Sesión 2:
Fundamentos de Microscopía Óptica
Nicolás Ubero Pascal
Técnicas de Microscopía aplicada a las Ciencias ForensesAdaptación Open Course Ware (OCW)
Máster Ciencias ForensesUniversidad de Murcia
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Nicolás Ubero Pascal 2
Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses
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Créditos de las Ilustraciones
Pictures Copyright
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Microscopía óptica: instrumentación y
principios
Autor:
David R. Caprette, Ph.D.
Adaptación:
Nicolás Ubero
Compound Microscope, circa 1751
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Microscopio óptico compuesto
Ocular(adaptador paralos ojos)
Objetivo
Platina móvil
condensador
Control de iluminación
Lente de campo(fuente luminosa)
Macrométrico
Micrométrico
Estativo
Cabezal
Revolver
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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses
Fundamentos técnicos de la microscopía óptica
Aumentos
Campo visualResolución Contraste
Profundidad de campo
Enfoque
IluminaciónÓptica (lentes)
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Refracción
Onda incidente
CristalAire
La onda se comprime y se dobla en el límite del medio que produce la desaceleración
La luz se dobla en ángulo cuando incide en una superficie
La componente que incide primerose ralentiza primero
Al igual que un vehículo cambia su dirección cuando entra en un terreno de gravilla
Pavimentoconsolidado
Pavimento suelto
Esta primera rueda frena
Eje perpendicular
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Aumentos y Orientación I
Objeto real
Imagen proyectada
Dirección de la luz
Posición actual
Imagen aparente
Dirección del movimiento
Dirección aparente
arriba
abajo
izquierda derecha
Una lente biconvexa curva la luz en la misma dirección cuando entra y cuando sale
rápido lento rápido
Punto focal
Las líneas de puntos son perpendiculares a la superficie de la lente
Frog gastrula, saggital section; arrow indicates yolk plug
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Aumentos y Orientación II
object
focal point
¿Por qué una lente de aumento simple no produce una imagen invertida?
Con el objeto más cerca de la lente que del punto focal, los rayos de luz divergen dando al observador la ilusión de que está viendo un objeto más grande, más alejado, pero en la misma orientación..
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Aumentos
40x 100x 400x
Aumentos finales usando una lente simple (por ejemplo un estereomicroscopio)
La misma imágen:usando un microscopio óptico compuesto
40x 100x 400x
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ResoluciónResolución (d) =
0.61λ
n sin α
λ = Longitud de onda de la luz; n = índice de refracción
5 µm 2 µm
1 µm 0.4 µm
0.2 µmEscala de resolución teórica
Escala de resolución de una 1 µm
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40x
1000x
400x
100x
Volumen de espacio observado
Volumen tridimensionalTeniendo en cuenta los cambios del aumento
Grosor del portaobjeto normal
1 mm
cubreobjeto (#1) 0.15 mm thick
Profundidad de una típica muestra
montada en humedat 0.1 mm
Profundidad de campo a diferentes aumentos
40x100x
400x
1000x
escala = 5 mm
Campo visual y profundidad de campo
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Campo visual e intensidad de la luz
Campo aparente:(izquierda) Sin ajustar el brillo
(derecha) Después de compensar con el control de intensidad
Demasiadobrillante Demasido
oscuro Demasidooscuro
Correcto correcto Correcto
100x 400x 1,000xAumento final
Aumento del objetivo100x40x10x
2 mm 0.5 mm 0.2 mmDiámetro de
campo real
Área 3 mm2 0.2 mm2 0.03 mm2
Quantity oflight
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El contraste y el condensador
Vista lateral del condensador
Vista superior de un condensador con selector de filtros
Apertura del condensador: tres posiciones
Totalmente cerrado
Totalmente abierto
Resolucióny contraste optimizados
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Contraste y variación en el condensadorTres imágenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con células de levadura)
Contraste bajo Contraste óptimo Alto contraste
A
B
(Izquierda) Bacillus thuringinensis con endosporas: (A) campo claro; (B) Contraste de fases (400x)
(derecha) Pseudopodo de Chaos (Pelomyxa) carolinensis: (C) campo claro; (D) campo oscuro (100x)
D
C
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Enfocando multiples surperficies
Condensador abierto para una mayor claridad
Foco inicial por encima de la preparación
Esquema no a escala
objetivo
Preparación
Dirección del enfoque
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Observando a través del especimen
Células superiores enfocadas
Enfocando a través de un filamento de Spirogyra (400x)
Cloroplastos enfocados justo debajo de la pared celular
Aproximadamente a la mitad de la célula
Enfoque en el centro de la célula
Alcanzando el fondo Cloroplastos enfocados justo encima de la pared celular
Siguiente paso
Siguiente paso
Siguiente paso
Siguiente paso
Siguiente paso
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Microscopía con aceite de inmersión
Diffracción severa que compromete una buena resolución
Aumentos en seco
A: Bacteria at 400x Aumentos en seco mostrando una imagen borrosa (Resolución pobre)
Aceite de inmersión
La difracción es minimizada con el uso de aceite de inmersión
B: Bacteria at 1000x Con un objetivo de inmersión (Porción central del campo de visión de A)
A B
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Uso del objetivo de inmersión
Enfocar en seco con el objetivo de mayor aumento.
Mover el revólver y dejarlo en una posición entre dos objetivos
Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el espécimen
Colocar cuidadosamente el objetivo de inmersión sobre el espécimen
Y ya se puede observar
1 2 3 4
5La punta del objetivo debe estar completamente embebida en el aceite.
Disposición de aceite sobre el cubreobjetos
Colocación de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos)
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Enfoque con un objetivo de inmersión
Demasiado lejos, mover la platina hacia arriba
Demasiado cerca – mover la platina hacia abajo
Correcto – solo es necesario un buen
enfoque
Imagen no visible Imagen no visible Alto o bajo
correcto
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Ajuste de los oculares
Enfoque del ocular(girar para enfocar)
centro
Separación de los ojos
Ajustar para una sola imagen
Totalmente cerrado
Totalmente abierto
Imagen doble
Girar para extender el tubo del ocular
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Lentes sucias?Si ve marcas contra un campo vacío, mueva la muestra de izquierda a derecha
... si se mueven, las manchas
están en la preparación
... si se mueven indica que las
marcas están en el ocular
Si las marcas no están en la preparación, girar el ocular
Manchas fuera de foco pueden aparecer en el condesador. Para saberlo
...si alejamos el condensador estas estarán
mas fuera de foco
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Comparación de los distintos tipos de
microscopía óptica
Dave Caprette
Autor:
David R. Caprette, Ph.D.
Adaptación:
Nicolás Ubero
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Comparación de los tipos de microscopía óptica
Spirogyra BacillusCampoclaro
Campooscuro
Contrastefases
“D.I.C.,” (off axis condenser)
Amoeba proteus
(top) bright field(bottom) D.I.C.
400x
100x except as noted 400x 40x
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Microscopía de campo claro
Fuente de iluminación
Filtro de luz de día
Condensador
platina
muestra
Objetivo
Control de diafragma
Campo claro
Imagen de la muestra*
Diámetro del campo visual
*Volvox (fixed and stained)
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Microscopía de campo oscuro
Fuente luminosa
Filtro luz de día
condensador
Platina
muestra
ObjetivoCampo oscuro
Imagen de la muestra*
Diámetro del campo visual
*yeast cells in suspension
Luz dispersat
Filtro opaco
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Microscopía de contraste de fase
(Fuente de luz no mostrada)
Condensador
Platinamuestra
Objetivo(no se esquematizan todos sus componentes
haloMembrana plasmática
Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis pseudopodium, 400x
Diafragma anular
Luz alterada por la muestra
Placa de faseLuz no obstaculizada
Diafragma visto desde arriba
Imagen proyectada
plasmagel
plasmasol con gránulos
Vacuola allimentaria
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Microscopía Contraste Interdiferencial (Nomarski)
Dirección de la vibración (luz que llega al observador)
(a) luz blanca (no polarizada)
(b) Filtro polarizador
(c) Luz polarizada
(a) (b) (c)
Polarized light
Amoeba proteus (100x):
(a) imagen de campo claro; (b) D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el condensador
a
b
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Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro
© N. Ubero-Pascal
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© N. Ubero-Pascal
Huevo de insecto con campo oscuro
A
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© N. Ubero-Pascal
Huevo de insecto con contraste de fases
B
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Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases
C
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Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski
D
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Créditos de las Ilustraciones / Pictures copyright• Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Dirección web: http://ocw.um.es/• Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microscopio_gif.jpg• Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: “Light Microscopy: Instrumentation and Principles” y “Light Microscopy: comparison of
optics”, publicadas on line en BioEd Online. Disponible en la página web: http://www.bioedonline.org/presentations/index.cfm#presentation32• Las figuras A, B, C y D de las páginas 29 a32 son de Nicolás Ubero
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