Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, Decana de América)
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Laboratorio de Fisiología Vegetal
GUÍA DE PRÁCTICAS DEL
CURSO
FISIOLOGIA VEGETAL
Para la E.A.P. de Genética y Biotecnología
AUTORES:
Mery L. Suni Ninataype Blga. Mag.
Enoc Jara Peña Blgo. Mag.
Rafael La Rosa Loli Blgo. Mag.
SEMESTRE 2013-I
1
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
CONTENIDO
PRÁCTICA TEMA PÁG.
Práctica 1. Contenido de agua y potencial hídrico del suelo
Práctica 2. Determinación del potencial hídrico foliar
Práctica 3. Estomas y estado hídrico foliar
Práctica 4. Transpiración en hojas de álamo
Práctica 5. Absorción de micro elementos
Práctica 6. Contenido de clorofila en la hoja
Práctica 7. Medición de la tasa de fotosíntesis (Uso del IRGA)
Práctica 8. Evaluación del crecimiento de la planta
Práctica 9. Maduración de las estructuras reproductivas
Práctica 10.
Introducción de tabaco a cultivo in vitro
Práctica 11.
Interacción de ABA y AG3 en la germinación de semillas
Práctica 12.
Regulación de la germinación
Práctica 13.
Embriogénesis somática en zanahoria
2
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
PRÁCTICA 1. CONTENIDO DE AGUA Y POTENCIAL HÍDRICO DEL
SUELO
INTRODUCCIÓN.-
La capacidad de campo se define como la cantidad de agua que un suelo
retiene en contra de la fuerza de la gravedad. Asimismo, la tensión de
humedad de un suelo que ha alcanzado la capacidad de campo suele estar
comprendida entre 1/10 y 1/3 de atmósfera. En un suelo bien drenado, de
estructura y textura uniforme por lo general se llega a este punto
aproximadamente a las 48 horas después del riego, o los tres días después de
una lluvia (Rodríguez y Rodríguez, 2002; López y López, 1985). La capacidad
de campo se puede estimar a partir de la textura del suelo y a partir de
porcentaje de porosidad. Asimismo, de acuerdo a Villa García (1997), en un
suelo franco el valor de la capacidad de campo (%) viene a ser la mitad de su
porosidad (%) y para suelos más sueltos o pesados se estima valores por
encima o debajo del valor correspondiente al suelo franco. Sin embargo, la
capacidad de campo puede ser afectado por los siguientes factores, 1) Textura.
Influye directamente en la cantidad de espacios porosos, en los movimientos
de agua y circulación del aire. En cuanto al tamaño de partícula, a mayor
tamaño será menor el valor de capacidad de campo y viceversa. 2) Estructura.
La agregación aparente o disposición de los suelos influye en la aeración,
porosidad, densidad aparente. 3) Materia orgánica. Esta ejerce una fuerza de
cohesión sobre las partículas inorgánicas, formando agregados débiles con los
que aumenta la cantidad de poros y, por tanto, el suelo retiene mayor cantidad
de agua a su capacidad de campo.
El potencial hídrico del suelo puede ser medido con un tensiómetro. Este mide
la succión o fuerza que ejerce el suelo sobre el agua. A medida que el suelo
pierde agua la succión aumenta, es decir, el suelo ejerce más fuerza para
retener agua. Por lo tanto observando cómo varía el valor de la succión
podemos saber la evolución del agua en el suelo. Normalmente se instalan dos
tensiómetros a distintas profundidades de esta forma podríamos medir
gradientes hidráulicos y por tanto conocer la dirección de los flujos de agua en
el suelo. Tiene las siguientes desventajas, limitado rango de acción, no mide
potencial osmótico, que en ciertos casos de salinidad puede ser mayor al
3
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
mátrico, lenta respuesta de lectura, no opera en suelos muy secos o de
texturas gruesas, requiere mantención, mide potencial no contenido hídrico.
OBJETIVO.-
Evaluar el contenido de humedad y potencial hídrico del suelo
MATERIALES.-
Placas Petri
Estufa
Balanza de precisión
Papel filtro
Tensiómetro
Por cada subgrupo de trabajo (4 estudiantes)
3 Botellas de plástico de 1.5 L
3 Recipientes plásticos de 1 L (Peziduris) con tapa
2 Muestras de suelo
2 Cucharas descartables
Cinta Masking tape
MÉTODO.-
1. Determinación de la capacidad de campo por el Método de la
columna del suelo
Procedimiento.- Para cada muestra de suelo seguir el procedimiento
siguiente:
a. Retirar mediante corte, aproximadamente 1/3 de una botella de plástico
de 1.5 L (de la parte de la base)
b. Cubrir la boca de la botella con papel filtro y asegurar con masking type
c. En un recipiente plástico con tapa, de un litro (Peziduri), realizar con un
sacabocado o una tijera, un hueco del tamaño del cuello de la botella en
la parte media de la tapa.
d. Tapar el recipiente plástico y fijar las botellas invertidas sobre la tapa
e. Agregar de 200-300 g de la muestra de suelo a la botella
4
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
f. Añadir agua hasta lograr completamente la saturación del suelo y luego
cubrir las botellas con un plástico polietileno para evitar la evaporación
del agua.
g. Pasado los 7 días evaluar el suelo drenado: de la parte media de la
botella, tomar 3 muestras de suelo, cada muestra colocar en las placas
petri y taparlas
h. Pesar las muestras y anotar los valores del peso húmedo
i. Secar las muestras de suelo en la estufa hasta peso constante
Cálculo de Capacidad de Campo
% de Capacidad de campo = Peso húmedo – Peso seco ____________________ Peso seco
2. Instalación del Tensiómetro y evaluación del potencial hídrico del suelo
Procedimiento.-
Tomar en cuenta que antes de enterrar el tensiómetro en el suelo es
necesario llenarlo de agua eliminando cualquier burbuja de aire. Para ello
se introduce en un balde de agua, y quitando el tapón que obtura
herméticamente el extremo opuesto al que va situado la cápsula porosa, se
llena de agua mediante succión utilizando una bomba de mano. Una vez el
agua rebose por el extremo, cerramos de nuevo el tapón. En estas
condiciones, el agua que llena la sonda esta a la presión atmosférica y el
vacuómetro marca cero. Además las medidas de presión hidrostáticas
están limitadas a potenciales matriciales inferiores a 1 atm. Para tensiones
superiores, puede penetrar aire en el interior de la sonda a través de la
cápsula porosa y se rompería la continuidad de la columna líquida.
Asimismo los tensiómetros funcionan en el rango de 0 a -0,07 Mpa (-70 cb),
que corresponde al 50% de la humedad aprovechable aproximadamente.
a) Llenar el tubo del tensiómetro con agua sin cerrarlo
b) Dejar el tensiómetro en balde con agua para saturar cápsula porosa
c) Hacer un orificio en el suelo con barreta
5
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
d) Disgregar un poco de suelo al fondo,
e) Mojar y ubicar el tensiómetro
f) Llenar espacio entre pared y tubo
g) Hacer montículo de suelo alrededor del tubo
h) Registrar el valor del potencial hídrico
(Se pueden sacar las burbujas de aire con un succionador)
RESULTADO.-
1. Determinación de la capacidad de campo por el Método de la columna del
suelo
Cuadro 1. Valores de contenido hídrico evaluado en 2 suelos diferentes.
Tipo de Suelo Repeticiones(No. de
placas/Tratamiento)
Capacidad de Campo
(%)
Suelo arenoso 1
2
3
Promedio
Suelo arcilloso o limoso 1
2
3
Promedio
2. Potencial hídrico del suelo:
REFERENCIAS.-
López R., J y J. López M. 1985. El diagnóstico de suelos y plantas. Edit. Mundi-Prensa, 4ta Edic. Madrid, España. 368 p.
Rodríguez F., H y J. Rodríguez A. 2002. Métodos de análisis de suelos y plantas. Edit. Trillas. México, 196 p.
Villa García, S. 1997. Apuntes del curso de fertilidad del suelo. Departamento de Suelos y Fertilizantes. Facultad de Agronomía. Universidad Nacional Agraria La Molina.
6
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
PRÁCTICA 2. DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL HÍDRICO FOLIAR
INTRODUCCIÓN.-
Las plantas desempeñan un papel importante en el movimiento del agua en la
naturaleza y son el eslabón intermedio en el flujo del agua desde el suelo a la
atmósfera. El cuerpo de las plantas está constituido, al menos, por un 70% de
agua. Para que un vegetal esté fisiológicamente activo precisa, entre otras
condiciones, de un balance hídrico favorable. La tendencia del agua a ser
retenida por un vegetal es la propiedad más importante para conocer los
movimientos del agua en el sistema suelo-planta/atmósfera.
El agua siempre se moverá, de manera pasiva hacia los lugares del sistema,
en donde el potencial hídrico sea más bajo. Ψ tiene dimensiones de presión. Y
sus unidades son el megapascal (Mpa), el bar o la atmósfera. Por otra parte, el
estado hídrico de la planta influye fuertemente en el crecimiento de la planta y
la producción de biomasa especialmente a través de su efecto en la expansión
de las hojas y crecimiento de sus raíces. Inclusive la tasa de fotosíntesis de la
canopia (equivalente a la producción de biomasa) declinará bajo estrés hídrico
debido al cierre de los estomas y el efecto del déficit en los procesos que se
llevan a cabo en los cloroplastos.
OBJETIVO.-
Determinar el potencial hídrico foliar y el contenido hídrico en plantas
sometidas a condiciones de déficit hídrico.
MATERIAL.-
Tubos con tapa
Sacabocados
48 Placas petri
10 Frascos Erlenmeyer
Soluciones de sacarosa 0.7m
10 Pipetas 10 mL
Balanza analítica y estufa
Área de cultivo
7
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Por cada grupo de trabajo:
Hojas de la misma edad y especie pero de plantas con diferente condición
hídrica (sometidas a déficit hídrico y otras sin)
Pinzas de punta fina
4L Agua destilada a entregar un día anterior a la práctica (por los 2 grupos de
práctica)
Papel absorbente (toalla)
Marcador de tinta indeleble y lápiz
Reloj
Etiquetas pequeñas (opcional)
MÉTODO.-
Determinación del Potencial Hídrico Foliar por el Método Gravimétrico
El potencial hídrico de un tejido vegetal mediante el método del volumen
constante o método gravimétrico, se fundamenta en la variación del peso de un
tejido vegetal debido al flujo de agua.
Preparar 8 frascos Erlenmeyer de soluciones de sacarosa de concentraciones
de 0.05 molar, 0.1 molal, 0.2 molal, 0.3 molal, 0.4 molal, 0.5 molal, 0.6 molal, y
0.7 molal. Luego de cada erlenmeyer con la ayuda de una pipeta retirar 10 ml
de sacarosa y aplicarlo a placas petri previamente rotuladas para cada
concentración. Luego con la ayuda de un sacabocado obtener 24 discos
foliares por cada condición hídrica, pasamos a un frasco con tapa. Cada
subgrupo trabajará con una concentración de sacarosa. Inmediatamente pesar
3 discos de cada condición y rotula con el marcador. Repetir para cada
concentración. Estos valores corresponden al peso inicial de muestra, Po.
Introducir tres discos de cada condición hídrica (total 6) a cada placa petri con
la sacarosa. Poner el reloj en tiempo 0 (To) en este instante. Trascurridos 15
minutos a partir del tiempo 0, de cada placa petri sacar con unas pinzas los
discos, secarlos con el papel toalla y pesar cada disco (P15). En seguida
devolver los discos a las placas petri. Repetir este proceso con cada uno de las
placas con las concentraciones restantes, siguiendo el mismo orden. A los 45
minutos repetir este proceso completo con todas las placas petri, anotando los
8
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
pesos y estas serán P45. Dado que las soluciones están a presión atmosférica
el potencial de presión (Ψp) =0. Y el Ψ de la solución depende del Ψs.
El potencial osmótico se calcula a partir de la ecuación de Van Hoff.
Ψs=miRT
m= molalidad
i= constante de ionización del soluto (para sacarosa=1)
R= constante de los gases (0.00831 kg Mpa/`oK mol);
T= temperatura absoluta (oK)= oC+ 273
RESULTADO.-
1.- Registre sus datos en una tabla y determine en qué concentración de
sacarosa no ocurre cambio de peso del tejido foliar (Ψh). Grafique el porcentaje
de cambio de peso inducido por el potencial de soluto de las soluciones de
sacarosa versus su potencial osmótico.
2.- Determine el contenido de hídrico de las hojas según la condición de estrés
y explique.
9
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Ficha de registro de datos. Determinación del potencial hídrico foliar
Sacarosa
(m)
Repetici
ón
Ψs
(Mpa)
P0 (g) P15 (g) P45(g) ∆(P45 - P0) % Cambio
c/
Est
s/Est c/Est s/Est c/Est s/
Est
c/Est s/Est c/Est s/Est
0.05 1
2
3
4
5
0.1 1
2
3
4
5
0.2 1
2
3
4
5
0.3 1
2
3
4
5
0.4 1
2
3
4
5
0.5 1
2
3
4
5
0.6 1
2
3
4
5
0.7 1
2
10
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
3
4
5
PRÁCTICA 3. ESTOMAS Y ESTADO HÍDRICO FOLIAR
INTRODUCCIÓN.-
La epidermis posee estomas usualmente más numerosos en el lado abaxial de
la hoja. La epidermis está usualmente cubierta por una capa denominada
cutícula. Esta previene de una excesiva pérdida de agua por transpiración. En
otras plantas, sin embargo, las hojas pueden estar reducidas o aun estar
ausente, como en las xerofitas. Las plantas en sí regulan el intercambio de
gases a través de sus estomas permitiendo el control de las relaciones hídricas
y la asimilación del carbono. Por lo tanto la apertura del estoma refleja un
compromiso entre el requerimiento fotosintético de CO2 y la disponibilidad de
agua.
La cantidad de agua en el vegetal puede ser expresado de diversas maneras.
Todas consideran la medida del peso fresco al momento del muestreo (Pf), el
peso seco (Ps, usualmente a 80°C) y el peso túrgido (Pt) de la muestra. Esta
última medición se obtiene al flotar hojas o secciones de hojas en agua en
condiciones de punto de compensación de la luz hasta que se alcance el peso
constante.
OBJETIVO.-
Determinar la densidad de estomas en el haz y envés de las hojas de plantas
sometidas a estrés y el contenido relativo de agua de sus hojas.
MATERIALES.-
Ramas foliares de especies sometidas a estrés hídrico y otra a riego normal.
Portaobjetos y cubreobjetos
11
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Goteros, pinza, estilete
Hoja de afeitar y papel lente, esmalte de uñas
Tubos con tapa
Sacabocados
18 Placas Petri
06 Pipetas 10 mL
Balanza analítica
Etiquetas para rotulación
Área de incubación
MÉTODO.-
1. Observación del Tejido epidérmico
Sin mover a la hoja de su posición original, aplicar con la ayuda del pincel
del esmalte, una o dos capas de esmalte en la superficie superior e inferior
de una hoja madura. Permitir que seque. Luego con la ayuda de una pinza
de punta fina, levantar desde un extremo la película que se ha formado y
preparar una lámina para su observación con el microscopio. Reconozca
las células epidérmicas y las de guardia. A 400X contabilice el número de
estomas que observa y expréselo como densidad de estomas
(n°estomas/mm2) o índice estomático [(n°estomas/n°células epidérmicas +
n°estomas) * 100]. Asimismo contabilice el número de estomas abiertos y
cerrados presentes en la muestra observada.
2. Contenido relativo de agua
Obtener 5 discos de las hojas de cada condición hídrica con la ayuda del
sacabocados y colocarlos en los tubos con tapa. Pesarlos inmediatamente
(Pf). Colocar los discos en las placas con agua destilada a 20°C por 3
horas en su punto de compensación de la luz. Cumplido el tiempo secar
cuidadosamente entre hojas de papel absorbente y volver a pesar (Pt).
Secar las muestras en la estufa a 70°C hasta peso constante (Ps).
12
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Determine el contenido de agua, contenido relativo de agua, déficit de
saturación de agua, relación peso túrgido-peso seco para los discos según
el tratamiento, en base a las siguientes fórmulas:
Contenido de agua = ((Pf – Ps)/Ps) *100
Contenido relativo de agua (R*) = ((Pf – Ps)/ (Pt – Ps)) * 100
Déficit de saturación de agua = 100 – R*
Relación peso túrgido- peso seco = Pt/Ps
Ficha de registro de datos.- Determinación del estado hídrico foliar
Repetic Pf Ps Pt Déf sat Pt/Ps Apert
estoma
c/Estrés
1
2
3
4
5
s/Estrés
1
2
3
4
5
RESULTADO.-
13
Facultad de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Fisiología VegetalMery L. Suni, Blga. M.Sc.; Enoc Jara, Blgo. Mag., Rafael La Rosa Blgo. Mag.,
Esquematice sus observaciones (o edite sus fotografías) indicando el aumento
de la imagen y las características de las estructuras observadas.
Relacione los resultados obtenidos con la especie y el momento de colecta.
14