Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in
vitro de AFB1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro
especies de aves: gallinas, pavos, patos y codornices.
Hansen Wilber Murcia Gutiérrez
Instituto de Biotecnología
Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología
Bogotá D.C., Enero 28 de 2010
Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in
vitro de AFB1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro
especies de aves: gallinas, pavos, patos y codornices.
Hansen Wilber Murcia Gutiérrez
Código 186273
Trabajo de grado presentado para optar al título de Magister en Microbiología
Dirigido por:
Dr. Gonzalo Jair Díaz
Facultad de Medicina Veterinaria
Universidad Nacional de Colombia
Codirectora
MSc. María Constanza Lozano
Departamento de Farmacia
Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Instituto de Biotecnología
Bogotá D.C., Enero 28 de 2010
NOTA DE ACEPTACIÓN
La presente tesis fue sustentada y aprobada para el grado de Maestría en Microbiología,
el 28 de enero de 2010.
En constancia firman:
Jurado: Alba Isabel Rodríguez
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia
Jurado: Héctor Suarez Mahecha
ICTA
Universidad Nacional de Colombia
A quienes siempre han creído a mi,
A quienes han compartido las tristezas y alegrías en el camino,
A mi esposa, Marcela Palacios,
Al Ser Supremo (Dios).
AGRADECIMIENTOS
A la IFC (International Foundation for Science) por su apoyo financiero.
A la Universidad Nacional de Colombia por su apoyo logístico y académico.
A la Facultad de Ciencias y al Instituto de Biotecnología por formarme como
estudiante de maestría.
Al Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
por su apoyo financiero y logístico en la realización de este proyecto.
Al Dr. Gonzalo Díaz por su orientación.
Al laboratorio de Fisiología y Bioquímica del Instituto Nacional de Salud (INS),
especialmente a su Coordinadora Dr. Ángela Guerra.
Al laboratorio de Patología Aviar de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia.
Al Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Agronomía. Universidad
Nacional de Colombia.
Al Grupo de investigación en Proteínas del Departamento de Química. Universidad
Nacional de Colombia.
A Rocío Rojas y Amparo Cortez por su colaboración durante la fase experimental
del proyecto.
Un agradecimiento muy especial a Milena Cepeda quien fue un apoyo invaluable y
muy enriquecedor durante toda la trayectoria de este proyecto de investigación.
A mis compañeros de posgrado de Microbiología y Nutrición Animal por
enseñarme que nunca hay que desfallecer.
A Socorro Prieto por el gran cariño, apoyo, orientación y cientos de virtudes más
que fueron indispensables en todo momento.
A mi esposa Marcela Palacios, quien ha estado siempre conmigo a pesar de la
adversidad y las dificultades.
1
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS ............................................................................................................. 4
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................ 5
RESUMEN ............................................................................................................................. 8
MARCO TEORICO ............................................................................................................ 10
Las micotoxinas ................................................................................................................... 10
Aflatoxinas ........................................................................................................................... 12
Efectos de la AFB1 en la salud animal ................................................................................ 13
Alteración del DNA y carcinogenicidad .............................................................................. 15
Bioactivación de la AFB1 en aves y mamíferos ................................................................... 16
Citocromos P450 (CYP450) ................................................................................................ 18
Clasificación de las enzimas CYP450.................................................................................. 21
Nomenclatura de las enzimas CYPP450 .............................................................................. 22
Usos y aplicaciones de las CYP450 ..................................................................................... 24
Medición de la actividad de las citocromos P450 ................................................................ 25
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 27
OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................... 27
HIPOTESIS .......................................................................................................................... 28
MATERIALES Y METODOS ............................................................................................ 29
Reactivos .............................................................................................................................. 29
Obtención de las muestras de hígado ................................................................................... 29
Obtención de microsomas .................................................................................................... 30
Determinación de proteína en microplaca por el método del ácido bicinconínico. ............. 30
Determinación de la actividad enzimática frente a sustratos prototipo ................................ 31
Condiciones cromatográficas (HPLC) ................................................................................. 31
Determinación de parámetros enzimáticos (KM y Vmax). ..................................................... 33
Uso de inhibidores específicos contra diferentes citocromos .............................................. 34
Cuantificación de la expresión de CYP450 aviares por la técnica de Western Blot. ........... 34
2
Análisis estadístico ............................................................................................................... 35
RESULTADOS .................................................................................................................... 37
Separación de sustratos prototipo y productos de biotransformación. ................................. 37
Codorniz ............................................................................................................................... 40
Determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax ............................................ 40
Estudios de inhibición ................................................................................................... 41
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina B1. ................................................................................................................ 43
Detección de ortólogos humanos en microsomas de codorniz ..................................... 44
Pavo ...................................................................................................................................... 45
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax ................................................. 45
Estudios de inhibición ................................................................................................... 45
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina B1. ................................................................................................................ 47
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pavo ........................................... 48
Pato ....................................................................................................................................... 50
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax ................................................. 50
Estudios de inhibición ................................................................................................... 50
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina B1. ................................................................................................................ 52
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pato ............................................ 53
Pollo ..................................................................................................................................... 54
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax ................................................. 54
Ensayos de inhibición ................................................................................................... 54
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina B1. ................................................................................................................ 56
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pollo ........................................... 57
DISCUSION ........................................................................................................................ 59
Biotransformación de sustratos prototipo ..................................................................... 59
Uso de inhibidores específicos ..................................................................................... 61
Correlación entre biotransformación de sustratos prototipo y activación de la AFB1 . 62
3
Immunoblot de ortólogos aviares ................................................................................. 63
CYP450 involucradas en la producción de AFBO ....................................................... 63
CONCLUSIONES ............................................................................................................... 64
REFERENCIAS ................................................................................................................... 66
4
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Estrategias para reducir la exposición y el riesgo de presencia de aflatoxinas
(adaptado de Groopman et al., 2008). ...................................................................................11
Tabla 2. DL50 oral aguda de AFB1 en diferentes especies (adaptado de Díaz, 1996b). ......14
Tabla 3. Sustratos metabolizados por enzimas citocromo P450 en humanos (adaptado de
Omiecinski et al., 1999). .......................................................................................................23
Tabla 4. Diferentes formas de citocromos P450 relacionadas con el metabolismo de
xenobióticos. Abreviaturas: AAF=2-acetilaminofluoreno, EROD=etoxiresorufin O-
deetilasa, PB=fenobarbital, PAH=hidrocarburo aromático policíclico, TCDD=2,3,7,8-
tetraclorodibenzodioxina, β-NF=β-naftoflavona, IQ=2-amino-3-metilimidazol[4,5-
f]quinolina (Adaptado de Josephy, 1997). ............................................................................23
Tabla 5. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo, obtenidos con
microsomas de codorniz macho y hembra. ...........................................................................41
Tabla 6. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo obtenidos con
microsomas de pavo macho y hembra. .................................................................................45
Tabla 7. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo usados en las
cinéticas con microsomas de pato macho y hembra. ............................................................50
Tabla 8. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo usados en las
cinéticas con microsomas de pollo macho y hembra. ...........................................................54
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Rutas de biotransformación de la AFB1 (Modificado de Eaton y Gallagher,
1994). CYP450(s): citocromo P450(s); PHS: prostaglandina H-sintasa; GST(s): glutatión S-
transferasa(s); UDP-GT(s): UDP-glucuronosiltransferasa(s); ST: sulfotransferasas. ......... 16
Figura 2. Productos de oxidación de la AFB1 (Tomado de Guengerich et al., 1998). ....... 16
Figura 3. Reacciones catalizadas por monooxigenasas P450: a. hidroxilación de ácidos
grasos. b. epoxidación de estireno. c. hidroxilación de compuestos aromáticos. d.
deetilación de 7-etoxicumarina. e. acoplamiento de fenol en la biosíntesis de vancomicina.
f. ruptura de un enlace acil-carbono en la demetilación de lanosterol (Tomado de Urlager y
Eiben, 2006). ........................................................................................................................ 19
Figura 4. Diagrama esquemático de la citocromo P450 BM-3 en su conformación
parcialmente abierta. Se indican las hélices F y G y el “loop” que las une. Estas hélices se
deslizan sobre la superficie de la hélice I, lo que permite el movimiento abierto/cerrado
para el acceso al sitio activo (Tomado de Poulos, 2003). .................................................... 20
Figura 5. Aplicaciones y uso de las monooxigenasas P450 (Tomado de Urlager y Eiben,
2006). ................................................................................................................................... 25
Figura 6. Cromatograma de la separación de AFB1 y su producto de biotransformación
dhd-AFB1. Tiempo de retención dhd-AFB1 =7.8 min. Tiempo de retención AFB1 =12.4
min. ...................................................................................................................................... 38
Figura 7. Cromatograma de la separación de etoxiresorufina y su producto de
biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina =3.7 min. Tiempo de
retención etoxiresorufina =7.3 min. ..................................................................................... 38
Figura 8. Cromatograma de la separación de metoxiresorufina y su producto de
biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina = 3.7 min. Tiempo de
retención metoxiresorufin =5.9 min. .................................................................................... 38
Figura 9. Cromatograma de la separación de 7-hidroxicumarina y un producto de
biotransformación desconocido. Tiempo de retención 7-hidroxicumarina = 4.1 min. Tiempo
de retención producto desconocido = 1.8 min. .................................................................... 39
6
Figura 10. Cromatograma de la separación de nifedipina y su producto de
biotransformación nifedipina oxidada. Tiempo de retención nifedipina oxidada =14.2 min.
Tiempo de retención nifedipina =16.7 min. ......................................................................... 39
Figura 11. Cromatograma de la separación de debrisoquinona y su producto de
biotransformación 4-hidroxidebrisoquinona. Tiempo de retención 4-hidroxidebrisoquinona
= 4.0 min. Tiempo de retención debrisoquinona = 5.9 min. ................................................ 40
Figura 12. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de codornices en presencia de diferentes inhibidores específicos para
citocromos P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras
(n=6). .................................................................................................................................... 42
Figura 13. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de codornices en presencia de diferentes inhibidores específicos para
citocromos P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de
AFBO. Los valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin
inhibidor). ............................................................................................................................. 43
Figura 14. Correlación de las actividad AFB1 epoxidasa y las diferentes actividades de las
CYP450 de codorniz con sustratos prototipo (n=12). .......................................................... 44
Figura 15. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de codorniz por la
técnica de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6:
microsomas de hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones
de peso molecular. ................................................................................................................ 45
Figura 16. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pavos en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ...... 46
Figura 17. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pavos en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los
valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ............ 47
Figura 18. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pavo frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12). .................................................................................. 48
7
Figura 19. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pavo por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular. ............................................................................................................................. 49
Figura 20. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pato en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos P450
humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ................ 51
Figura 21. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pato en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos P450
humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los valores con
asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ................................ 52
Figura 22. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pato frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12). .................................................................................. 53
Figura 23. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pato por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular. ............................................................................................................................. 54
Figura 24. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pollo en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6). ...... 55
Figura 25. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pollo en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los
valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor). ............ 56
Figura 26. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pollo frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12). .................................................................................. 57
Figura 27. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pollo por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular. ............................................................................................................................. 58
8
RESUMEN
Las aflatoxina B1 (AFB1) es un metabolito secundario producido por algunas cepas de
Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus que crecen sobre diferentes tipos de granos
utilizados en alimentación de animales de granja. Al momento de ser ingeridas estas toxinas
son metabolizadas por un tipo de enzimas llamadas citocromo P450 (CYP450), una familia
de enzimas relacionadas con la biotransformación de productos endógenos y xenobióticos.
El producto de biotransformación es una molécula altamente reactiva conocida como
AFB1-8,9-epóxido (AFBO). Este producto es capaz de reaccionar con proteínas y ADN
produciendo efectos citotóxicos y mutagénicos respectivamente. Esto se ve representado en
problemas en la salud animal en general.
Con este estudio se busca determinar el fundamento bioquímico de la diferente
susceptibilidad a la AFB1 en diferentes especies aviares comerciales como pollos, pavos,
patos y codornices. El proyecto investiga las diferencias cualitativas y cuantitativas del
metabolismo fase I de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) y busca determinar si existe
relación entre el metabolismo de la aflatoxina y los efectos observados in vivo. Los
alcances del proyecto incluyen la generación de información básica sobre el metabolismo
fase I de la aflatoxina en aves lo cual permitirá realizar la selección genética de aves
resistentes a la aflatoxina así como el posible control de la toxicosis mediante la
manipulación de las enzimas responsables de su metabolismo.
Al final del estudio se pudo evidenciar que el uso de sustratos prototipo e inhibidores
específicos para CYP450 humanas permitió cumplir con los objetivos planteados
identificando claramente ortólogos aviares y determinando el rol especifico de aquellos
ortólogos relacionadas con la producción de AFBO en pavo, codorniz, pato y pollo. Estos
resultados representan información novedosa acerca de la presencia de CYP450 con
funcionalidades similares a las CYP450 de humanos y otras especies de mamíferos y abre
el campo en la investigación y búsqueda de nuevos ortólogos no descritos con papeles
relevantes en la biotransformación de compuestos tóxicos, como es caso de esta
investigación. Debido a que en la literatura los estudios de este tipo donde se mencione la
existencia de ortólogos en aves de producción e importancia económica son escasos. Con
9
los resultados obtenidos de esta investigación se demostró que en todas las especies aviares
estudiadas la participación de los ortólogos 1A1 y 2A6 en la biotransformación de la
aflatoxina B1. Las correlaciones de actividades frente a sustratos prototipo corroboró la
importancia del ortólogo 2A6 en las cuatro especies aviares, acumulando evidencia a favor
de su rol en la producción de AFBO. Según la evidencia los ortólogos 1A2 y 3A4 no se
encuentran relacionados en la formación de AFBO.
10
MARCO TEORICO
Las micotoxinas
Las micotoxinas surgen como compuestos de interés toxicológico luego de descubrirse su
rol como agentes etiológicos de la “enfermedad X” de los pavos reportada en los años 60.
Esta enfermedad asociada al consumo de una harina de maní procedente de Brasil causó la
muerte de más de 100.000 pavitos en Inglaterra. Con el tiempo se descubrió que ciertas
sustancias tóxicas aisladas del alimento causaron dicha enfermedad. Estas sustancias se
denominaron “aflatoxinas” ya que el principal hongo productor de estas resultó ser
Aspergillus flavus (Sargeant et al., 1961). Después de las aflatoxinas se descubrieron otras
micotoxinas entre las cuales se incluyen los tricoticenos, la ocratoxina A, la zearalenona y
hacia finales de la década de los noventa un grupo de micotoxinas producidas por hongos
del género Fusarium a las cuales se les dio el nombre de fumonisinas (Bezuidenhout et al.,
1988).
La habilidad de las micotoxinas para inducir varios tipos de cáncer en animales domésticos
y de experimentación constituye una gran preocupación para la salud pública. En 1993 la
Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer clasificó las micotoxinas de
acuerdo a su carcinogenicidad, encontrando micotoxinas clasificables en el grupo 1
correspondientes a compuestos carcinógenos para humanos (como la aflatoxina B1), en el
grupo 2 correspondiente a compuestos posiblemente carcinógenos para humanos
(aflatoxina M1, ocratoxina, fumonisina B1) y en el grupo 3, correspondiente a compuestos
no carcinógenos para humanos (como zearalenona y tricoticenos) (Lesson et al., 1995).
Teniendo en cuenta que los metabolitos primarios son aquellas moléculas sintetizadas
durante el crecimiento del hongo, las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos
cuando la fase de crecimiento termina o cuando hay deficiencias en nutrientes esenciales.
Bajo estas condiciones los procesos de síntesis se encaminan hacia la producción de
pigmentos, antibióticos y micotoxinas, los cuales son excretados de manera abundante
durante la fase estacionaria de crecimiento del hongo. Cuando las micotoxinas son
producidas en granos o alimentos destinados a la alimentación de animales o humanos se
convierten en un peligro potencial tanto para la salud humana como para la salud y
producción animal (Díaz, 1995). Hasta el 2004 se habían detectado y clasificado como
11
micotoxinas más de 300 metabolitos secundarios provenientes de hongos filamentosos.
Estas sustancias son producidas principalmente por los géneros Aspergillus, Penicillium y
Fusarium. Se conoce que estos compuestos causan enfermedades severas incluyendo
ciertos tipos de cáncer, disminución de la respuesta inmune, e hiperestrogenismo, entre
otras (Bünger et al., 2004).
Después de haberse descubierto el efecto carcinogénico de las aflatoxinas, la búsqueda de
micotoxinas ha llevado a la identificación de más de 10 tipos de hongos toxigénicos, cuya
genética y metabolismo han sido descritos recientemente. Debido a esto se han generado
diferentes estrategias para inactivar o disminuir el impacto de la presencia de micotoxinas,
en especial de las aflatoxinas, en los lugares de almacenamiento (Tabla 1) (Groopman et
al., 2008).
Tabla 1. Estrategias para reducir la exposición y el riesgo de presencia de aflatoxinas
(adaptado de Groopman et al., 2008). Tipo de intervención Enfoque Resultado
Primario Condiciones de almacenamiento pos-
cosecha
Reducción en la exposición a aflatoxinas
medido por la reducción de los niveles de
aductos aflatoxina-albúmina.
Primario Agentes adsorbentes (aluminosilicatos) Reducción en la exposición a aflatoxina en
animales modelo y ensayos clínicos.
Primario Clorofilina Eficacia demostrada en modelos
experimentales y un 55% de reducción en
aductos aflatoxina-ADN urinarios en
ensayos clínicos humanos.
Secundario Polifenoles de té verde Prevención de cáncer demostrado en ratas
y reducción de biomarcadores (daño
oxidativo al ADN) en ensayos clínicos.
Secundario Ditioletiones (oltipraz) Eficacia demostrada en la prevención de
tumores hepáticos en ratas y modulación
de biomarcadores para aflatoxina,
prediciendo el efecto protector, según
ensayos clínicos.
Secundario Brotes de brócoli (sulforafano) Prevención de cáncer en modelos murinos.
Reducción dosis dependiente de aductos
aflatoxina-ADN en ensayos clínicos
humanos.
12
Diferentes factores afectan el crecimiento de los hongos toxigénicos, clasificándose estas
condiciones en intrínsecas y extrínsecas. Las condiciones intrínsecas hacen referencia a las
condiciones del sustrato sobre el cual crece el hongo e incluyen la composición de
carbohidratos, grasas, proteína, macro y microelementos, entre otros. Además de la
composición del grano existen otros factores como la actividad del agua (Aw), pH y
potencial de óxido-reducción (Díaz, 1996a).
Los factores extrínsecos están relacionados con la atmósfera en la cual se encuentra
almacenado el grano y puede crecer un hongo toxigénico como humedad de la atmósfera de
almacenamiento (óptima >70%), temperatura atmosférica la cual varia de acuerdo al hongo
y adecuado suministro de oxígeno, el cual no es un factor limitante en condiciones
normales de almacenamiento (Díaz, 1996a). Por lo general se afectan sustratos como el
maíz, el trigo, el sorgo, la torta de algodón, la cebada y el maní (Díaz, 1996b).
Los hongos toxigénicos se clasifican de acuerdo con el momento de infección en hongos de
campo (fitopatogénicos) que infectan las plantas antes de la cosecha y hongos de
almacenamiento (saprofíticos) que invaden los granos almacenados. Dentro del primer
grupo se encuentran los géneros Fusarium (el más común), Alternaria, Cladosporium,
Helminthosporium, Pullaria y Aspergillus. Entre los hongos saprofíticos los géneros más
importantes son Aspergillus y Penicillium (Díaz, 1996a).
Es importante anotar que la presencia del hongo toxigénico en un sustrato no implica por
necesidad la existencia de micotoxinas. Esto se debe a que generalmente solo un pequeño
porcentaje de las cepas de hongos posee la capacidad genética de sintetizar micotoxinas y a
que la producción de estos metabolitos ocurre solo bajo estrictas condiciones ambientales
que no siempre se cumplen (Díaz, 1996a).
Aflatoxinas
Las aflatoxinas (AF) son un grupo de metabolitos heterocíclicos sintetizados por algunas
cepas de Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus. La palabra aflatoxina se deriva del
principal hongo productor de esta (Aspergillus flavus) y del sufijo toxina. Los Aspergillus
son generalmente hongos de almacenamiento y por lo común no contaminan los granos
antes de la cosecha, sin embargo, condiciones de estrés en las plantas y daño producido por
13
insectos pueden dar lugar a la infección a nivel de campo y a la producción de AF en los
granos aún no cosechados (Díaz, 1996b).
Estudios realizados por el Laboratorio de Toxicología de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia demostraron la presencia
de varias especies del género Aspergillus spp. en muestras de maíz y mazorca tomadas en la
región del atlántico colombiano, donde se encontraron niveles muy altos de aflatoxinas, en
especial la B1 y la B2. Al parecer la gran producción de estas micotoxinas y gran incidencia
de hongos aflatoxigénicos se encontraron relacionadas con aspectos medioambientales
como elevadas precipitaciones, plagas y diversidad de hongos aflatoxigénicos y cepas
presentes con gran capacidad de síntesis de aflatoxinas (Acuña et al, 2005), demostrando la
importancia de las condiciones tanto macro como microambientales para el crecimiento de
hongos micotoxigénicos y la producción de micotoxinas. En otro estudio se corroboró la
prevalencia del género Aspergillus spp. en granos de maíz y algodón, en especial las
especies A. flavus y A. parasiticus, este último capaz de producir las cuatro aflatoxinas de
ocurrencia natural (B1, B2, G1 y G2) (Díaz et al, 2009). Hasta el momento se han
identificado cerca de 18 tipos de aflatoxinas, siendo las únicas que se presentan de manera
natural la B1, B2, G1 y G2, mientras las demás aflatoxinas como M1, M2, P1, Q1, aflatoxicol,
etc. se presentan como productos del metabolismo (productos de biotransformación) de
sistemas microbianos o animales. La existencia de cepas aflatoxigénicas de Aspergillus spp.
y presencia de aflatoxinas ha sido reportada en los cinco continentes (Díaz, 1996b) donde
se han hecho grandes esfuerzos por controlar tanto el crecimiento del hongo toxigénico
como de la producción de la micotoxina (Díaz et al., 2009; Felix D’Mello et al., 1998).
Efectos de la AFB1 en la salud animal
Además de los efectos carcinógenos se conocen efectos adversos de las micotoxinas en la
salud en general tanto de animales de producción como mascotas. Dentro de los síntomas
se encuentran la reducción en la ganancia de peso, efectos adversos en la reproducción,
daño al sistema inmunológico, síntomas severos de intoxicación e incluso muerte cuando la
dosis de micotoxina es demasiado alta (Hussein y Brasel, 2001; Lesson et al., 1995).
14
Diferentes estudios han demostrado los efectos adversos sobre el sistema inmune de pollos
en estadios tempranos del desarrollo (Qureshi et al. 1998) y efectos hematológicos y
hepáticos significativos a altas concentraciones en adultos (Del Bianchi et al., 2005) y
durante el desarrollo, evaluando su efecto en enzimas séricas, renales y hepáticas (Quezada
et al., 2000). También se han presentado efectos hepatotóxicos a altas concentraciones en
codornices (Oliveira et al. 2002), además de afectar la producción de huevos (Ogido et al.,
2004).
Dentro de las aflatoxinas, la AFB1 se encuentra como un compuesto altamente tóxico para
la mayoría de las especies y en especial aquellas muy susceptibles como la trucha arco iris,
los gatos o los patos. En ensayos in vitro la toxicidad de la aflatoxinas G1, B2 y G2 es
aproximadamente 50, 20 y 10% de la que presenta la AFB1, respectivamente. Existen
diferencias de susceptibilidad entre animales de diferentes especies frente a la AFB1. Los
animales más susceptibles son el pato, el conejo y el gato, mientras que los más resistentes
son el pollo, ratón, hámster y rata (Tabla 2). En las aves la susceptibilidad varía teniendo
como más susceptibles a los patos, seguido de los pavos, gansos, faisanes y los pollos como
la especie aviar menos afectada. A su vez los animales jóvenes son más susceptibles que los
adultos y las hembras más resistentes que los machos (Díaz, 1996b).
Tabla 2. DL50 oral aguda de AFB1 en diferentes especies (adaptado de Díaz, 1996b). Especie DL50 (mg/kg)
Conejo 0.3-0.5
Patito 0.34-0.56
Gato 0.55
Cerdo 0.62
Trucha arco iris
(intraperitoneal)
0.81
Perro 1.0
Cobayo 1.4-2.0
Oveja 2.0
Mico 2.2
Pollito 6.5-16.5
Ratón 9.0
Hámster 10.2
Rata 5.5-17.9
15
Alteración del DNA y carcinogenicidad
La AFB1 se bioactiva a través de las citocromos P450 a un metabolito electrofílico
altamente reactivo e inestable que una vez formado reacciona con macromoléculas,
especialmente con el ADN (produce alquilación del ADN). Este metabolito, conocido
como aflatoxina-8,9-epóxido (AFBO) es capaz de unirse a los residuos de guanina de los
ácidos nucleicos causando alteraciones irreversibles que pueden llevar a carcinogenicidad,
mutagenicidad y teratogenicidad (Do y Choi, 2007; Eaton y Gallager, 1994; Ferguson y
Philpott, 2008; Verma, 2004). La biotransformación de la AFB1 se inicia en las enzimas
citocromo P450 (CYP450) donde sufre oxidación a AFBO. La forma epóxido puede
conjugarse con glutatión para continuar con la vía de detoxificación o ser hidrolizada por
una epóxido hidrolasa para generar un hidrodiol (AFB1-8,9-dihidrodiol o dhd-AFB1), el
cual puede reaccionar fuertemente con proteínas y tener efectos citotóxicos. En los casos en
que el epóxido llega a conjugarse con glutatión, o la AFB1 no sufre epoxidación sino
adición grupos OH- y posterior conjugación con acido glucurónico o sulfato, los efectos
tóxicos de la molécula se ven neutralizados (Figura 1) (Eaton y Gallagher, 1994).
16
Figura 1. Rutas de biotransformación de la AFB1 (Modificado de Eaton y Gallagher,
1994). CYP450(s): citocromo P450(s); PHS: prostaglandina H-sintasa; GST(s): glutatión S-
transferasa(s); UDP-GT(s): UDP-glucuronosiltransferasa(s); ST: sulfotransferasas.
Se han reconocido que tanto la CYP1A2 como la 3A4 son capaces de oxidar la AFB1 tanto
a formas reactivas que incluyen la AFB1 endo-8,9-epóxido y AFB1 exo-8,9-epóxido (forma
mas toxica del epóxido), como a productos no activos que no son sustratos óptimos para
epoxidación, como la AFM1, AFQ1 (Figura 2) (Gallagher et al. 1996; Guengerich et al.,
1998, 1996).
Figura 2. Productos de oxidación de la AFB1 (Tomado de Guengerich et al., 1998).
Bioactivación de la AFB1 en aves y mamíferos
El hecho de que se presenten diferentes tipos de citocromos P450 capaces de transformar la
AFB1 a sus formas reactivas (fase I de detoxificación), además de una pobre conjugación
de estas formas reactivas con glutatión o sulfatos (fase II de detoxificación) hace que
diferentes especies de aves y de mamíferos presenten diferentes niveles de susceptibilidad.
En la mayoría de las especies de mamíferos la biotransformación de la AFB1 ocurre a
través de citocromos P450, encontrándose a las citocromo 1A1, 2A3, 2B7, 2C8, 2K1 y
3A3/4 implicadas en la activación hepática y producción de AFBO (Klein et al., 2003). En
17
humanos se han reportado estas mismas citocromos como agentes bioactivadores de la
AFB1 (Doi et al., 2002; Omiecinski et al, 1999) al igual que a la CYP2A6 (Pelkonen et al.,
2000).
Las enzimas citocromo P450 aviares parecen ser del mismo tipo de aquellas encontradas en
mamíferos, incluyendo la especie humana. Por ejemplo, estudios realizados por Nebbia et
al. (2003) demostraron la presencia de CYP2B1, 3E1, 1A1 y 3A4 en pollos. Asimismo,
Gorman et al. (1998), realizando “immunoblots” de microsomas extraídos de embriones de
pato y pollo encontraron la presencia de otólogos CYP1A1, 1A2, 1A4 y 1A5.
En pavos, especie altamente sensible a los efectos adversos de las aflatoxinas se ha
atribuido el efecto tóxico a la actividad de las enzimas CYP1A1 y 3A4, capaces de
biotransformar la AFB1 a su forma epóxido (Klein et al. 2000). En esta especie se ha
demostrado que el efecto es más pronunciado en aves jóvenes que en adultas y se ha
demostrando que cantidades relativamente bajas de AFB1 presentes en el alimento pueden
llegar a causar efectos deletéreos (Klein et al. 2002). También se ha encontrado un ortólogo
aviar de la citocromo 1A5 humana que ha presentado actividad metoxiresorufin O-
dealquilasa y oxidación del AFB1 (Yip y Coulombe Jr., 2006), lo cual ayuda a explicar la
alta susceptibilidad de los pavos, ya que el efecto de la aflatoxina depende de su oxidación
a la forma exo-epóxido.
En embriones de pollos como de patos y pavos se ha demostrado actividad EROD
(etoxiresorufin orto-deetilasa), los cual indica la presencia de citocromos 1A que no
necesariamente corresponden a ortólogos a los de mamíferos, pero que presentan una
actividad enzimática similar (Brunström y Halldin, 1998). Yip y Coulombe (2006)
demostraron la presencia de un ortólogo de pollos en pavos, la CYP1A5, con capacidad
tanto de oxidar la AFB1 a su forma epóxido como de producir AFM1. En patos, pollos,
pavos y codornices se demostró la capacidad de biotransformación de la AFB1 a su forma
AFBO (Lozano y Díaz, 2005), pero no se determinó cual o cuales de los ortólogos aviares
eran los responsables de la transformación de la aflatoxina a su forma epóxido.
Aunque las aflatoxinas y sus efectos tóxicos se conocen desde los años sesenta (Newberne
y Butler; 1969; Patterson, 1973), las enzimas responsables de su metabolismo en algunas
especies de mamíferos y en muchas especies aviares (especialmente pollos, patos, pavos y
18
codornices) no han sido caracterizadas de manera completa. Por esto es necesario investigar
cuales enzimas de la superfamilia de las citocromos P450 son las responsables del
metabolismo y bioactivación de la AFB1 en especies aviares de interés comercial.
Citocromos P450 (CYP450)
Las enzimas citocromo P450 son monooxigenasas, es decir, son enzimas que catalizan
reacciones en las cuales un átomo de oxígeno del oxígeno molecular (O2) es insertado en un
sustrato, mientras el otro átomo es reducido a agua. La estequiometria general de la
hidroxilación del sustrato por las citocromo P450 se representa en la siguiente ecuación:
NAD(P)H + H+ + O2 + R-H → NAD(P)+ + R-OH + H2O.
Las citocromo P450 son una gran familia de hemoproteínas involucradas en diferentes tipos
de reacciones oxidativas, distribuidas ampliamente en los grandes dominios de organismos
(archaea, bacteria y eucariotes) (Munro et al. 2007). Las enzimas citocromo P450 están
entre las proteínas con actividad REDOX más versátiles conocidas hasta ahora y catalizan
principalmente reacciones de hidroxilación de cadenas carbonadas, oxigenación de
heteroátomos, dealquilación y formación de epóxidos (Fig. 3) (Isin y Guenguerich, 2007).
Las CYP450 son muy conocidas por su papel en el metabolismo de medicamentos y en la
detoxificación de xenobióticos ya que la hidroxilación de estos compuestos por las P450s
les confiere mayor solubilidad para facilitar su excreción. Varias de estas enzimas se
pueden encontrar en microsomas y su expresión es inducida por una gran variedad de
moléculas orgánicas (Josephy, 1997). También intervienen en el metabolismo de hormonas
sexuales, vitamina D y ácidos biliares en mamíferos, ecdisona en insectos (Poulos, 2003),
terpenos en plantas y juegan un papel importante en microorganismos en el uso de varios
compuestos orgánicos como fuente de carbono y en la obtención de importantes productos
naturales como los antibióticos (Urlacher y Eiben, 2006).
19
Figura 3. Reacciones catalizadas por monooxigenasas P450: a. hidroxilación de ácidos
grasos. b. epoxidación de estireno. c. hidroxilación de compuestos aromáticos. d.
deetilación de 7-etoxicumarina. e. acoplamiento de fenol en la biosíntesis de vancomicina.
f. ruptura de un enlace acil-carbono en la demetilación de lanosterol (Tomado de Urlager y
Eiben, 2006).
Las citocromo P450 humanas tienen un peso molecular que oscila entre 40 y 50 KDa y
contienen un solo grupo heme. Se encuentran ancladas a membrana a excepción de algunas
que se encuentran solubles en el citosol (por lo general de microorganismos). La mayoría
de estas enzimas responsables del metabolismo de compuestos endógenos se encuentran en
las membranas de órganos esteroidogénicos como las glándulas adrenales, testículos,
ovarios y placenta. Las P450 relacionadas con la oxidación de xenobióticos están
ampliamente distribuidas con altas concentraciones presentes en el retículo endoplasmático
liso de células específicas del hígado, riñón, pulmón, cavidades nasales e intestinos, además
de presentarse en niveles importantes en otros tejidos (Josephy, 1997).
20
En general, aquellas P450s relacionadas con el metabolismo de compuestos endógenos,
como por ejemplo los esteroides, son muy específicas. Sin embargo, las citocromos
encargadas de la biotransformación de xenobióticos no lo son y son capaces de hidroxilar
una gran variedad de diversos compuestos sin ninguna relación estructural entre sí (Poulos,
2003; Urlacher y Eiben, 2006). Un tema importante sobre la actividad enzimática de las
P450s es entender como pueden adaptarse y acomodarse a diferentes sustratos teniendo en
cuenta la restricción que implica poseer el mismo tipo de plegamiento en todas las P450s.
La primera estructura obtenida de una CYP450 (Poulos et al., 1987) representó un
rompecabezas complejo en el que se pudo demostrar como la forma del sustrato accede a
un sitio activo inaccesible al exterior de la proteína (Figura 4). Interpretando su estructura
se encontró que ciertas α-hélices (F y G) y el “loop” que las conecta le confieren cierta
flexibilidad y presentan un movimiento abierto/cerrado que permite la entrada de los
sustratos y la salida de los productos (Poulos, 2003; Urlacher y Eiben, 2006).
Figura 4. Diagrama esquemático de la citocromo P450 BM-3 en su conformación
parcialmente abierta. Se indican las hélices F y G y el “loop” que las une. Estas hélices se
deslizan sobre la superficie de la hélice I, lo que permite el movimiento abierto/cerrado
para el acceso al sitio activo (Tomado de Poulos, 2003).
21
La estructura cristalina de algunas CYP450 se ha dilucidado, como la CYP2D6 (Rowland
et al., 2006) y la 3A4 (Ekroos y Sjögren, 2006; Yano et al., 2004) donde basado en los
alineamientos de secuencias se ha corroborado la existencia de este plegamiento general
constante entre las enzimas P450.
Aunque la homología en secuencia entre las proteínas P450 entre grupos taxonómicos es
comúnmente baja y puede ser menor del 20%, el creciente número de estructuras cristalinas
obtenidas de enzimas P450 ha demostrado que esta inusual variabilidad no excluye el
hecho de encontrar una gran conservación en la topografía general de estas proteínas y en
su plegamiento estructural (Urlacher y Eiben, 2006; Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000),
razones que sugieren la probabilidad de encontrar ortólogos aviares de las CYP450
humanas con actividades catalíticas semejantes.
Clasificación de las enzimas CYP450
Las P450 han sido clasificadas en cuatro clases dependiendo de la forma como los
electrones provenientes del NAD(P)H son entregados al sitio catalítico. Las enzimas de la
clase I requieren tanto de una reductasa con dominio FAD como de una hierro-azufre
reductasa. La clase II (donde se encuentran las CYP450 de mamíferos y aves) solo requiere
de P450 reductasa con dominio FAD/FMN para la transferencia de los electrones. Las de la
clase III son autosuficientes y no requieren de un donador de electrones ya que catalizan el
rearreglo o la deshidratación de alquilhidroperóxidos o alquilperóxidos inicialmente
generados por dioxigenasas. Las P450 de la clase IV reciben electrones directamente del
NAD(P)H (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).
La localización de las diferentes citocromos varía considerablemente. Todas las P450s de
procariotes son proteínas solubles mientras que la clase I de eucariotes se encuentran
asociadas con la membrana interna de la mitocondria y catalizan varios pasos en la
biosíntesis de hormonas esteroidales y vitamina D en mamíferos. Las P450 mitocondriales
también han sido encontradas en insectos y nemátodos, pero no en plantas. La clase II son
las más comunes en eucariotes. Tanto las P450s como las NADPH-P450 reductasas se
encuentran disociadas y se encuentran independientemente ancladas en la cara externa del
retículo endoplasmático por el extremo amino terminal. Tanto la clase I como la II de todos
22
los organismos participan en la detoxificación y en algunos casos la activación de
xenobióticos. Se ha demostrado su contribución en eventos carcinogénicos y son
determinantes en el metabolismo, tolerancia, selectividad y compatibilidad de
medicamentos y pesticidas (Tabla 3) (Werck-Reichhart y Feyereisen, 2000).
Nomenclatura de las enzimas CYPP450
La dificultad en purificar enzimas con formas estrechamente relacionadas entre sí como las
CYP450 hace que su estudio mediante la “bioquímica clásica” se haga muy complicado,
mientras la biología molecular ha brindado más herramientas para su clasificación. En los
años 80 se obtuvieron cDNAs para P450s inducidas en roedores por tratamientos con
agentes como el fenobarbital o la β-naftoflavona y el análisis de estas secuencias permitió
el desarrollo de una nomenclatura más clara para las P450.
En el pasado la nomenclatura se basaba en la movilidad electroforética, el λmax del
cromóforo o la especificidad en el sustrato encontrada por diferentes laboratorios, donde la
misma enzima era identificaba con diferentes nombres. Esta nomenclatura ha sido
modificada por un enfoque más sistemático y evolutivo. De esta forma, dos enzimas que
difieren muy poco en secuencia como las CYP2B1 y 2B2 se espera que tengan gran
semejanza estructural y funcional, mientras que enzimas con secuencias diferentes se
espera que no mantengan tal similitud. Así, se han asignando a la misma familia aquellas
enzimas que tengan homología en secuencia mayor al 40%. Si esta homología es mayor al
55% se consideran miembros de la misma subfamilia. Las enzimas individuales se
identifican por el número de la familia, la letra de la subfamilia y finalmente el número que
identifica la enzima dentro de la subfamilia (Tabla 4). Además, una forma de abreviar la
nomenclatura de estas enzimas es reemplazando citocromo P450 por las letras CYP450
(Josephy, 1997).
23
Tabla 3. Sustratos metabolizados por enzimas citocromo P450 en humanos (adaptado de
Omiecinski et al., 1999). Enzima/Sustratos
endógenos
Xenobióticos
activados
Xenobióticos
metabolizados
Inducibilidad Inhibidores
CYP1A1
Oxidación de ω-2
prostaglandina, 6β-
hidroxilación,
hidroxilación de17β-
estradiol-C2.
Benzo[a]pireno,
hidrocarbonos
policíclicos
aromáticos
7-etoxicumarina, 7-
etoxiresorufin, R-
warfarina 8-
hidroxilación
3-MC; βNF; TCDD;
omeprazol;
tabaquismo; algunos
vegetales
9-OH-ellipticina; 7,8-
benzoflavona; apigenina.
CYP1A2
hidroxilación de 17β-
estradiol-C2;
oxidación de
prostaglandina ω-1;
hidroxilación de
testosterona 6β.
2-AAF;
acetaminofen;
aflatoxina B1; MeIQ;
PhIP
Cafeína; 7-
etoxiresorufin;
fluoroquinolona 3´-
hidroxilación;
imipramina; 7-
metoxiresorufin;
fenacetina; teofilina;
tacrina; R-warfarina 6-
hidroxilación
3-MC; βNF; TCDD;
tabaquismo, algunos
vegetales
Furafilina; enoxacina; 7,8-
benzoflavona; fluvoxamina;
isosafrol; apigenina
CYP2A6
Aflatoxina B1;
Benzo[a]pireno;
nicotina; N-nitroso-
dietilamina; NNK
1,3-butadieno;
cumarina
Dietilditiocarbamato, 8-
metoxipsoraleno, mentofurano
CYP3A4
Hidroxilación de
testosterona 6β
(mayoría), 2β, 6α, 18,
16β, 15β;
hidroxilación de
cortisol 6β;
hidroxilación de
androstenediona 6β;
progesterona; DHEA -
3-sulfato; 17β-
estradiol-2-
hidroxilación
Acetaminofen;
aflatoxina B1;
Benzo[a]pireno 7,8-
dihidrodiol;
ciclofosfamida;
ifosfamida
Alfentanil,
aminodarona,
antipirina,
carbamazepina,
cloropromazina,
claritromicina,
clozapina, ciclosporina
A, dapsona,
dexametasona,
diazepam, diltiazem,
eritromicina,
etinilestradiol,
fluvastatina,
imiquimod, indinavir,
lidocaína, lovastatina,
midazolam, nelfinavir,
nifedipina, omeprazol,
Fenobarbital,
dexametasona,
rifampina, fenitoina,
carbamazepina
Triacetiloleandomicina (TAO),
claritromicina, eritromicina,
gestoden, midazolam,
ketoconazol, clotromazol,
naringenina,
Tabla 4. Diferentes formas de citocromos P450 relacionadas con el metabolismo de
xenobióticos. Abreviaturas: AAF=2-acetilaminofluoreno, EROD=etoxiresorufin O-
24
deetilasa, PB=fenobarbital, PAH=hidrocarburo aromático policíclico, TCDD=2,3,7,8-
tetraclorodibenzodioxina, β-NF=β-naftoflavona, IQ=2-amino-3-metilimidazol[4,5-
f]quinolina (Adaptado de Josephy, 1997).
Familia
P-450 Enzima
Nombres antiguos Sustrato típico o actividad
Rata Ratón Conejo
1 1A1 c P1 LM6 EROD, aril hidroxilasa
1A2 d P3 LM4 2-AAF, IQ, N-hidroxilación
2
2A1 a Testosterona, 7α-hidroxilasa (metabolismo esteroides)
2B1 b LM2 Hexobarbital, PB
2D6 UT-H Debrisoquinona, esparteina
2E1 j LM3a Dimetilnitrosamina, nifedipina
3 3A4 p nifedipina
4 4A1 P-452 Ω-hidroxilasa
Usos y aplicaciones de las CYP450
Tradicionalmente las P450 han sido aplicadas en la determinación del efecto de
medicamentos y otros xenobióticos en su actividad in vivo y en la producción de
metabolitos de carácter tóxico. Durante la década de los 90’s las P450 microbianas y
recientemente las de mamíferos han sido investigadas respecto a la producción de
químicos, fragancias, compuestos farmacéuticos y también su uso en biorremediación
(Figura 5) (Urlager y Eiben, 2006).
25
Figura 5. Aplicaciones y uso de las monooxigenasas P450 (Tomado de Urlager y Eiben,
2006).
Medición de la actividad de las citocromos P450
Si se desea hacer un estimativo de la actividad total en una muestra que contiene múltiples
citocromos P450, el ensayo ideal debe estar basado en un compuesto que sea un sustrato
comparable para todas las enzimas presentes. Sin embargo, ese “sustrato universal” no
existe. Por otra parte, si se decide determinar la actividad de una forma específica de
enzima (isoenzima) el ensayo debe fundamentarse en un compuesto que es sustrato sólo
para esa enzima. De nuevo, se disponen solo de sustratos enzima-específicos para algunas
formas de CYP450 (Tabla 3). Una forma de resolver la falta de sustratos enzima-
específicos es usar un solo sustrato que produzca varios metabolitos, cada uno de los cuales
es producido con cierta selectividad por un subgrupo de enzimas. La cuantificación de los
metabolitos producidos en la mezcla total separados, por ejemplo, por cromatografía
líquida de alta eficiencia (HPLC,) genera una estimación simultánea de las actividades de
26
varias enzimas. En resumen, no existe un ensayo universal para medir la actividad
enzimática de las P450, especialmente en fuentes crudas como microsomas hepáticos
(Josephy, 1997).
Aunque las citocromos en mamíferos y aves no son estrictamente ortólogos, se han
encontrado algunos inhibidores e inductores de expresión para algunas de estas enzimas
comunes a ambos grupos de vertebrados (Chauret et al., 1997) e inclusive peces (Renault et
al., 1999). Una de las principales ventajas de usar inhibidores selectivos de P450s
individuales es la posibilidad de observar en qué proporción cada P450 es responsable de
una reacción específica (Halpert et al., 1994; Pelkonen et al., 2008). Así, el uso de
inhibidores más o menos específicos y determinación de su efecto sobre la reacción de
interés se ha utilizado como estrategia muy importante en la identificación de enzimas
relacionadas con la transformación de sustratos específicos (Appiah-Opong et al, 2007;
Donato et al, 2004; Henderson et al, 2000; Peng et al, 2004).
El uso de sustratos prototipo y la determinación de su correlación con el metabolismo del
sustrato a investigar ha sido otra estrategia en muchos casos de gran ayuda para dilucidar el
papel de una enzima en la activación o transformación de sustratos (Kenworthy et al, 1999;
McManus et al, 1984; Quintieri et al, 2005; Sy et al, 2001;). De forma similar, la
cuantificación de la expresión de la proteína mediante immunoblot y la determinación de su
correlación con la actividad enzimática sobre el sustrato a investigar se ha utilizado como
alternativa complementaria a la correlación de actividades enzimáticas y uso de inhibidores
(Díaz y Squires, 2000).
Debido a que el conocimiento actual acerca de las enzimas involucradas en la
biotransformación de diferentes tóxicos y fármacos y su modulación en especies aviares de
producción es insuficiente (Šavlík et al., 2007) es necesario utilizar las herramientas que se
encuentren disponibles para profundizar en el conocimiento del papel de los ortólogos
CYP450 aviares en la transformación de xenobióticos como la AFB1 a formas tóxicas para
la salud animal.
27
OBJETIVO GENERAL
Identificar las enzimas citocromo P450 relacionadas con el metabolismo fase I de la
aflatoxina B1 (AFB1) en pollo (Gallus domesticus), pavo (Melleagridis gallopavo), pato
(Anas platyrhynchos) y codorniz (Coturnix japonica).
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Determinar las condiciones óptimas de separación de sustratos prototipo y productos de
biotransformación utilizando la técnica de HPLC.
• Correlacionar la actividad enzimática de las diferentes citocromo P450 frente a la AFB1
y a diferentes sustratos prototipo.
• Identificar la actividad enzimática específica de las citocromo P450 involucradas en la
biotransformación de la AFB1 utilizando inhibidores específicos.
• Detectar ortólogos aviares por la técnica de Western Blot.
28
HIPOTESIS
En diferentes especies de mamíferos y en aves se ha demostrado la capacidad de
biotransformación de la aflatoxina B1 a su forma epóxido por parte de las CYP450. En
mamíferos estas enzimas han sido claramente identificadas y en pavos se han reportado la
CYP1A2 y la CYP3A4 como responsables. Sin embargo, debido a la falta de un mayor
conocimiento en aves de interés comercial como pollos, patos, pavos y codornices es
importante investigar el papel de los ortólogos aviares de citocromos P450 reportadas como
responsables en mamíferos del metabolismo de la aflatoxina B1. La hipótesis que se plantea
es que los ortólogos aviares de las enzimas CYP1A1/2, 2A6 y 3A4 metabolizan la
aflatoxina B1 a su forma epóxido, al igual que en humanos y mamíferos.
La estrategia a utilizar consiste en relacionar funcionalmente la actividad enzimática de los
diferentes ortólogos frente a diferentes sustratos prototipo específicos con el metabolismo
hepático fase I de la aflatoxina B1 in vitro. Específicamente se determinarán las actividades
etoxiresorufina etoxiresorufina-O-deetilasa (EROD) para las citocromos 1A1/2, 7-
metoxiresorufina-O-demetilasa (MROD) para la citocromo 1A2, 7-coumarina-O-
hidroxilasa para la citocromo 2A6, nifedipina oxidasa para la citocromo 3A4 y
debrisoquinona-4-hidroxilasa) para la citocromo 2D6. Adicionalmente, se emplearán
inhibidores específicos para CYP450 humanas como la α-naftoflavona (CYP 1A1/2),
furafilina (CYP 1A2), 8-metoxipsoralen (CYP 2A6) y troleandromicina (CYP 3A4) con los
cuales se busca determinar su efecto en la producción de la forma epóxido de la aflatoxina.
Por último se tendrá en cuenta la cantidad relativa de cada citocromo en los microsomas
hepáticos mediante la técnica de Immunoblot para correlacionarla con la actividad AFB1
epoxidasa de los mismos citocromos. Se espera que la información suministrada por la
utilización de estas tres estrategias distintas sirva para determinar cuales citocromo P450
están involucradas en la bioactivación de la aflatoxina B1 a su forma más tóxica.
29
MATERIALES Y METODOS
Reactivos
Los siguientes reactivos fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA):
AFB1, AFB2α, tween 20, glucosa 6-fosfato sal sódica, nicotinamida dinucleótido fosfato
(NADP+), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ácido etilendiamintetracético (EDTA), ácido
bicinconínico, sulfato de cobre, sacarosa, glicina, glicerol, albúmina sérica bovina (BSA),
metoxiresorufina, α-naftoflavona, 8-metoxipsoralen, troleandomicina y 7-hidroxicumarina.
El Cloruro de sodio y el cloruro de magnesio hexahidratado se obtuvieron de Mallinckrodt
Baker (Phillipsburg, NJ, USA). El fosfato monobásico de sodio monohidratado y el fosfato
de sodio bibásico anhidro se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Germany). La furafilina, la
nifedipina, nifedipina oxidada y los citocromos humanos CYP1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 se
obtuvieron de BD-Biosciences (San José, CA, USA). La debrisoquinona sulfato, 4-
hidroxidebrisoquinona sulfato, cumarina, etoxiresorufina y resorufina sal sódica se
obtuvieron de MP Biomedicals (Solon, OH, USA). Los anticuerpos primarios (IgG de
conejo anti-CYP450 humanas) contra las citocromos 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 se obtuvieron
de AbCam (Cambridge, MA, USA). Los patrones de bajo peso molecular preteñidos
(fosforilasa B 106.5 KDa, albumina sérica bovina 97.6 KDa, ovoalbúmina 50.2 KDa,
anhidrasa carbónica 36.9 KDa, inhibidor de tripsina de soya 28.9 KDa y lisozima 19.9
KDa), membrana de PVDF, papel filtro, solución de acrilamida/bisacrilamida al 30%
(29:1), persulfato de amonio, TEMED, azul de bromofenol, kit de detección Opti-4CN IgG
de cabra contra IgG de conejo y dodecil sulfato de sodio (SDS) se obtuvieron de BioRad
(Hércules, CA, USA). El metanol, acetonitrilo, agua y otros solventes para la preparación
de las fases móviles se adquirieron de grado HPLC.
Obtención de las muestras de hígado
Todos los experimentos se realizaron a 4ºC a partir de microsomas obtenidos de muestras
de hígado de cada especie de ave. Los hígados se obtuvieron de 6 machos y 6 hembras de
aves adultas en buen estado de salud correspondientes a pavos (Melleagridis gallopavo) de
seis semanas de edad, codornices (Coturnix japonica) de siete semanas de edad, patos
30
(Anas platyrhynchos) raza Pekín de siete semanas de edad y pollos (Gallus domesticus) de
siete semanas de edad. Las aves se sacrificaron y los hígados se extrajeron inmediatamente,
se lavaron con PBS (fosfatos 20 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM) y se almacenaron a -70ºC
hasta el momento de la extracción de los microsomas.
Obtención de microsomas
Para la obtención de los microsomas las muestras de hígado se descongelaron parcialmente,
se lavaron con abundante PBS frío (fosfatos 20 mM pH 7.4, NaCl 100 mM) y se secaron
suavemente. Se pesaron aproximadamente 5 g de la muestra fresca en tubos de centrifuga
mantenidos en hielo. Posteriormente se adicionaron 10 mL del buffer de extracción (PBS,
EDTA disódico 1 mM, sacarosa 250 mM) por cada 5 gramos de peso del tejido en relación
1:2. Se homogenizó por 30 segundos en un homogenizador de tejidos Cat X120 (IKA
Ultra-Turrax, Staufen, Alemania) y se centrifugó a 4°C por 30 minutos a 10000 x g. Luego
se transfirió el sobrenadante (volumen aproximado = 10 mL) a un tubo de ultracentrífuga
mantenido en hielo y se centrifugó por 90 minutos a 98000 x g.
Los sobrenadantes se separaron en alícuotas para ensayos posteriores y a cada pellet se
adicionó 3 mL de buffer de almacenamiento (buffer fosfatos 20 mM pH 7.4, EDTA
disódico 1 mM, sacarosa 250 mM, 20% de glicerol) se desprendió cuidadosamente de las
paredes del tubo con una espátula delgada y se transfirió a un homogenizador de tejidos
manual, donde se resuspendió el pellet completamente. La suspensión microsomal se
fraccionó en tubos de microcentrífuga que se almacenaron a -70°C hasta su posterior
utilización. Se dejó una alícuota para determinar el contenido de proteína.
Determinación de proteína en microplaca por el método del ácido bicinconínico.
La cuantificación de proteína se realizó por el método del acido bicinconínico adaptado
para microplacas (Smith et al., 1985; Redinbaugh and Turley, 1986). Para la determinación
de proteína se tomaron 20 µL de una dilución 1:10 de cada muestra de microsomas por
pozo y por duplicado. Para la curva de calibración se tomaron diferentes volúmenes de
estándar de BSA (albúmina sérica bovina) de concentración 1 mg/mL (2, 5, 10, 15 y 20 µL)
por duplicado y se completo a un volumen total de 20 µL con buffer fosfato 20 mM pH 7.4.
31
Luego se adicionaron 200 µL de reactivo de trabajo por pozo, el cual consta de una parte
del reactivo A (solución de sulfato de cobre pentahidratado al 4%) y 50 partes del reactivo
B (solución de ácido bicinconínico que contiene ácido bicinconínico, carbonato de sodio,
tartrato de sodio y bicarbonato de sodio en NaOH 0.1 N pH 11.25). Se incubó a 37°C por
30 minutos y se midió la absorbancia a 562 nm vs blanco.
Determinación de la actividad enzimática frente a sustratos prototipo
La determinación de la actividad enzimática de los microsomas se realizó en tubos de
microcentrífuga de 1.5 mL, cada incubación conteniendo glucosa 6-fosfato 5 mM, NADP+
0.5 mM, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa 0.5 UI y 2 µL de sustrato en DMSO equivalente
al 0.8% de fase orgánica en incubación (Busby et al., 1999), diferentes concentraciones de
proteína microsomal (20 µg para codornices, 50 µg para pavos, 75 µg para patos y 100 µg
para pollos) y buffer de incubación (buffer fosfato 50 mM pH 7.4, MgCl 5 mM, EDTA 0.5
mM) hasta un volumen de 250 µL. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 10 minutos
a 39ºC .Las reacciones se detuvieron con 250 µL de acetonitrilo a -20ºC (Blanchard, 1981),
luego de lo cual se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos. Una alícuota del sobrenadante
se analizó por HPLC como se describe en la sección de condiciones cromatográficas. La
cantidad de producto formado se cuantificó utilizando una curva de calibración con un
estándar del producto de cada actividad. Debido a la inestabilidad de la forma epóxido de la
AFB1 y su rompimiento a una forma más estable conocida como AFB1 dihidrodiol (dhd-
AFB1), la cantidad de epóxido formado se estimó por la cantidad de dhd-AFB1 presente en
la incubación. Como el dhd-AFB1 no se encuentra disponible comercialmente, la
cuantificación de este se realizó utilizando como estándar la aflatoxina B2α (AFB2α) debido
a sus características fluorométricas y espectrales semejantes (Neal et al, 1981) de acuerdo
con la metodología descrita por Lozano y Díaz (2005).
Condiciones cromatográficas (HPLC)
Las siguientes actividades enzimáticas prototipo se determinaron por cromatografía liquida
de alta eficiencia (HPLC): 7-etoxiresorufin-O-deetilasa (EROD) para las citocromos
1A1/1A2, 7-metoxiresorufin-O-demetilasa (MROD) para la citocromo 1A2, cumarina 7-
32
hidroxilasa para la citocromo 2A6 (Dierks et al., 2001), debrisoquinona 4-hidroxilasa para
la citocromo 2D6 y oxidación de nifedipina para la citocromo 3A4. La cantidad de
producto formado por cada actividad enzimática se cuantificó en un equipo Shimadzu
Prominence System (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, USA) equipado con
un degasificador DGU-20A3, una bomba LC-20AB, un automuestrador SIL-20A HT, un
horno para columna CTO-20A, un detector UV/visible SPD-20AV, un detector de
fluorescencia RF-10A XL y un integrador CBM-20A, todos controlados por computador
utilizando el programa “LC Solutions”. Las separaciones se llevaron a cabo utilizando una
columna Alltech Alltima HP C18 5 µm de 150 mm x 3.0 mm de diámetro (Alltech
Associates Inc., Deerfield, IL, USA).
La separación de etoxiresorufina y resorufina (actividad 7-etoxiresorufina-O-deetilasa) se
llevó a cabo a temperatura ambiente a un flujo de 0.3 mL/min usando una fase móvil
isocrática consistente de 30% buffer fosfato (20 mM pH 7.4) y 70% metanol. Los analitos
se detectaron por fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 530 nm y de 580
nm de emisión (Leclercq et al., 1996; Mdegela et al., 2006). De cada incubación se realizó
una dilución 1:10 en agua y se inyectó un volumen de 5 µL en el cromatógrafo.
La separación de metoxiresorufina y resorufina (actividad 7-metoxiresorufin-O-demetilasa)
se realizó bajo las mismas condiciones cromatográficas utilizadas para la separación de la
etoxiresorufina y resorufina. De cada incubación se realizó una dilución 1:10 en agua y se
inyectó un volumen de 2 µL en el equipo.
La separación de la cumarina y su producto de biotransformación hidroxilado 7-
hidroxicumarina (actividad cumarina 7-hidroxilasa) se realizó a temperatura ambiente a un
flujo de 0.4 mL/min con una fase móvil isocrática consistente de 30% acetonitrilo y 70%
agua. Ambos analitos se monitorearon usando detección por fluorescencia a longitudes de
onda de excitación y de emisión de 325 y 452 nm respectivamente (Fink y Hoehler, 1970).
De cada incubación se realizó una dilución 1:100 en agua y se inyectó un volumen de 5 µL.
La separación de la debrisoquinona y la 4-hidroxidebrisoquinona (actividad debrisoquinona
4-hidroxilasa) se llevó a cabo a temperatura ambiente a un flujo de 0.3 mL/min con una
fase móvil isocrática consistente de 30% de metanol, 70% agua y 0.1% de acido fórmico.
33
La detección se realizó por fluorescencia a longitudes de onda de excitación y de emisión
de 210 y 290 nm respectivamente (Granvil et al., 2002; Pereira et al., 2000). De cada
incubación se inyectó un volumen de 5 µL sin diluir.
La separación de nifedipina y su producto oxidado se llevó a cabo a temperatura ambiente a
un flujo de 0.5 mL/min con una fase móvil isocrática consistente de 32% acetonitrilo y
68% agua. Los analitos se monitorearon por detección ultravioleta a una longitud de onda
de 270 nm (Shim et al., 1988). De cada incubación se inyectó un volumen de 5 µL sin
diluir.
La separación de la AFB1 y su producto de biotransformación AFBO en su forma dhd-
AFB1 se llevó a cabo a una temperatura de 40ºC y un flujo de 0.35 mL/min. La elución se
realizó en un gradiente lineal con A: agua y B: metanol acidificados con acido fórmico al
0.1%, de la siguiente manera: 0 minutos: 30% B; 7 minutos: 55% B; 7.01 minutos: 30% B;
14 minutos: 30% B. La detección de los analitos se realizó por fluorescencia a longitudes
de excitación y emisión de 365 y 425 nm, respectivamente (Gallagher et al., 1996; Lozano
y Díaz, 2005; Majerus y Zakaria, 1992). De cada incubación se realizó una dilución 1:100
en agua y se inyectó un volumen de 2 µL en el cromatógrafo.
Determinación de parámetros enzimáticos (KM y Vmax).
Para la estimación de los parámetros enzimáticos (KM – constante de Michaelis-Menten;
Vmax – velocidad máxima de producción) se tomaron 5 diferentes concentraciones de
sustrato específicos para citocromos P450 humanos. En la actividad 7-etoxiresorufina-O-
deetilasa (EROD) (CYP 1A2 y 1A1) se evaluaron concentraciones desde 4.8 µM a 0.3 µM
de etoxiresorufina. Para la actividad cumarina 7-hidroxilasa (CYP 2A6) desde 80 µM a 5
µM de cumarina. En la actividad 7-metoxiresorufina-O-deetilasa (MROD) (CYP 1A2)
desde 5.88 µM a 0.36 µM de metoxiresorufina. En la oxidación de nifedipina (CYP 3A4)
desde 71.0 µM a 4.4 µM de nifedipina. En la epoxidación de AFB1 se utilizaron
concentraciones desde 256 µM a 16 µM de AFB1. Para la actividad debrisoquina-4-
hidroxilasa (CYP2D6) (Eiermann et al. 1998; Yuan et al., 2002) se realizaron ensayos a
una concentración de 508.8 µM para determinar si existía actividad 2D6 en los
microsomas. Para establecer la posible participación de los ortólogos aviares en el
34
metabolismo de la AFB1 se correlacionó la actividad de las diferentes citocromo frente a los
sustratos prototipo (Stresser et al. 2002; Morse et al., 1999) contra la biotransformación de
la AFB1.
Uso de inhibidores específicos contra diferentes citocromos
Con el fin de obtener mayor información sobre el papel de cada ortólogo aviar en la
biotransformación de la AFB1 se utilizaron cuatro diferentes inhibidores específicos para
las CYP450 humanas: α-naftoflavona (CYP1A1/2) en concentraciones en incubación desde
22.95 µM hasta 1.43 µM, 8-metoxipsoralen (CYP2A6) desde 92.5 µM hasta 2.8 µM,
troleandromicina (CYP3A4) desde 122.8 µM hasta 7.6 µM (Pelkonen et al., 2008) y
furafilina (CYP1A2) desde 384.2 µM hasta 24 µM. Se adiciono 1µL de inhibidor en
DMSO para la α-naftoflavona y el 8-metoxipsoralen y 4 µL de inhibidor en DMSO para la
furafilina y la troleandomicina debido a su baja solubilidad a altas concentraciones del
inhibidor en la solución de incubación, más 1 µL se AFB1 en DMSO. Cada inhibidor se
probó en tres muestras de microsomas seleccionadas aleatoriamente de cada especie de ave
y de sexo, con cada incubación realizada por duplicado.
Cuantificación de la expresión de CYP450 aviares por la técnica de Western Blot.
La expresión de los diferentes citocromos en las cuatro especies de aves se cuantifico por la
técnica de Western Blot. Para la realización de los Immunoblot de las citocromo CYP1A1,
1A2 y 2A6 se utilizaron 100 µg de proteína microsomal mientras que para la detección de
la CYP3A4 se utilizaron solamente 30 µg de proteína. Cada muestra se trató previamente
para eliminar el glicerol y las sales del buffer de almacenamiento por dilución en 200µL de
una solución de agua-metanol 20:80 para ser agitados por 1 minuto y centrifugados a 14000
x g durante 15 minutos. El pellet se resuspendió en 10µL de buffer muestra (Tris-HCl 7
mM, pH 6.8, SDS 1.5%, glicerol 20%, β-mercaptoetanol 5%, azul de bromofenol 0.02%)
para posteriormente ser calentado a 92ºC por 5 minutos. Posteriormente se separaron en un
gel SDS-PAGE (T=10%, C=3.3%) (Laemmli, 1970) a un voltaje constante de 150 V en
buffer de separación (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8.8) por 80 minutos. Las proteínas
se transfirieron luego a una membrana de PVDF en buffer de transferencia Dunn-Carbonato
35
(NaHCO3 10 mM, Na2CO3 3 mM, pH 9.9) a un voltaje constante de 100 V durante 2.5
horas. Luego de la transferencia la membrana se bloqueó con PBS-leche en polvo
descremada al 5% por una hora a temperatura ambiente y agitación constante. A
continuación se incubó con el anticuerpo primario (IgG de conejo anti-P450 humana) en
una dilución 1:1000 en PBS-leche en polvo descremada al 5% durante toda la noche a 4ºC
y agitación constante. Finalmente se realizaron tres lavados con PBS-Tween 0.1% cada uno
de 5 minutos y se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente a IgG de cabra anti-
IgG de conejo acoplada a peroxidasa preparado en una dilución 1:2000 en PBS-leche en
polvo descremada al 5% por una hora a temperatura ambiente y agitación constante. Se
lavó 3 veces con PBS-Tween 0.1% por cinco minutos cada lavado y luego se realizó el
revelado de la membrana con el kit de detección BioRad Opti-4CN “goat anti-rabbit” hasta
que las bandas se hicieran visibles. La reacción se detuvo lavando repetidamente con agua
destilada. Cada membrana se dejo secar y se escaneó posteriormente con el equipo BioRad
Gel Doc XR. Las imágenes se analizaron con el programa “BioRad Quantity One 1-D
analysis software” versión 4.6.3 con el fin de cuantificar la cantidad de proteína según la
intensidad de las bandas
.
Análisis estadístico
Los parámetros enzimáticos KM y Vmax se determinaron por regresión no lineal usando el
método de Marquardt, ajustando los datos al modelo de Michaelis-Menten: V= Vmax [S] /
(KM + [S]), en donde V es la velocidad de la reacción enzimática, [S] representa la
concentración de sustrato, Vmax la velocidad máxima de la reacción y KM representa la
constante de Michaelis-Menten (Marangoni, 2003; Bisswanger, 2008). La regresión se
ajustó utilizando la función de peso ω = 1/yiα, donde yi es la velocidad para cada
concentración de sustrato y α la magnitud de la relación entre los residuales y la varianza
(Kakkar et al., 1999; Marangoni, 2003).
La producción de la AFB1 epóxido debido a la acción de las P450 aviares en presencia de
las diferentes concentraciones de inhibidor se expresa como el porcentaje de inhibición
promedio respecto al control sin inhibidor ± la desviación estándar.
36
Para determinar la correlación entre la actividad de los ortólogos P450 aviares frente a la
AFB1 y la cantidad de cada citocromo presente en los microsomas determinada por
Western Blot y la correlación frente a los sustratos prototipo se calculó los
correspondientes coeficientes de correlación de Pearson. Los cálculos estadísticos se
llevaron a cabo en el programa estadístico SAS (SAS Institute, 2008).
37
RESULTADOS
Separación de sustratos prototipo y productos de biotransformación.
El uso de sustratos prototipo específicos para las citocromo P450 humanas demostró la
presencia de ortólogos aviares con actividades: AFB1 epoxidasa donde se identificaron
tanto la aflatoxina como su epóxido en forma de dihidrodiol (Fig. 6), 7-etoxiresorufina-O-
deetilasa (EROD) (CYP1A1/1A2) donde se separaron por HPLC tanto la etoxiresorufina
como su producto de biotransformación resorufina (Fig. 7), 7-metoxiresorufina-O-
demetilasa (MROD) (CYP1A2) con la respectiva separación de metoxiresorufina y su
producto resorufina (Fig. 8), cumarina 7-hidroxilasa (2A6) donde solo la 7-hidroxicumarina
y otro producto de biotransformación que no pudo ser identificado produjeron fluorescencia
a la longitud de excitación y emisión utilizadas (Fig. 9) mientras la cumarina solo es
detectable por UV a 325 nm (dato no reportado) y oxidación de nifedipina (CYP3A4) con
la detección por UV tanto de nifedipina como de nifedipina oxidada (Fig. 10). El uso de
debrisoquinona no demostró algún tipo de actividad debrisoquinona 4-hidroxilasa (2D6) en
codornices y pavos mientras en patos y pollos se detectaron trazas la producción de 4-
hidroxidebrisoquinona (Fig. 11). Tanto en el caso de patos como en el de pollos no se
realizaron las respectivas cinéticas e inhibiciones debido a la baja actividad presentada por
este ortólogo.
38
Figura 6. Cromatograma de la separación de AFB1 y su producto de biotransformación
dhd-AFB1. Tiempo de retención dhd-AFB1 =7.8 min. Tiempo de retención AFB1 =12.4
min.
Figura 7. Cromatograma de la separación de etoxiresorufina y su producto de
biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina =3.7 min. Tiempo de
retención etoxiresorufina =7.3 min.
Figura 8. Cromatograma de la separación de metoxiresorufina y su producto de
biotransformación resorufina. Tiempo de retención resorufina = 3.7 min. Tiempo de
retención metoxiresorufin =5.9 min.
39
Figura 9. Cromatograma de la separación de 7-hidroxicumarina y un producto de
biotransformación desconocido. Tiempo de retención 7-hidroxicumarina = 4.1 min. Tiempo
de retención producto desconocido = 1.8 min.
Figura 10. Cromatograma de la separación de nifedipina y su producto de
biotransformación nifedipina oxidada. Tiempo de retención nifedipina oxidada =14.2 min.
Tiempo de retención nifedipina =16.7 min.
40
Figura 11. Cromatograma de la separación de debrisoquinona y su producto de
biotransformación 4-hidroxidebrisoquinona. Tiempo de retención 4-hidroxidebrisoquinona
= 4.0 min. Tiempo de retención debrisoquinona = 5.9 min.
Teniendo estandarizadas las condiciones para la separación de sustratos y productos se
continuó con la determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax. A continuación se
resumen los resultados obtenidos para las diferentes especies aviares estudiadas.
Codorniz
Determinación de los parámetros enzimáticos KM y Vmax
El uso de diferentes concentraciones de sustrato prototipo permitió determinar los
parámetros enzimáticos (KM y Vmax) que se calcularon por regresión no lineal. Los valores
de los respectivos parámetros para cada sustrato por sexos se presentan en la tabla 5.
41
Tabla 5. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo, obtenidos con
microsomas de codorniz macho y hembra.
Sustrato
Machos Hembras
KM (µM) Vmax
(pmol .µg proteína-1. min-1) KM (µM)
Vmax
(pmol .µg proteína-1. min-1)
AFB1 27.9 3.4 52.0 4.6
Etoxiresorufina 0.4 0.3 0.50 0.2
Metoxiresorufina 1.9 0.7 2.9 0.60
Cumarina 4.9 1.6 4. 6 1.1
Nifedipina 3.0 5.3 2.6 3.9
Estudios de inhibición
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
Biotransformación de AFB1 (% control)
Concentración de a‐naftoflavona (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de furafilina (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 30,0 60,0 90,0 120,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de troleandomicina (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de 8‐metoxipsoralen (µM)
42
Figura 12. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de codornices en presencia de diferentes inhibidores específicos para
citocromos P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras
(n=6).
La adición de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen, inhibidores específicos de las citocromo
P450 humanas CYP1A1/2 y CYP2A6, respectivamente, resultó en una inhibición
significativa de la biotransformación de la aflatoxina B1 a su forma epóxido (Fig. 12).
Cuando se usaron los inhibidores furafilina (para CYP1A2) y troleandomicina (para
CYP3A4) no se observó disminución en la formación del epóxido (Fig. 12 y 13).
La α-naftoflavona inhibió la formación del epóxido de la AFB1 a todas las concentraciones
utilizadas, con porcentajes de biotransformación respecto al control de 34.7, 25.0, 25.1,
25.2 y 18.7% para concentraciones del inhibidor de 1.4, 2.9, 5.7, 11.5 y 23.0 µM
respectivamente. El uso de 8-metoxipsoralen resultó en reducción en la producción de
AFBO en todas las concentraciones de inhibidor utilizadas con porcentajes de
biotransformación de 23.5, 19.8, 15.5, 13.0 y 10.1% para concentraciones del inhibidor de
2.89, 5.78, 11.57, 46.2 y 92.5 µM respectivamente (Fig. 13).
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
7.7
15.4
30.7
61.4
122.8
Biotransfomación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
trol
eand
omic
ina
(µM
)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
2.9
5.8
11.6
46.3
92.5
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
8‐m
etox
ipso
rale
n(µM
)
*
*
*
*
*
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
24.0
48.0
96.0
192.1
384.2
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
fura
filin
a (µ
M)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
1.4
2.9
5.7
11.5
23.0
Biotransfomación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
α‐n
afto
flavo
na (
µM) *
*
*
*
*
43
Figura 13. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de codornices en presencia de diferentes inhibidores específicos para
citocromos P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de
AFBO. Los valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin
inhibidor).
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina
B1.
La epoxidación de la aflatoxina B1 se graficó versus las actividades de las citocromo P450
de codorniz frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 14). Ninguna de las actividades
resultó ser significativa a un nivel del 5% , a pesar que el caso de la actividad cumarina 7-
hidroxilasa se encontró cerca de presentar relación, con un coeficiente de correlación de
Pearson de 0.56 y un valor P=0.057.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
7-et
oxire
soru
fina-
O-d
eetil
ació
n (n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
7-m
etox
ireso
rufin
a-O
-dem
etila
ción
(n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
Cum
arin
a 7-
hidr
oxila
ción
(n
mol
de
7-hi
drox
icum
arin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
Oxi
daci
ón d
e ni
fedi
pina
(n
mol
de
nife
dipi
na o
xida
da. m
g pro
tein
a-1. m
inut
o-1)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
44
Figura 14. Correlación de las actividad AFB1 epoxidasa y las diferentes actividades de las
CYP450 de codorniz con sustratos prototipo (n=12).
Detección de ortólogos humanos en microsomas de codorniz
La detección de los ortólogos presentes en microsomas de codorniz se realizó por la técnica
de Western Blot (Fig. 15). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia
1A por colorimetría debido a la baja sensibilidad de este método de revelado, en contraste a
sistemas de revelado más sensibles como la quimioluminiscencia donde se ha podido
detectar perfectamente este ortólogo (Klein et al., 2000; Verbrugge, et al., 2001; Yip y
Coulumbe, 2006). Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos
moleculares de 53.8±1.4 KDa y 53.6±0.8 KDa respectivamente.
45
Figura 15. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de codorniz por la
técnica de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6:
microsomas de hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones
de peso molecular.
Pavo
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax
El uso de sustratos prototipo con citocromos P450 de pavos demostró la presencia de
ortólogos aviares en esta especie. Los valores de la constante de Michaelis-Menten (KM) y
velocidad máxima (Vmax) se presentan en la tabla 6.
Tabla 6. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo obtenidos con
microsomas de pavo macho y hembra. Sustrato Machos Hembras
KM (µM) Vmax
(pmol .µg proteína-1. min-1)
KM (µM) Vmax
(pmol .µg proteína-1. min-1)
AFB1 25.5 6.1 21.2 5.7
Etoxiresorufina 2.5 0.6 2.3 0.6
Metoxiresorufina 8.6 2.3 5.4 1.8
Cumarina 44.8 1.1 84.7 1.5
Nifedipina 26.3 6.1 18.7 6.9
Estudios de inhibición
Al igual que en el caso de codornices, la adición de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen
resultó en una gran reducción en la producción de AFBO (Fig. 16). No se obtuvo reducción
en la producción de AFBO con furafilina o troleandomicina (Fig. 16 y 17).
Con α-naftoflavona se tuvieron porcentajes de biotransformación de 15.2, 17.4 16.3, 15.4 y
17.3% para concentraciones del inhibidor de 5.7, 11.5, 23.0, 45.1, 91.81 µM
respectivamente. El uso de 8-metoxipsoralen resultó en porcentajes de biotransformación
46
del 40.2, 35.4, 31.8, 17.9 y 14.3% a concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3 y
92.5µM respectivamente (Fig. 17).
Figura 16. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pavos en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de furafilina (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)Concentración de α‐naftoflavona (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de 8‐metoxipsoralen (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de troleandomicin (µM)
47
Figura 17. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pavos en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los
valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina
B1.
La epoxidación de la aflatoxina B1 se graficó versus las actividades de las citocromo P450
de pavo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 18). La actividad cumarina 7-
hidroxilasa presentó una correlación muy fuerte y significativa al 5% con un valor para el
coeficiente de Pearson de 0.90.
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
24.0
48.0
96.0
192.1
384.2
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
fura
filin
a(µM
)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
5.7
11.5
23.0
45.9
91.8
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
α‐n
afto
flavo
na (
µM)
*
*
*
*
*
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
7.7
15.4
30.7
61.4
122.8
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
trol
eand
omic
in(µ
M)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
2.9
5.8
11.6
46.3
92.5
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
8‐m
etox
ipso
rale
n µM
)
*
*
*
*
*
48
Figura 18. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pavo frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12).
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pavo
La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pavo se realizó por la técnica de
Western Blot (Fig. 19). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia
1A, mientras los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares
de 56.6±2.4 KDa y 52.2±0.8 KDa respectivamente.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0
7-et
oxire
soru
fina-
O-d
eetil
ació
n (n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
7-m
etox
ireso
rufin
a-O
-dem
etila
ción
(n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
Cum
arin
a 7-
hidr
oxila
ción
(n
mol
de7
-hid
roxi
cum
arin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-
1 )
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
Oxi
daci
ón d
e ni
fedi
pina
(nm
ol d
e ni
fedi
pina
oxi
dada
. mg p
rote
ina-1
. min
uto-
1 )
Epoxidación de AFB1 (nmol deAFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
49
Figura 19. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pavo por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular.
50
Pato
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax
Al igual que el caso de codornices y pavos, el uso de sustratos prototipo permitió evidenciar
la existencia de los ortólogos 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 en patos. Los valores de los parámetros
enzimáticos (KM y Vmax) calculados por cada sustrato se presentan en la tabla 7.
Tabla 7. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo usados en las
cinéticas con microsomas de pato macho y hembra. Sustrato Machos Hembras
KM (µM) Vmax (pmol. µg proteína-1. min-1) KM (µM) Vmax (pmol. µg proteína-1. min-1)
AFB1 44.0 2.7 23.3 2.9
Etoxiresorufina 0.6 0.1 1.0 0.3
Metoxiresorufina 3.0 0.8 3.1 1.2
Cumarina 4.5 0.3 8.2 0.5
Nifedipina 48.5 4.8 91.3 9.5
Estudios de inhibición
Al igual que el caso de codornices y pavos, la α-naftoflavona y el 8-metoxipsoralen
presentaron una reducción evidente de la producción del epóxido (Fig. 20) mientras el uso
de furafilina y troleandomicina no arrojo diferencias entre las diferentes concentraciones de
inhibidor utilizadas y la producción del AFBO (Fig. 20 y 21).
El uso de α-naftoflavona como inhibidor redujo el porcentaje de biotransformación a un
67.5, 9.6 y 41.3% con concentraciones del inhibidor de 5.7, 11.5, 22.9 µM respectivamente.
Con 8-metoxipsoralen se redujo el porcentaje de biotransformación a un 29.7, 18.7, 17.8,
9.0 y 13.7% con concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3 y 92.5 µM
respectivamente (Fig. 21).
51
Figura 20. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pato en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos P450
humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de furafilina (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de α‐naftoflavona (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de 8‐metoxipsoralen (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de troleandomicina (µM)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
12.0
24.0
48.0
96.0
192.1
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
fura
filin
a (µ
M)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
1.4
2.9
5.7
11.5
23.0
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
α‐n
afto
flavo
na (
µM)
*
*
*
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
2.9
5.8
11.6
46.3
92.5
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
8‐m
etox
ipso
rale
n (µ
M)
*
*
*
*
*
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
3.8
7.7
15.4
30.7
61.4
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
trol
eand
omic
ina
(µM
)
52
Figura 21. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pato en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos P450
humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los valores con
asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina
B1.
La epoxidación de la aflatoxina B1 se graficó versus las actividades de las citocromo P450
de pavo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 22). Se encontraron valores de los
coeficientes de correlación de Pearson para las diferentes actividades de 0.81 para la
actividad 7-etoxiresorufin-O-deetilasa (EROD), de 0.82 para la actividad 7-
metoxiresorufin-O-demetilasa (MROD), de 0.68 para la actividad cumarina 7-hidroxilasa y
de 0.88 para la oxidación de nifedipina. En todos los casos se encontró una correlación
significativa a un nivel de significancia del 5%.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
7-et
oxire
soru
fina-
O-d
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n (n
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a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol deAFB1 epóxido. mg proteina -1 . minuto-1)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
7-m
etox
ireso
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a-O
-dem
etila
ción
(n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Cum
arin
a 7-
hidr
oxila
ción
(n
mol
de
7-hi
drox
icum
arin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Oxi
daci
ón d
e ni
fedi
pina
(nm
ol d
e ni
fedi
pina
oxi
dada
. mg p
rote
ina-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epoxido. mg proteina-1 . minuto-1)
53
Figura 22. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pato frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12).
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pato
La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pato se realizó por la técnica de
Western Blot (Fig. 23). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia
1A. Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares de
53.8±1.4 KDa y 50.3±0.8 KDa respectivamente.
54
Figura 23. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pato por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular.
Pollo
Determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax
Los microsomas de pollo al igual que las otras tres especies aviares presentaron
biotransformación de los sustratos prototipo. En la tabla 8 se presentan los valores de KM y
Vmax calculados por cada sustrato y sexo.
Tabla 8. Valores de KM y Vmax para los diferentes sustratos prototipo usados en las
cinéticas con microsomas de pollo macho y hembra. Sustrato Macho Hembra
KM (µM) Vmax (pmol .µg proteína-1. min-1) KM (µM) Vmax (pmol .µg proteína-1. min-1)
AFB1 121.7 1.5 220.0 2.6
Etoxiresorufina 0.3 0.02 0.4 0.02
Metoxiresorufina 0.4 0.06 0.6 0.1
Cumarina 10.1 0.2 20.0 0.4
Nifedipina 4.8 1.3 5.5 1.4
Ensayos de inhibición
Tanto α-naftoflavona como 8-metoxipsoralen produjeron reducciones significativas en la
biotransformación de la aflatoxina respecto al control en todas las concentraciones
utilizadas durante las incubaciones (Fig. 24). En el caso de furafilina y troleandomicina no
se presentó inhibición (Fig. 24 y 25).
55
El uso de α-naftoflavona redujo la epoxidación de la aflatoxina a porcentajes de 29.2, 14.3,
14.7, 15.8 y 16.5% en concentraciones del inhibidor de 1.4, 2.9, 5.7, 11.5 y 22.9 µM
respectivamente. En el caso de 8-metoxipsoralen la reducción llegó a un 22.0, 17.5, 15.1,
10.3 y 8.9% con concentraciones del inhibidor de 2.9, 5.8, 11.6, 46.3, 92.5 µM
respectivamente (Fig. 25).
Figura 24. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pollo en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se reportan los valores tanto para machos como para hembras (n=6).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1 (%
con
trol
)
Concentración de furafilina (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1(%
con
trol
)
Concentración de α‐naftoflavona (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
Biot
rans
form
ació
n de
AFB
1(%
con
trol
)
Concentración de 8‐metoxipsoralen (µM)
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Biot
rans
form
ació
n A
FB1
(% c
ontr
ol)
Concentración de troleandomicina (µM)
56
Figura 25. Porcentaje de biotransformación de la aflatoxina B1 (producción de AFBO) con
citocromos de pollo en presencia de diferentes inhibidores específicos para citocromos
P450 humanas. Se presenta el promedio del porcentaje de producción de AFBO. Los
valores con asterisco son significantemente diferentes del control (sin inhibidor).
Correlación de las actividades frente a sustratos prototipo y la epoxidación de la aflatoxina
B1.
La epoxidación de la aflatoxina B1 se graficó versus las actividades de las citocromo P450
de pollo frente a los diferentes sustratos prototipo (Fig. 26). La actividad cumarina 7-
hidroxilasa mostro una fuerte relación con la producción de AFBO con un valor del
coeficiente de correlación de Pearson de 0.74 con un nivel de significancia del 5%.
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
12.0
24.0
48.0
96.1
192.1
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
fura
filin
a (µ
M)
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
1.4
2.9
5.7
11.5
23.0
Biotransformacion de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
α‐n
afto
flavo
na (
µM)
*
*
*
*
*
0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
3.8
7.7
15.4
30.7
64.4
Biotransformacion de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
trol
eand
omic
ina
(µM
)0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0
control
2.9
5.8
11.6
46.3
92.5
Biotransformación de AFB1 (% control)
Conc
entr
ació
n de
8‐m
etox
ipso
rale
n(µM
)
*
*
*
*
*
57
Figura 26. Correlación de las diferentes actividades de las CYP450 de pollo frente a los
diferentes sustratos prototipo (n=12).
Detección de ortólogos humanos en microsomas de pollo
La detección de los ortólogos presentes en microsomas de pollo se realizó por la técnica de
Western Blot (Fig. 27). No se puso evidenciar la presencia de los ortólogos de la familia
1A. Los ortólogos 2A6 y 3A4 se detectaron perfectamente con pesos moleculares de
53.8±1.4 KDa y 53.5±1.4 KDa respectivamente.
0,00
0,01
0,01
0,02
0,02
0,03
0,03
0,04
0,04
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
7-et
oxire
soru
fina-
O-d
eetil
ació
n (n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
7-m
etox
ireso
rufin
a-O
-dem
etila
ción
(n
mol
de
reso
rufin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-
1)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Cum
arin
a 7-
hidr
oxila
ción
(n
mol
de
7-hi
drox
icum
arin
a. m
g pr
otei
na-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-1)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Oxi
daci
ón d
e ni
fedi
pina
(nm
ol d
e ni
fedi
pina
oxi
dada
. mg p
rote
ina-1
. min
uto-1
)
Epoxidación de AFB1 (nmol de AFB1 epóxido. mg proteina-1 . minuto-
1)
58
Figura 27. Detección de ortólogos CYP450 aviares en microsomas de pollo por la técnica
de Western Blot. Carriles 1 al 3: microsomas de machos. Carriles 4 al 6: microsomas de
hembras. Carriles 7 al 9: CYP450 humanas. Carril de la izquierda: patrones de peso
molecular.
59
DISCUSION
Debido a la gran importancia que tienen las CYP450 en el metabolismo de sustancias
endógenas, medicamentos y xenobióticos como las micotoxinas, se ha hecho indispensable
conocer el papel que este tipo de enzimas juega en la activación de moléculas nocivas para
la salud humana y animal. Los inconvenientes que presenta la purificación de las CYP450
debido a sus semejanzas estructurales, ha dificultado el estudio y caracterización de cada
una de las CYP450. Además, la falta de estudios en ortólogos aviares ha hecho que la
investigación sobre su acción en diferentes tipos de sustratos se haga prioritaria. Además de
la incipiente información, los estudios realizados con extractos crudos de CYP450, como
son los microsomas, donde se encuentran toda la diversidad de formas de citocromos, no
permiten una caracterización individual por lo cual el uso de sustratos prototipo que puedan
ser biotransformados por formas aviares de estas enzimas nos permite hacer un primer
acercamiento funcional en la identificación de estas formas presentes en microsomas
hepáticos de aves de producción. Estudios realizados con microsomas y sustratos prototipo
o inhibidores específicos para las CYP450 humanas en microsomas de otras especies han
permitido la identificación de ortólogos que no necesariamente deben tener una semejanza
estructural o en secuencia con sus formas humanas.
Biotransformación de sustratos prototipo
En el caso puntual de este estudio, el uso de sustratos prototipo permitió detectar y
cuantificar productos de biotransformación que son comúnmente encontrados con el uso de
CYP450 humanas gracias a que se encontraron las condiciones cromatográficas adecuadas
que permitieran la separación de cada sustrato prototipo y de su producto de
biotransformación respectivo por cromatografía de alta eficiencia (HPLC). Al observar que
se podía encontrar actividades homologas a las humanas en aves, se continuó con la
determinación de parámetros enzimáticos KM y Vmax. Esto demostró la presencia de
citocromos capaces de biotransformar los cuatro sustratos prototipo con microsomas
hepáticos obtenidos de las cuatro especies aviares bajo estudio, confirmando la presencia
de ortólogos aviares de las CYP450 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 humanas con capacidad de
actuar sobre la etoxiresorufina, la metoxiresorufina, la cumarina y la nifedipina
60
respectivamente. También se comprobó que estos ortólogos son sensibles a cambios en la
concentración del sustrato corroborando que los ortólogos tienen el comportamiento típico
de una enzima. Respecto a los parámetros enzimáticas se encontró que los ortólogos
CYP450 de pavo presentaron la afinidad más alta por la AFB1 representado en un bajo
valor de KM para ambos sexos (25.5 y 21.2 µM para machos y hembras respectivamente),
mientras los ortólogos CYP450 de pato (44.0 y 23.3 µM para machos y hembras
respectivamente) y codorniz (27.9 y 52.0 µM para machos y hembras respectivamente)
presentaron un nivel medio de afinidad y en pollos se encontró una baja afinidad (121.7 y
220.0 µM para machos y hembras respectivamente). Al observar los valores de velocidad
máxima, se encuentra que los pavos presentan las tasas de biotransformación más altas
tanto para machos como para hembras (6.1 y 5.7 pmol .µg proteína-1. min-1
respectivamente), seguido de las codornices (3.4 y 4.6 pmol .µg proteína-1. min-1 para
machos y hembras respectivamente) y patos (2.7 y 2.9 pmol .µg proteína-1. min-1 para
machos y hembras respectivamente) con valores intermedios. Los ortólogos de pollo
presentaron tasas mucho menores que las tres especies aviares antes mencionadas (1.5 y 2.6
pmol .µg proteína-1. min-1 para machos y hembras respectivamente). Estos resultados
sugieren que la razón por la cual especies como pavo o codorniz son tan sensibles a los
efectos de la AFB1 es el hecho que en la fase I de detoxificación de la toxina están
involucradas ortólogos CYP450 aviares con gran afinidad por la toxina y con la capacidad
de convertir la toxina a AFBO a tasas muy altas. Es importante resaltar el metabolismo fase
I se encuentra acompañado del metabolismo fase II, donde el compuesto bioactivado puede
sufrir conjugación con otros compuestos como el glutatión o sulfatos para continuar con el
proceso de excreción. Por esto es necesario determinar el rol de las enzimas responsables
de la fase II teniendo en cuenta que existen ortólogos que bioactivan la toxina en la fase I
para determinar exactamente el por que de la sensibilidad diferencial entre las aves
estudiadas. Los resultados obtenidos con microsomas hepáticos se encuentran en
concordancia con los hallazgos realizados por Lozano y Díaz (2006), donde se reportó que
pavos y codornices presentaban las mayores tasas de biotransformación de la AFB1,
seguidos por patos y pollos, respaldando los resultados obtenidos en esta investigación
61
donde la afinidad por la toxina y las tasas de biotransformación son mayores en pavo
seguido de codorniz, pato y finalmente pollo.
Uso de inhibidores específicos
Teniendo en cuenta que existen ortólogos aviares 1A1, 1A2, 2A6 y 3A4 y que se presenta
la activación de la AFB1 a AFBO, se requiere de otra herramienta que permita discriminar
el papel de cada uno de los ortólogos aviares en la biotransformación de la toxina. Por esto
se utilizaron inhibidores específicos para CYP450 humanas, donde se demostró que la
actividad enzimática de los ortólogos 1A1 y 2A6 en las cuatro especies aviares se podía
inhibir fuertemente con el uso de α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen respectivamente.
Hasta el momento no se ha encontrado reportes en la literatura donde se relacione a estos
ortólogos aviares en la producción de AFBO, inclusive no se encontraron reportes donde se
relacione la CYP1A1 con la producción de AFBO tanto en humanos como en otras especies
de mamíferos (Omiecinski et al., 1999), por lo cual se presenta información novedosa
acerca de las formas aviares de estas enzimas relacionadas con la producción de la forma
epóxido de la toxina. En contraste, la furafilina y la troleandomicina, inhibidores
específicos de las CYP450 1A2 y 3A4 humanas no produjeron algún tipo de reducción en
la formación de AFBO usando los ortólogos aviares. En la literatura se ha reportado que
tanto la furafilina como la troleandomicina son inhibidores fuertes de la actividad de las
CYP1A2 (Kunze y Trager, 1993; Sesardic et al., 1990) y 3A4 (Jousserandot et al., 1995;
Mansuy et al., 1995) humanas respectivamente. Hasta el momento no se han encontrado
reportes donde se demuestre el efecto de estos inhibidores sobre los ortólogos aviares. Para
corroborar la acción inhibitoria de estos dos compuestos se realizaron ensayos de inhibición
en las cuatro especies de aves utilizando metoxiresorufina como sustrato y diferentes
concentraciones de furafilina para corroborar su efecto sobre la actividad del ortólogo 1A2,
como también se utilizó nifedipina y diferentes concentraciones de troleandomicina para
corroborar su efecto sobre la actividad del ortólogo 3A4 (datos no reportados). En ambos
casos se encontró que estos inhibidores redujeron significativamente la actividad de estas
enzimas respecto del control (sin inhibidor), con lo cual se demuestra su efecto inhibitorio
sobre la producción de resorufina en el caso de la CYP1A2 y de nifedipina oxidada en el
62
caso de la CYP3A4. Reportes en pavo han demostrado la importancia del ortólogo 3A4 en
la bioactivación de la toxina con el uso de 17-α-etinilestradiol como inhibidor de la
CYP3A4 y de α-naftoflavona para las CYP1A (Klein et al, 2000). En este punto hay que
recalcar que se están presentando los primeros reportes del efecto de estos inhibidores en
otólogos aviares y es probable que la furafilina o la troleandomicina no presenten una gran
eficiencia o especificidad como inhibidor de la CYP1A1 y 3A4, por lo que es necesario el
uso de otro tipo de inhibidores específicos que corroboren el papel tanto de las enzimas que
en los resultados demostraron estar relacionadas con la producción de AFBO (ortólogos
1A1 y 2A6) como de las enzimas que según este estudio no demostraron actividad en la
activación de la AFB1. En el estudio realizado por Klein et al en el año 2000 con los
ortólogos 1A de pavo hay que notar que no se utilizó un inhibidor diferencia que permitiera
evidenciar el accionar de las CYP1A1 y de la CYP1A2 como la furafilina, inhibidor
especifico de la CYP1A2. Según esto no se podría afirmar cual de las enzimas 1A estaría
involucrada en la activación de la AFB1. Es importante resaltar que las CYP1A2 y 3A4 han
sido reportadas como unas de las principales CYP450 responsables de la biotransformación
de la AFB1 y otros xenobióticos en mamíferos y humanos (Doi et al., 2002; Klein et al.,
2003; Omiecinski et al, 1999) pero este estudio demuestra que en el caso de pavo, codorniz,
pato y pollo estos ortólogos no se encuentran relacionados con la activación de la AFB1.
Correlación entre biotransformación de sustratos prototipo y activación de la AFB1
La correlación las actividades de los ortólogos aviares frente a la producción de AFBO
demostró una fuerte relación de la actividad cumarina 7-hidroxilasa (CYP 2A6) y la
epoxidación de AFB1 en todas las especies estudiadas. Este resultado corrobora los
hallazgos obtenidos con inhibidores donde se comprobó que la CYP2A6 juega un rol
importante en la activación de la AFB1. Los resultados encontrados para la actividad EROD
(CYP1A1) no demostró correlacionarse con la epoxidación de AFB1 (a excepción de pato)
debido muy probablemente al hecho de utilizar un sustrato que puede ser metabolizado por
dos enzimas, la CYP1A1 y 1A2, hecho que no permite evidenciar la relación de la
CYP1A1 directamente con la formación de AFBO. Un caso excepcional se encontró con
pato, donde las actividades de correspondientes a cada sustrato prototipo utilizado se
63
correlacionó con la producción de AFBO. Este resultado puede ser un indicio de la relación
de los ortólogos 1A2 y 3A4 en la activación de la AFB1.
Immunoblot de ortólogos aviares
La detección de los ortólogos aviares por la técnica de Western Blot permitió evidenciar
claramente la expresión de los ortólogos 2A6 y 3A4 en las cuatro especies aviares. La
expresión de las CYP1A1/2 no pudo determinarse debido a la baja sensibilidad del método
de revelado (100 pg de proteína) y muy probablemente a la baja expresión proteica de estos
ortólogos en microsomas aviares. En algunos casos se evidencio la presencia de proteínas
inmunoreactivas con pesos cercanos a los a los 85 KDa. En estudios anteriores se ha podido
visualizar e identificar estos ortólogos utilizando como método de revelado
quimioluminiscencia (Kein et al., 2000; Verbrugge, et al., 2001; Yip y Coulumbe, 2006) ya
que esta forma de revelado es más sensible que la colorimetría (1-3 pg de proteína). En el
caso de las CYP2A6 y 3A4 donde se encontraron cantidades cuantificables de proteína se
realizó la correlación de la cantidad relativa de proteína versus la actividad cumarina 7-
hidroxilasa y nifedipina oxidasa respectivamente, donde no se encontró alguna dependencia
entre las variables correlacionas en ninguna de las aves estudiadas. Es probable que al no
existir diferencias grandes en la expresión de proteína entre individuos de la misma especie,
representado en la intensidad de las bandas encontrada por individuo, la correlación de la
cantidad de proteína relativa versus su actividad enzimática no resulte en algún tipo de
relación entre estas variables.
CYP450 involucradas en la producción de AFBO
En definitiva, las técnicas utilizadas permitieron identificar las enzimas CYP450
relacionadas con el metabolismo fase I de la aflatoxina B1 (AFB1) en pollo (Gallus
domesticus), pavo (Melleagridis gallopavo), pato (Anas platyrhynchos) y codorniz
(Coturnix japonica). De los ortólogos propuestos en la hipótesis de trabajo (1A1/2, 2A6 y
3A4) como posibles bioactivadores de la AFB1, se pudo relacionar a los ortólogos 1A1 y
2A6 según los resultados obtenidos.
64
CONCLUSIONES
• En las cuatro especies aviares se pudieron identificar ortólogos de las CYP450 1A1/2,
2A6 y 3A4 humanas.
• Las CYP450 de pavos presentan la mayor afinidad por la AFB1, seguido de codorniz y
pato con una afinidad intermedia y pollo con la menor afinidad.
• Las CYP450 de pavo presentan la mayor tasa de biotransformación de la AFB1 seguido
de codorniz, pato y pollo con la menor tasa.
• Los ortólogos aviares 1A1 y 2A6 están relacionados con la epoxidación de la aflatoxina
B1 en las cuatro especies aviares, según los resultados obtenidos por inhibiciones
hechas con α-naftoflavona y 8-metoxipsoralen respectivamente, teniendo en cuenta que
el ortólogo 1A1 no ha sido reportado tampoco en humanos u otras especies de
mamíferos.
• Se pudo confirmar la relación del ortólogo 2A6 en la formación de AFBO para las
cuatro especies aviares, al encontrase correlación entre la actividad cumarina 7-
hidroxilasa y la producción de AFBO. Esta actividad no se ha reportado previamente en
ninguna especie aviar.
• Respecto a los ortólogos 1A2 y 3A4 no se encontró que estos ortólogos jugaran un
papel relevante en la epoxidación de la AFB1 para las cuatro especies aviares, según los
resultados obtenidos con inhibidores
• Existe evidencia en patos del posible papel de las CYP1A2 y 3A4 en la formación de
AFBO, según los coeficientes de correlación encontrados entre las actividades
metoxiresorufin-O-demetilasa y nifedipina oxidasa frente a la producción de AFBO.
• No se encontró relación entre la actividad del ortólogo CYP1A2 de pavos y la
activación de la AFB1, a diferencia de los reportes publicados en años anteriores.
• No se encontró evidencia en pavos, codornices y pollos que relacione los ortólogos
CYP1A2 y 3A4 con la formación de AFBO, a pesar de estar reportada la CYP3A4 en
humanos y pavos.
65
• Por la técnica de Western Blot se pudo demostrar la presencia de ortólogos 2A6 y 3A4
en los microsomas hepáticos obtenidos de las especies aviares estudiadas.
• El método de revelado por colorimetría en la técnica de Western Blot no permitió
evidenciar la presencia de ortólogos CYP1A en microsomas aviares.
• Finalmente, el uso de otros sustratos como metoxiresorufina y nifedipina demostró el
efecto inhibitorio de la furafilina y la troleandomicina en la actividad de los ortólogos
aviares 1A2 y 3A4 respectivamente.
66
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