,50 mM NaH2PO4) e repetidamente levou-se ao vortex de modo a remover
o máximo possível de lípido das paredes do eppendorf. Em seguida, realizaram-se ciclos de
congelamento-descongelamento, repetidos 8x, usando azoto líquido e um banho a 50°C.
Posteriormente, a suspensão lipídica foi extrudida 23x através de membranas policarbonato
de poros de 100 nm. A solução final foi armazenada a 4°C.
2.7. Dispersão Dinâmica de Luz
A dispersão de luz foi feita recorrendo ao método descrito por Pacheco et al. (2005). A fonte
de luz foi um Spectra Physics 127, 35 mW laser He-Ne, operado no único modo em λ = 632,8
nM. A luz reflectida pelos espelhos chegou à amostra contida numa célula de quartzo Hellma
com 10 mm de percurso óptico. A colecção óptica captura a luz dispersada num ângulo de 90°
em polarização V-V e conduzida através de uma fibra óptica para um fotomultiplicador
ALV/SO-SIPD. A intensidade das funções de correlação foi determinada com UNICOR photon
correlator. O alinhamento do ângulo de 90° foi ajustado com a ajuda de um Melles Griot,
1mW, laser He-Ne. As medições foram realizadas à temperatura ambiente (≈ 20°C).
Materiais e Métodos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 27
Os tempos de correlação, τ, relacionados com a difusividade, D, e o vector de onda de
dispersão, q, τ = (Dq2)-1, foram obtidos das funções de correlação usando o método dos
cumulantes. Os valores do raio hidrodinâmico, Rh, foram obtidos através da equação de
Stokes-Einstein �� ����
����� , fazendo a aproximação de que as partículas estão em condições
de diluição infinita. Considerou-se a viscosidade, h, da água.
2.8. Análise Estatística
Todos os resultados são apresentados como média ± desvio padrão, tendo sido utilizado o
software Microsoft ® Excel 2007.
Adicionalmente realizou-se uma análise estatística ANOVA (do inglês Analysis of Variance) de
distribuição F-Snedecor com um intervalo de confiança de 95%.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 28
Capítulo III – Resultados e Discussão de Resultados
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 29
Os ácidos hidroxicinâmicos, como os ácidos cafeico e rosmarínico, apresentam um grande
poder antioxidante (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Mais recentemente, Falé et al. (2009)
evidenciou que para além desta propriedade, o ácido rosmarínico também exibia actividade
inibidora de AChE. Uma vez que estes compostos apresentaram actividade inibidora de AChE e
dado que a colina é o substrato natural deste enzima, propôs-se a combinação destes ácidos
fenólicos com colina, originando ésteres de colina que poderiam ser melhores inibidores do
enzima em causa. Assim, neste trabalho, utilizaram-se ésteres de colina do trolox e dos ácidos
cafeico, cinâmico, 3,4-dimetoxicinâmico e rosmarínico – figura 11.
Ácido Cafeico Ácido Cinâmico Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico
Ácido Rosmarínico
Trolox
Cafeato de Colina
Cinamato de Colina 3,4-Dimetoxicinamato de Colina
Rosmarinato de Colina
Trolox de Colina
Figura 11 Estruturas químicas dos vários ácidos fenólicos e seus derivados de colina usados neste
trabalho.
OH
O
OH
OH
OH
O
O
OH
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
H3CO
OCH3
OH
O
CH3
O
O
N+
CH3
CH3
Cl-
O
OH
CH3
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
N+
CH3
CH3
Cl-
OH
OH
O
O
OO
OH
OH
N+
CH3
CH3
CH3
O
O-
F3C
CH3
O
O
N+
CH3
CH3
OH
OH
O
O-
F3C
Cl-
CH3
O
O
N+
CH3
CH3
H3CO
OCH3
OH
OH
O
O
OH
O
OH
OH
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 30
Primeiramente, foram analisados relativamente à sua actividade antioxidante (ponto 1) e
inibidora do enzima AChE (ponto 2) com a finalidade de saber se as propriedades antioxidantes
se mantinham, em relação ao ácido respectivo, e se possuem capacidade de inibir o enzima
intimamente ligado à AD. Mesmo que os compostos estudados sejam substratos fracos para a
inibição da actividade de AChE, não devem apresentar qualquer toxicidade significativa para
mamíferos. No entanto, poderão apresentar actividade antioxidante, podendo assim ter algum
potencial terapêutico na aplicação à AD.
Para além das suas propriedades biológicas, como antioxidante e inibidora do enzima AChE,
foram realizados estudos de metabolismo gastrointestinal (ponto 3) para se poder conhecer a
estabilidade dos compostos nas condições da digestão (pH ácido do estômago e pH neutro do
suco pancreático, com os respectivos enzimas). Como um dos compostos mostrou boa
actividade inibidora do enzima AChE e biodisponibilidade, seleccionou-se este composto para
prosseguir os estudos. Procedeu-se, assim, à sua síntese química (ponto 4) e continuou-se o
estudo no sentido de determinar o seu comportamento face às células Caco-2 (ponto 5). Este
estudo tem como finalidade avaliar a facilidade com que os compostos podem ultrapassar a
barreira intestinal. Para facilitar a permeação através das membranas celulares, iniciaram-se
estudos com o encapsulamento de ácido cafeico, como modelo, em sistemas lipossomais
(ponto 6).
1. Propriedades Antioxidantes
Nesta primeira fase do trabalho pretendeu-se estudar a capacidade antioxidante dos derivados
de colina obtidos a partir de ácidos fenólicos, face à capacidade antioxidante dos próprios
ácidos utilizados como composto de partida. O estudo desta propriedade foi realizado através
do método do DPPH, um radical estável, sendo avaliado neste teste a existência de compostos
com capacidade para capturarem um radical livre, podendo assim funcionar como
antioxidante.
A concentração de antioxidante que produz 50% de extinção do radical (valor de EC50) é usada
frequentemente como um parâmetro para caracterizar o poder antioxidante. Assim, para cada
um dos compostos realizou-se o ensaio do DPPH para diferentes concentrações destes
compostos. A representação da percentagem de extinção do radical DPPH em função da
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 31
concentração de cada um dos compostos permite estabelecer uma regressão linear, que se
encontram no ANEXO 1. Os valores de EC50 para os vários ácidos e seus derivados são
expressos em µg/mL e µM (tabela 1).
Tabela 1 Valores de EC50 dos vários ácidos e seus derivados, expressos em µg/mL e µM. Análise
estatística ANOVA: ácido cafeico vs cafeato de colina p > 0,05; ácido rosmarínico vs rosmarinato de
colina p < 0,05; trolox vs trolox de colina p < 0,05.
Composto
Actividade Antioxidante
EC50 (µg/mL) EC50 (µM)
Composto
Actividade Antioxidante
EC50 (µg/mL) EC50 (µM)
Ácido Cafeico
4,47±0,03
24,78±0,19
Cafeato de Colina
11,23±2,25
29,62±5,94
Ácido Cinâmico
100(a)
675(a)
Cinamato de Colina
100(c)
371(c)
Ácido 3,4-
Dimetoxicinâmico
100(b)
480(b)
3,4-Dimetoxicinamato
de Colina
100(d)
303(d)
Ácido
Rosmarínico
2,30±0,05
6,38±0,13
Rosmarinato de Colina
2,41±0,10
4,30±0,18
Trolox
3,31±0,09
13,22±0,38
Trolox de Colina
14,27±0,34
38,39±0,93
(a) máximo que se usou no ensaio, apresentando 2,48±1,00% de extinção.
(b) máximo que se usou no ensaio, apresentando 2,20±0,64% de extinção.
(c) máximo que se usou no ensaio, apresentando 3,91±0,28% de extinção.
(d) máximo que se usou no ensaio, apresentando 4,27±0,45% de extinção.
Desde a sua síntese há vinte anos atrás, o antioxidante fenólico sintético Trolox foi investigado
pelo seu poder antioxidante por inúmeros investigadores. A estrutura de Trolox apresenta os
requisitos para uma actividade antioxidante efectiva, ou seja, é um fenol substituído com um
Resultados e Discussão de Resultados
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oxigénio éter em para num sistema de anéis. Assim, a estrutura possui o requisito de
estabilização estereoelectrónica, resultando radicais fenoxilo, através da transferência de um
átomo de hidrogénio para um radical oxigénio activo, tais como peroxilo (figura 12). Devido a
esta estrutura cromanol, que antevê a actividade antioxidante, e o grupo carboxilo com efeitos
de solubilidade moderada em água, Trolox tem vantagens em relação a outros antioxidantes
(Barclay et al., 1995).
O
OH
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
O
O
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
Os ácidos cafeico (EC50 = 24,78 ± 0,19 µM) e rosmarínico (EC50 = 6,38 ± 0,13 µM) apresentam
boa actividade antioxidante quando comparado com o Trolox (EC50 = 13,22 ± 0,38 µM). A boa
actividade antioxidante destes ácidos é devida à presença da fracção catecol que dá origem,
por eliminação do átomo de hidrogénio, a radicais semiquinonas que são altamente
estabilizados por uma ligação hidrogénio intramolecular – figura 13 (Amorati et al., 2006).
Porém, o ácido rosmarínico apresenta uma melhor actividade antioxidante pois exibe dois
grupos catecol, enquanto o ácido cafeico apenas contém um grupo catecol.
Ao contrário dos ácidos cafeico e rosmarínico, os ácidos cinâmico e 3,4-dimetoxicinâmico não
apresentam a fracção catecol responsável pela captação eficiente de radicais livres. Assim,
com igual massa de ácidos cinâmico e 3,4-dimetoxicinâmico só se obteve uma actividade
antioxidante inferior a 5%, não sendo possível determinar o EC50. Estes 5%, provavelmente,
devem-se ao facto de o grupo acrilo (H2C=CH–C(=O)R) ter também alguma relevância na
Figura 13 Mecanismo de reacção de
catecóis com radicais peroxilo,
originando radicais semiquinonas.
HAT = Transferência de átomo de
hidrogénio; ET = Transferência de
electrão; X = qualquer grupo (retirado
de Amorati et al., 2006)
ROO•
Figura 12 Esquema reaccional da acção
antioxidante do Trolox na presença de
radical peroxilo, com formação do
radical fenoxilo.
Resultados e Discussão de Resultados
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determinação das boas propriedades antioxidantes dos derivados do ácido cinâmico (Amorati
et al., 2006).
Com a introdução da fracção colina, o cafeato de colina e o trolox de colina apresentaram
valores de EC50 ligeiramente superiores em relação aos respectivos ácidos (tabela 1). No
entanto, só para o trolox e trolox de colina é que a diferença é estatisticamente significante
para uma probabilidade de 5%.
O trolox de colina (EC50 = 38,39 ± 0,93 µM) e o cafeato de colina (EC50 = 29,62 ± 5,94 µM), para
além de apresentarem os grupos característicos dos seus ácidos respectivos, têm o grupo
hidroxilo (-OH) do grupo carboxilo (COOH) substituído pela colina. Esta deverá ser a causa
provável do aumento do EC50, uma vez que o grupo hidroxilo do grupo carboxilo também
conseguiria captar radicais de uma forma mais eficiente que a fracção colina. Contudo, o
rosmarinato de colina, EC50 = 4,30 ± 0,18 µM, conseguiu apresentar melhor actividade
antioxidante que o respectivo ácido e Trolox. Tal como para os ácidos cinâmico e 3,4-
dimetoxicinâmico, também não foi possível determinar os EC50 para os seus derivados de
colina.
Neste estudo verificou-se que a introdução da fracção colina não afecta a actividade
antioxidante dos compostos de partida com estrutura de ácido, desde que, de facto, já
tivessem a propriedade de serem antioxidantes, logo no início.
2. Inibição da Actividade de Acetilcolinesterase
Desde que a patogénese das fases tardias de AD foi associada a uma deficiência da ACh no
cérebro, utilizam-se inibidores da AChE para o tratamento sintomático da doença. Assim, para
além de conhecer as propriedades antioxidantes dos ácidos e ésteres de colina sintetizados,
também se estudou a capacidade de estes inibirem o enzima que está intimamente ligado ao
tratamento da AD.
Tal como para a determinação da actividade antioxidante, a representação da percentagem de
inibição do enzima em função da concentração de cada composto permite estabelecer uma
regressão linear, a partir da qual se determina a concentração de composto que produz 50%
de inibição do enzima (valor de IC50). As regressões lineares dos vários compostos encontram-
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se no ANEXO 2. Os valores de IC50 para os vários ácidos e seus derivados são expressos em
µg/mL e µM (tabela 2).
Tabela 2 Valores de IC50 dos ácidos e ésteres de colina sintetizados, expressos em µg/mL e µM.
Composto
Inibição de AChE
IC50 (µg/mL) IC50 (µM)
Composto
Inibição de AChE
IC50 (µg/mL) IC50 (µM)
Ácido Cafeico
1000(a)
5551(a)
Cafeato de Colina
34,3±1,9
90,5±5,1
Ácido Cinâmico
1465±92
9885±624
Cinamato de Colina
13,4±1,8
49,8±6,6
Ácido 3,4-
Dimetoxicinâmico
1500(b)
7204(b)
3,4-Dimetoxicinamato
de Colina
2,4±0,3
7,3±0,8
Ácido Rosmarínico
440±26
1222±73
Rosmarinato de Colina
167,3±15,2
299,1±27,2
Trolox
1000(c)
3995(c)
Trolox de Colina
443,4±34,5
1192,7±92,7
(a) máximo que se usou no ensaio, apresentando 25,70±0,07% de inibição.
(b) máximo que se usou no ensaio, apresentando 19,34±0,35% de inibição.
(c) máximo que se usou no ensaio, apresentando 27,27±7,18% de inibição.
O ácido rosmarínico tem boa capacidade de inibição, IC50 = 1,2 mM, relativamente aos outros
ácidos. Todavia, a adição do grupo colina em todos os ácidos originou um aumento drástico na
actividade de inibição do enzima, ou seja, houve uma diminuição do IC50. É o caso do éster de
colina derivado do ácido rosmarínico que apresentou um aumento de 75% na inibição da
actividade.
Os valores obtidos para a inibição de AChE são da mesma ordem de grandeza que os
apresentados com ésteres de colina derivados de aminoácidos, IC50 de 36,9 µM – 1264,3 µM
(Grigoryan et al., 2008). Pelo contrário, quando comparados com o donepezil, IC50 = 11,6 nM
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(Camps et al.,2008), estes compostos têm poder de inibição inferior. Equiparando todos os
compostos sintetizados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina mostrou ter maior capacidade de
inibir o enzima, IC50 = 7,3 µM. Este possui o grupo catecol protegido com dois grupos metoxi
que é semelhante ao donepezil.
Donepezil hidroclorado (E2020; donepezil) é o segundo fármaco aprovado para o tratamento
de AD. Donepezil faz as principais interacções ao longo da cavidade do local activo do enzima
AChE através dos seus três grandes grupos funcionais: o grupo benzilo, a N-piperidina, e o
grupo dimetoxiindanona (figura 14).
H3CO
H3CO
O
N
Perto do fundo da cavidade, o anel benzilo interage com o grupo indolo do Trp84. Na região de
constrição da cavidade, o azoto da piperidina faz uma interacção π-catião com o grupo fenilo
do Phe330. No topo da cavidade, o anel indanona interactua com o anel indolo do Trp279, no
PAS, através da interacção clássica π-π. Estas observações foram relativas ao TcAChE, no
entanto como este é muito semelhante ao AChE dos mamíferos, poderão ser aplicadas as
mesmas conclusões (Kryger et al., 1999; Camps et al., 2008). As interacções entre o donepezil
e o enzima TcAChE estão representadas na figura 15.
N-piperidina benzilo dimetoxiindanona
Figura 14 Estrutura do donepezil com
evidência aos seus três grupos
funcionais: dimetoxiindanona, N-
piperidina e o grupo benzilo.
(adaptado de Kryger et al., 1999)
Figura 15 Donepezil liga-se ao longo do centro activo e interage
com o PAS no topo da cavidade. Donepezil é exibido a verde semi-
transparente; as moléculas do solvente são as bolas a lilás; os
resíduos da tríade catalítica estão a laranja; e a superfície acessível
ao solvente da cavidade é apresentado a castanho. (retirado de
Kryger et al., 1999)
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Dada a semelhança de estrutura do donepezil com o 3,4-dimetoxicinamato de colina, o grupo
do Centro de Química Estrutural do Instituto Superior Técnico realizou estudos de docking
molecular para estudar as interacções dos ésteres de colina com o enzima.
Parece que os potentes inibidores de AChE, como donepezil e 3,4-dimetoxicinamato de colina
são capazes de proteger o local de ligação da ACh ao enzima. Os seus anéis aromáticos são
praticamente coplanares e estão localizados no local de entrada da ACh. Assim, o 3,4-
dimetoxicinamato de colina é capaz de proteger não só o centro activo do enzima com o grupo
amónio como também o local de entrada da ACh através do grupo aromático dimetoxi, tal
como o donepezil. Contrariamente, quando o inibidor não ocupa o local de entrada da ACh, há
um aumento do IC50, isto é, torna-se num inibidor mais fraco. Poderá ser este o motivo pelo
qual os outros compostos não apresentam tão boa actividade inibidora do enzima quando
comparado com o 3,4-dimetoxicinamato de colina.
3. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro
Dado que o enzima AChE actua na junção sináptica neuronal, para que estes compostos
possam actuar como inibidores do enzima AChE é essencial que cheguem intactos ao cérebro,
para actuar a nível de AD. Isto é, não devem ser digeridos/metabolizados pelo tracto digestivo
de modo a serem transportados até ao cérebro, através da corrente sanguínea, tal como são.
Assim, com o objectivo de conhecer as alterações dos compostos que ocorrem ao nível do
tracto digestivo, realizaram-se ensaios de digestão com suco gástrico e suco pancreático
artificiais, in vitro.
O suco gástrico é composto pelo enzima pepsina que é produzido pelas paredes do estômago,
sendo assim possível mimetizar o primeiro passo da digestão. Tem como função quebrar as
proteínas em péptidos mais simples, através da clivagem das ligações peptídicas do lado N-
terminal de aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptofano e tirosina. Este enzima só
apresenta actividade em meio ácido (pH 1,0).
O suco pancreático é um líquido secretado pelo pâncreas que é constituído por um conjunto
de enzimas, incluindo a tripsina, quimotripsina, elastase, carboxipeptidase, lipase e amilase
pancreática. Ao contrário do suco gástrico, o suco pancreático é de natureza alcalina devido à
elevada concentração de iões bicarbonato. Estes são fundamentais para a neutralização do
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 37
ácido gástrico, permitindo uma acção enzimática eficaz. Os enzimas pancreáticos são
responsáveis pela digestão de proteínas – enzimas proteolíticos, pelas gorduras – lipases, e
carbohidratos – amilases. No entanto, alguns dos enzimas proteolíticos do pâncreas são
descritos por terem actividade esterase, tal como tripsina (Ganea et al., 1982) e lipases
(Mattson et al., 1966).
Os resultados dos ácidos e ésteres de colina sintetizados aquando digeridos com os sucos
digestivos estão apresentados na tabela 3. Para cada ensaio de suco digestivo foi considerado
que às 0h existia 100% de composto.
Tabela 3 Percentagem de composto remanescente, ao fim de 4h, dos ácidos e ésteres de colina
sintetizados nos sucos gástrico (SG) e pancreático (SP).
Composto
SG SP
Composto
SG SP
Ácido Cafeico
103,2±5,6
97,9±6,5
Cafeato de Colina
107,5±22,1
7,0±1,0
Ácido Cinâmico
97,1±1,1
93,4±4,2
Cinamato de Colina
89,5±10,4
19,2±7,7
Ácido 3,4-
Dimetoxicinâmico
90,0±22,8
100,8±12,1
3,4-Dimetoxicinamato
de Colina
95,1*
82,8±5,3
Ácido Rosmarínico
99,3±4,5
90,0±2,2
Rosmarinato de Colina
97,6±6,5
40,7±7,2
Trolox
53,3±23,6
100,3±27,3
Trolox de Colina
109,7±12,0
0,3±12,0
* Realizou-se um único ensaio, devido à escassa quantidade de composto.
Como era de esperar, os ácidos não sofreram degradação significativa tanto em meio ácido
como em meio básico, pois não possuem qualquer local de hidrólise para os enzimas presentes
nos sucos. Todavia, o trolox em meio ácido sofreu alguma degradação, ficando apenas 53%
Resultados e Discussão de Resultados
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disponível no suco gástrico. No entanto, não foi visível qualquer surgimento de um novo pico
no cromatograma (anexo 3).
Relativamente aos ésteres de colina sintetizados, estes apresentaram igualmente grande
biodisponibilidade no suco gástrico, logo não são degradados pela pepsina nem pelo meio
ácido. Quanto ao suco pancreático, estes exibiram uma degradação variada. Neste estudo
usou-se a pancreatina comercial para simular o suco pancreático que é constituído por
amilase, tripsina, lipase, ribonuclease e protease. Como referido anteriormente, este suco
possui enzimas com actividade esterase pelo que conseguem clivar a ligação éster destes
compostos, como a tripsina e a lipase. Assim, devido à presença destes enzimas, os ésteres de
colina sofreram hidrólise. A diferença de percentagem de degradação dos ésteres poderá estar
relacionada com a maior afinidade ou não para o centro activo do enzima, ou seja, ésteres
com maior afinidade serão mais degradados.
Para se compreender quais seriam os compostos formados durante a digestão pelo suco
pancreático, foram feitas análises por HPLC de amostras retiradas no decorrer do ensaio
enzimático (figura 16).
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 39
Figura 16 Cromatogramas das digestões pelo suco pancreático nos tempos 0h e 4h dos ésteres de colina
sintetizados: A – Cafeato de Colina (RT = 6.80). Aparecimento de ácido cafeico (RT = 7.67) ao fim de 4h;
B – Cinamato de Colina (RT = 16.51). Aparecimento de ácido cinâmico (RT = 23.86) ao fim de 4h; C – 3,4-
Dimetoxicinamato de Colina (RT = 17.57). Aparecimento de ácido 3,4-dimetoxicinâmico (RT = 21.14) ao
fim de 4h; D – Trolox de Colina (RT = 28.39). Aparecimento de trolox ao fim de 4h (RT = 24.93); E –
Rosmarinato de Colina (RT = 18.62). Aparecimento de ácido rosmarínico (RT = 17.99) e de ácido cafeico
(RT = 11.81) ao fim de 4h.
-20000
30000
80000
130000
180000
230000
0 10 20 30
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
0h
4h
-100000
0
100000
200000
300000
400000
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
0h
4h
-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
0h
4h
-50000
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
0h
4h
-50000
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
0h
4h
A B
C D
E
16.51
16.26
23.86
6.80
7.67
17.57
17.31
21.14
18.62
18.84
17.99
11.81
28.39
24.93
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Tendo em conta os tempos de retenção (RT), os espectros UV dos compostos detectados por
HPLC (anexo 4) aquando digeridos com suco pancreático e os enzimas presentes no suco pode-
se inferir que o cafeato de colina (RT = 6.80; figura 16-A) degrada-se no seu ácido respectivo
(RT = 7.67), visto que ao fim de 6h aparece o pico correspondente a este. Através da recta de
calibração realizada para o ácido cafeico, a degradação do cafeato de colina deu origem a
227,17 ± 3,66 µM de ácido, restando 7% de cafeato de colina. Semelhantemente, o cinamato
de colina (RT = 16.51 às 0h; figura 16-B) originou o seu ácido respectivo (RT = 23.86) ao fim de
6h, permanecendo 19% do éster. O 3,4-dimetoxicinamato de colina (RT = 17.57 às 0h; figura
16-C) degradou-se no seu ácido correspondente, devido ao aparecimento do pico do ácido (RT
= 21.14). Como realizado para o ácido cafeico, fez-se uma recta de calibração para o ácido 3,4-
dimetoxicinâmico. Assim, a degradação do 3,4-dimetoxicinamato de colina originou 9,40 ±
1,53 µM de ácido 3,4-dimetoxicinâmico, ficando aproximadamente 83% do éster. Igualmente,
o trolox de colina (RT = 24.83; figura 16-D) deu origem ao respectivo ácido, com um
rendimento de hidrólise de 100%, ou seja, degradou-se todo o trolox de colina. No caso do
rosmarinato de colina (RT = 18.62 às 0h; figura 16-E), apareceu o pico correspondente ao ácido
rosmarínico (RT = 17.99), aparecendo 81,08 ± 4,06 µM de ácido rosmarínico. Para além deste
éster se degradar no seu ácido, este por sua vez degrada-se em ácido cafeico (RT = 11.81),
aparecendo assim 18,98 ± 3,90 µM de ácido cafeico. Isto acontece porque o próprio ácido
rosmarínico é um éster do ácido cafeico pelo que também é alvo da acção dos enzimas
pancreáticos. Porém, permaneceu no meio aproximadamente 41% de rosmarinato de colina.
In vivo, para além dos enzimas mencionados, existe também a esterase pancreática (também
conhecida como colesterol esterase) que parece ser o enzima hidrolítico responsável pela
hidrólise de ésteres colesteril e ésteres tocoferol (Mathias et al., 1981). Assim, uma vez que o
trolox é um análogo à vitamina E, o seu derivado éster poderá ser alvo da acção deste enzima.
A quimotripsina também hidrolisa ligações éster e tem como principais substratos os
aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptofano, tirosina. Como todos os derivados de
colina são ésteres e possuem anéis aromáticos poderão ser alvos da acção deste enzima.
Porém, como o cafeato e cinamato de colina têm anéis aromáticos semelhantes com a tirosina
e fenilalanina, respectivamente, deverão ser os mais degradados. De seguida, surgiria o
rosmarinato de colina, que é semelhante ao cafeato de colina mas com menos degradação,
talvez devido ao seu grande volume. O menos degradado seria o 3,4-dimetoxicinamato de
Resultados e Discussão de Resultados
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colina possivelmente porque o seu anel aromático contém dois grupos metoxi sendo assim um
pouco diferente dos anéis aromáticos dos aminoácidos.
De todos estes compostos verifica-se que o 3,4-dimetoxicinamato de colina tem uma baixa
degradação, aproximadamente, 13% no suco pancreático, o que permitirá chegar ao intestino
em larga quantidade de produto, caso fosse tomado por via oral.
4. Síntese do 3,4-Dimetoxicinamato de Colina
De todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina foi o que apresentou
melhor inibição do enzima AChE e menor degradação. Com o propósito de realizar estudos em
células Caco-2, foi necessário sintetizá-lo novamente para a continuação do trabalho. Como os
compostos sintetizados até esta fase tinham sido sintetizados pelo grupo da Professora Amélia
Santos do IST, descreve-se agora a síntese química do 3,4-dimetoxicinamato de colina
sintetizado desta vez na FCUL, com a metodologia desenvolvida pelo grupo referido.
A síntese deste composto envolve quatro passos fundamentais: a síntese do 3,4-
dimetoxicinamato de metilo (1); a síntese do ácido 3,4-dimetoxicinâmico (2); a preparação da
colina (3); e, a síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina (4). O esquema reaccional desta
síntese encontra-se elucidado na figura 17.
Figura 17 Esquema reaccional da síntese do 3,4-dimetoxicinamato de Colina. Primeiramente, o ácido
cafeico é metilado, originando o 3,4-dimetoxicinamato de metilo (composto 1). De seguida, hidrolisou-
se o éster com NaOH e acidificou-se o meio com HCl, formando-se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico
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(composto 2). Por fim, depois da colina preparada (composto 3) adicionou-se ao ácido, gerando o 3,4-
dimetoxicinamato de colina (composto 4).
Para se seguir a formação do composto utilizou-se cromatografia em camada fina com sílica,
mediada de fluorescência. As fases móveis usadas foram CHCl3:MeOH 9:1 (X) e
BuOH:HCOOH:H2O 75:14:12 (Y), pois estas permitiram a visualização do aparecimento dos
compostos a sintetizar.
O composto 1 foi obtido através da adaptação do método de Jung et al. (2003). O ácido cafeico
(1g; 5,6mmol) foi metilado com (MeO)2SO2 (3,15mL; 33,3mmol), K2CO3 (4,6029g; 33,3mmol)
em THF (20mL). A mistura reaccional foi aquecida (50-60°C) sob refluxo. Após 43h a reacção
ficou completa. Fez-se uma filtração para remover o K2CO3 e de seguida evaporou-se, no
rotavapor, o THF. Na figura 18 constata-se que na pista 1 o ácido cafeico já não está presente,
convertendo-se na sua totalidade no 3,4-dimetoxicinamato de metilo. Assim, uma vez que a
reacção foi completa, obteve-se 1g de composto 1, apresentando um RF de 0.88 no eluente X
em TLC (figura 18).
O composto 2 foi obtido pela adaptação do método descrito por Bisogno et al. (2007). Para
hidrolisar o éster do composto 1 (0,990g; 4,63mmol) foi adicionado a este 10mL de NaOH 1M
até obter pH 12. Após 2h de agitação, a mistura reaccional foi lavada com éter (2x). Por fim,
acidificou-se o meio de reacção, com algumas gotas de HCl 37% até obter-se um pH de 1-2,
para a precipitação do ácido, extraiu-se com acetato de etilo e o solvente foi evaporado à
secura. Na figura 19 observa-se que, em relação à pista AD, a pista 2 apresenta um arrasto,
pelo que não está completamente puro, obtendo-se 0,551g (2,58mmol; 56%) de composto 2
que apresenta um RF de 0.41 no eluente X em TLC (figura 19). O ácido 3,4-dimetoxicinâmico
(AD) usado como padrão foi o sintetizado previamente pelo grupo IST, tendo sido
caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura química.
Figura 18 TLC da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de
metilo (1). Como controlo utilizou-se o ácido cafeico comercial
(AC - banda da esquerda). Eluente usado – CHCl3:MeOH 9:1. AC 1
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
Este composto sintetizado
identidade. O espectro de 1H
singleto, δ 7.13, 2 dupletos δ
δ 7.53 e δ 6.27, J=16Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados
ácido cafeico (Exarchou et al.
dos dois grupos metilo do anel aromátic
Para preparar a colina (3), p
para secar. A este sólido branco foi adicionado SOCl
110°C) sob refluxo durante 3h. O solvente foi evaporado até à secura.
dissolvido em MeOH (3x) e re
O 3,4-dimetoxicinamato de colina clorado (
do IST (artigo a ser escrito)
dioxano-água (3:2) (10mL) e adicionou
água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou
se o composto 3 (1g; 6,96mmol). Estes sólidos c
para secar. DMSO foi adicionado à mistura quente e a temperatura foi mantida a 60°C durante
15 dias. DMSO foi destilado e o resíduo foi seco na linha de vácuo.
RF de 0.27 no eluente Y em TLC
3,4-dimetoxicinamato de colina (DC)
grupo IST, tendo sido caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura
química.
AD AD+2 2
Resultados e Discussão de Resultados
DQB – FCUL
foi analisado por 1H-NMR (anexo 5), para comprova
H-NMR apresentou os sinais correspondentes aos três protões (1
7.09 e δ 6.90, J=8.4Hz) aromáticos e aos dois protões (2 dupletos,
Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados
et al. 2001), e o sinal correspondente aos 6 protões (1
upos metilo do anel aromático.
Para preparar a colina (3), pôs-se colina clorada (1g; 6,96mmol) no liofilizador durante 24h
para secar. A este sólido branco foi adicionado SOCl2 (10mL) e a reacção foi aquecida (100
C) sob refluxo durante 3h. O solvente foi evaporado até à secura. O sólido obtido foi re
dissolvido em MeOH (3x) e re-evaporado até à secura, para eliminar restos de SOCl
toxicinamato de colina clorado (4) foi obtido através do método descrito
do IST (artigo a ser escrito). Pôs-se o composto 2 (0,359g; 1,72mmol) numa mistura de
água (3:2) (10mL) e adicionou-se uma solução de K2CO3 (123,4mg
água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou
96mmol). Estes sólidos combinados estiveram um dia no liofilizador
para secar. DMSO foi adicionado à mistura quente e a temperatura foi mantida a 60°C durante
15 dias. DMSO foi destilado e o resíduo foi seco na linha de vácuo. O composto
TLC (figura 20). Tal como para o ácido 3,4-dimetoxicinâmico (AD), o
dimetoxicinamato de colina (DC) usado como padrão foi o sintetizado previamente pelo
grupo IST, tendo sido caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura
Figura 19 TLC da reacção de síntese do ácido 3,4-dimetoxicinâmico.
Aplicou-se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico à esquerda (AD); ácido
3,4-dimetoxicinâmico e o composto 2 obtido no meio (AD + 2); e o
composto 2 à direita (2). Eluente usado – CHCl3:MeOH 9:1
Resultados e Discussão de Resultados
43
comprovar a sua
apresentou os sinais correspondentes aos três protões (1
dois protões (2 dupletos,
Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados de
2001), e o sinal correspondente aos 6 protões (1 singleto, δ 3.79)
96mmol) no liofilizador durante 24h
(10mL) e a reacção foi aquecida (100-
O sólido obtido foi re-
evaporado até à secura, para eliminar restos de SOCl2.
descrito pelo grupo
72mmol) numa mistura de
4mg; 0,90mmol) em
água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou-
ombinados estiveram um dia no liofilizador
para secar. DMSO foi adicionado à mistura quente e a temperatura foi mantida a 60°C durante
O composto 4 apresenta um
dimetoxicinâmico (AD), o
sintetizado previamente pelo
grupo IST, tendo sido caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura
dimetoxicinâmico.
dimetoxicinâmico à esquerda (AD); ácido
obtido no meio (AD + 2); e o
:MeOH 9:1.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
Como se observa na figura 20
completa, pelo que na pista 4 é visível a banda correspondente ao
(banda de cima) e ao 3,4-dimetoxicinamato de colina (banda de baixo).
separá-los, o resíduo obtido
Merck. A separação foi efectuada no eluente ACN:H
separação foi conseguida pois verifica
ácido correspondente (banda de cima). N
composto 4 da sílica.
A sílica com o 3,4-dimetoxicinamato de colina foi retirada da placa e
metanol. Após algum tempo de agitação foi filtrada.
se uma TLC dos vários filtrado
dimetoxicinamato de colina (
tempo em metanol, o composto
substituição do resíduo de colina pelo grupo metilo
AD DC 4
AD
Resultados e Discussão de Resultados
DQB – FCUL
Como se observa na figura 20, a reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina não foi
pelo que na pista 4 é visível a banda correspondente ao ácido 3,4-
dimetoxicinamato de colina (banda de baixo). Com o objectivo de
obtido foi re-dissolvido em CHCl3 e colocado em placas TLC de 1mm da
Merck. A separação foi efectuada no eluente ACN:H2O (3:1). Como é visível n
pois verifica-se a separação do éster de colina (banda de baixo) do
ácido correspondente (banda de cima). No entanto, o problema surgiu na extracção do
oxicinamato de colina foi retirada da placa e foi ressuspendi
pós algum tempo de agitação foi filtrada. Este processo foi repetido três vezes e f
filtrados e todos estes apresentavam um Rf semelhante ao do 3,4
dimetoxicinamato de colina (figura 22-A). Porém, ao fim de algumas extracções
, o composto começou a alterar-se sofrendo uma transesterificação com
substituição do resíduo de colina pelo grupo metilo. Possivelmente devido à fracção
Figura 20 TLC da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de
colina (4). Como controlos utilizaram-se o ácido 3,4
(AD - banda da esquerda) e 3,4-dimetoxicinamato de colina (
banda do centro). Eluente usado – BuOH:HCOOH:H
DC
Figura 21 TLC da separação do
composto 4. A banda superior
corresponde ao ácido 3,4
dimetoxicinâmico (AD)
inferior ao 3,4-dimetoxicinamato
de colina (DC). Eluente usado
ACN:H2O 3:1.
Resultados e Discussão de Resultados
44
dimetoxicinamato de colina não foi
-dimetoxicinâmico
Com o objectivo de
em placas TLC de 1mm da
Como é visível na figura 21, a
se a separação do éster de colina (banda de baixo) do
o problema surgiu na extracção do
ressuspendida em
Este processo foi repetido três vezes e fez-
um Rf semelhante ao do 3,4-
). Porém, ao fim de algumas extracções e de algum
se sofrendo uma transesterificação com
Possivelmente devido à fracção colina ser
dimetoxicinamato de
se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico
dimetoxicinamato de colina (DC -
BuOH:HCOOH:H2O 75:14:12.
da separação do
banda superior
corresponde ao ácido 3,4-
(AD) e a banda
dimetoxicinamato
. Eluente usado –
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
melhor grupo sainte que o grupo metilo
Tal é visível através do aparecimento de uma banda mais hidrófoba (com R
Figura 22 TLC’s da reacção de síntese do 3,4
dimetoxicinamato de colina (DC
sílica, onde se observa o éster pretendido (composto 4).
metanol. O éster sofreu transesterificação, a
composto ficou metilado originando o 3,4
Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos
metabolismo nas células Caco
5. Metabolismo pelas células Caco
As células Caco-2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,
amplamente utilizadas para mimetizar a barreira de células
estudo da digestão nos sucos gástrico e pancreático, o passo seguint
composto em estudo é metabolizado e/ou absorvido pelas células
máxima importância porque para o composto chegar ao cérebro é necessário que ultrapasse a
barreira intestinal, sem sofrer alterações, para poste
Assim, com a finalidade de
absorvido pelas células intestinais
Primeiramente, efectuou-se um ensaio de
composto poderia ser tóxico
verificaria essa toxicidade. Como se utilizou a mistura, 3,4
DC 4 DC
Resultados e Discussão de Resultados
DQB – FCUL
melhor grupo sainte que o grupo metilo, obtendo-se novamente o composto
Tal é visível através do aparecimento de uma banda mais hidrófoba (com Rf superior)
da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina. Como controlo usou
dimetoxicinamato de colina (DC - bandas da esquerda). (A) TLC’s de algumas extracções
, onde se observa o éster pretendido (composto 4). (B) TLC da solução após algum tempo em
metanol. O éster sofreu transesterificação, aparecendo uma banda mais hidrofóbica
originando o 3,4-dimetoxicinamato de metilo (banda superior)
Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos
metabolismo nas células Caco-2 foram efectuados com a mistura dos dois.
Metabolismo pelas células Caco-2
2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,
amplamente utilizadas para mimetizar a barreira de células epiteliais intestina
estudo da digestão nos sucos gástrico e pancreático, o passo seguinte é perceber se o
composto em estudo é metabolizado e/ou absorvido pelas células intestinais
máxima importância porque para o composto chegar ao cérebro é necessário que ultrapasse a
barreira intestinal, sem sofrer alterações, para posteriormente entrar na corrente sanguínea.
de compreender se o composto em estudo é metabolizado e/ou
absorvido pelas células intestinais, realizaram-se ensaios de metabolismo com
se um ensaio de toxicidade/viabilidade com o intuito
tóxico para as células e, caso assim fosse, em que concentração se
Como se utilizou a mistura, 3,4-dimetoxicinamato de colina e ácido
(A)
4 DC 4 DC 4
Resultados e Discussão de Resultados
45
se novamente o composto 1 (figura 22-B).
superior).
dimetoxicinamato de colina. Como controlo usou-se 3,4-
de algumas extracções do composto da
ção após algum tempo em
o uma banda mais hidrofóbica, ou seja, o
(banda superior).
Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos de
2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,
intestinais. Ora, feito o
e é perceber se o
intestinais. Esta análise é de
máxima importância porque para o composto chegar ao cérebro é necessário que ultrapasse a
riormente entrar na corrente sanguínea.
é metabolizado e/ou
com células Caco-2.
toxicidade/viabilidade com o intuito de saber se o
, em que concentração se
dimetoxicinamato de colina e ácido
(B)
4
Trimetilado
DC
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 46
3,4-dimetoxicinâmico, realizou-se o método do MTT com diferentes concentrações desta.
Verificou-se pelo ensaio do MTT (figura 23) que as células se mantinham viáveis e
metabolicamente activas a qualquer concentração usada. Ou seja, a partir deste estudo,
conseguiu-se confirmar que nem o 3,4-dimetoxicinamato de colina nem o seu ácido respectivo
são tóxicos para as células. Contudo, devido aos grandes desvios padrões observados, o ensaio
de metabolismo pelas células Caco-2 foi efectuado com 0,5 mg/mL da mistura.
Como se pode observar na figura 24, ao fim de 1h há uma ligeira diminuição de ácido 3,4-
dimetoxicinâmico no meio das células, mas depois volta a aumentar. Estas oscilações são
normais se os compostos entrarem e saírem das células. Pelo contrário, o 3,4-
dimetoxicinamato de colina não apresentou qualquer alteração, permanecendo inalterável no
meio (anexo 6).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Via
bili
dad
e (%
)
[Mistura] (mg/mL)
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6
Bio
dis
po
nib
ilid
ade
(%)
Tempo (h)
Figura 23 Ensaio de viabilidade celular,
pelo método do MTT, aquando exposto
à mistura (3,4-dimetoxicinamato de
colina + ácido 3,4-dimetoxicinâmico).
Análise estatística ANOVA: p > 0,05.
Figura 24 Ensaio de biodisponibilidade
do ácido 3,4-dimetoxicinâmico, presente
na mistura, pelas células Caco-2. Análise
estatística ANOVA: p > 0,05.
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 47
Quando ao fim das 6h de ensaio se romperam as células para visualizar o seu interior, as
oscilações observadas do ácido 3,4-dimetoxicinâmico no meio das células puderam ser
explicadas. Na figura 25 está representado o cromatograma do interior das células ao fim das
6h de incubação com a mistura. No cromatograma é bem visível o aparecimento do pico
respeitante ao ácido 3,4-dimetoxicinâmico (RT = 19.80) no interior das células, sendo o pico
com RT = 15.03 correspondente ao composto do meio de cultura, o HBSS.
Actualmente, sabe-se que as células Caco-2 possuem um transportador de ácido
monocarboxílico (MCT). Um grupo carboxilo monoaniónico e uma cadeia apolar ou uma
fracção aromática hidrofóbica parecem ser os componentes necessários para ser substrato do
MCT (Konishi & Kobayashi, 2005). Estudos realizados com os ácidos ferúlico e p-cumárico (ver
estruturas na figura 7) demonstraram que estes são absorvidos através do transportador MCT
(Konishi & Shimizu, 2003; Konishi et al., 2003), uma vez que possuem um grupo carboxilo
monoaniónico e um anel aromático relativamente hidrófobo. No caso do ácido cafeico, este é
preferencialmente absorvido via paracelular mas também é transportado via MCT. No
entanto, como o ácido cafeico é um derivado dihidroxi do ácido cinâmico a afinidade para o
transportador diminui, relativamente aos ácidos acima referidos, pois a região do anel é
menos hidrófoba (Konishi & Kobayashi, 2004). Pelo contrário, o ácido clorogénico (ver
estrutura na figura 7) tem um grupo monocarboxilo na porção do ácido quínico e uma porção
aromática como o ácido cafeico, o que poderia ser um substrato para o MCT. Porém, o grupo
éster parece causar um efeito negativo na interacção com o transportador MCT (Konishi &
Kobayashi, 2004), pelo que este não é transportado via MCT.
Tendo este conhecimento, é possível explicar os resultados obtidos neste estudo. Apesar do
éster 3,4-dimetoxicinamato de colina ter um anel hidrófobo não é transportado via MCT, pois
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
0 10 20 30 40 50Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
19.80
Figura 25 Cromatograma do interior
das células ao fim de 6h de
incubação com a mistura de 3,4-
dimetoxicinamato de colina e ácido
3,4-dimetoxicinâmico. Aparecimento
do ácido com RT = 19.80. O pico com
RT = 15.03 corresponde ao HBSS
(meio de cultura).
15.03
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 48
possui um grupo éster com carga positiva, o que pode ter um efeito impeditivo na interacção
da molécula com MCT. No entanto, o ácido 3,4-dimetoxicinâmico como é um derivado
dimetoxi do ácido cinâmico pode ser transportado pelo MCT e também via paracelular,
entrando, assim dentro das células, como detectado pela análise por HPLC (figura 25).
A ausência de flora intestinal em estudos in vitro faz com que não seja detectável a
permeabilidade dos compostos na barreira intestinal. Em estudos in vivo, a flora intestinal
exibe actividade esterase. Assim, o ácido clorogénico, que não é transportado pelo MCT, pode
ser hidrolisado por uma esterase, formando-se o ácido cafeico que, por sua vez, pode ser
transportado via MCT (Konishi & Kobayashi, 2004). Igualmente, o 3,4-dimetoxicinamato de
colina será susceptível de sofrer hidrólise por uma esterase da flora intestinal, originando o
ácido 3,4-dimetoxicinâmico. Este, por sua vez, pode ser transportado via MCT, entrando assim
para o interior das células, no entanto, perderá deste modo a sua fracção colina necessária à
inibição do enzima AChE.
A utilização do 3,4-dimetoxicinamato de colina conjuntamente com o correspondente ácido foi
favorável ao estudo, pois assim permitiu o conhecimento da entrada do ácido para o interior
das células. O suposto mecanismo para a absorção do ácido 3,4-dimetoxicinâmico e o seu
derivado éster de colina é elucidado na figura 26.
Figura 26 Vias propostas para a absorção de 3,4-dimetoxicinamato de colina.
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 49
6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas
Uma vez que o 3,4-dimetoxicinamato de colina apresenta actividade inibitória do enzima
AChE, mas não tem actividade antioxidante, a proposta seria fazer chegar ao interior da célula
dois compostos, um com actividade inibidora do enzima e outra com actividade antioxidante,
de modo a que pudessem existir duas funcionalidades que poderia conduzir ao melhoramento
da doença. Deste modo e como o ácido 3,4-dimetoxicinâmico não apresenta actividade
antioxidante, poder-se-ia utilizar o 3,4-dimetoxicinamato de colina com o ácido cafeico que é
um bom antioxidante. Contudo, como os derivados de colina não permeiam a barreira
intestinal, começou-se primeiramente por desenvolver o sistema de lipossomas para o ácido
cafeico para futuramente se poder encapsular a mistura em questão.
As propriedades benéficas dos lipossomas como transportadores de fármacos foram
reconhecidas pela primeira vez nas décadas de 1970 e 1980, e o seu número de aplicações
biofarmacêuticas têm aumentado rapidamente. Lipossomas são, a partir de uma perspectiva
morfológica, mais frequentemente classificados pela sua dimensão e número de bicamadas
membranares (lamelas). As vesículas unilamelares são de especial interesse na investigação,
principalmente devido às propriedades das membranas estarem bem caracterizadas e por ser
de fácil preparação. Elas são divididas em três tipos de tamanho: pequena, grande e gigante
(Jesorka & Orwar, 2008).
Neste estudo, foram preparadas vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e grandes (LUVs).
Primeiramente a solução lipídica foi bem seca, formando-se um filme lipídico. Para a formação
de vesículas multilamelares (MLVs), o filme lipídico foi hidratado com um tampão. Os MLVs
formados foram reduzidos através da técnica de extrusão e de sonicação, formando-se LUVs e
SUVs, respectivamente.
Inicialmente, reduziram-se os MLVs a SUVs, através da técnica de sonicação, fazendo-se 5
ciclos de 0.6 com 75% de amplitude, cada ciclo com uma duração de 3 minutos. Pela técnica da
dispersão dinâmica de luz (DLS), determinou-se o perfil de distribuição dos tamanhos dos
lipossomas na solução. Os resultados preliminares da DLS mostraram a existência de um
sistema polidisperso, isto é, com partículas de diferentes tamanhos, com diâmetros que
variam desde poucas dezenas de nanómetros até diâmetros de várias ordens de grandeza
superiores. Isto verifica-se pelo facto das funções de correlação apresentarem a tempos de
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 50
correlação baixos, um decaimento exponencial correspondente a partículas mais pequenas
essencialmente com o mesmo tamanho (entre 10 e 30 nm), mas, simultaneamente, para
tempos de correlação muito superiores evidenciaram a existência de processos
correspondentes à dinâmica de partículas, ou aglomerados, de tamanhos de várias ordens de
grandeza superiores ao das partículas mais pequenas. Assim, de modo a recolher os
lipossomas de menores dimensões, fez-se uma filtração de exclusão molecular, com uma
coluna Sephadex LH-20, utilizando tampão PBS como eluente. Seguidamente, analisou-se as 19
fracções por UV-Vis com o intuito de visualizar a presença de ácido cafeico. De todas as
fracções, as fracções 12 e 13 foram as que mostraram espectros mais intensos e bem definidos
(figura 27). Efectivamente, o espectro da fracção 12 é semelhante ao espectro do ácido
cafeico. Todavia, no espectro da fracção 13 observa-se uma dispersão de luz, ou seja, o
espectro é quase idêntico ao do ácido cafeico mas as bandas têm intensidades diferentes, pelo
que se pode inferir que o ácido cafeico se encontra dentro dos lipossomas. Contudo, a partir
deste processo não se conseguiu separar os lipossomas de menores dimensões dos de
maiores.
Figura 27 Espectros de
UV-Vis das fracções 12 e
13 recolhidas. A fracção
12 (em cima) apresenta
um espectro típico do
ácido cafeico, enquanto a
fracção 13 (em baixo)
exibe dois picos de igual
intensidade.
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 51
Decidiu-se reduzir os MLVs pela técnica de extrusão utilizando membranas de poro 0,1 µm, de
modo a obter lipossomas de 100 nm – LUVs. No extrusor usado, ao fim de 11 passagens já há
uma grande quantidade de LUVs, tendo-se uma distribuição gaussiana. Assim, quanto mais
passagens se efectuar menor é a variância, pelo que se fez 23 passagens, de forma a conseguir
o maior número possível de LUVs com 100 nm. De seguida, fez-se uma centrifugação a 19 000g
durante 30min com o intuito de separar o ácido cafeico livre do encapsulado. Porém, não se
conseguiu realizar esta separação, pois a solução permaneceu incolor e portanto não sofreu
qualquer alteração, provavelmente devido aos lipossomas terem tamanho reduzido. Logo,
continuou-se o trabalho com a mistura dos dois. Para se conseguir quantificar a absorção de
ácido cafeico encapsulado, efectuou-se um branco que consistiu em células Caco-2 incubadas
com ácido cafeico livre.
Como é visível na figura 28, há uma ligeira diminuição de ácido cafeico no meio das células
Caco-2 ao fim de 6h quando este é encapsulado em lipossomas, de 5,60 para 5,47 µg/mL. Esta
diferença mínima, mas significativa, pode ser o fruto da junção dos lipossomas com a parede
celular, conduzindo à entrada de ácido cafeico para o interior das células. Contudo, estes
resultados não puderam ser confirmados quando se romperam as células (figura 29).
Provavelmente, pode ter entrado uma concentração mínima, a qual não foi detectável pelo
HPLC.
Figura 28 Concentração de ácido
cafeico no meio das células Caco-2 às
0h e 6h de ensaio, quando incubadas
com ácido cafeico encapsulado (e
não-encapsulado) em lipossomas e
ácido cafeico livre. Análise estatística
ANOVA: AC livre p > 0,05; AC
encapsulado p < 0,05.
Resultados e Discussão de Resultados
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 52
Não se encontraram na literatura resultados de encapsulamento de ácido cafeico em
lipossomas. No entanto, estudos realizados com o sistema constituído por fosfatidilcolina e
colesterol, semelhante ao utilizado neste trabalho, para encapsular ATP demonstraram que
conseguiam encapsular 0,38 µmol de ATP por µmol de lípido total, ou seja, 38% (mol) (Liang et
al., 2004).
Estes resultados foram promissores, pois demonstraram que o ácido cafeico pode ser mais
facilmente introduzido no interior das células quando dentro de lipossomas, todavia é
necessário ainda muito estudo sobre a elaboração do sistema em questão de modo a
aumentar a quantidade de composto a permear as células. Por outro lado, os ensaios foram
muito preliminares para se avaliar a eficiência de encapsulamento do ácido cafeico, sendo
preciso melhorar o sistema constituído pelos próprios lipossomas e o processo da sua
obtenção.
O sistema aqui utilizado foi escolhido por ser o sistema “clássico” de formação de lipossomas,
sobre o qual existe maior número de referências bibliográficas. Contudo, o sistema com
fosfatidilcolina poderá não ser o mais apropriado para o encapsulamento de 3,4-
dimetoxicinamato de colina, pois poderá haver repulsão electrostática entre as unidades
“colina” do composto e do lípido constituinte do lipossoma e, portanto, seria interessante
utilizar outros sistemas para encapsulamento.
05000
1000015000200002500030000350004000045000
0 10 20 30
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
Tempo (min)
AC livre
AC encapsulado
Figura 29 Cromatograma do interior das
células Caco-2 ao fim de 6h de ensaio,
quando incubadas com ácido cafeico
livre e ácido cafeico encapsulado (e não-
encapsulado) em lipossomas.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 53
Capítulo IV – Conclusão
Conclusão
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 54
De todos os compostos fenólicos estudados (ácidos cafeico, cinâmico, rosmarínico, 3,4-
dimetoxicinâmico e trolox), o ácido rosmarínico apresentou maior actividade antioxidante.
Contudo, observou-se que a introdução da fracção colina não afectou o poder antioxidante
dos ésteres quando comparado com os correspondentes ácidos. Porém, a existência da
fracção colina melhorou exponencialmente a actividade inibidora do enzima AChE, obtendo-se
IC50 mais baixos. Assim, de todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina
foi o inibidor mais potente, apresentando um IC50 = 7,3µM. Este contém um grupo catecol
protegido com grupos metoxi que é semelhante ao fármaco aprovado pela FDA, o donepezil.
Todavia, sabe-se que os componentes da conjugação de ácidos hidroxicinâmicos e colina são
compostos naturalmente não tóxicos, pelo que será mais uma vantagem destes compostos.
A metabolização ao longo do tracto digestivo foi estudada in vitro. Com excepção do trolox,
nenhum composto é degradado no suco gástrico. No suco pancreático, os ácidos não sofreram
praticamente degradação, pelo que se mantiveram presentes no meio. O trolox, rosmarinato,
cinamato e cafeato de colina apresentaram degradação significativa, pois estes devem ter
requisitos para serem substratos dos enzimas pancreáticos. O 3,4-dimetoxicinamato de colina
foi o que apresentou menor degradação aquando digerido com suco pancreático.
Face ao metabolismo e inibição do enzima, o 3,4-dimetoxicinamato apresentou ser o melhor,
pelo que este foi o escolhido para continuação dos estudos de metabolização.
O estudo de metabolização exterior às células Caco-2 e de biodisponibilidade através destas
células foi estudado com o 3,4-dimetoxicinamato de colina em conjunto com o ácido
correspondente. Embora não se tenha observado alterações significativas do ácido 3,4-
dimetoxicinâmico e do éster de colina no meio das células, ao fim das 6h quando se romperam
as células, encontrou-se o ácido dentro do interior destas. Este ácido poderá ter entrado via
paracelular e através do transportador MCT, tal como descrito na literatura para o ácido
cafeico. Como não se visualizou a presença do éster de colina dentro das células, este não
passará pela barreira intestinal, no entanto é um forte candidato a ser metabolizado pela flora
intestinal que contém esterases. Os ensaios preliminares de permeação da barreira intestinal
com lipossomas e ácido cafeico encapsulado, como padrão, demonstraram que os lipossomas
facilitam a entrada do ácido cafeico nas células.
Com estes resultados expostos permite-nos propor a realização de alguns estudos, para
melhorar a compreensão de alguns ensaios.
Conclusão
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 55
Primeiramente, deverá se separar o ácido 3,4-dimetoxicinâmico do seu éster de colina com
eficiência para ser possível prosseguir com os estudos. Após obtenção do éster de colina,
verificar os resultados obtidos no ensaio com células Caco-2, ou seja, esclarecer se o 3,4-
dimetoxicinamato de colina é absorvido e/ou metabolizado pelos intestinos, de modo a passar
a barreira intestinal. Caso não se observe a entrada do composto sem sofrer hidrólise,
encapsular este em lipossomas. Para tal, aperfeiçoar a técnica iniciada nesta dissertação,
começando por fazer extrusão com membranas de poros superiores ao usado neste trabalho,
por exemplo 200 ou 400 nm. Assim, é provável que pelo menos seja possível separar o
composto livre do encapsulado. Posteriormente, realizar ensaios em células Caco-2 com os
lipossomas para descobrir se assim o 3,4-dimetoxicinamato de colina passa a barreira
intestinal. Também seria interessante saber se o 3,4-dimetoxicinamato de colina se encontra
nas paredes do lipossoma ou está numa forma solúvel, uma vez que possui a fracção colina.
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 56
Bibliografia
Bibliografia
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 57
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Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 62
Anexos
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 63
1. Determinação dos EC50
Extinção do radical DPPH em função da concentração de alguns compostos. O valor final de
EC50 é determinado pela média dos três ensaios.
y = 7618,4x + 15,766R² = 0,9932
y = 7615,7x + 15,928R² = 0,9796
y = 7688,4x + 15,955R² = 0,9709
0102030405060708090
100
0 0,005 0,01 0,015
Exti
nçã
o (
%)
[Ácido Cafeico] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 1686,7x + 34,804R² = 0,9679
y = 1291,5x + 32,55R² = 0,9046
y = 1957,1x + 28,13R² = 0,976
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,01 0,02 0,03Ex
tin
ção
(%
)[Cafeato Colina] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 18531x + 6,5277R² = 0,9755
y = 17303x + 10,366R² = 0,999
y = 17537x + 10,444R² = 0,9915
0102030405060708090
100
0 0,002 0,004 0,006
Exti
nçã
o (
%)
[Ácido Rosmarínico] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 16170x + 12,863R² = 0,9893
y = 17050x + 7,5294R² = 1
y = 16192x + 10,634R² = 0,9974
0102030405060708090
100
0 0,002 0,004 0,006
Exti
nçã
o (
%)
[Rosmarinato Colina] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 12982x + 5,7868R² = 1
y = 12658x + 9,2719R² = 0,9919
y = 12696x + 8,0411R² = 0,9994
0102030405060708090
100
0 0,002 0,004 0,006 0,008
Exti
nçã
o (
%)
[Trolox] (mg/mL)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 2267x + 17,094R² = 0,9894
y = 2157,5x + 20,053R² = 0,9852
y = 2156,8x + 18,883R² = 0,9626
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0,01 0,02 0,03 0,04
Exti
nçã
o(%
)
[Trolox Colina] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 64
2. Determinação dos IC50
Inibição do enzima AChE em função da concentração de alguns compostos. O valor final de IC50
é determinado pela média dos três ensaios.
y = 44,422x - 15,794R² = 0,8354
y = 61,299x - 33,677R² = 0,9704
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
100,0
0 1 2 3
Inib
ição
(%
)
[Ácido Cinâmico] (mg/mL)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 1771,7x + 29,415R² = 0,8655
y = 1132,9x + 34,639R² = 0,9822
y = 2214,7x + 16,411R² = 0,9548
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 0,01 0,02 0,03 0,04In
ibiç
ão (
%)
[Cinamato Colina] (mg/mL)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 979,42x + 14,376R² = 0,9986
y = 940,62x + 17,929R² = 0,9545
y = 980,35x + 18,102R² = 0,8551
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0,02 0,04 0,06
Inib
ição
(5
)
[Cafeato Colina] (mg/mL)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 191,78x + 21,03R² = 0,9626
y = 232,52x + 10,563R² = 0,8977
y = 254,69x + 3,836R² = 0,9974
0102030405060708090
0 0,1 0,2 0,3 0,4
Inib
ição
(%
)
[Rosmarinato Colina] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
y = 89,428x + 7,0466R² = 0,988
y = 113,33x + 3,3048R² = 0,9989
y = 107,22x + 3,0385R² = 0,9965
0
10
20
30
40
50
60
70
0 0,2 0,4 0,6
Inib
ição
(%
)
[Trolox Colina] (mg/ml)
Replicado 1
Replicado 2
Replicado 3
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 65
3. Cromatograma do Trolox após digestão gástrica
Cromatograma do Trolox aquando digerido pela pepsina presente no suco gástrico artificial. O
pico com RT = 25.14 corresponde ao trolox, não havendo aparecimento de outro pico.
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
dad
e (u
AU
)
T (min)
25.14
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 66
4. Espectros UV detectados por HPLC
Espectros UV dos compostos detectados por HPLC do cafeato de colina (A), cinamato de colina
(B), 3,4-dimetoxicinamato de colina (C), rosmarinato de colina (D/E) e trolox de colina (F)
aquando digeridos com suco pancreático. Os tempos de retenção (RT) dos compostos estão
indicados em minutos.
0100000200000
300000400000500000600000700000800000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Cafeato Colina - RT: 7.67
-500000
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Cinamato Colina - RT: 23.86
A
B
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 67
-150000
-100000
-50000
0
50000
100000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
3,4-Dimetoxicinamato Colina - RT: 21.14
-200000
20000400006000080000
100000120000140000160000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Rosmarinato Colina - RT: 11.81
-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Rosmarinato Colina - RT: 17.99
C
D
E
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 68
-100000
0
100000
200000
300000
400000
500000
200 300 400 500 600
Ab
sorv
ênci
a
Comprimento de onda (nm)
Trolox Colina - RT: 24.74
F
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB
5. Espectro de 1H-NMR do Ácido 3,4
Espectro de NMR de 1H do ácido 3,
apresenta os sinais correspondentes aos três protões (1 singleto
6.90, J=8.4Hz) aromático, aos dois protões (2 dupletos,
insaturada e o sinal correspondente aos 6 protões (1
do anel aromático.
DQB – FCUL
NMR do Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico
H do ácido 3,4-dimetoxicinâmico (composto 2), em MeOD.
os sinais correspondentes aos três protões (1 singleto, δ 7.13, 2 dupletos
aos dois protões (2 dupletos, δ 7.53 e δ 6.27, J=16
insaturada e o sinal correspondente aos 6 protões (1 singleto, δ 3.79) dos dois gr
Anexos
69
dimetoxicinâmico (composto 2), em MeOD. O espectro
3, 2 dupletos δ 7.09 e δ
6.27, J=16Hz) da cadeia
dois grupos metilo
Anexos
Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 70
6. Ensaio de biodisponibilidade pelas células Caco-2
Ensaio de biodisponibilidade do 3,4-dimetoxicinamato de colina, presente na mistura, pelas
células Caco-2, ao longo de 6h de ensaio.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6
Bio
dis
po
nib
ilid
ade
(%)
Tempo (h)
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