UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA Facultad de Ingenierías
Departamento de Ingeniería de Alimentos Maestría en Ciencias Agroalimentarias
i
EVALUACION DEL PROCESO DE FERMENTACION
DEL LACTOSUERO ÁCIDO (ENTERO Y DESPROTEINIZADO)
UTILIZANDO Lactobacillus casei
KATIA ISABEL CURY REGINO
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE INGENIERÍAS
MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARÍAS
BERÁSTEGUI, CÓRDOBA
2013
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA Facultad de Ingenierías
Departamento de Ingeniería de Alimentos Maestría en Ciencias Agroalimentarias
ii
EVALUACION DEL PROCESO DE FERMENTACION
DEL LACTOSUERO ÁCIDO (ENTERO Y DESPROTEINIZADO)
UTILIZANDO Lactobacillus casei
KATIA ISABEL CURY REGINO
Tesis presentada en opción al Título Académico de Máster en Ciencias
Agroalimentarias con énfasis en Tecnología de los alimentos
MSc. MARGARITA ARTEAGA MARQUEZ
Ph. D. ALBA DURANGO VILLADIEGO
Directoras
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE INGENIERÍAS
MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARÍAS
BERÁSTEGUI, CÓRDOBA
2013
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iii
La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas, conceptos y resultados
del proyecto, serán responsabilidad de los autores.
Artículo 61, acuerdo N0 093 del 26 de noviembre de 2002 del consejo superior.
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iv
Nota de aceptación
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________
Firma del jurado
______________________________
Firma del jurado
_____________________________
Firma del jurado
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v
DEDICATORIA
Dedico lo que representa este trabajo de grado en mi vida personal y
profesional a
CAMILO ANDRES…
Mi guerrero de mil batallas…el ser más valiente que he conocido…
Quien hoy está en un mejor lugar, lleno de paz y rodeado del amor de Dios...
A quien siempre llevare en mi corazón y en mis recuerdos, como el motor que
me impulsa a seguirlo intentando… Quien me enseño que no existen imposibles
y que se puede sonreír en la adversidad…
Descansa en paz mi monito hermoso…
KATIA ISABEL
“Las pruebas te hacen fuerte. Las penas te hacen humano. Los fracasos te
hacen humilde. Y solo Dios, te mantiene en pie”…
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vi
AGRADECIMIENTOS
A DIOS todopoderoso, por el don de la vida y por permitirme superar los
obstáculos y alcanzar con éxito esta meta.
A mis padres JULIO y LUZ NELLY y a mis hermanas ANY, YULY y
LORENA, gracias por su apoyo incondicional paciencia y permanente
motivación a seguir adelante a pesar de las dificultades.
A mis Directoras de trabajo de grado Msc MARGARITA ARTEAGA
MARQUEZ, Ph. D. ALBA DURANGO VILLADIEGO y a los docentes
Ph. D. GUILLERMO MARTINEZ y Ph. D. CLAUDIA DENISE DE PAULA
por su invaluable apoyo y por el tiempo dedicado para aconsejarme y orientarme
a lo largo de este proyecto de investigación, a CARLOS MARIO GAMERO
REDONDO por su colaboración.
A mis jurados de trabajo de grado por sus aportes y contribución de
conocimiento para con este trabajo.
A la Universidad de Córdoba y a los tutores de la Maestría, mi recuerdo e
inmensa gratitud por compartir conmigo sus conocimientos y por regalarme su
amistad y confianza.
A mis amigos y compañeros del programa de Maestría en Ciencias
Agroalimentarias, en especial a LINDA, BEATRIZ, YENIS, DALDO,
ANGELLY Y JORGE EMILIO que de una u otra manera contribuyeron con la
investigación y a mi crecimiento profesional y personal.
A la Universidad de Sucre, en especial a ANA MARTINEZ, DERIS
CUMPLIDO, YELITZA AGUAS, OLGA PERNA, BRYDYZ MAZZY y
ROBER BETIN, al igual que a mis compañeros de la Secretaria de Desarrollo
Economico y Medio Ambiente de la Gobernación de Sucre por su paciencia en
mis crisis, su colaboración y motivación constante y a la empresa
COLQUESOS, por su contribución para con el desarrollo de este trabajo.
A todos aquellos amigos que facilitaron de algún modo mi tránsito a través de
este nuevo camino lleno de dificultades y satisfacciones.
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vii
TABLA DE CONTENIDO
pag
1. INTRODUCCION 2
2. REVISION DE LITERATURA 6
2.1. EL LACTOSUERO: PROBLEMÁTICA EN TORNO A SU
PRODUCCION Y MANEJO 6
2.2. TIPOS DE LACTOSUERO 16
2.3. COMPOSICION Y CARACTERISTICAS 18
2.3.1 Características fisicoquímicas del lactosuero 21
2.3.2 Composición del lactosuero 22
2.3. USOS Y APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO 22
2.4. APROVECHAMIENTO BIOTECNOLOGICO DEL LACTOSUERO 27
2.5. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO 34
2.6. Lactobacillus casei COMO PRODUCTOR DE ACIDO LACTICO 39
3. MATERIALES Y MÉTODOS 44
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN 44
3.2. LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO 44
3.3. MATERIALES EMPLEADOS 44
3.4. PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN 45
3.4.1. Obtención del lactosuero 45
3.4.2. Caracterización de los lactosueros utilizados 45
3.4.3. Proceso de fermentación 46
3.4.4. Seguimiento de la fermentación 51
3.4.5. Procesamiento y análisis 55
3.4.6. Diseño Estadístico 55
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 57
4.1. CARACTERIZACIÓN DEL LACTOSUERO 57
4.2. RELACIÓN DE LA ACIDIFICACIÓN CON EL TIPO DE
LACTOSUERO E INÓCULO. 58
4.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO, CONSUMO DE SUSTRATO Y
FORMACIÓN DEL PRODUCTO. 64
4.3.1. Parámetros fermentativos 73
4.3.2. Parámetros cinéticos 77
5. CONCLUSIONES 85
6. RECOMENDACIONES 86
BIBLIOGRAFIA 87
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viii
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Clasificación de los lactosueros según su acidez. 17
Tabla 2. Composición porcentual de los lactosueros 19
Tabla 3. Caracterización de lactosuero ácido entero y desproteinizado 20
Tabla 4. Características fisicoquímicas de los lactosueros dulce y ácido. 21
Tabla 5. Composición porcentual del lactosuero dulce y ácido. 22
Tabla 6. Producción de ácido láctico, acético y etanol por lactobacillus
casei
42
Tabla 7. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero 42
Tabla 8. Análisis fisicoquímicos 46
Tabla 9. Características fisicoquímicas de los lactosueros 57
Tabla 10. Medias de producción biomasa, ácido láctico y consumo de
lactosa.
71
Tabla 11. Coeficientes estequiométricos Yp/s, Yx/s y Yp/x,Op,Ox 74
Tabla 12. Parámetros de los modelos 82
Tabla 13. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico 84
Tabla 14. Especificaciones de Lactobacillus Caseí ATCC 393 105
Tabla 15. Especificaciones de AGAR M.R.S OXOIDCM0361 109
Tabla 16. Estadística descriptiva - Análisis de Covarianza de las variables
Lactosuero e inóculo
111
Tabla 17. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el
tiempo
114
Tabla 18. Análisis de varianza para biomasa 121
Tabla 19. Análisis de Varianza para Consumo Lactosa 122
Tabla 20. Análisis de Varianza para Ácido Láctico 123
Tabla 21. Análisis de Varianza para Yp/s 124
Tabla 22 Análisis de Varianza para Yp/x 125
Tabla 23 Análisis de Varianza para Yx/s 126
Tabla 24 Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.
128
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ix
LISTA DE FIGURAS Pag
Figura 1. Exportaciones de Quesos - Enero a Junio de 2012 13
Figura 2. Producción de ácido láctico a partir de lactosa 35
Figura 3. Ecuación estequiometrica de producción de ácido láctico
36
Figura 4. Fermentación Heteroláctica 43
Figura 5. Efecto de la interacción del tipo de lactosuero (a) 1: entero,
2: desproteinizado; y del porcentaje de inóculo (b) en la acidificación
(°D).
59
Figura 6. Acidificación con del L. casei debido al efecto combinado del tipo de
lactosuero y concentración de inóculo (■: 5%; ▲:10%; ♦: 15%)
60
Figura 7. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero entero
inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.
63
Figura 8. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero
desproteinizado inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.
63
Figura 9. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero entero y 5% de inóculo.
65
Figura 10. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero desproteinizado y 5% de inóculo.
65
Figura 11. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero entero y 10% de inóculo.
67
Figura 12. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero desproteinizado y 10% de inóculo.
68
Figura 13. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración
de lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero entero y 15% de inóculo.
69
Figura 14. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en
lactosuero desproteinizado y 15% de inóculo.
69
Figura 15. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 5% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
78
Figura 16. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 10% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
79
Figura 17. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 15% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
79
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x
Figura 18. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 5% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado
(∆).
80
Figura 19. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 10% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado
(∆).
80
Figura 20. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 15% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado
(∆).
81
Figura 21. a) Determinación de Acidez por titulación y b) Medición de pH de
los lactosueros
106
Figura 22. c) Determinación de densidad d) Humedad y ST 106
Figura 23. e) Determinación de contenido de nitrógeno y porcentaje de proteína
presente en los lactosueros
107
Figura 24. f) Determinación de porcentaje de grasa presente en los lactosueros 107
Figura 25. g) Determinación de contenido de cenizas h) Determinación de
Contenido de Lactosa.
107
Figura 26. Lactobacillus casei activado 108
Figura 27. Formación del cultivo madre en leche entera UHT a) antes de
inocular la cepa de Lactobacillus caseí b) luego de incubación de la
cepa c) Control
108
Figura 28. Montajes Proceso de Fermentación batch 108
Figura 29. Curva de calibrado para azucares reductores – Lactosa 110
Figura 30. Curva patrón microorganismo 110
Figura 31. Gráfico de medias de la Acidez 113
Figura 32. Efectos principales para biomasa
121
Figura 33. Efectos principales para biomasa
121
Figura 34. Gráfico de Interacción para consumo de lactosa
122
Figura 35. Gráfico de interacción para ácido láctico
123
Figura 36. Gráfica de interacción para Yp/s
124
Figura 37. Gráfica interacción para Yp/x
125
Figura 38. Gráfica de interacción para Yx/s
126
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xi
ANEXOS
Pág.
Anexo A. Ficha técnica del microorganismo empleado 105
Anexo B. Evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para la
caracterización fisicoquimica y evaluación del proceso de
fermentación de los lactosueros objeto de estudio.
106
Anexo C. Ficha técnica del medio de cultivo empleado 109
Anexo D. Curvas de calibración 110
Anexo E.
Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e
inóculo.
111
Anexo F.
Análisis estadístico de los lactosueros para los
tratamientos y el tiempo
114
Anexo G. Análisis factorial de los parámetros estequiométricos 121
Anexo H. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret. 128
Anexo I. Modelos cinéticos aplicados 130
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xii
RESUMEN
El empleo de suero de leche acidificado de manera controlada para la obtención de
quesos hilados, se perfila como una alternativa mucho más eficiente que la aplicada
actualmente por empresas productoras de quesillo o queso tipo mozzarella. Se fermenta
de manera espontánea e incontrolada el lactosuero, lo cual pone en riesgo la salud del
consumidor y reduce la calidad del producto obtenido. El propósito de esta
investigación fue evaluar el proceso de acidificación del lactosuero ácido (entero y
desproteinizado) a través de una fermentación con Lactobacillus casei para determinar
la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y el porcentaje de inóculo adecuado
en la producción de la acidez requerida para la elaboración de quesos hilados (quesillo
y tipo mozzarella). Se caracterizó fisicoquímicamente el lactosuero y se sometió a una
fermentación anaeróbica a 37°C en constante agitación (120 rpm) por un periodo de 96
horas. Se evaluó la concentración de biomasa en el medio, consumo de lactosa,
producción de ácido láctico y se estimaron los parámetros cinéticos y estequiométricos.
Se aplicó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2x3,
donde el primer factor es el tipo de lactosuero, con 2 niveles (entero y desproteinizado)
y el segundo factor es la cantidad de inóculo adicionada con 3 niveles (5%, 10%, 15%)
con tres repeticiones, para un total de 18 unidades experimentales. El procesamiento de
los datos y su análisis se realizó empleando los paquetes estadísticos SAS versión 9 y
Statgraphics® centurión XVI. Los lactosueros, entero y desproteinizado empleados,
se encontraron dentro de los rangos fisicoquímicos aceptables para su acidificación. Se
logró una acidificación hasta valores superiores a los 120°D con la inoculación de L.
casei a 37°C y 120 rpm, excepto en el lactosuero desproteinizado, inoculado con un
15% de cultivo. Las ecuaciones logística modificada y Gompertz presentaron mejor
ajuste para describir las etapas logarítmica, exponencial y estacionaria del L. casei en
los medios. El modelo de Luedeking-Piret se ajusta adecuadamente a la formación de
ácido láctico. El lactosuero entero con 15% de inóculo, alcanzo 120°D en el menor
tiempo (34 horas), mostrando parámetros cinéticos de crecimiento (µmax = 0.004 h-1
) y
de formación de producto (α = 0,37 g ácido láctico UFC-1
y = 0,09 g ácido láctico
(UFC h)-1
), donde α es la contantes estequiometrica y una constante de
proporcionalidad.
Palabras claves: aprovechamiento agroindustrial, suero de leche, L casei, ácido láctico,
queso hilado, parámetros cinéticos
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xiii
ABSTRACT
The use of acidified whey controlled way to obtain yarn cheeses, it emerges as a much
more efficient alternative than the currently applied by producers of mozzarella string
cheese or cheese where spontaneously fermented and uncontrolled the whey, which
threatens consumer health and reduce the quality of the product obtained. The purpose
of this study was to evaluate the process of acidification of the acid whey (whole and
deproteinized) through fermentation with Lactobacillus casei, to determine the
influence of treatment applied to the whey and the percentage of suitable inoculum for
the production of the required acidity for cheese making yarn (string cheese and
Mozzarella). Was characterized physicochemically the whey and was subjected to
anaerobic fermentation at 37 °C under constant agitation at (120 rpm) for a period of 96
hours. We assessed the concentration of biomass in the medium, lactose consumption,
lactic acid production and were estimated kinetic and stoichiometric parameters. It was
performed a experimental design completely random with factorial arrangement in 2x3,
where first factor is the type of whey, with 2 levels (whole and deproteinized), and
second factor are the amount of inoculum added, with 3 levels (5%, 10%, 15%), with
three repetitions, for a total of 18 experimental units. The data processing and analysis
was performed using SAS statistical package version 9 and Statgraphics® centurión
XVI. The whole and deproteinized whey used were found within ranges
physicochemical acceptable for its acidification. Acidification was achieved to values
above 120 ° D with inoculation of L. casei at 37 °C and 120 rpm, except in the
deproteinized whey inoculated with 15% of crop. The modified logistic and Gompertz
equations presented best fit to describe the stages logarithmic, exponential and
stationary of L. casei in the media. The Luedeking-Piret model fits well to the
formation of lactic acid. The whole whey with 15% of inoculum, reached 120 °D in the
shortest time (34 hours), showing kinetic parameters of growth (μmax = 0.004 h-1
) and
product formation (α = 0.37 g lactic acid UFC-1
and = 0.09 g lactic acid (UFC h-1
),
where α is the stoichiometric constant and a proportionality constant.
Keywords: Agroindustrial utilization, whey, L casei, lactic acid, cheese yarn, kinetic
parameters
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2
INTRODUCCION
En los procesos de obtención de queso, caseína o coprecipitados se genera
lactosuero, subproducto que se puede convertir en un problema ambiental
importante; siendo este líquido translúcido y amarillo verdoso, uno de los
materiales más contaminantes que existen en la industria alimentaria (Parra
2009).
La industria láctea está enfrentada a regulaciones que prohíben el vertimiento de
lactosuero en fuentes naturales de agua, por su carácter contaminante y alta
producción; se estima que a partir de 10 litros de leche de vaca se puede
producir de 1 a 2 kg de queso y un promedio de 8 a 9 kg de lactosuero, lo cual
representa cerca del 85 - 90% del volumen de la leche, que contiene alrededor
del 55% de sus nutrientes; lo que corresponde a decir que el volumen de
lactosuero es aproximadamente 7 a 10 veces mayor que el queso producido,
según su variedad (Liu et al. 2005; Callejas et al. 2012).
El lactosuero se constituye en el principal residuo de la industria láctea, pues
solo una parte de este es usado para alimentación animal o es procesado, pero el
resto es tratado como un desecho; de manera que, aproximadamente, 47 % de
las 115 millones de toneladas de lactosuero, producido a nivel mundial, fueron
desechadas sin tratamiento previo al ambiente, en ríos, lagos o en el suelo, lo
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3
que además de ocasionar un gran daño, también representa una pérdida
significativa de recursos (Guerrero et al. 2012). El no darle un uso adecuado al
lactosuero, crea un enorme desperdicio de nutrientes que pueden ser
aprovechados en la alimentación humana; se estima que en términos de
composición y de valor energético, los sólidos del lactosuero son comparables a
la harina de trigo (357 Kcal/100 gr), lo que hace un alimento con mucho
potencial. (Inda 2000; Lagua 2011).
El no darle un uso adecuado al lactosuero, crea un enorme desperdicio de
nutrientes que pueden ser aprovechados en la alimentación humana, pues cerca
del 70% de la proteína cruda que se encuentra en el suero corresponde a
proteínas con un valor nutritivo superior al de la caseína (Kirk et al. 2005); que
se caracterizan porque contiene proteínas y fracciones proteicas de alto valor
biológico. El alto contenido de nutrientes que genera aproximadamente con un
contenido de materia orgánica entre 40 y 60 g/L de DBO y entre 50 y 80 g/L de
DQO de lactosuero líquido (Kavacik y Tapaloglu 2010; Guerrero et al. 2012), se
compone principalmente de lactosa, proteínas, grasas y minerales; siendo la
lactosa, el principal componente de sólidos que contribuye a la alta DBO y DQO
(Ghaly y Kamal 2004; Mukhopadhyay et al. 2005; Koutinas et al. 2009;
Almeida et al. 2009; Kavacik et al. 2010; Guerrero et al. 2012).
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4
En los últimos años se ha creado la necesidad de conocer la naturaleza del
lactosuero, su composición y valor nutricional, con el objetivo de concentrarlo o
modificarlo para usarlo apropiadamente como ingrediente, fuente de nutrientes
o materia prima para la de otros derivados; el lactosuero se ha empleado en
muchos productos alimenticios, como bebidas, cremas para untar, mantequilla,
concentrado proteínico, lactosa, proteínas en polvo, suero en polvo
desmineralizado y quesos como el quesillo, entre otros,
Colombia, para el año 2012, registró en los departamentos de Antioquia y
Cundinamarca un total de 10 millones de kg de queso comercializado, donde se
obtuvieron aproximadamente 90.000.000 L de lactosuero (Martínez 2012). Los
departamentos de Córdoba y Sucre, presentan un creciente desarrollo en lo que a
la industria láctea se refiere, en especial en la producción de quesos frescos.
Alrededor del 70% del total de la producción lechera se destina a la elaboración
de queso, para lo cual se emplean sistemas artesanales e industriales. La
fabricación no estandarizada de quesos constituye un renglón importante en la
economía de muchos pobladores; siendo un producto de consumo masivo
(Gallegos et al. 2007). Empresas productoras de quesillo o queso tipo
mozzarella fermentan de manera espontánea el lactosuero producto del proceso
del día anterior, pero estas fermentaciones se producen de manera incontrolada
de modo que en algunos casos podrían representar un riesgo para la salud del
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5
consumidor y van en detrimento de la calidad del producto obtenido; lo
conveniente es que este se realice empleando los microorganismos y
condiciones adecuadas para garantizar mejoras en el proceso y en el producto
obtenido; así como el aprovechamiento de este importante subproducto
agroindustrial por parte de las plantas productoras de queso de pasta hilada
como la empresa COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo, pudiéndose
posteriormente replicar esta tecnología en otras queseras de la región.
El propósito de esta investigación es evaluar el proceso de acidificación de
lactosuero ácido (entero y desproteinizado) por fermentación con Lactobacillus
casei para su utilización en elaboración de quesos de pasta hilada, buscando
determinar la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y del porcentaje
de inóculo adicionado en la producción de acidez, como alternativa para el
aprovechamiento de los nutrientes que contiene este subproducto. De este modo
no será necesario el empleo de acidulantes durante el proceso de coagulación
mixta aplicado en la elaboración de quesos como tipo mozzarella; de modo que
se desarrolle una tecnología que permita suprimir la práctica de someter a
fermentación espontánea el lactosuero, afectando la calidad higiénica del
producto terminado; y el mejoramiento de sus características organolépticas.
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6
2. REVISION DE LITERATURA
2.1. EL LACTOSUERO: PROBLEMÁTICA EN TORNO A SU
PRODUCCION Y MANEJO
La leche ha sido uno de los primeros productos pecuarios utilizados por el
hombre, es un alimentos completo e incluso, uno de los primeros alimentos
sometidos a procesos fermentativos debido a la facilidad con que pueden crecer
y multiplicarse diferentes bacterias que la acidifican, constituyéndose esta
materia prima en la base de numerosos derivados ampliamente utilizados en las
industrias agroalimentarias, químicas y farmacéuticas (Valencia y Ramírez
2009). Esta industria, ha sido ampliamente cuestionada por generar impacto
negativo ambiental y por caracterizarse por la producción de cantidades
importantes de residuos orgánicos e inorgánicos, que presentan características
contaminantes (FAO 2012).
Hay una tendencia sostenida de incremento de la demanda de productos lácteos
en los países en desarrollo (China, Norte de África, Oriente Medio y Rusia),
impulsado por el aumento del ingreso per cápita y por un proceso de
urbanización de la población (la población urbana ha superado a la rural en el
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7
mundo) que ha generado cambios en los hábitos alimenticios y un mayor
consumo de lácteos en la dieta. Se dice que el queso es el producto más
representativo, llegando a considerarlo como el más importante de los productos
lácteos en valor. La producción de quesos en 2011 fue de 14,9 Mtn, apenas un
1,1% más que en 2010; siendo los principales elaboradores la UE con 7 Mtn,
EE.UU con 4,8Mtn, Brasil quien fabricó 0,67 Mtn, seguido de cerca por
Argentina con 0,55 Mtn. El consumo de quesos fue de 14,5 Mtn. Las
exportaciones alcanzaron 1,4 Mtn; estos países al liderar la producción de
queso, son los a su vez los mayores productores de lactosuero, al igual que
Francia, Alemania e Italia, donde la producción mundial anual de suero lácteo es
de aproximadamente 145 Mtn, de las cuales 6 millones son de lactosa (Valencia
y Ramírez 2009; Cadenas Agroindustriales 2012)
Durante la coagulación de la leche, presentada en todo proceso industrial donde
se produzca queso, caseína o coprecipitados, se obtendrá un subproducto que se
puede convertir en un problema ambiental importante: el lactosuero o suero de
leche; líquido claro de color amarillo verdoso, obtenido al separar la leche en
dos fases: la cuajada, que posteriormente es escurrida y prensada dando lugar al
queso y el líquido resultante que representa del 80 al 90% del volumen de leche
tratada de la cual contiene el 50% de los nutrientes; obteniéndose cantidades 7 a
10 veces mayores de lactosuero que de queso producido (Monsalve y Gonzales
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8
2005). También se dice que el suero es la fase acuosa de la leche, obtenida por
medio de acidificación, aplicación de calor o coagulación enzimática (Gutiérrez
2006).
Aproximadamente 90% del total de la leche utilizada en la industria quesera es
eliminada como lactosuero, el cual retiene cerca de 55% del total de
ingredientes de la leche como la lactosa, proteínas solubles, lípidos y sales
minerales. Algunas posibilidades de la utilización de este residuo han sido
propuestas, pero las estadísticas indican que una importante porción de este
residuo es descartada como efluente el cual crea un serio problema ambiental
(Aider et al. 2009; Fernandes et al. 2009), debido a que afecta física y
químicamente la estructura del suelo, lo anterior resulta en una disminución en
el rendimiento de cultivos agrícolas y cuando se desecha en el agua, reduce la
vida acuática al agotar el oxígeno disuelto (Aider et al. 2009).
El uso que tradicionalmente se le ha dado a este subproducto, es suministrarlo
como alimento a los animales domésticos especialmente cerdos. Cuando el
productor de queso no encuentra otra forma de utilizarlo, escoge esparcirlo a las
fuentes de agua o al suelo, causando deterioro del medio ambiente y
desaprovechamiento de un nutriente proteico potencialmente útil en la
alimentación humana (Gómez et al. 2010).
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9
Los productores de queso están enfrentados a las regulaciones encaminadas a
prohibir el vertimiento de éste en fuentes naturales, por su carácter corrosivo y
alta carga de materia orgánica. Por lo tanto, en los últimos años se ha dado la
necesidad de conocer su naturaleza, composición y valor nutricional; para
concentrarlo o modificarlo y darle un uso apropiado como ingrediente, fuente de
nutrientes y fuente de otros derivados o compuestos de interés o en caso
contrario someterlo a tratamientos o transformaciones biológicas encaminadas a
su descontaminación (Pelayo 2009).
En el año 2005, a nivel mundial, la distribución de la producción de lactosuero
fue: Europa 53%, América del Norte y central 28%, Asia 6%, África 5%,
Oceanía 4%, América del Sur 4%, anualmente, estos porcentajes representan
110-115 millones de toneladas métricas de lactosuero y son producidas para la
elaboración de queso (Briczinski y Roberts 2002; Revillion et al. 2003;
Londoño 2006; Almécija 2007; Parra 2009). Para el año 2008 ascendió a 186
millones de toneladas; la Unión Europea (UE) y los EE.UU producen alrededor
del 70% del volumen mundial de este producto (Cruz et al. 2009).
En 1999, la producción de quesos en España, según estimaciones de la Unión
Europea fue de 287.000 toneladas; produciendo aproximadamente
2.870.000.000 de litros de lactosuero, que equivale a 8.000.000 de litros/día,
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10
cuyo poder contaminante corresponde al de una población de 26-32 millones de
habitantes/día (Ronda 2000).
En Tulancingo y Acatlán, México, 450.000 L/día de lactosuero, son producidos
por 67 plantas productoras de queso tipo Oaxaca y mantequilla, generando gran
polémica y encendiendo las alarmas, por las afectaciones de tipo ambiental
generada al verterse sin tratamiento hacia arroyos y drenajes de los municipios
de la región, canalizándose hacia el río Tulancingo y perneándose hacia el
subsuelo, agregándose a los mantos acuíferos. Otra parte del lactosuero
impermeabiliza las capas del suelo con sus contenidos grasos, desperdiciando el
alto contenido proteínico de esta sustancia (Cervantes et al. 2010). En el estado
de Hidalgo, se encuentran establecidas un gran número de empresas
procesadoras de lácteos, las cuales generan lactosuero dulce y ácido y con la
mezcla de ambos producen requesón, dando origen a un tercer tipo de lactosuero
(Guerrero 2012).
Durante el 2009, en Argentina de las 508.069 toneladas de quesos producidas se
repartieron entre los tres tipos de pasta y los quesos fundidos; existiendo
aproximadamente 12 plantas procesadoras de suero de leche, en su mayoría
localizadas en la zona pampeana y se producen aproximadamente 450.000 ton
de suero líquido/año, de los cuales el 62% se destina para alimentación animal,
el 33% se procesa para obtención de lactosa, caseínas, caseinatos y concentrados
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proteicos, un 4% se destina para la producción de suero en polvo y el 1%
restante es tratado como efluente (Moreau 2003; Cruz et al. 2009).
Venezuela para el año 2011 produjo 49.300.000 kilogramos de queso industrial
(en plantas); observándose una muy importante producción de quesos
artesanales (frescos de menor duración), elaborados con técnicas principalmente
manuales. De igual modo, se registraron importaciones de quesos en todas sus
variedades de 21.430.406,79 kilogramos, según cifras de importaciones oficiales
del país, donde se puedo observar que Uruguay se encuentra en primer lugar
como proveedor con un 44% de participación en el mercado Venezolano.
Seguidamente, Argentina con un 36% de participación y en tercer lugar Holanda
con un 13% de participación (ProChile 2012). Estos volúmenes representan de
igual modo una apreciable producción de lactosuero, que desde tiempos remotos
ha despertado el interés no solo por lo polémico de su manejo, sino por la
presencia de proteínas con altos niveles de aminoácidos como triptófano, lisina,
y aminoácidos azufrados que le imparten un alto valor nutricional, incentivando
la realización de investigaciones orientadas hacia su aprovechamiento a escala
industrial (Monsalve y Gonzalez 2005).
En Colombia, en el año 2011, según ANALAC, la producción de leche se
estimó en 5595 millones de litros (Suarez et al. 2012, MADR et al. 2011).
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Estudios señalan que la producción de leche en un día del año 2011, se estimó
en 12.979.075 litros, obtenidos de un total de 2.858.779 vacas en ordeño con
una productividad de 4,5 lts./vaca/día. Los departamentos que presentaron la
mayor producción de leche fueron: Antioquia (18,5%), Cundinamarca (16,3%),
Boyacá (11,7%) y Nariño (6,0%) (DANE-ENA 2011).
El Acopio industrial de leche (millones de litros), fue de 2.557 para el año 2010
y 2.669 para el año 2011, mostrando una variación del 4,40%; durante el primer
semestre del año 2012 (Salamanca, 2012), de igual modo, para el año 2010, en
los departamentos de Antioquia y Cundinamarca se registró un total de 10
millones de kg de queso comercializado, donde se obtuvieron aproximadamente
90.000.000 L de lactosuero (Martínez 2012).
Es poca la información actualizada que se consigue en cuanto a producción de
lactosuero, sin embargo, se opta por estimar el que se generaría durante la
producción del queso que es exportado, sumado al producido de manera
industrial para consumo interno, pero resulta imposible conocer las cifras
totales, si se considera que el generado a nivel artesanal en muchos casos no es
reportado. Del mismo modo, no se cuenta con datos concretos en cuanto a usos
o destino dado a este subproducto. Se sabe que Colombia exportó 50 toneladas
de leche en polvo a USA y Ecuador, 10 toneladas de Lactosuero a Bolivia y 372
toneladas de queso a otros países, estas exportaciones fueron realizadas solo por
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las empresas Alpina y Colanta (Salamanca, 2012), con los destinos descritos en
la Figura 1.
.
Figura 1.Exportaciones de Quesos - Enero a Junio de 2012
Fuente: Salamanca, 2012
En Colombia, en el Departamento de Córdoba la producción industrial de leche
y sus derivados ha ido en aumento, de la mano con la expansión ganadera. Se
produce alrededor de 677.746 Litros de leche/día, de los cuales 77.544 son
procesados, 101.263 se destinan a autoconsumo y 498.939 es vendida; de esta
leche vendida, solo 237.098 se destina a la industria, y el valor restante es
tomado por intermediarios (DANE-ENA 2011).
Según Marinovich y Villadiego (2010), la relación entre el volumen de leche
empleada y de queso productivo oscila de 10.3 a 11.47 Kg/100 Kg de leche. De
acuerdo con la información de producción de leche en finca en Córdoba,
reportada en las encuestas nacionales agropecuarias de Minagricultura, del total
de la producción de leche diaria, alrededor de una quinta parte se destina a la
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elaboración de queso: 9% procesada en finca y 11% por queseros
independientes.
Por lo tanto, se evidencia un alto nivel de informalidad empresarial, pues
alrededor del 80% de las empresas queseras no poseen registros de Cámara de
Comercio ni registro sanitario expedido por el INVIMA, pese a lo cual es
evidente que constituye un eslabón importante en la cadena láctea, al producir
alrededor de 61,0 toneladas de queso por semana, siendo una fuente no
despreciable de empleo e ingresos para una parte de la población; y este es un
producto ampliamente comercializado hacia mercados regionales y nacionales,
aproximadamente el 40% de la producción se destina a los mercados de
Medellín y Bogotá y el 60% restante para consumo interno (Castillo 2012 y
Cabeza 2011).
El Departamento de Sucre, donde la principal actividad económica es la
ganadería vacuna y se caracteriza por ser de tipo extensivo, escasa preparación
tecnológica, bajo nivel empresarial y de baja productividad, donde el principal
mercado de los productos lácteos se concentra en 11 de los 16 municipios,
ubicándose la mayoría de las empresas en la subregión sabanas y en los
municipios Sincelejo y San Marcos. El 83,3% de las industrias del sector lácteo,
en estas regiones son plantas de procesamiento que en su mayoría producen
queso doble crema o quesillo como también, se fabrica el queso costeño picado
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o amasado, el suero y el yogurt (Gómez et al. 2010, Gobernación de Sucre,
2011).
Empresas productoras de quesillo o queso tipo mozzarella, fermentan de manera
espontánea el lactosuero obtenido en el proceso por un tiempo de 24 horas
aproximadamente, pero estas fermentaciones se producen de manera
incontrolada de modo que en algunos casos podría representar un riesgo para la
salud del consumidor su empleo en la coagulación, además, de ir en detrimento
de la calidad del producto obtenido.
El considerar esta situación, conlleva a la búsqueda de mecanismos para lograr
un aprovechamiento del lactosuero mediante la extracción de nutrientes o su
transformación en insumos o aditivos alimentarios y a plantear y analizar
alternativas como la propuesta en la presente investigación, que pretende
evaluar el proceso de fermentación de lactosuero ácido (entero y
desproteinizado), inoculado con bacterias lácticas como Lactobacillus casei
buscando determinar la influencia del tratamiento aplicado al lactosuero y del
porcentaje de inóculo adicionada en la producción de acidez, como alternativa
para el aprovechamiento de los nutrientes que este subproducto contiene en el
proceso de coagulación mixta aplicado en la elaboración de queso tipo
mozzarella; alternativa que podría conllevar a mejorar el proceso y producto
obtenido, al igual que al aprovechamiento de este importante subproducto
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agroindustrial por parte de las plantas productoras de queso de pasta hilada,
pudiéndose posteriormente, replicar esta tecnología en otras queseras de la
región.
2.2 TIPOS DE LACTOSUERO
Existen varios tipos de lactosuero, dependiendo del origen de la leche, el queso
y las variaciones del proceso: se conoce como lactosuero ácido al proveniente de
la coagulación ácida y es el que se utiliza para la fabricación de quesos frescos o
de pasta blanda; y generalmente debe neutralizarse primero para la mayor parte
de sus aplicaciones y el contenido de lactosa se reduce a causa de la
fermentación láctica (ácido láctico). El lactosuero dulce, proveniente de la
coagulación enzimática (renina), y es un buen sustrato para todas las
utilizaciones o transformaciones. De modo que se dice que si en la coagulación
de la leche se utiliza enzimas, el lactosuero se denomina dulce, y si se remplaza
la enzima por ácidos orgánicos se denomina ácido (Parra 2009).
Según las propiedades fisicoquímicas, los lactosueros también pueden ser
clasificados como ácidos o dulces. En el primer grupo, se encuentran aquellos
que provienen de la fabricación de quesos frescos de pasta blanda, obtenidos a
partir de leche de vaca y/o de cabra; en ellos, la lactosa se ha transformado en
ácido láctico, son ricos en calcio y fósforo; el pH es < 4,5 y los Grados Dornic
son < 20 °. Un lactosuero Dulce, en cambio, proviene de la fabricación de
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quesos de pasta cocida y prensada (vaca) y quesos de ovejas; pobres en calcio y
fósforo; el pH es > 6,0 y presentan > 50 ° grados Dornic (ºD) (Callejas et al.
2012). En la Tabla 1 se describe la clasificación de los lactosueros derivados de
la producción de queso, considerando su acidez.
Tabla. 1. Clasificación de los lactosueros según su acidez.
Tipo de suero Acidez Titulable
(%) Ácido Láctico
pH
Suero dulce 0.10 a 0.20 5.8 a 6.6
Suero medianamente ácido 0.20 a 0.40 5.0 a 5.8
Suero ácido 0.40 a 0.60 4.0 a 5.0
Fuente: Gutierrez 2006
Dado que el lactosuero ácido es obtenido de una coagulación ácida o láctica de
la caseína de la leche, presenta un pH próximo a 4,5 que se produce al alcanzar
el punto isoeléctrico de la caseína con anulación de las cargas eléctricas que las
mantienen separadas por las fuerzas de repulsión que generan, impidiendo así, la
floculación, lo que implica una total destrucción de la estructura micelar. Es un
suero muy mineralizado pues contiene más del 80 % de los minerales de la leche
de partida; en éste, el ácido láctico secuestra el calcio del complejo de
paracaseinato cálcico, produciendo lactato cálcico y el fosforo de la caseína se
encuentra bajo la forma de monoéster ortofosfórico de un aminoácido
hidroxilado (Callejas et al. 2012).
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Por otro lado, los lactosueros ácidos y dulces pueden ser condensados, secados,
fermentados, deslactosados, desmineralizados y desproteinizados por medio de
tecnología como la ultra-filtración, ósmosis inversa, intercambio de iones y
electrodiálisis (Gutiérrez 2006). El lactosuero desproteinizado en su estado
natural ha sido poco estudiado, pese a los grandes volúmenes que se derivan del
mismo y los posibles usos que se le podría dar al mismo.
2.3 COMPOSICION Y CARACTERISTICAS
La composición de los lactosueros y de sus subproductos, puede depender de
las condiciones de producción, al igual que de la inclusión durante el proceso
industrial primario de bacterias ácido-lácticas y podrían determinar el destino
último de este subproducto en la producción de alimentos tanto para el consumo
humano como animal (Miranda et al. 2009).
El lactosuero de quesería contiene principalmente lactosa, proteínas como
sustancias de importante valor nutritivo, minerales, vitaminas y grasa. La lactosa
es el principal componente nutritivo (4,5 % pv-1
), proteína (0,8% pv-1
), y lípidos
(0,5%). La lactosa es el componente mayoritario de la materia seca de la leche,
de modo que el 95% de la lactosa se pierde en el lactosuero durante el proceso
de fabricación de quesos (Gutiérrez 2006). Este es un glucócido reductor que
pertenece al grupo de los diholósidos y está formada por la unión de una
molécula de α o β-glucosa y otra β-galactosa (Early 2004).
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En la composición del lactosuero se encuentran las α-lacloalbúmina (20-44%),
β-lactoglobulina (44-52%), sero albúminas (5-7%), inmunoglobulinas (12-16%)
y proteosa-peptonas (19%). También, contiene la mayor cantidad de
aminoácidos esenciales (400 mg/g) siendo superior al huevo, y posee 32 mg/g
de aminoácidos azufrados con un valor superior al de la carne y la caseína
comparados nutricionalmente (Londoño et al. 2008; Smithers 2008; FAO 1985).
Estas proteínas son un conjunto de sustancias nitrogenadas que no precipitan a
pH 4.6, que corresponde al punto isoeléctrico de la caseína bruta, por lo que, se
les denomina también caseínas solubles; su valor nutritivo es de un 25 a 35%
superior que el de la caseína (Gutiérrez 2006).
En la Tabla 2. Se observa la composición de lactosueros dulce y ácido en sus
estados líquido y sólido.
Tabla 2. Composición porcentual de los lactosueros
Fuente: Restrepo 2006.
Componente Liquido Sólido
Dulce* Ácido** Dulce Ácido
Proteína 0.8 0.7 12 12
Lactosa 4.9 4.4 73.3 68.7
Minerales 0.5 0.8 7.9 11.5
Grasa 0.2 0.04 1.3 0.8
Agua 93 93.5 4.6 3.9
Ácido láctico 0.2 0.5 1.7 4.6
* Suero procedente de la coagulación enzimática de la leche (pH = 6.4)
** Suero procedente de la coagulación ácida de la leche (pH= 4.5)
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A pesar que el lactosuero tiene un contenido proteico bajo, sus proteínas son de
alto valor biológico (por su contenido en triptófano, lisina y aminoácidos
azufrados), tienen una calidad igual a las del huevo y no son deficientes en
ningún aminoácido. Además, presenta una cantidad rica de minerales donde
sobresale el potasio, seguido del calcio, fósforo, sodio y magnesio. Cuenta
también con vitaminas del grupo B (tiamina, ácido patogénico, riboflavina,
piridoxina, ácido nicotínico, cobalamina) y ácido ascórbico (Londoño et al.
2008).
En la Tabla 3, se compara lactosueros ácidos entero y desproteinizado empleado
en la producción de ácido láctico a partir de suero de leche, utilizando
lactobacillus helveticus en cultivo continuo
Tabla 3. Caracterización de lactosuero ácido entero y desproteinizado
Parámetros Suero de leche fresco Suero de leche desproteinizado*
X±S X±S
Lactosa
(kg/m3)
44,2 0,1290 44,93 0,1290
Nitrógeno (%) 0,21 0,0050 0,12 0,0104
Proteínas (%) 1,34 0,0032 0,76 0,0048
Fósforo (%) 0,34 0,0221 0,35 0,0010
pH 5,45 0,0023 5,97 0,0098
X: Valor promedio. *Suplementado y ajustado su pH a 5,9
Fuente: Urribarrí et al. 2004
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2.3.1 Características fisicoquímicas del lactosuero
La caracterización físico-química de los sueros de queso constituye un paso
importante en la utilización de estos subproductos de la industria láctea en los
distintos procesos industriales propios tanto de la alimentación humana como
animal.
Investigaciones realizadas en los sueros resultantes de la producción de quesos
en el Combinado de Quesos de la ciudad de Bayamo (Granma - Cuba),
demostraron que el suero de queso ácido presentaba un pH menor (Ácido: 4.220
± 0.500 vs. Dulce: 6.620 ± 0.800; p < 0.05); una mayor acidez (Ácido: 0.320 ±
0.020 vs. Dulce: 0.080 ± 0.020; p < 0.05); y un menor contenido de lactosa
(Ácido: 4.100 ± 0.050 vs. Dulce: 4.670 ± 0.600; p < 0.05) (Miranda et al. 2009).
Los lactosueros dulce y ácido evaluados, presentaron las características físico-
químicas descritas en la Tabla 4. Resaltando que las variedades de lactosuero
ácido se caracterizan por presentar un pH menor, una mayor acidez y un menor
contenido de lactosa (Miranda et al. 2009).
Tabla 4. Características fisicoquímicas de los lactosueros dulce y ácido.
Característica Lactosuero dulce Lactosuero ácido Especificación de calidad
pH 6.620 ± 0.800 4.220 ± 0.500 6.600 ± 0.600
Acidez (%) 0.080 ± 0.020 0.320 ± 0.020 0.100 ± 0.300
Densidad (gcm-3
) 1.025 ± 0.020 1.024 ± 0.010 1.024 ± 0.010
Materiaseca (%) 6.410 ± 0.700 6.400 ± 0.600 6.400 ± 0.211
Grasa (%) 0.330 ± 0.010 0.330 ± 0.020 0.330 ± 0.100
Proteínabruta
(%)
0.960 ± 0.040 0.940 ± 0.030 0.900 ± 0.500
Lactosa (%) 4.670 ± 0.600 4.100 ± 0.050 4.700 ± 0.700
Calcio (%) 0.530 ± 0.020 0.510 ± 0.020 0.500 ± 0.800
Fósforo (%) 0.330 ± 0.030 0.310 ± 0.020 0.300 ± 0.300
Fuente: Miranda et al. 2009.
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22
2.3.2 Composición del lactosuero
En la Tabla 5 se encuentra detallada la composición porcentual del lactosuero
dulce y ácido. Estos se originan dependiendo principalmente de la eliminación
de la caseína, de modo que el denominado lactosuero dulce, está basado en la
coagulación por la renina a pH 6,5; mientras el llamado lactosuero ácido resulta
del proceso de fermentación o adición de ácidos orgánicos o ácidos minerales
para coagular la caseína como en la elaboración de quesos frescos (Jelen 2003).
Tabla 5. Composición porcentual del lactosuero dulce y ácido.
Componente Lactosuero dulce Lactosuero ácido
Sólidos totals 6,300 - 7,620 6,745 - 7,375
Agua 93,700 – 93,000 93,255 – 92,625
Lactosa 4,600 - 5,200 4,400 - 4,600
Proteína 0,600 - 1,000 0,600 - 0,800
Grasa 0,050 – 0,370 0,040 – 0,270
Minerales 0,500 0,800
Calcio 0,043 0,120
Fosfatos 0,137 0,065
Sodio 0,050 0,050
Cloro 0,110 0,110
Potasio 0,160 0,160
Ácido lactic 0,050 0,400
Fuente: Panesar et al.2007; Franchi 2010
2.3. USOS Y APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO
El lactosuero presenta características nutricionales adecuadas para ser utilizadas
en alimentación, medicina y farmacología, constituyéndose en un sustrato
económico y atractivo para el procesamiento, demostrándose mediante
investigaciones la diversidad de usos posibles para este subproducto y
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concluyéndose que es más beneficioso emplearlo que convertirlo en efluente
(Monsalve y Gonzales 2005). Su valor nutricional constituye una ventaja si se
piensa en su aprovechamiento, considerando su contenido de lactosa, fácilmente
fermentable, proteínas de excelentes propiedades funcionales y alto valor
nutritivo, su riqueza en potasio, calcio, fósforo, sodio y magnesio, y en
vitaminas del grupo B (Londoño et al. 2006).
A finales del siglo XX, el lactosuero se empleaba en la elaboración de productos
alimenticios como bebidas, cremas para untar, mantequilla, concentrado
proteínico, lactosa, proteínas en polvo, suero en polvo desmineralizado y
quesillo, entre otros (Londoño 2006). Del mismo modo, se han desarrollado
productos de exitosa aceptación debido a sus bajos costos de producción, grado
de calidad alimenticia y aceptable sabor, se encuentran las bebidas refrescantes,
bebidas fermentadas, y alcohólicas, proteína unicelular, biopeliculas, producción
de ácidos orgánicos, concentrados de proteínas, derivados de lactosa entre otros
(Londoño 2008; Lagua 2011).
Por lo anterior, el uso que se le puede dar al lactosuero varía desde la
producción como medio de cultivo, propagación de inóculo en las queserías,
producción de ácidos orgánicos, bebidas fermentadas (cerveza y vino),
producción de biopelículas a partir de proteínas del suero, producción de
probióticos y bacteriocinas, entre muchos más (Díaz et al. 2004).
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24
Investigaciones realizadas en el estado de San Luis Potosí en México,
evidencian o establecen que a pesar de las numerosas investigaciones realizadas,
en la actualidad, no se ha desarrollado ningún proceso capaz de dar rentabilidad
de las importantes cantidades de suero que se producen y vierten cada año,
representando un importante problema medioambiental debido a su elevada
carga orgánica (Reyes et al. 2008). Si se considera que 0,25-0,30 litros de suero
sin depurar equivalen, aproximadamente, a la contaminación de las aguas
residuales correspondientes a un habitante/día; y que una industria quesera
media de cualquier país que produzca diariamente 400.000 litros de suero sin
depurar, está produciendo una contaminación diaria similar a una población de
1.250.000 habitantes, y que la eliminación de los sueros lácteos a los ríos está
prohibida, moral y legalmente, se tiene obligatoriamente que pensar en que hay
que seguir dos caminos: aprovechamiento íntegro del suero o depuración del
mismo (Ronda 2000).
La depuración es muy costosa y las industrias queseras no pueden pagar tan alto
valor, por lo que, la concentración de la industria quesera agrava el problema.
Por otra parte, el lactosuero, depurado, biológica y mecánicamente, siempre
aporta sustancias residuales que contaminan los ríos (sales minerales) (Berruga
1999). Sin embargo, no hacer uso del lactosuero como alimento es un
desperdicio de nutrientes, por su alto valor nutricional y por cada 1000 L de
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lactosuero se puede extraer 9 kg de proteína, 50 kg de Lactosa, 3 kg de grasa,
los cuales constituyen los requerimiento/día de 130 personas y de energía/día de
100 personas (Pérez 2008).
Considerando lo anterior, se ha desarrollado tecnologías basadas en el
aprovechamiento de nutrientes; e investigadores y expertos realizan un llamado
a que la industria quesera tenga opciones para usar el lactosuero como base de
alimentos, preferentemente para el consumo humano, con el fin, de no
contaminar el medio ambiente y de recuperar con gran margen el valor
monetario del lactosuero (Díaz et al. 2009).
Estudios recientes han demostrado la diversidad de usos nutricionales de este
subproducto, concluyéndose que es más beneficioso emplearlo que convertirlo
en afluentes, de igual modo, se ha estudiado ampliamente la aplicación de
mecanismos como la coagulación de proteínas lactoséricas mediante
acidificación, con calcio y tratamientos térmicos, obteniéndose productos, como
el requesón, ricottone ó Ricotta, económicos y deseables para los consumidores
(García et al.2002; Londoño et al.2008).
Se obtuvo quesos tipo Mysost, empleando los sólidos del lactosuero sin requerir
grandes inversiones económicas, mediante un proceso de concentración de
sólidos, similar a la fabricación de dulce de leche, adquiriendo incluso el color
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del mismo, debido a las reacciones de oscurecimiento no enzimático, y que
puede ser formulado con textura para cortar o untar (Inda 2000).
El lactosuero en polvo, puede sustituir el agregado de leche en polvo
descremada, aportando proteínas de alta calidad a casi la mitad del costo y
reduciendo el agregado de endulzantes al reemplazarlos por la lactosa, siendo
los lactosueros y concentrados proteicos ampliamente utilizados como
ingredientes versátiles en elaboración de alimentos, para mejorar su calidad y
funcionalidad y los efectos benéficos para la salud (Moreau 2003)
En la actualidad se utiliza lactosuero en la fabricación de alimentos lácteos
(helados, yogur, untables), productos cárnicos (carnes procesadas, embutidos),
panificados (bases para pasteles, galletas, barras nutritivas), productos de
confitería, entre otros (Ronda 2000).
Por lo tanto, es importante darle una buena utilización a este subproducto de la
industria quesera, con el fin, de disminuir la contaminación ambiental que está
causando y así generar valor agregado.
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27
2.4 APROVECHAMIENTO BIOTECNOLOGICO DEL
LACTOSUERO
En la actualidad, la legislación prohíbe el vertimiento directo del suero a los
cursos de agua sin un tratamiento previo, que consiste principalmente en la
remoción de la lactosa y las proteínas; sin embargo, son estos componentes los
más valiosos en el momento de aprovechar el lactosuero, por lo que resulta un
inmenso desperdicio de nutrientes no usarlo como alimento o como medio de
cultivo para fermentaciones industriales (Sanchez et al. 2004).
Los procesos biotecnológicos son una excelente alternativa en la biodegradación
de desechos, convirtiéndolos en materias primas para la obtención de
importantes productos de consumo y perfilarse como una herramienta para el
control de residuos contaminantes (Caselles et al. 2003). Lactosueros no salados
pueden utilizarse para la fabricación de bebidas refrescantes energéticas;
consideradas bebidas nutricionales análogas de la leche, ideales para programas
gubernamentales (Lagua 2011).
Por otro lado, los suplementos nutricionales y los probióticos han encontrado
nichos importantes en la industria de alimentos y la industria farmacéutica
(Nerlich y Koteiko, 2008; Pham y Day 2008; Rosmini et al. 2004). Resulta
entonces atractivo dirigir hacia estos destinos los esfuerzos por conferir valor a
los productos derivados del suero de leche; trabajos de este tipo fueron
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28
desarrollados en México donde se determinó la factibilidad de la obtención de
proteína liofilizada y biomasa probiótica liofilizada a partir de suero de leche de
cabra empleando Lactobacillus casei; y mediante la aplicación de procesos de
ultrafiltración se logró la obtención de un permeado conformado por una alta
relación proteína/lactosa.
Esta proteína luego de ser liofilizada presentó características de solubilidad
superiores a productos comerciales similares y además, demostró ser fácilmente
empleable como medio de cultivo para el crecimiento del microorganismo
probiotico L. caseí (Aguirre et al. 2009)
En Egipto se evaluó el efecto de condiciones de fermentación en la producción
de ácido cítrico a partir de suero de queso, empleando cepas de Aspergillus
niger, y durante la fermentación fueron medidos aspectos como lactosa
utilizada, concentración de ácido cítrico, coeficiente de transformación de
lactosa en ácido cítrico, y peso seco del micelio, obteniendo una concentración
máxima de ácido cítrico y coeficiente de conversión con lactosuero inoculado
con A. niger CAIM 167 a pH de 3,5 luego de 9 días de fermentación y de
adición de 4% de metanol en el medio de fermentación (Y. A. El-Samragy et
al.1995).
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29
En la Universidad de Oviedo España, se trabajó con el lactosuero en polvo o
permeado, como substrato de fermentación alcohólica empleando la cepa
Kluyveromyces fragilis, el producto puede emplearse en la elaboración de
bebidas para consumo humano al igual que etanol industrial, obteniéndose una
concentración, de alcohol superior a la de la sidra y cervezas comunes.
También, se empleó como sustrato en una fermentación acética, obteniéndose
vinagre de grado alimentario que puede emplearse en la elaboración de
conservas e incluso para consumo directo (Parrondo 2001).
Investigadores del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías
(CUCEI) de México, desarrollaron procesos de producción de ácido propiónico
a partir de lactosuero y glicerol usando bacterias inmovilizadas. Este ácido, es
utilizado como aditivo en alimentos, agente antimicrobiano para conservación
de quesos, mantequillas, embutidos, panes, pasteles, cereales y similares. Estas
investigaciones, señalan la fermentación microbiana como una ruta atractiva
para producir ácido propiónico a partir de fuentes renovables (Marcelli 2000).
En Colombia, en la Universidad libre de Barranquilla, se realizó un estudio
basado en la biotransformación del lactosuero con microorganismos de Kéfir
para la obtención de una bebida refrescante tipo lácteo (Caselles 2003), en
ecuador se desarrolló una investigación similar, en la cual se elaboró una bebida
nutricional con pulpa de maracuyá (pasiflora incarnata), y suero láctico, en la
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30
planta procesadora de frutas y hortalizas de la Universidad Estatal de
Bolívar (Lagua 2011).
La Universidad de Caldas de Manizales, adelantó una investigación empleando
hongos del género Aspergillus con miras al aprovechamiento del lactosuero y a
la reducción del impacto ambiental que causa el vertimiento de este subproducto
en cuerpos de agua. Se evaluó la biosíntesis de ácido cítrico a partir de suero de
leche modificado mediante diferentes tratamientos, (desproteinización, hidrólisis
y evaporación), obteniéndose que las cepas de A. carbonarius no presentaron
diferencias significativas en la formación del ácido, mientras A. niger NRRL 3
alcanzó mayores concentraciones cuando se utilizó suero de leche
desproteinizado, evaporado y con lactosa hidrolizada con â -galactosidasa. A.
carbonarius arrojó concentraciones promedio de ácido cítrico mayores que A.
niger (Sanchez et al. 2004).
De madera similar, en la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, se
elaboró una bebida fermentada con adición de pulpa de maracuyá a partir del
lactosuero (Flórez y Peña 2001; Londoño et al. 2008), también se empleó la
biotransformación del lactosuero con un conjunto de microorganismos de
genero kéfir para obtener una bebida refrescante de tipo lácteo (Caselles y Vega
2003) y una bebida fermentada de suero de queso fresco inoculada con
Lactobacillus casei (Londoño et al. 2008).
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31
En la Universidad Popular del Cesar, se desarrolló una investigación de tipo
descriptiva-experimental con enfoque cuantitativo, en la cual se evaluó la
obtención de etanol por fermentación de lactosuero con dos tipos de levaduras
(Candida kefyr y Saccharomyces cerevisiae), variando la temperatura (28, 31 y
34ºC), lográndose una productividad máxima del 6,8% de etanol con la levadura
Candida kefyr a 34°C, durante un tiempo de 192 horas; al realizar análisis
fisicoquímicos al etanol obtenido, demostró características fisicoquímicas
favorables; y un estudio de viabilidad técnica y económica, que el proceso es
económicamente viable (Orozco et al. 2012).
En la Universidad de Córdoba se obtuvo una bebida deslactosada y fermentada a
partir de lactosuero proveniente de la elaboración de queso costeño, enriquecida
con L-glutamina, hidrolizado con β-galactosidasa, adicionada con pulpa
comercial de maracuyá y estabilizantes. Encontrándose que los tratamientos con
β-galactosidasa conllevan a el mismo grado de hidrólisis; se observó que la
relación bebida deslactosada y fermentada/pulpa preferida por los consumidores
fue aquella donde la pulpa de maracuyá aportó el 7,5% de los sólidos
solubles. La bebida obtenida cumplió con los requerimientos de la normatividad
colombiana hasta los 14 días de almacenamiento que podría brindar al cuerpo
humano parte de los beneficios funcionales referenciados por el aminoácido
L-glutamina (Martínez 2012).
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32
Se ha aplicado procesos de bioconversión al lactosuero empleando bacterias del
genero Lactobacillus obteniendo ácidos orgánicos de alto valor comercial que
son ampliamente demandados a nivel industrial (Jakymec et al. 2001). De igual
modo, se ha discutido el uso de ácidos orgánicos (acético, láctico, propiónico)
para acidificar directamente la leche y acelerar el tiempo de acidificación de la
cuajada en queso Mozzarella (Kimura et al.1992, Kiely et al.1992). Debido a
que el tipo de ácido afecta significativamente la composición química, textura,
sabor y color, obteniendo quesos con alto contenido de humedad (Shehata et
al.1989), también en quesos como el Oaxaca (queso de pasta hilada elaborado
artesanalmente en México), ha sido evaluado el efecto de la adición de suero
fermentado a la leche y cuajada a diferentes porcentajes, para disminuir el
tiempo de acidificación de la cuajada y evaluar las características fisicoquímicas
y sensoriales del queso (Aguilar et al.2006).
Más allá de las soluciones biotecnológicas a las que se somete el lactosuero en
la actualidad, se han buscado otras vías de salida a este residuo y se ha
modificado la bacteria Lactobacillus casei mediante técnicas de manipulación
genética, para que sintetice dos compuestos químicos el diacetilo y la acetoína
muy utilizados como aditivos aromáticos en la industria alimentaria (Pelayo
2009).
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33
En investigaciones realizadas con el objetivo de desarrollar una bebida
fermentada a partir del lactosuero fresco, inoculado con un cultivo liofilizado
estandarizado para kéfir que en su composición contenía Lactobacillus casei y
otros microorganismos, se obtuvo una bebida refrescante con características
similares al kéfir. En el proceso de elaboración de esta bebida, se empleó una
combinación de 5% de sacarosa y 25% de inóculo, con un tiempo de
fermentación de 24 horas y una temperatura de -2 a 24 ºC (Caselles y Vega
2003).
Mientras que en otras investigaciones se elaboró una bebida fermentada
inoculada con Lactobacillus casei y saborizada con pulpa de maracuyá
(Passiflora edulis), en la cual se evaluó la viabilidad del microorganismo. En
esta experiencia se utilizó medios de cultivos selectivos bajo condiciones
anaeróbicas, simulando así, las condiciones del tracto gastrointestinal de los
humanos y se verificó la supervivencia durante un período de almacenamiento;
observándose que la composición físico – química de la bebida, almacenada a
4°C, no tuvo una variación significativa durante el período de 21 días de
conservación, los microorganismos permanecieron viables, obteniendo valores
superiores a 106 ufc·g-1
. La bebida tuvo un nivel de aceptación bueno,
obteniendo el calificativo de “Me gusta” (Londoño et al. 2008).
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34
La aplicación de procesos biotecnológicos permite obtener sustancias con
interesantes aplicaciones en la industria de alimentos, química y farmacéutica;
como es el caso del ácido L (+) láctico cuya demanda mundial ascendió en el
2007 a 130-150 TM/año, estimando un crecimiento del 10 al 15% anual (Araya
et al. 2010). Razón por la cual, investigaciones como la realizada por García
(2012) quien desarrolló un modelo cinético para la producción de ácido láctico a
partir de lactosuero utilizando Lactobacillus casei en un cultivo batch;
observándose adecuadas condiciones de producción a una temperatura de 37 ºC
y pH de 6.5. Se estableció que los modelos basados en Monod no logran
describir las etapas del crecimiento del microorganismo empleado, mientras que
al aplicar los modelos reparametrizados logísticos, Gompertz y Baranyi se
observa un mejor ajuste.
2.5. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE
LACTOSUERO
El ácido láctico es un valioso producto en la industria de alimentos y también
como materia prima en la industria química, lo mismo que sus sales, como el
lactato de sodio, calcio, hierro y antimonio principalmente. Este, tiene un amplio
rango de aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica, química, y
cosmética, entre otras, por lo que recientemente se ha acelerado la investigación
en L(+) y D(−) ácido láctico por vía biotecnológica, debido a su posibilidad de
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transformación en poliláctido biodegradable (PLA). Por lo que, los esfuerzos en
la investigación del ácido láctico, están enfocados a disminuir los costes de
producción a través de nuevos sustratos, nuevas tecnologías de fermentación y
separación y nuevos microorganismos capaces de alcanzar altas concentraciones
de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades (Parra 2009).
Uno de los sustratos es el lactosuero que ha sido un medio de cultivo para la
producción de ácido láctico por vía biotecnológica (Ghasemi et al. 2009), la
fermentación láctica ha sido típicamente conducida en modo batch utilizando
cepas homofermentativas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, y
Lactobacillus casei donde fuentes de complejos nutricionales como licor de
maíz, malta o extracto de levadura pueden ser suplementados al medio
(Wit 2003; Serna y Rodríguez 2005). En la Figura 2. Se esquematiza la reacción
mediante la cual se obtiene ácido láctico a partir de lactosa, considerándose
como su evolución más frecuente, y a la vez, más importante, llevada a cabo por
las bacterias lácticas.
Figura 2.Produccion de ácido láctico a partir de lactosa
Fuente: Spreer 1991
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Las bacterias lácticas como L. casei usualmente metabolizan la glucosa por la
vía Embden-Meyerhof, dando como resultado dos moléculas de ácido láctico de
cada molécula de glucosa con un rendimiento mayor a 0,9 gg-1
(Garcia et al.
2010).
En la Figura 3 se muestra la estequiometria clásica de la fermentación
homoláctica.
Figura 3. Ecuación estequiometrica de producción de ácido láctico
Fuente: Salminen 1993; Serna y Rodriguez 2005
Es así, como la fermentación de lactosuero por bacterias ácido lácticas podría
disminuir el contenido de lactosa produciendo principalmente ácido láctico y
otros metabolitos como componentes aromáticos contribuyendo al sabor y
textura e incrementado la solubilidad de carbohidratos y el dulzor final del
producto (Pescumma et al. 2008).
El lactosuero es un medio de cultivo con la lactosa como fuente de carbono, por
ello se utiliza en innumerables procesos fermentativos para la producción de
etanol, ácido acético, ácido láctico, ácidopropiónico, ácido gluconico, ácido
succínico, ácido cítrico, glicerol, proteína unicelular, enzimas (β-galactosidasa o
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lactasa), grasas y aceites, butanol y acetona, polisacáridos extracelulares y
vitaminas, entre otros (Giraldo 2007; Lopez et al. 2005; Parra 2009). Surgiendo
los procesos de bioconversión como una alternativa para el aprovechamiento de
este subproducto como sustrato para el crecimiento de muchos
microorganismos. Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helvetiens,
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y lactobacillus delbrueckii ssp
lactis son capaces de producir sustancias como el ácido láctico, ampliamente
usado en la industria alimenticia, farmacéutica, textil y cosmética (S.A EL-
AASAR 2006; Wittcoff, 2000; Reyes y Franco 2006; Londoño et al. 2008).
En Zulia Venezuela, se ha producido ácido láctico a partir de suero de leche,
utilizando Lactobacillus helveticus en cultivo continuo, revelando el potencial
uso del lactosuero como sustrato para bacterias homolácticas (Urribarrí et al.
2006).
Almario y Pérez (2008), evaluaron el rendimiento y características de calidad
del quesillo mediante el empleo de cepas de cultivos lácticos mixtos
obteniéndose como resultado que la utilización de Streptococus thermophilus,
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus
inoculados al lactosuero entero y desprotenizado permiten alcanzar niveles de
acidez requeridos para la elaboración del quesillo.
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Urribarn et al. (2004). Realizaron estudios sobre el comportamiento en cultivo
continuo de la bacteria Lactobacillus helveticus ATCC 8018 en suero de leche
desproteinizado suplementado con extracto de levadura y peptona tripsina de
caseína, obteniendo como resultado una máxima productividad de biomasa y
ácido láctico de 6.2 y 1.83 Kg/m3.h respectivamente y un D=0.2h-1,
revelándose así, el potencial del uso del lacto suero como sustrato para bacterias
homolacticas.
En Sucre (Colombia), investigaciones realizadas sobre la fabricación de quesos
de pasta hilada revelaron que esta labor se realiza mediante adición de suero
ácido, el cual se manipula en forma inadecuada, poco higiénica permitiendo su
contaminación. Sobre lo cual investigaciones realizadas por la Universidad de
Sucre al proceso de elaboración de queso costeño revelan que en la mayoría de
los casos, la fermentación del lactosuero se efectúa de manera inadecuada
favoreciendo la contaminación del suero ácido, de la masa de la cuajada y del
producto final, debido al desconocimiento de las personas involucradas en el
oficio (Chávez y Romero 2006).
Otras investigaciones realizadas en esta misma Institución sobre la producción
de queso costeño a partir de la acción fermentativa de cultivos lácticos,
arrojaron mejores resultados en cuanto a las propiedades fisicoquímicas y
organolépticas del producto final, en comparación a las del queso costeño
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elaborado mediante el empleo de suero ácido en forma tradicional (Contreras y
Salgado 2006). Por lo que, se hace necesario profundizar en cuanto al
aprovechamiento de lactosueros empleando bacterias ácido lácticas para su
empleo en la elaboración de quesos de pasta hilada como el quesillo, reduciendo
así, los costos de producción y los riesgos sanitarios de emplear lactosueros
fermentados de manera espontánea.
El empleo de suero acidificado de manera controlada utilizando microrganismos
productores de ácido láctico, se perfila como una alternativa mucho más
eficiente que la que actualmente se viene aplicando por empresas productoras de
quesillo o queso tipo mozzarella, que fermentan de manera espontánea e
incontrolada, por aproximadamente 24 horas, y representan un riesgo para la
salud de consumidores al emplear este suero en la elaboración de lotes
posteriores de quesos, además, de ir en detrimento de la calidad del producto
obtenido.
2.6. Lactobacillus casei COMO PRODUCTOR DE ÁCIDO LACTICO
El Lactobacillus casei, es un microorganismo que se encuentra ampliamente
distribuido en la naturaleza, ha sido aislado de leche cruda, productos lácteos
como quesos, leches fermentadas, vegetales frescos y fermentados; habita en la
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boca, vagina y en el tracto intestinal de varios animales, donde no afecta al
organismo, más bien lo beneficia.
Se ha comprobado que el Lactobacillus casei tiene efectos benéficos sobre el
sistema defensivo del cuerpo pero no existen pruebas suficientes que determinen
su eficacia en la protección ante determinadas enfermedades como la gripe o los
resfriados , por lo que además, de su empleo como productor de ácido láctico, es
un probiotico, cuya ingestión regular reduce los niveles de colesterol sérico,
ayuda a prevenir ciertos tipos de cáncer y mejora las funciones digestivas e
intestinales, entre otras características (Londoño et al. 2008).
Este es un bacilo de tamaño mediano de 1-2.5 μm de largo con un diámetro de
aproximadamente 0.5 μm, aunque, en general su tamaño varia durante el
cultivo; a veces en etapas tardías del cultivo se ha llegado a observar células de
más de 4 μm de largo, son microrganismos de rápido crecimiento con pequeños
genomas; no presenta flagelo o cilios, ni cápsula, y su pared celular es de entre
20 y 30 nm de ancho (Rojas 2009; Takahashi 1999; Gutiérrez 2006).
Es una bacteria anaerobia facultativa, Gram-positiva, mesófila
homofermentativa, produce ácido L-láctico, como producto principal de la
fermentación y la estructura de peptidoglicano de su pared celular es del tipo
Lisina-Aspartato. Se ha usado ampliamente en la industria alimentaria como un
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probiótico, debido a su capacidad de sobrevivir al jugo gástrico; ha probado ser
más resistente que otras bacterias ácido lácticas a pH bajo, pudiendo demostrar
su adecuado desempeño a amplios rangos de pH y evidenciando que a pH de 6,0
a 6,5 no tiene un efecto significativo en la producción se ácido láctico (Kandler y
Weiss 1986; Aguirre 2009; García 2012),
Las bacterias ácido lácticas son generalmente clasificadas en homofermentativas o
heterofermentativas, las primeras pueden a su vez dividirse en homofermentativas
obligadas y homofermentativas facultativas, estas últimas pueden cambiar a
heterofermentativas cuando cambian las condiciones del cultivo. El Lactobacillus
casei se encuentra en el grupo de las bacterias homofermentativas facultativas, ya
que produce trazas de ácido acético y etanol (Morishita y Deguchi, 1999). La
mayoría de especies pertenecientes a este género tienen alta tolerancia a pH por
debajo de 5.0, que les da una ventaja competitiva sobre otras bacterias; respecto a la
temperatura, 28 °C su temperatura óptima, pero para la producción de ácido láctico,
prefiere de 28 a 35 °C (Nabi y Ardalan 2004) y reportando su máxima producción
a 37 °C (Garcia 2012).
Cuando Lactobacillus casei, se cultiva en medio con glucosa o lactosa como
principal fuente de carbono, produce ácido láctico como el producto predominante
de la fermentación, es un microorganismo de metabolismo simple y relevancia
industrial (Morishita y Deguchi 1999).
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En la Tabla 6 se presenta la producción de ácidos orgánicos láctico, acético y
etanol por lactobacillus casei.
Tabla.6. Producción de ácido láctico, acético y etanol por lactobacillus casei
Tiempo de
incubación
Ácido láctico (mg/L) Ácido acético (mg/L) Etanol (mg/L)
24 horas 6 600 150 3.6
72 horas 154 010 200 3.0
Fuente: Morishita y Deguchi 1999
En la Tabla 7. Se establece la relación entre las características del sustrato,
microorganismo y condiciones de producción de ácido láctico de acuerdo a
varias investigaciones donde se emplea el lactosuero.
Tabla. 7 Producción de ácido láctico a partir de lactosuero.
Fuente: García 2012
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La fermentación de determinados azúcares, empleando lactobacilos produce
ácido láctico, por lo que se obtienen productos como el yogur a partir de la
leche. La viabilidad o la rentabilidad o el éxito de la producción biotecnológica
de ácido láctico está sujeta a que las materias primas tengan las siguientes
características: baratas, bajos niveles de contaminantes, rápidas tasa de
producción, alto rendimiento, subproductos formados, capacidad para ser
fermentado con poco o ningún pre-tratamiento y disponibilidad durante todo el
año. Se han usado materias primas baratas para la producción económica del
ácido láctico, entre estos materiales están los celulósicos, los amiláceos, el
lactosuero y la melaza.
En la Figura 4 se muestra la ruta metabólica de una fermentación heteroláctica
(Parra 2010).
Figura 4. Fermentación Heteroláctica
Fuente: Parra 2010
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN
Se desarrolló una investigación de tipo experimental
3.2. LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO
El estudio se realizó en la Planta piloto de Operaciones unitarias de la
Universidad de Sucre, ubicada en la granja los Pericos en el municipio de
Sampués – Sucre, Colombia. Los análisis fisicoquímicos se desarrollaron en los
laboratorios de bromatología y bioingeniería y laboratorio de microbiología de
la Universidad de Sucre, al igual que en el laboratorio de control de calidad de la
empresa COLQUESOS ubicado en Sincelejo – Sucre.
3.3. MATERIALES EMPLEADOS
Los dos tipos de lactosuero, se obtuvieron en la elaboración de queso tipo
Mozzarella, (lactosuero ácido entero) y a partir del proceso de obtención de
requesón (lactosuero ácido desproteinizado) desarrollado por la empresa
COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo – Sucre.
El microorganismo empleado en la investigación para promover la fermentación
fue la bacteria Lactobacillus casei ATCC 393 (Liofilizada), suministrada por la
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American Type Culture Colection (ATCC) (Anexo A), esta bacteria fue
seleccionada por ser de fácil manejo, tener la habilidad para fermentar una
amplia variedad de fuentes de carbono, además de ser económica, de fácil
consecución y presentar altos rendimientos en producción de ácido láctico.
3.4. PROCEDIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN
3.4.1. Obtención del lactosuero
700 ml de cada tipo de lactosuero fueron tomados a manera de muestra para
cada repetición; estos fueron mantenidos en refrigeración por una (1) hora,
previo al desarrollo de los experimentos.
3.4.2. Caracterización de los lactosueros utilizados
Los lactosueros fueron caracterizados siguiendo los protocolos de análisis
fisicoquímico que se enuncian en las técnicas referenciadas en la Tabla 8. Las
mediciones fueron realizadas en base húmeda.
En el Anexo B, se observa evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para
la caracterización fisicoquimica efectuada a los lactosueros objeto de estudio.
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Tabla 8. Análisis fisicoquímicos
ANÁLISIS MÉTODO
Acidez AOAC 947.05/09 adaptado (Jaramillo, 1994)
Densidad AOAC 925.22, 1990
pH AOAC 981.12/90
Sólidos Totales AOAC 925.105/90 adaptado
Proteína AOAC 920.05/90 adaptado
Nitrógeno AOAC 976.06/90
Materia grasa AOAC 989.04/90 adaptado CAA, Tomo II, 13-8, 1989
Cenizas AOAC 945.05/90 adaptado
Lactosa AOAC 16051/84
3.4.3. Proceso de fermentación
Activación del microorganismo y mantenimiento del cultivo. Cepas
liofilizadas de Lactobacillus casei, fueron activadas según las instrucciones del
inserto (Anexo A), en agar MRS (Merck) (Anexo C), para lo cual se adicionó
una asada de microorganismos, en 20 ml de caldo MRS e incubada por 2 días a
37oC y 90 rpm (Hujanen y Linko 1996; Vicente et al. 2009). A partir de cultivo
obtenido, se realizaron repiques periódicos tomando las cepas de trabajo,
extrayendo una asada del medio líquido que fue extendida sobre la superficie de
una caja de petri con agar MRS, e incubada a 37°C durante dos días y
posteriormente almacenada a 4°C (Hujanen y Linko 1996).
Preparación del Cultivo Madre. El cultivo madre se preparó empleando 800
ml de leche entera UHT que fue calentada a 37°C e inoculada con 5 a 6 asadas
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asadas del caldo de cultivo de la cepa Lactobacillus casei ATTC® 393TM
activado el cual tenía una turbidez del estándar de 0.5 de McFarland que
contiene aproximadamente 1 a 2 x 106 UFC/mL, y luego se llevó a cabo la
incubación a 37°C, por el tiempo necesario para la formación de un coagulo
transparente y firme; característica que fue tomada como referencia,
considerando que las bacterias ácido lácticas como Lactobacillus casei en
productos alimenticios como la leche, forman gelificación, además, producen un
sabor ácido, inhibición de organismos patógenos, reducción de contenido de
lactosa, formación de aromas, entre otros (Parras 2010). Desde el momento de la
siembra, hasta la formación del coagulo, se realizaron mediciones de la biomasa
con Cámara de Neubauer, cada 2 horas, de igual modo, se midió la acidez, cuyo
incremento en el tiempo demostraba la viabilidad de las bacterias, facilitándose
la estimación del comportamiento del microorganismo hasta un crecimiento
mayor a 108
UFC mL-1
.
Para el control se tomaron 100 ml de leche entera UHT a 37ºC, que fueron
dejadas en incubación sin la siembra del microorganismo de modo que se
pudiera comprobar la no existencia de contaminación por presencia de otra
cepa. Inicialmente se realizó un preensayo en el que se sometía a esterilización
la leche UHT a emplear, lo cual teóricamente es innecesario si se considera que
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ya fue sometida a un tratamiento térmico severo, pero se observó que esta sufría
desproteinizacion, formándose grumos y afectando el crecimiento de la cepa.
Pretratamiento de lactosueros y Preparación del Cultivo de adaptación
(Preinóculo). Para desarrollar el proceso de fermentación, el lactosuero ácido
entero debió ser sometido a un proceso de pasteurización lenta hasta alcanzar
una temperatura de 60°C por un tiempo de 30 minutos a fin de disminuir la
carga bacteriana, lo que garantiza el crecimiento del cultivo seleccionado, sin
lograr la desproteinizacion del mismo; posteriormente este fue enfriado hasta
37°C. Para el caso del lactosuero de requesón, por proceder de un tratamiento
térmico severo, no se consideró conveniente pasteurizarlo. Los lactosueros
empleados en la investigación se consideraron higiénicamente confiables, ya
que la empresa Colquesos controla sus procesos para alcanzar la inocuidad del
producto; cuenta con alta tecnología y con certificación en HACCP e ISO
9000:2000; además, se manejó adecuadamente las muestras desde el momento
de su recolección, transporte y aplicación de tratamientos de fermentación.
Se preparó un cultivo de adaptación (Preinóculo) para cada uno de los
lactosueros, empleando un 10% del cultivo madre y adicionando los lactosueros
hasta completar 1000 ml de cultivo de adaptación. El lactosuero se utilizó sin
suplementar, debido a que se pretendía conocer su comportamiento con su
composición normal (Alvarez y Aguirre 2008); mas sin embargo se realizaron
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49
preensayos en los cuales se determinó que el desarrollo de esta fermentación era
viable en ese estado.
Se realizaron mediciones de pH, acidez y recuento de microorganismos por
Cámara de Neubauer, en intervalos de una hora, se consideró que los cultivos
presentaban condiciones óptimas para ser inoculados al observar un conteo
superior a 108 UFC mL
-1, momento en el cual se suspendió la fermentación por
una disminución lenta de la temperatura a 4ºC. Los preensayos realizados
demostraron que se alcanzó el conteo de deseado (108 UFC mL
-1 de L. casei)
alrededor de las 12 horas.
Proceso de fermentación batch. La fermentación se llevó a cabo en 6
montajes diseñados siguiendo las especificaciones del FERMENTADOR
AEROBIO – ANAEROBIO TECFERM 2L serie 0204, fabricado por Tecferm y
distribuido por PBM Colombia en el año 2003, tal como se observa en el
Anexo B (Figura 28). Estos permitieron el desarrollo simultaneo de las
repeticiones necesarias, realizando control de temperatura y aplicando una
agitación de 120 rpm (Lee 2004; Serna y Naranjo 2005; Serna y Rodríguez
2005, 2007), durante 96 horas; en investigaciones similares, se demostró una
disminución en la absorbancia y en el recuento de microorganismos vivos a
partir de las 96 horas (Escobar et al. 2010).
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50
La temperatura de fermentación en todos los experimentos fue de 37ºC (Serna y
Rodríguez 2005; Aguirre et al. 2009; Escobar et al. 2010; García 2012); ambos
tipos de Lactosuero fueron inoculados con cepas del cultivo de Lactobacillus
casei, en un 5, 10 y 15% (vv-1
) de los 700 ml en cada repetición, bajo
condiciones asépticas; es decir, el volumen final de cada ensayo fue de
700 ml. Para el control, se sometieron ambos lactosueros a las mismas
condiciones de fermentación, pero sin la adición de microorganismo.
El Lactobacillus casei puede autoinhibirse, por producto (ácido láctico) en el
lactosuero (Aguirre et al. 2009; Aguirre et al. 2010), por lo tanto, se realizó una
serie de preensayos para determinar el pH óptimo de desarrollo de este
microorganismo, para lo cual se adicionó NaOH 0.1 N con el fin de estabilizar
los lactosueros a un pH 5.7. En estas condiciones, se realizaron prensayos del
proceso de fermentación, sin embargo, la acidez del medio durante las primeras
22 horas no aumento significativamente, y solo a partir de las 34 horas de
fermentación, se observaba un cambio en la acidez en ambos sueros.
Simultáneamente se realizaron preensayos sin modificación del pH, observando
que la acidez aumentaba de manera considerable, razón por la cual se optó por
trabajar con el pH inicial de los sueros. Otras investigaciones reportan que el pH
óptimo para la producción de ácido láctico en los lactosueros varía entre 5 y 7
(Vijayakumar et al. 2008).
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51
3.4.4. Seguimiento de la fermentación
Se realizó un seguimiento de la fermentación mediante un monitoreo de los
parámetros, consumo de sustrato, recuento en placa, acidez desarrollada,
contenido de nitrógeno y proteína y estimación de parámetros cinéticos, tal
como se describe a continuación. Tomando mediciones cada 2 horas durante las
primeras 10 horas y luego cada 12 horas hasta completar 96 horas de
fermentación. Es decir, se realizaron mediciones a las 2, 4, 6, 8, 10, 22, 34, 46,
58, 72 y 96 horas.
Consumo de sustrato. Para establecer el comportamiento en relación al
consumo de sustrato (Lactosa), se tomó como base la curva patrón de azúcares
reductores (Anexo D), determinada por el método colorimétrico modificado
DNS (ácido dinitrosalicilico). La concentración de lactosa presente en el medio
de cultivo, fue medida por el método espectrofotométrico a 540 nm (AOAC
16051; Serna y Naranjo 2005; Serna y Rodríguez 2007).
Recuento en placa. Se utilizó peptona universal (0.1% p/v), para realizar
diluciones sucesivas de las muestras inoculadas hasta 108
UFC mL-1
en
proporción 1:9. Se sembró en profundidad en agar MRS y se incubó a 37oC, por
72 h en condiciones de anaerobiosis. El conteo de células viables se realizó
como UFC/ml y se expresó el resultado en unidades logarítmicas (UFC/ml).
Para cada sustrato en los tiempos de control, el recuento se efectuó por
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52
triplicado. Se estableció, a través de preensayos que se debía realizar diluciones
de 10-7
y 10-8
UFC mL-1
porque se encontró que para 10-5
UFC mL-1
era
incontable.
Acidez desarrollada. La acidez fue medida mediante titulación según AOAC
947.05/09, en términos de grados Dornic (ºD). Se tomó como referencia la
acidez requerida en lactosuero a emplear en la elaboración de quesos de pasta
hilada, que según lo reportado por la empresa Colquesos es de mínimo 120°D
(información primaria; Jaramillo et al. 1993).
Cabe anotar que como el peso molecular del ácido láctico es 90 g/mol, un
°Dornic equivale a 1mg de ácido láctico lo que equivale a 0.01 gramos de ácido
láctico.
Contenido de nitrógeno y proteína. Este se determinó por el método Kjendahl
(AOAC 976.06), para luego calcular el porcentaje de proteína.
Estimación de parámetros cinéticos. Fueron estimados los parámetros
cinéticos empleando un modelo descriptivo para el crecimiento, utilizando la
información recaudada como respuesta al efectuar la medición de variación de
las concentraciones de lactosa, recuento en placa y acidez, en relación al tiempo
de fermentación para cada uno de los tratamientos, que son requeridos para la
solución de los modelos matemáticos siguiendo las ecuaciones propuestas
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53
donde se relacionan parámetros cinéticos definidos; luego se procedió a
solucionar dichos modelos numéricamente; y a compararlos gráficamente con
los puntos experimentales a fin de corroborar y dar validez a los modelos
planteados.
Considerando que la bacteria crece exponencialmente, se graficó en una escala
logarítmica la población bacteriana contra el tiempo (h), y se ajustó
acorde a los modelos de Gompertz y Logístico modificado (Anexo I). La
velocidad de producción de ácido láctico fue descrita por el modelo de
Luedeking y Piret (Luedeking y Piret 2000; Jakymec et al. 2001; Garcia 2012).
Dónde α y β son los parámetros asociados y no al crecimiento (Luedeking y
Piret 2000). De modo que las velocidades volumétricas de crecimiento
(UFC/ml.h), de producto (mg/ml. h), de consumo de sustrato, la velocidad
especifica de crecimiento (μ) y los parámetros de producción α y β, permitieron
modelar el crecimiento y la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei
y principalmente el desarrollo de acidez en los distintos tratamientos. Los
valores de los parámetros del modelo fueron ajustados minimizando la función
objetivo:
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54
La ecuación (SSE) es la suma del cuadrado del error, donde n es el número de
observaciones en la fermentación de cada tratamiento, Xiexp representa el dato
experimental y Xical el dato calculado por los modelos.
La naturaleza sigmoidal de la curva de crecimiento de los microorganismos,
hace que los modelos aplicables deban ajustarse a esta característica; de tal
forma, que los modelos logístico modificado, Gompertz, Baranyi describen
apropiadamente este comportamiento basándose en la representación del
logaritmo del tamaño de la población (ln(N/No)) versus el tiempo y la obtención
de parámetros microbianos de fácil interpretación como son μmax, λ y As. El
parámetro λ representa el tiempo lag, periodo en el cual la fase exponencial se
caracteriza por la velocidad máxima de crecimiento μmax, parámetro común a
los anteriores modelos. Cuando aparece la fase estacionaria se alcanza el valor
de la asíntota del parámetro As (Van Boekel 2009). La velocidad específica
máxima de crecimiento (μmax) fue determinada ajustando los modelos de
crecimiento a los modelos de Gompertz, Logistico modificado y Baranyi
integrado.
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55
3.4.5. Procesamiento y análisis
Las pruebas y los análisis aplicados fueron los de varianza ANAVA, pruebas de
comparación de Duncan y polinomios ortogonales. Se realizaron análisis por cada
tiempo y al final se realizó una regresión para ver el efecto del tiempo. Como
prueba de validación se aplicó Shapiro-Wilk y la prueba de homogeneidad de
varianza de Hartley (Anexos E y F)
Los parámetros estequiométricos y cinéticos fueron evaluados aplicando un
análisis de varianza (ANOVA) a los diferentes tratamientos y una prueba de
comparación de medias de Tukey a los tratamientos que mostraron diferencias
significativas (p<0.05). (Anexo F)
Se realizó un ajuste de modelos cinéticos de Gompertz y Logístico modificado
por regresión no lineal, para lo cual se empleó el software STATGRAPHICS®
Centurión XVI (Warrenton, Virginia. U.S.A). Para seleccionar el modelo que
presento el mejor ajuste se utilizaron como criterios estadísticos el valor del
coeficiente de determinación, basado en la observación del menor valor en el
error estándar (SSE) y en el R2
de acuerdo a lo planteado por (Montgomery
1997; Sprinthall 2007 y Gutiérrez y de la Vara 2008) (Anexos G, H e I)
3.4.6. Diseño Estadístico
Se aplicó diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial 2x3,
donde el factor 1 es el tipo de lactosuero empleado, con 2 niveles (suero ácido
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56
entero y suero ácido desproteinizado) y la cantidad de inóculo empleado, con 3
niveles 5, 10 y 15%, con tres repeticiones, para un total de 18 unidades
experimentales, evaluando, el consumo de lactosa, producción de ácido láctico, los
parámetros cinéticos y estequiométricos durante las 96 horas de fermentación.
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57
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. CARACTERIZACIÓN DEL LACTOSUERO
La tabla 9 muestra las características fisicoquímicas de los tipos de lactosuero
empleados en la investigación.
Tabla. 9. Características fisicoquímicas de los lactosueros
Lactosuero desproteinizado Lactosuero entero
Ceniza (%) 0,22±0,13 0,45±0,26
Lactosa (g/dL) 4,37±0,03 4,12±0,06
Densidad (g/ml) 1,026±0,00 1,029±0,00
pH 4,8±0,00 5,35±0,00
Acidez (°D) 34,67±0,58 28±0,00
Nitrogeno (N) 0,098±0,00 0,185±0,01
Proteína (%) 0,628±0,02 1,03±0,15
Grasa (%) DLD 0,3±0,00
ST (%) 5,22±0,11 6,09±0,37
Humedad (%) 94,78±0,11 93,91±0,37
DLD: Debajo del límite de detección
La caracterización realizada a los lactosueros coincide con el rango de valores
reportado para lactosuero ácido y lactosuero de requesón por (Guerrero et al.
2012). Se pudo observar en el suero desproteinizado una notable concentración
de la acidez posiblemente causada por el calor al efectuar la desproteinización,
al igual que una disminución en el contenido de nitrógeno. Los valores de
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58
nitrógeno y proteína para este suero son comparables a los hallados por
(Urribarri et al. 2004). Así mismo, los resultados obtenidos para el lactosuero
entero son similares a lo encontrado por (Monsalve y Gonzalez 2005; Madrid
1999; Panesar et al.2007; Franchi 2010).
El valor del pH en los dos tipos de lactosueros, los define como sueros ácidos
(Miranda et al. 2009), pudiéndose considerar medianamente ácido al suero
entero y ácido al desproteinizado, de acuerdo a lo observado por (Gutiérrez
2006); estudios realizados señalan que la mayoría de las bacterias ácido lácticas
tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5.0, lo que da la ventaja competitiva
sobre otras bacterias (Hofvendahl y Hagerdal 2000), y al empleo de L. casei en
lactosuero con estas características viable desde el punto de vista biotecnológico
para ser usado en producción de ácido láctico.
4.2. RELACIÓN DE LA ACIDIFICACIÓN CON EL TIPO DE
LACTOSUERO E INÓCULO.
Se observa que el tipo de lactosuero, la concentración del inóculo el tiempo de
fermentación y la interacción de estas variables tienen un efecto significativo
(p<0,05) sobre la formación de ácido (Anexo E).
En los tratamientos con lactosuero desproteinizado se presenta una mayor acidez
promedio que en aquellos donde se usó lactosuero entero (Figura 5), mientras
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59
que el inóculo al 15% logró una mayor acidez media en todos los tratamientos y
las concentraciones de 5 y 10%, mediante un análisis de comparación de medias
por Tukey, no mostraron diferencias significativas (p>0,05) (Anexo E).
Figura5. Efecto de la interacción del tipo de lactosuero (a) 1: Entero,
2: Desproteinizado; y del porcentaje de inóculo (b) en la acidificación (°D).
La interacción entre el tipo de lactosuero y el inóculo muestra un efecto
favorable a altas concentración de inóculo y lactosuero desproteinizado (Figura
6); sin embargo, la acidez media más alta fue de 108°D con el lactosuero entero
y 15% de inóculo, en los demás casos se formaron dos grupos estadísticamente
significativos formados por los tratamientos con lactosuero entero inoculado con
5 y 10%; lactosuero desproteinizado inoculado con 5, 10 y 15%, tal como lo
Entero Desproteinizado
1 2
Tipo de Lactosuero
61
64
67
70
73
76
Ácid
ez(ºD
)
a
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60
establece el análisis de diferencias de las interacciones tipo de lactosuero :
inóculo por la prueba de Tukey (Anexo E).
Figura6. Acidificación con L. casei debido al efecto combinado del tipo de lactosuero
1: entero, 2: desproteinizado y concentración de inóculo (■: 5%; ▲:10%; ♦: 15%)
En términos generales, se deduce que el lactosuero entero y las altas
concentraciones del inóculo al inicio de la fermentación favorecen una alta
acidificación del medio. Tal como lo reportado (Aguirre et al. 2009), al
producir biomasa de L. casei a partir de lactosuero ultrafiltrado de leche de
cabra, al obtener una bebida fermentada acidificada por Lactobacillus, ellos
demostraron que las bacterias ácido-lácticas inoculadas en el suero de queso,
durante el proceso de elaboración, lograron crecer en este medio, gracias en
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61
parte a la composición de nutrientes de la materia prima inicial y el nivel de
inóculo utilizado (Miranda et al. 2007),
En este estudio los dos tipos de lactosuero, no se presentaron diferencias
estadísticamente significativas en el valor de la acidez durante las primeras 10h
de la fermentación (Anexo E), con muestreos cada dos horas. Lo anterior
concuerda con lo aportado por (Machado et al. 2007), quienes establecieron que
a medida que se fermenta el suero lácteo, la mayor cantidad de ácido láctico se
obtiene, en general, con mayores tiempos de fermentación. Sin embargo, otras
investigaciones señalan que el producto principal del metabolismo de L. casei,
el ácido láctico, inhibe el desarrollo de biomasa, la estrategia de cultivo por lote
alimentado se recomienda como la que preferentemente debe utilizarse, para
contrarrestar esta limitante. (Aguirre et al. 2009).
En la actividad desarrollada por la empresa Colquesos, para la elaboración de
quesos de pasta hilada, se requiere el uso de lactosuero ácido con 120°D mínimo
(información primaria suministrada por Colquesos; Jaramillo et al. 1993). Es así
como, las Figuras 7 y 8 muestran que los tratamientos con lactosuero entero y
lactosuero desproteinizado inoculado al 5% y 10% con L casei, alcanzaron el
valor mínimo de acidificación; mientras el tratamiento con 15% de inóculo en el
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62
Lactosuero desproteinizado, no alcanza el valor deseado en todo el desarrollo
de la fermentación.
En la presente investigación, para el caso específico de los tratamientos con
lactosuero entero inoculados al 5% el valor de referencia se alcanzó a las 82h y
con10% a las 86h; mientras que con el lactosuero desproteinizado inoculado al
5% a las 72h y a las 87h para el 10% de inóculo. En el lactosuero inoculado al
15% se alcanza la acidez deseada a las 34h, lo cual no se consiguió para el suero
desproteinizado aun completándose las 96h de la fermentación. Según lo
observado por (Orozco y Solarte 2003), los microorganismos toman los
nutrientes del medio y lo utilizan para llevar a cabo todas sus funciones
metabólicas: mantenimiento, crecimiento, reproducción y biosíntesis de
metabolitos. En muchos casos el producto de las fermentaciones industriales es
la biomasa, pero en la gran mayoría de los esquemas de producción son
sustancias de alto valor agregado por fermentación, una vez que se verifica el
crecimiento de la biomasa se favorece la biosíntesis de un metabolito como
producto; de este modo el lactosuero entero mostro un comportamiento como
sustrato que favorece la síntesis de producto, mientras el lactosuero
desproteinizado el crecimiento del microorganismo.
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63
Figura7. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero entero
inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.
Figura 8. Acidificación con L. casei debido al efecto de lactosuero
desproteinizado inoculado al ■: 5%, ▲:10% y ♦: 15%.
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64
El lactosuero ha sido un medio de cultivo empleado para la acidificación por vía
biotecnológica (Ghasemi et al. 2009), de igual modo, se ha desarrollado
fermentaciones lácticas en el sistema batch usando cepas homofermentativas de
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, y Lactobacillus casei a partir de
otras fuentes complejas nutricionales o por la suplementación de estas.
4.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO, CONSUMO DE SUSTRATO Y
FORMACIÓN DEL PRODUCTO.
La formación de ácido láctico en los medios con lactosuero entero y
desproteinizado e inoculados con 5, 10 y 15% de cultivo madre, fue evaluada y
representada mediante un perfil de fermentación con L. casei, donde se
consideró la formación de ácido láctico, concentración de lactosa, y recuento de
L. casei, tal como se observa en las figuras de la 9 a la 14.
Se evidencio que en los medios inoculados con 5% (Figura 9, 10) al final del
periodo de fermentación (96h) la concentración de lactosa fue de 27,7g/L en el
lactosuero entero y 40,1g/L en el desproteinizado, correspondiente a una
conversión del 32,8% y 8,2% de lactosa respectivamente. Esto concuerda con lo
encontrado por (Serna y Rodriguez 2007), quienes concluyeron que la
concentración de azúcares totales muestra un efecto mucho menor e inverso
sobre la concentración de ácido láctico, lo que significa que un aumento en la
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65
concentración de azúcares produce una ligera disminución en la concentración
de ácido láctico.
Tiempo(h)
Lacto
sa, Á
cid
ez(g
/L)
Variables
Lactosa(g/L)
Ácidez(g/L)
UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
14
17
20
23
26
29(X 1,E7)
Figura9. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y
5% de inóculo.
Lacto
sa, A
cid
ez (
g/L
)
Tiempo(H)
Variables
Acidez (g/L)
Lactosa (g/L)
UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
11
15
19
23
27
31(X 1,E7)
Figura10. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero
desproteinizado y 5% de inóculo.
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66
El mayor crecimiento fue de 3,08E+08 UFCL-1
en el lactosuero desproteinizado
y de 2,88E+08 UFC L-1
en el entero a las 96h de fermentación. El
comportamiento del lactosuero desproteinizado al ser empleado como sustrato,
sugiere que en este se encuentran, además de los micronutrientes señalados en la
caracterización, factores de crecimiento, aminoácidos y ácidos grasos,
considerados esenciales para el crecimiento y la producción de ácido láctico por
L.casei tal como plantean (Serna y Rodriguez 2007), quienes sometieron a
fermentación sustratos vegetales no enriquecidos, encontrando comportamientos
similares.
En los medios inoculados con 10% del cultivo madre, en el caso del lactosuero
entero (Figura 11) se logró una conversión de 43,6% y una concentración de
ácido láctico 13,9gL-1
. En el lactosuero desproteinizado (Figura 12) la
conversión de lactosa fue de 22,2% para una producción de 13,7 g L-1
de ácido
láctico. Al final de la fermentación del lactosuero entero e inoculado con 10%,
se observa una reducción del crecimiento del microrganismo de 3,16E+08
UFC/L a las 72h hasta 1,86E+08 UFC/L a las 96h; mientras en el lactosuero
desproteinizado no se observa reducción del crecimiento. Estudios realizados al
inocular 10% de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, con ajuste de pH y
suplementación de nutrientes (extracto de levadura, peptona tripsica de caseína
y lactosa), demostraron que los rendimientos de biomasa disminuyen al
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67
aumentar la concentración de lactosa, de modo que la mayor concentración de
ácido láctico se obtiene en suero desproteinizado sin adición de lactosa,
evidenciando que entre mayor es el sustrato, mayor es el consumo y mayor la
velocidad de consumo; puesto que la producción de ácido láctico origina una
disminución del pH en el medio y este bajo pH afecta el crecimiento, el
consumo y la producción (Jakimec et al. 2001). Lo cual sucedió con el
lactosuero entero que muestra mayor producción de ácido, pero menor
crecimiento en términos de biomasa.
La
cto
sa
, Á
cid
ez(g
/L)
VariablesLactosa(g/L)Ácidez(g/L)UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
Tiempo(h)
0
10
20
30
40
50
12
16
20
24
28
32(X 1,E7)
Figura11. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y
10% de inóculo.
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Lacto
sa, Á
cid
ez(g
/L)
Tiempo(h)
Variables
Lactosa(g/L)
Ácidez(g/L)
UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
16
19
22
25
28
31(X 1,E7)
Figura12. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero
desproteinizado y 10% de inóculo.
Con respecto a los medios inoculados con un 15% del cultivo madre, durante la
fermentación del lactosuero entero (Figura13) se logró la mayor concentración
final de ácido láctico (20,8 g L-1
), una conversión de 36,2% de lactosa y
3,63E+08 UFCL-1
de L. casei; caso contrario en el lactosuero desproteinizado
(Figura14) donde se obtuvo la menor concentración final de ácido láctico
(8,1g/L).
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69
La
cto
sa
, Á
cid
ez(g
/L)
VariablesLactosa(g/L)Ácidez(g/L)UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
Tiempo(h)
0
10
20
30
40
21
25
29
33
37(X 1,E7)
Figura13. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero entero y 15% de
inóculo.
Lacto
sa, Á
cid
ez(g
/L)
Variables
Lactosa(g/L)
Ácidez(g/L)
UFC/L
UFC/L
0 20 40 60 80 100
Tiempo(h)
0
10
20
30
40
50
18
20
22
24
26
28
30(X 1,E7)
Figura14. Perfil de fermentación con L. casei en Lactosuero. Concentración de
lactosa (■), ácido láctico (♦) y recuento de L. casei (▲) en lactosuero
desproteinizado y 15% de inóculo.
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Las figuras concuerdan con lo arrojado en la Tabla 10, donde se observa que los
medios con lactosuero entero obtuvieron las mayores conversiones de lactosa a
ácido láctico, a las tres concentraciones de inóculo, la menor (8,2%) fue en el
lactosuero desproteinizado e inoculado con 5% de L casei, (5,09g/L) de ácido
láctico, mostrando que la fermentación se direcciono al desarrollo del L. casei
en el medio. En cuanto al crecimiento, la concentración de Lactobacillus casei
fue de 2,82E+08±0,097 UFCL-1
promedio de los tratamientos a las 96h de
fermentación. Los resultados obtenidos muestran que los residuales de lactosa
no son mejores a los reportados en la fermentación con L. helveticus a
concentraciones iniciales de lactosa de 36 g L-1
y 52 g L-1
se alcanzó un azúcar
residual de 8,5 g L-1
y 7,5 g L-1
(Plessas et al. 2008), así confirman que el efecto
de la suplementación favorece la bioconversión a ácido láctico (Garcia 2012);
tal como lo muestran los estudios cuando al suplementar con una fuente de
nitrógeno se mejoró la velocidad de bioconversión y se duplico el ácido láctico
producido (De Lima et al. 2009).
La Tabla 10 muestra los tratamientos evaluados para producir ácido láctico a
partir de lactosuero entero, desproteinizado y los inóculos a 5%, 10% y 15%, sus
respectivos valores medios obtenidos por diferencia desde las 2h hasta las 96h
de fermentación para el crecimiento de L. casei (X), concentración de ácido
láctico (P) y lactosa (S); y los coeficientes estequiométricos o rendimientos.
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Tabla 10. Medias de Producción biomasa, ácido láctico y consumo de lactosa.
Crecimiento Producto Consumo
Biomasa A. Láctico Lactosa
Tratamientos X(UFC/L) P(g/L) S (g/L)
1 L1I5 1,18E+08±0,009ac 8,88±0,12ª 13,50±0,63ª
2 L1I10 5,28E+07±0,02b 11,21±0,035b 17,96±0,49b
3 L1I15 1,36E+08±0,03abc 16,27±0,12c 14,92±0,28ª
4 L2I5 1,82E+08±0,005d 5,09±0,087d 3,57±0,80c
5 L2I10 1,36E+08±0,011c 10,50±0,036e 9,69±0,33d
6 L2I15 9,06E+07±0,049ab 4,51±0,07f 7,72±0,35e
L1: lactosuero entero, L2: lactosuero desproteinizado, I: inóculo (5=5%, 10=10%, 15=15%)
Valores con igual letra, en una misma columna, no son significativamente diferentes, (α=0,05)
Se observó que el tipo de lactosuero, inóculo y la interacción de estos indican un
efecto significativo (p<0,05) sobre el crecimiento, el consumo de sustrato, la
formación de producto y los rendimientos de la fermentación (Anexo G). El
tratamiento con lactosuero desproteinizado favoreció el crecimiento del
L. casei, observándose valores de 1,82E+08UFC L-1
a partir de un inoculo del
5% (Tabla 10), con respecto al lactosuero entero donde se obtuvo el menor
crecimiento (5,28E+07UFC L-1
) con el inoculo del 10% de cultivo. Respecto a
la producción, cabe destacar que el tratamiento con lactosuero entero y 15% de
inóculo, mostró la mayor producción de ácido láctico (16,27 g L-1
), mientras
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que el lactosuero desproteinizado con 15% de inoculo presento la menor
producción de ácido láctico (4,51 g L-1
); en cuanto al consumo de lactosa, el
tratamiento con lactosuero entero y 10% de inóculo, presento el mayor consumo
de lactosa (17,96 g L-1
), y el lactosuero desproteinizado con 5% evidencio el
menor consumo de lactosa (3,57 g L-1
); lo cual indica que probablemente el
primero fue un medio propicio para el desarrollo del microorganismo en lugar
de sintetizar producto, mientras que en el segundo el rendimiento de producto
con respecto a la biomasa (Y´p/x) fue superior. Otras investigaciones
desarrolladas en lactosuero inoculado por L. casei, demostraron que al optimizar
las condiciones del proceso se consiguió una conversión alta de lactosa
(95,62%) a L (+) producción de ácido láctico (33,73 g/L) después de un período
de incubación de 36 h (Panesar et al. 2010).
La acidificación y el consumo de lactosa muestra diferencias significativas
(p<0,05) para los factores de variación en el tipo de lactosuero, porcentaje de
inóculo y la interacción de estos, cuando son evaluadas en cada periodo de
tiempo monitoreado hasta las 96h (Anexo F). Mediante el test de media de
Duncan se obtuvieron 3 grupos diferentes asociados a cada uno de los inóculos
y tipos de lactosuero. En el caso del consumo de lactosa, la fuente de variación
mediante el test de Duncan mostró dos grupos en cada periodo evaluado; esto no
se presentó cuando se consideró el porcentaje de inóculo. La cinética de la
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fermentación de los tratamientos muestra que deben ser considerados durante
todos los periodos y aplicar los modelos que nos permitan conocer los
parámetros cinéticos y estequiométricos, dado que modelos lineales y cuadrados
derivados del análisis por periodo (Anexo F) no nos permitieron caracterizar
adecuadamente los seis tratamientos.
4.3.1. Parámetros fermentativos
Basado en los datos experimentales de concentración de lactosa, ácido láctico y
recuento de L. casei los coeficientes estequiométricos fueron determinados para
formación de producto, consumo de sustrato y biomasa (Tabla 11) en cada uno
de los tratamientos, donde los factores de variación mostraron un efecto
significativo (p<0,05) sobre estos (Anexo G). El rendimiento de producto a
partir del sustrato (Y´p/s) fue más estable en los tratamientos con lactosuero
entero que cuando se usó el desproteinizado, y no está relacionado directamente
con el logro de la acidificación del medio al estándar requerido (120°D). El
medio con lactosuero entero e inoculado con 15% de cultivo madre logró la
acidificación a las 34h de fermentación, contrastado con el mejor rendimiento
Y´p/x igual a 80,38.
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Tabla 11. Coeficientes estequiométricos Y´p/s, Y´x/s y Y´p/x, Qp, Qx
Rendimientos
experimentales
Productividad
Volumétrica
Tratamientos Lactosa
inicial
(g L-1)
Acidez
°D
Y´p/s Y´x/s Y´p/x
Qp gAL/Lh
Qx
UFC/Lh
1 Entero /5% 41,2 152
0,65ª 0,0169ª 38,83ª 0,095 1,25E+06
2 Entero /10% 41,2 139
0,62ª 0,0081ª 77,32b 0,119 5,62E+05
3 Entero /15% 41,2 236
0,86c 0,0136ª 80,38b 0,173 1,44E+06
4 Desproteinizado/5% 43,7 82
0,49c 0,1080b 13,18c 0,054 1,93E+06
5 Desproteinizado/10% 43,7 137
0,68b 0,0275ª 39,43ª 0,112 1,45E+06
6 Desproteinizado/15% 43,7 81
0,58ª 0,0218ª 26,88ac 0,048 9,64E+05
Los rendimientos obtenidos Y´p/s son superiores a los rendimientos de 0,47 a
0,33 cuando suplementaron con glucosa (Mirdamadi et al.2008); 0,15 y 0,23 en
lactosuero diluido (36 g L-1
) y no diluido (52 g L-1
) respectivamente (Plessas et
al.2008) usando L. helveticus. (Aguirre et al. 2009) reportaron 0,52 g g-1
en
suero de leche de cabra en un cultivo batch con un consumo de lactosa de 28,36
g L-1
después de 40 h de fermentación y al reportado de 0,53 g g-1
por García
(2012) cuando suplemento lactosuero desproteinizado con 2,62 g L-1
de sulfato
de amonio y 1,4 g L-1
de lactosa.
Considerando que el ácido láctico es el componente mayoritario de los ácidos
orgánicos formados en el suero lácteo; la cantidad teórica de ácido láctico que se
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puede producir en la fermentación se calcula a través de reacción de
descomposición de la lactosa en glucosa y galactosa y luego de la glucosa en
ácido láctico. Esto indica que por cada mol de glucosa se forman 2 moles de
ácido láctico, si se considera los pesos moleculares de la lactosa y ácido láctico,
el máximo rendimiento teórico de ácido láctico producido seria de
1,05 gac.lactico/gLactosa, lo cual en la práctica, generalmente no ocurre y de obtienen
rendimientos de alrededor un 85% en los mejores casos (Serna y Ridriguez
2005). Este caso, es distinto a lo observado en sustratos como el lactosuero,
dado que en condiciones teóricas un sustrato puro adicionaría una fuente de
vitaminas y cofactores que son aprovechados en su totalidad, sin considerar que
una parte de estos en la realidad no son transformados, pues son usados para la
realización de las actividades metabólicas del microorganismo.
Los resultados muestran que a altas concentraciones de inóculo se favoreció la
acidificación en el lactosuero entero. Mientras que en el lactosuero
desproteinizado el crecimiento microbiano fue mayor y favorecido por la baja
concentración inicial de inóculo. Varios factores estimulan el crecimiento y
tienen considerable efecto sobre la producción de ácido láctico; entre ellos la
mezcla de aminoácidos y péptidos usualmente no solo estimulan el crecimiento
y resultan en velocidades de crecimiento mucho más altas (Vásquez 2008).
Estudios similares realizados con suero de leche de cabra desproteinizado,
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demostraron que este es un sustrato adecuado (sin necesidad de suplementación
con fuentes adicionales de carbono o nitrógeno) para obtener concentraciones en
el orden de 3 a 4 g/L de biomasa probiótica de L. casei. Una vez liofilizada, esta
biomasa tiene una viabilidad en el orden de 1010
UFC/g de biomasa (Aguirre et
al. 2009). En otros estudios, se logro estandarizar curvas de crecimiento de
L. casei en lactosuero dulce con una producción celular de 5,9x1010
UFC/mL
en 75 h, y de ácido láctico de 70,39 y 76,24 g/L en 93 h, con 0% y 5% de
glucosa respectivamente (Escobar et al. 2010).
En investigaciones realizadas empleando residuos de cosecha, se obtuvieron
concentraciones de ácido láctico por encima de 70,19 g L-1, una conversión de
sustrato (CS) de 85,46%, Yp/s de 0,88 g g-1 y rp de 0,97 g L-1 h-1 con una
concentración de 90 g L-1 de azúcar total usando una mezcla de jugos de
cogollos y hojas (JCG) de la caña de azúcar y jugos extraídos de esta caña
(JCL), cosechada con quema y sin quema, con adición de 3% (p/v) de extracto
de levadura y la cepa Lactococcus lactis subsp. Lactis, la cual fue adicionada en
un 10% respecto al volumen. Aún sin adición de extracto de levadura, estas
mezclas presentaron muy buen comportamiento como sustrato de fermentación
ácido láctica; este comportamiento se explica en parte por el mayor contenido en
nitrógeno del JCG y del JCV, comparado con el JCL (Serna y Rodríguez 2007).
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Los resultados obtenidos al evaluar la productividad Qp y Qx, evidenciaron que
el tratamiento con lactosuero entero y 15% de inoculo presento mayor
productividad en relación a la formación de ácido láctico, siendo la menor la
obtenida en el lactosuero desproteinizado inoculado con 5% de L .Casei; esto
concuerda con el comportamiento mostrado al evaluar los rendimientos
Y´p/s en esta investigación, y con lo establecido por (Serna y Rodríguez 2005),
para quienes las cepas que dan altas concentraciones y rendimientos, dan altas
productividades.
Respecto a Qx, se encontró que la mayor productividad fue obtenida en el
lactosuero desproteinizado con 5% de inoculo y la menor en el tratamiento con
lactosuero entero inoculado con 10% de L. casei, estos resultados concuerdan
con lo establecido por (Aguirre et al. 2009), quienes afirman que dado que el
producto principal del metabolismo de L. casei, el ácido láctico, se inhibe el
desarrollo de biomasa, recomendando la estrategia de cultivo por lote
alimentado como la que preferentemente debe utilizarse para conseguir altas
productividades tanto de biomasa como de producto.
4.3.2. Parámetros cinéticos
Los modelos Logístico modificado y Gompertz durante las 96 horas de
fermentación fueron los que mejor se ajustaron al crecimiento del L. casei en los
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diferentes tratamientos (Figuras 15 a 20). Los datos experimentales (ln(N/No))
y los modelos ajustados de Gompertz y Logístico modificado describen las
etapas lag, exponencial y estacionaria en el lactosuero entero más no en el
lactosuero desproteinizado.
Figura 15. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 5% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
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Figura 16. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 10% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
Figura 17. Cinética de crecimiento en lactosuero entero con 15% de inóculo,
experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
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Figura 18. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 5% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
Figura 19. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 10% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
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Figura 20. Cinética de crecimiento en lactosuero desproteinizado con 15% de
inóculo, experimentales (♦), Gompertz (□) y Logístico modificado (∆).
La Tabla 12, muestra las velocidades específicas de crecimiento máximas
(μmax) y tiempos lag (λ), calculadas para cada uno de los sueros y tratamientos,
calculados para cada uno de los modelos; arrojando que al calcular el Error
experimental y el R2
para los mismos, los modelos Gompertz y Logístico
modificado fueron los que mejor ajuste presentaron.
Para las fermentaciones analizadas, se encontró velocidades específicas de
crecimiento máximas (μmax) similares y tiempos lag (λ) diferentes.
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Tabla 12. Parámetros de los modelos.
Lactosuero / Inóculo Modelo μmax (h-1
) As λ(h) SSE
Entero /5% Gompertz 0,032 0,585 33,61 0,098
Logístico modificado 0,014 0,535 38,54 0,100
Desproteinizado/5% Gompertz 0,26 492,14 289,15 0,27
Logístico modificado 0,39 48,15 157,46 0,27
Entero /10% Gompertz 0,007 0,886 43,53 0,231
Logístico modificado 0,0459 0,881 43,72 0,222
Desproteinizado/10% Gompertz 0,0026 0,762 1,07 0,116
Logístico modificado 0,0068 0,678 6,54 0,1362
Entero /15% Gompertz 0,0044 0,433 10,18 0,055
Logístico modificado 0,0304 0,413 13,73 0,074
Desproteinizado/15% Gompertz 0,0029 0,373 15,59 0,282
Logístico modificado 0,0099 0,3478 20,33 0,291
La velocidad específica de crecimiento (μmax) es afectada por el incremento de la
acidez en el medio y es menor en los tratamientos donde mayor acidificación se
logró a las 96h. En los medios inoculados con 5% las μmax fueron mayores a los
otros tratamientos, acorde al rango de 0.013 a 0.037 h-1 reportado por
(Mondragón y Nájera 2006), mientras que valores inferiores a 0,01 h-1 fueron
reportados por (Aguirre et al. 2009) usando L. casei y entre 0,26 y 0,4 h-1
en un
lactosuero suplementado (Garcia 2012).
La velocidad de formación de ácido láctico está directamente relacionada a la
velocidad de crecimiento definida por los parámetros α y β del modelo
Luedeking Piret. El valor α es el parámetro asociado al crecimiento del
microorganismo y el β está asociado a la biomasa, muestran diferencias
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significativas en todos los casos (Anexo H) excepto el primero que no muestra
diferencias significativas (p>0,5) con respecto al tipo de lactosuero. Los
resultados muestran que hay un buen ajuste al modelo con los parámetros
α (g ácido láctico UFC-1
) y β (g ácido láctico log UFC-1
h-1
) y que la asociación
de la formación de ácido al crecimiento del L. casei (Tabla 13) caracteriza la
fermentación en todos los tratamientos y en un menor grado el parámetro β
asociado a la biomasa presente. Los modelos que se escogieron fueron ajustados
con base a que son asociados al crecimiento.
En otra investigación similar, realizada a partir de lactosuero desproteinizado
suplementado con extracto de levadura y peptona trípsica de caseína,
fermentada en un cultivo continuo con L. helveticus, se encontró una tasa
específica de crecimiento máximo, (μmax= 0,469 ± 0,012 h-1), un rendimiento
real (Yc= 0,759 ± 0,061 kg de biomasa producido/ kg de lactosa consumido para
crecimiento), Similar a lo observado en la presente investigación para el
lactosuero entero con 10% de inoculo. La máxima concentración de biomasa y
ácido láctico fue de 55 y 10,97 kg/m3, siendo la máxima productividad de
biomasa y ácido láctico 6,2 y 1,83 kg/m3.h respectivamente. Estos resultados
revelan y sugieren el potencial uso del lactosuero como sustrato para bacterias
homolacticas (Urribarrí et al. 2004). Del mismo modo, otros estudios han
demostrado que la fermentación en continuo da en la mayoría de los casos
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mayores concentraciones y mayores rendimientos, comparado con la
fermentación en discontinuo; además, altas y concentraciones se obtienen
manteniendo constante el pH durante la fermentación. (Hofvendahl y Hagerdal
2000).
Tabla 13. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico.
Lactosuero / Inóculo α Β SSE R2
Entero /10% 0,250ª 0,039b 0,19 95,5
Desproteinizado/5% 0,256ª 0,051c 0,28 93,7
Desproteinizado/10% 0,297b 0,042b 0,045 99,2
Entero /5% 0,344c 0,034ª 0,03 98,1
Entero /15% 0,370c 0,098d 0,68 93,0
Desproteinizado/15% 0,423d 0,039b 0,75 94,3
La cepa de L. casei logro alcanzar la acidificación deseada 120°D a partir de
lactosuero entero e inóculo al 15% en 34h de fermentación, sin control de pH y
sin agitación; la cepa se adaptó a las concentraciones de lactosa y gracias a que
este microorganismo puede hidrolizar el disacárido y metabolizar luego la
glucosa por vía glicolitica, logro su transformación alcanzando adecuados
parámetros cinéticos µmax, Y´P/S, Y´X/S, Qp, Qx, α y β (Salminen 1993; Serna y
Naranjo 2005).
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5. CONCLUSIONES
Los lactosueros entero y desproteinizado proveniente de la elaboración de queso tipo
mozzarella y requesón en la empresa COLQUESOS de la ciudad de Sincelejo – Sucre,
se encuentran dentro de los rangos fisicoquímicos aceptable para su acidificación y
posterior empleo como suero ácido en la elaboración de nuevos lotes de producción de
este tipo de queso.
La acidificación de los tratamientos se logró con la inoculación de L. casei a 37°C y
120rpm, hasta valores superiores a los 120ºD, excepto en el lactosuero desproteinizado
inoculado con un 15% de cultivo.
Las ecuaciones logística modificada y Gompertz son las que mejor ajuste tienen para
describir las etapas lag, exponencial y estacionaria del L. casei en los medios y el
modelo de Luedeking-Piret se ajustan adecuadamente a la formación de ácido láctico de
acuerdo a lo observado al analizar el Error experimental y del R2.
Los parámetros cinéticos de crecimiento (µmax de 0.004 h-1) y de formación de
producto α de 0,37 g ácido láctico UFC-1
y de 0,09 g ácido láctico (UFC h)-1
) de la
fermentación corresponde al tratamiento con lactosuero entero y 15% de inóculo,
representa la acidificación hasta 120ºD en el menor tiempo, encontrando en este tipo de
lactosuero el mayor valor de y´p/s 0,86 g g-1
, al igual que la mayor productividad. Sin
embargo, el mayor crecimiento se experimenta en lactosueros desproteinizados.
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6. RECOMENDACIONES
Evaluar el comportamiento de la acidificación de los lactosueros objeto de
estudio suplementando con fuentes de carbono, nitrógeno y minerales.
Ensayar empleando mayor porcentaje de inóculo para establecer si se puede
reducir el tiempo de fermentación.
Ampliar el estudio hacia la evaluación de las características de hilado del queso
tipo Mozzarella elaborado empleando lactosuero ácido entero fermentado hasta
120°D mediante la inoculación de 15% de L. casei.
Realizar mediciones de peso seco durante el proceso de fermentación para hacer
seguimiento al crecimiento de los microorganismos.
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ANEXOS
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Anexo A. Ficha técnica del microorganismo empleado
Tabla 14. Especificaciones de Lactobacillus Caseí ATCC 393
Organism Lactobacillus casei (orla-Jensen) Hansen and
Lessel deposited as Lactobacillus casei subsp.
Casei (Orla-Jensen) Hansen and Lessel
Designations 03 [7. LAM 12473. Orland L-323.R.P Tittsler
303]
Isolation Dairy products (cheese)
Depositor GJ Hucker
Biosafetv Level 1
Shipped Freeze-dried
Growth ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth
Conditions Temperature: 37.0 °C
Permits/Forms In addition to the MTA mentioned above,
other ATCC and/or regulatory permits may be
required for the transfer of this ATCC
material. Anyone purchasing ATCC material
is ultimately responsible for obtaining the
permits. Please click here for information
regarding the specific requirements for
shipment to your location.
References Nucleotide (GenBank): AF129168
Lactobacillus casei sorbose operon partial
sequence.
Nucleotide (GenBank): Z75478 L. casei m
operon. 165-235 rRNA spacer (long). tRNA-
lle and tRNA-Ala genes.
Nucleotide (GenBank): Z80834 L.casei lacT
gene.
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Anexo B. Evidencias fotográficas de las técnicas utilizadas para la
caracterización fisicoquimica y evaluacióndel proceso de fermentación de
los lactosueros objeto de estudio.
Figura 21. a) Determinación de Acidez por titulación y b) Medición de pH
de los lactosueros
Figura 22. c) Determinación de densidad d) Humedad y ST
a) b)
c) d)
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107
Anexo B. (Continuación)
Figura 23. e) Determinación de contenido de nitrógeno y porcentaje de
proteína presente en los lactosueros
Figura 24. f) Determinación de porcentaje de grasa presente en los
lactosueros
Figura 25. g) Determinación de contenido de cenizas h) determinación de
contenido de lactosa
e)
f)
g) h)
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108
Anexo B. (Continuación)
Figura 26. Lactobacillus casei activado
Figura 27. Formación del cultivo madre en leche entera UHT a) antes de
inocular la cepa de Lactobacillus caseí b) luego de incubación de la cepa c)
Control
Figura 28. Montajes proceso de fermentación batch.
a) b) c)
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109
Anexo C. Ficha técnica del medio de cultivo empleado
Tabla 15. Especificaciones de AGAR M.R.S OXOIDCM0361
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
M.R.S AGAR (de Man, Rogosa, Sharpe) - For Laboratory Use
Only/500g makes 8 Litres/ Typical Formula (gL-1) pH 6.2±
0.2 at 25°C
Proteosa peptona Nº 3 10.0 Suspender 64 g del medio en
un litro de agua destilada.
Reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullición
durante 1 ó 2 minutos.
Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121 ºC.
Extracto de carne 8.0
Extracto de levadura 4.0
Glucosa 20.0
Monoleato de sorbitán 1 ml
Fosfato dipotásico 2.0
Acetato de sodio 5.0
Citrato de amonio 2.0
Sulfato de magnesio 0.2
Sulfato de manganese 0.05
Agar 13.0
pH final: 6.4 ± 0.2
Almacenar de 10 a 30 °C
Incubation method
42°C thermophilic: 2 days
35°C mesophilic: 2 days
30°C + 22°C mesophilic-
psychrotrophic
2+1 days
25°C psychrotrophic: 3 days
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Anexo D. Curvas de calibración
Figura 29. Curva de calibrado para azucares reductores – Lactosa
Figura 30. Curva patrón microorganismo
Absorbancia a 540 nm
Azucare
s R
educto
res (
mg/L
)
[AR]=1492.49*Abs + 59.37
r2=98.79%
0 0,2 0,4 0,6 0,8
0
200
400
600
800
1000
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Anexo E. Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e inóculo
TABLA 16. Estadística descriptiva - Análisis de Covarianza de las variables Lactosuero e inóculo
Análisis ANOVA Type I Sum of Squares:
Análisis de las diferencias por Tukey entre los tipos de lactosuero con un intervalo de confianza de 95%:
Categoría Media estimada Grupos 2 61,757 A 1 73,202 B
Variable Observaciones Observaciones con datos perdidos
Observaciones sin datos perdidos
Mínimo Máximo Media Desviación típica
ACIDEZ 594 0 594 22,700 267,900 67,480 43,757 Tiempo 594 0 594 2,000 96,000 32,545 30,310
Fuente GDL Suma de los cuadrados
Media de los cuadrados
F Pr > F
Tiempo 1 665645,934 665645,934 1760,107 < 0,0001 LACTOSUERO 1 19453,267 19453,267 51,438 < 0,0001 PORCENTAJE DE INÓCULO 2 114773,812 57386,906 151,743 < 0,0001 INTERACCIÓN: Tiempo*LACTOSUERO 1 29396,046 29396,046 77,729 < 0,0001 INTERACCIÓN: Tiempo*PORCENTAJE DE INÓCULO 2 13654,035 6827,018 18,052 < 0,0001 INTERACCIÓN:LACTOSUERO*PORCENTAJE DE INÓCULO 2 71616,926 35808,463 94,685 < 0,0001
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Anexo E. (Continuación) Análisis de las diferencias por Tukey entre los porcentajes de inóculo con un intervalo de confianza de 95%:
Categoría Media estimada Grupos 10 56,692 A 5 58,641 A
15 87,106 B Análisis de diferencias de las interacciones tipo de lactosuero : inóculo por la prueba de Tukey
Categoría Media estimada Grupos
LACTOS-1*PORC-10 53,600 A
LACTOS-1*PORC-5 57,700 A LACTOS-2*PORC-5 59,583 A B
LACTOS-2*PORC-10 59,784 A B LACTOS-2*PORC-15 65,904
B
LACTOS-1*PORC-15 108,307 C
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Anexo E. (Continuación) Análisis de las diferencias entre los tiempos de fermentación y la acidez observada con un intervalo de confianza de 95%: por la prueba de tukey
Categoría Media estimada Grupos
96 129,187 A
72 116,598
B
58 98,848
C 46 86,211
D
34 72,378
E 22 55,561
F
10 42,065
G
8 36,007
G
4 35,385
G
2 35,030
G
6 35,006 G
Figura 31. Gráfico de medias de la acidez
Tiempo (h)
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114
Anexo F. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el tiempo
Tabla 17. Análisis estadístico de los lactosueros para los tratamientos y el tiempo
Cuadrados medios para acidez
TIEMPO
G
L
2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
F.V
Tipo de Lactosuero 1 112.811** 167.481** 35.122** 15.041** 422.8** 58.593NS 194.180NS 1640.106NS 1917.689NS 8172.120NS 76915.629**
Porcentaje de
inóculo
2 1095.560** 1169.675** 1495.688** 2162.240** 3158.848** 12993.355** 10923.031** 16150.806** 18932.401** 12333.192** 7880.067*
Interacción:
Lactosuero*Porcen
taje
2 68.865** 136.192** 44.027** 22.465** 41.350** 831.768NS 5469.972** 13257.286** 13521.079** 16200.245** 26416.911**
Error
Experimental
1
2
0.368 2.470 1.410 1.222 5.084 130.202 275.469 617.377 983.241 1729.284 1261.604
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Anexo F. (Continuación)
Pruebas de Duncan para acidez-lactosuero:
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
Tipo de Lactosuero
1 36.559A 37.181A 35.925A 36.759A 42.755A 58.470A 74.274A 91.722A 104.807A 128.90A 176.022A
2 33.668B 33.659B 34.313B 35.703B 37.159B 56.387A 70.481A 80.700A 92.889A 104.30A 100.541B
Pruebas de Duncan para Acidez-Porcentaje de Inóculo
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
PORCENTAJED
E INÓCULO
5% 34.522B 35.444B 32.577B 32.305B 33.055B 40.267B 60.333B 73.000B 88.24B 110.83B 117.48B
10% 27.625C 27.347C 27.544C 27.775C 31.586B 43.628B 50.083B 65.133B 73.05B 93.79B 138.04AB
15% 33.194A 43.469A 45.236A 48.613A 55.230A 88.392A 100.717A 120.500A 135.26A 145.18A 159.32A
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Anexo F. (Continuación)
Polígonos ortogonales para Interacción lactosaxporcentaje de inóculo para acidez
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
POLÍGONO
LINEAL-L1 297.680* 102.722** 527.042** 1139.235** 2755.293** 11390.435** 22890.867** 43394.580** 43483.005** 38281.445** 32055.120**
CUAD-L1 1277.014** 1527.478** 1102.518** 1277.014** 1167.615** 6268.356** 8829.449** 14055.360** 18455.609** 13795.215* 18503.706NS
LINEAL-L2 381.800NS 571.783** 495.400** 1255.840** 1729.700** 9496.716** 401.388NS 46.080NS 81.920NS 2492.180NS 2.275NS
CUAD-L2 372.356** 409.751** 504.472** 697.322** 747.749** 494.738NS 664.302NS 1320.166NS 2886.426NS 2516.036NS 18032.856**
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Anexo F. (Continuación)
Pruebas de validación para acidez
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
R2 (%) 99.54 99.66 99.92 99.79 99.81 97.83 99.86 99.98 99.96 99.90 99.96
C.V (%) 1.727 4.437 3.381 3.051 5.642 19.869 22.931 28.821 31.724 35.664 25.686
MEDIA 35.113 35.420 35.119 36.231 39.957 57.428 72.377 86.211 98.848 116.598 138.281
SHA-WILK 0.9432* 0.7628** 0.9697NS 0.7934** 0.8332** 0.7966** 0.8461** 0.9380** 0.9798NS 0.9303** 0.9565**
F.MAX 232.370NS 323.619* 47.544NS 59.710NS 187.911** 139.415NS 69.038NS 8.540NS 87.209NS 9.548NS 116.154NS
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Anexo F. (Continuación)
Cuadrados medios para lactosa
T GL 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
F.V
LACTOSA 1 1.211* 1.191** 1.004NS 1.802* 0.903NS 0.915NS 1.504* 0.827NS 10.973* 8.768* 16.237**
PORCENTAJE DE INÓCULO 2 0.595NS 0.991** 1,694NS 0.333NS 0.131NS 0.209NS 0.129NS 1.923NS 1.836NS 0.277NS 1.260NS
INTERACCIÓN:
LACTOSA*PORCENTAJE DE
INÓCULO
2 0.929* 0.579* 0.060NS 0.785NS 0.023NS 0.092NS 0.697NS 0.242NS 0.816NS 0.264NS 0.085NS
ERROR EXPERIMENTAL 12 0.209 0.115 0.868 0.203 0.325 0.547 0.282 1.089 1.349 1.444 1.469
Pruebas de Duncan para la lactosa
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
LACTOSA
1 4.366A 4.108A 3.912A 4.093A 3.838A 3.898A 3.698A 3.235A 3.018B 2.760B 2.573B
2 4.066B 3.811B 3.639A 3.728B 4.096A 3.637A 3.364B 3.482A 3.920A 3.566A 3.670A
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Anexo F. (Continuación) Pruebas de Duncan para la lactosa-porcentaje de inóculo
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
PORCENTAJE
DE INÓCULO
5% 4.245BA 3.776B 3.468A 3.762A 3.871A 3.887A 3.439A 3.688A 3.816A 3.299A 3.390A
10% 4.382A 4.224A 4.081A 4.028A 3.993A 3.677A 3.606A 3.354A 3.405A 3.055A 2.861A
15% 4.021B 3.878B 3.777A 3.941A 4.036A 3.738A 3.548A 3.034A 3.187A 3.134A 3.112A
Polígonos ortogonales para interaccion LactosueroxPorcentaje de inóculo para lactosa:
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
POLÍGONO
LINEAL-L1 2.070** 0.293NS 0.278NS 0.254NS 0.242NS 0.001NS 0.338NS 1.409NS 1.644NS 0.043NS 0.090NS
CUAD-L1 0.363NS 0.802* 0.835NS 0.184NS 0.002NS 0.038NS 0.007NS 0.188NS 0.442NS 0.010NS 0.844NS
LINEAL-L2 0.239NS 0.946* 0.615NS 1.608* 0.042NS 0.345NS 1.087NS 2.517NS 1.921NS 0.239NS 0.773NS
CUAD-L2 0.376NS 0.100** 1.780NS 0.191NS 0.021NS 0.218NS 0.221NS 0.218NS 1.298NS 0.791NS 0.982NS
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Anexo F. (Continuación)
Pruebas de validación para azúcar:
TIEMPO 2 4 6 8 10 22 34 46 58 72 96
R2 (%) 91.05 89.99 90.11 85.02 76.38 90.98 90.47 97.34 98.63 96.09 98.67
C.V (%) 10.84 8.56 24.67 11.52 14.37 19.62 15.03 31.07 33.48 37.99 39.18
MEDIA 4.216 3.959 3.775 3.910 3.967 3.768 3.531 3.358 3.469 3.163 3.121
SHA-WILK 0.957NS 0.980NS 0.874** 0.963NS 0.973NS 0.970NS 0.967NS 0.989NS 0.915** 0.933** 0.897**
F.MAX 17.04NS 85.53NS 35.08NS 8.18NS 24.41NS 44.35NS 84.86NS 13.19NS 64.19NS 195.74NS 143.02NS
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Anexo G. Análisis factorial de los parámetros estequiométricos
Figura 32. Efectos principales para biomasa
Tabla 18 . Análisis de varianza para biomasa Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 0,0444083 1 0,0444083 41,19 0,0000
B:Tipo Lactosuero 0,0288 1 0,0288 26,72 0,0003
AA 0,005625 1 0,005625 5,22 0,0432
AB 0,027075 1 0,027075 25,12 0,0004
Bloques 0,00123333 2 0,000616667 0,57 0,5803
Error total 0,0118583 11 0,00107803
Total (corr.) 0,119 17
R-cuadrada = 90,035 porciento
R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 86,9689 porciento
Error estándar del est. = 0,0328334
Error absoluto medio = 0,0200926
Estadístico Durbin-Watson = 1,95748 (P=0,2926)
Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,0197939
Figura 33. Efectos principales para biomasa
Gráfica de Interacción para Biomasa
0,16
0,2
0,24
0,28
0,32
0,36
0,4
Bio
ma
sa
Inoculo
5,0 15,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Tipo Lactosuero=desproteinizado
5,0
Tipo Lactosuero
desproteinizado
Gráfica de Efectos Principales para Biomasa
0,16
0,19
0,22
0,25
0,28
0,31
Bio
ma
sa
Inoculo
15,0 Entero
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Gráfica de Interacción para Consumo Lactosa
0
4
8
12
16
20
Co
nsu
mo
La
cto
sa
Inoculo
5,0 15,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Anexo G. (Continuación)
Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Tipo Lactosuero
Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Entero 9 0,193333 0,00906084 X
desproteinizado 9 0,273333 0,00906084 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Inóculo
Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
15 6 0,185 0,0110972 X
10 6 0,208333 0,0110972 X
5 6 0,306667 0,0110972 X
Tabla 19. Análisis de Varianza para Consumo Lactosa Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 23,213 1 23,213 77,75 0,0000
B:Tipo Lactosuero 322,749 1 322,749 1081,08 0,0000
AA 60,866 1 60,866 203,88 0,0000
AB 5,56241 1 5,56241 18,63 0,0012
Bloques 0,0522111 2 0,0261056 0,09 0,9169
Error total 3,28399 11 0,298545
Total (corr.) 415,727 17
R-cuadrada = 99,2101 porciento
R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,967 porciento
Error estándar del est. = 0,546392
Error absoluto medio = 0,355216
Estadístico Durbin-Watson = 1,8445 (P=0,2189)
Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,0460248
Figura 34. Gráfico de Interacción para consumo de lactosa
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Anexo G. (Continuación)
Pruebas de Múltiple Rangos para Consumo Lactosa por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Desproteinizado 9 6,99667 0,173554 X
Entero 9 15,4656 0,173554 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Consumo Lactosa por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 6 8,54 0,212559 X
15 6 11,3217 0,212559 X
10 6 13,8317 0,212559 X
Tabla 20. Análisis de Varianza para Ácido Láctico Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 34,8502 1 34,8502 7,68 0,0182
B:Tipo Lactosuero 132,302 1 132,302 29,16 0,0002
AA 18,7345 1 18,7345 4,13 0,0670
AB 47,561 1 47,561 10,48 0,0079
Bloques 0,00854444 2 0,00427222 0,00 0,9991
Error total 49,9046 11 4,53678
Total (corr.) 283,361 17
R-cuadrada = 82,3883 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 76,9694 porciento
Error estándar del est. = 2,12997 Error absoluto medio = 1,56852
Estadístico Durbin-Watson = 2,39433 (P=0,6359)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,223426
5,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Gráfica de Interacción para Ácido Láctico
5,6
7,6
9,6
11,6
13,6
15,6
Ácid
o L
áctic
o
Inoculo
15,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Figura 35. Gráfico de interacción para ácido láctico
Anexo G. (Continuación)
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Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
desproteinizado 9 6,70444 0,0293552 X
Entero 9 12,1267 0,0293552 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 6 6,99 0,0359526 X
15 6 10,3983 0,0359526 X
10 6 10,8583 0,0359526 X
Tabla 21. Análisis de Varianza para Yp/s Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 0,157552 1 0,157552 5,78 0,0349
B:Tipo Lactosuero 0,296193 1 0,296193 10,88 0,0071
AA 0,0387434 1 0,0387434 1,42 0,2581
AB 1,3101 1 1,3101 48,10 0,0000
Bloques 0,0312148 2 0,0156074 0,57 0,5798
Error total 0,299589 11 0,0272354
Total (corr.) 2,13339 17
R-cuadrada = 85,9572 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 81,6363 porciento
Error estándar del est. = 0,165031 Error absoluto medio = 0,0982191
Estadístico Durbin-Watson = 2,38109 (P=0,6255)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,204366
5,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Gráfica de Interacción para Yp/s
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Yp
/s
Inoculo
15,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Figura 36. Gráfica de interacción para Yp/s
Anexo G. (Continuación)
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Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/s por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
15 6 0,838167 0,0575286 X
10 6 0,854333 0,0575286 XX
5 6 1,06733 0,0575286 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/s por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Entero 9 0,791667 0,0469719 X
desproteinizado 9 1,04822 0,0469719 X
Tabla 22. Análisis de Varianza para Yp/x Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 0,00667408 1 0,00667408 29,05 0,0002
B:Tipo Lactosuero 0,007442 1 0,007442 32,40 0,0001
AA 0,00219336 1 0,00219336 9,55 0,0103
AB 0,00567675 1 0,00567675 24,71 0,0004
Bloques 0,000147444 2 0,0000737222 0,32 0,7320
Error total 0,00252681 11 0,00022971
Total (corr.) 0,0246604 17
R-cuadrada = 89,7536 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 86,6009 porciento
Error estándar del est. = 0,0151562 Error absoluto medio = 0,00943827
Estadístico Durbin-Watson = 2,33321 (P=0,5873)
Autocorrelación residual de Lag 1 = -0,176987
Gráfica de Interacción para Yp/x
-0,01
0,01
0,03
0,05
0,07
0,09
0,11
Yp
/x
Inoculo
5,0 15,0
Tipo Lactosuero=EnteroTipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Figura 37. Gráfica interacción para Yp/x
Anexo G. (Continuación)
Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/x por Tipo Lactosuero
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Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Entero 9 0,0131111 0,00387059 X
Desproteinizado 9 0,0537778 0,00387059 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Yp/x por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
15 6 0,0176667 0,00474049 X
10 6 0,0178333 0,00474049 X
5 6 0,0648333 0,00474049 X
Tabla 23. Análisis de Varianza para Yx/s Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Inóculo 2537,17 1 2537,17 37,62 0,0001
B:Tipo Lactosuero 6927,67 1 6927,67 102,71 0,0000
AA 1363,95 1 1363,95 20,22 0,0009
AB 556,132 1 556,132 8,25 0,0152
Bloques 39,353 2 19,6765 0,29 0,7526
Error total 741,944 11 67,4495
Total (corr.) 12166,2 17
R-cuadrada = 93,9016 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 92,0252 porciento
Error estándar del est. = 8,21276 Error absoluto medio = 4,76925
Estadístico Durbin-Watson = 1,76669 (P=0,1748)
Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,108125
No puede ejecutarse la prueba de falta de ajuste.
No hay grados de libertad para el error puro.
5,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Gráfica de Interacción para Yx/s
0
20
40
60
80
100
Yx/s
Inoculo
15,0
Tipo Lactosuero=Entero
Tipo Lactosuero=desproteinizado
Figura 38. Gráfica de interacción para Yx/s
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Anexo G. (Continuación)
Pruebas de Múltiple Rangos para Yx/s por Tipo Lactosuero Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Tipo Lactosuero Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
Desproteinizado 9 27,1093 2,6896 X
Entero 9 66,3456 2,6896 X
Pruebas de Múltiple Rangos para Yx/s por Inóculo Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD
Inóculo Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
5 6 26,0315 3,29407 X
15 6 55,1128 3,29407 X
10 6 59,038 3,29407 X
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Anexo H. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.
Tabla 24. Anova para los parámetros cinéticos de Ludeking Piret.
Fuente GDL
Suma de los
cuadrados
Media de los
cuadrados F Pr > F
Inóculo 2 0,050 0,025 150,891 < 0,0001
Tipo 1 0,000 0,000 0,473 0,505
Inóculo*Tipo 2 0,019 0,010 57,535 < 0,0001
Inóculo / Tukey (HSD) / Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confianza de 95%:
Contraste Diferencia Diferencia estandarizada
Valor
crítico
Pr >
Dif Significativo
10 vs 15 -0,123 -16,483 2,668
<
0,0001 Si
10 vs 5 -0,026 -3,491 2,668 0,011 Si
5 vs 15 -0,097 -12,992 2,668
<
0,0001 Si
Valor crítico del d de Tukey:
3,773
Categoría Media
estimada Grupos
10 0,274 A
5 0,300
B
15 0,397 C
Tipo / Tukey (HSD) / Análisis de las diferencias entre las categorías con un intervalo de confianza de
95%:
Contraste Diferencia Diferencia estandarizada Valor crítico
Pr > Dif Significativo
Entero vs
desproteinizado -0,004 -0,687 2,179 0,505 No
Valor crítico del d de Tukey:
3,081
Categoría
Media
estimada Grupos
Entero 0,322 A
Desproteinizado 0,326 A
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Anexo H. (Continuación) Resumen de las comparaciones por pares para Tipo (Tukey
(HSD)):
Categoría Media estimada(alfa) Grupos
Entero 0,322 A
Desproteinizado 0,326 A
Categoría Media estimada(beta) Grupos
Desproteinizado 0,045 A
Entero 0,057 B
Resumen de las comparaciones por pares para Inóculo*Tipo
(Tukey (HSD)):
Categoría Media estimada(alfa) Grupos
Entero /10% 0,250a A
Desproteinizado/5% 0,256a A
Desproteinizado/10% 0,297b
B
Entero /5% 0,344c
C
Entero /15% 0,370c
C
Desproteinizado/15% 0,423d D
Categoría Media estimada(beta) Grupos
Entero /5% 0,034a A
Desproteinizado/15% 0,039b
B
Entero /10% 0,039b
B
Desproteinizado/10% 0,042b
B
Desproteinizado/5% 0,051c
C
Entero /15% 0,098d D
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Anexo I. Modelos cinéticos aplicados
Modelos Ajustados:
Gompertz
Logistico modificado
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