Lic Stuchi Viviana GLic Stuchi Viviana G
Depto Microbiología IDIM A. LanariDepto Microbiología IDIM A. Lanari
Identificación de Identificación de Levaduras de interés Levaduras de interés
clínicoclínico
Características generalesCaracterísticas generales Hongos unicelularesHongos unicelulares EucariotasEucariotas Son heterótrofosSon heterótrofos 623 especies distribuidos en 60 géneros 623 especies distribuidos en 60 géneros
taxonómicostaxonómicos Amplia distribución en la naturaleza ( en frutas, Amplia distribución en la naturaleza ( en frutas,
granos, miel, alimentos con contenidos en azúcar, granos, miel, alimentos con contenidos en azúcar, suelo, aire, mar ( saprobios), piel, intestino, suelo, aire, mar ( saprobios), piel, intestino, mucosas de mamíferos ( comensal).mucosas de mamíferos ( comensal).
Utiles y perjudiciales para el hombreUtiles y perjudiciales para el hombre No forman parte de la flora humana normal, No forman parte de la flora humana normal,
exepto exepto C albicans, C parapsilosis y Malassezia spC albicans, C parapsilosis y Malassezia sp
Identificar los aislamientos a Identificar los aislamientos a nivel de especienivel de especie
situación actualsituación actualControlar a t= tControlar a t= t11,…t,…tnn, la aparición de , la aparición de
nuevas especies en el nosocomionuevas especies en el nosocomio incidencia, perfil de R a antifúngicos incidencia, perfil de R a antifúngicos Comparar con centros homólogosComparar con centros homólogosRealizar estudios de sensibilidad Realizar estudios de sensibilidad
cuando hay fallas en el ttocuando hay fallas en el ttoConfirmar posibles brotes ( técnicas Confirmar posibles brotes ( técnicas
de BM)de BM)
Criterios básicos para Criterios básicos para identificación de levadurasidentificación de levaduras
Forma de reproducción vegetativaForma de reproducción vegetativa
anamorfo o asexualanamorfo o asexual
teleomorfo o sexualteleomorfo o sexual
Formas de reproducción asexualFormas de reproducción asexual
Brotación Brotación Origen de la pared celular (holoblástica o enteroblástica)Origen de la pared celular (holoblástica o enteroblástica)
Posición en que se producen ( mono –bi—multipolar)Posición en que se producen ( mono –bi—multipolar) Forma en que se producen los brotes sucesivos (simpodial, Forma en que se producen los brotes sucesivos (simpodial,
en cadenas, acrópetas o basípetas)en cadenas, acrópetas o basípetas)
Fisión Fisión
Producción de conidias sobre un corto Producción de conidias sobre un corto cuellocuello
Formación de balistosporasFormación de balistosporas
Micromorfologia Micromorfologia (EXT DE MALTA LIQUIDO)(EXT DE MALTA LIQUIDO) Características de la fase Características de la fase
vegetativavegetativaForma de las células Forma de las células vegetativas o vegetativas o blastoconidiasblastoconidiasFormación de Formación de pseudomicelio: formación pseudomicelio: formación de cadenas de células de cadenas de células elongadas que se elongadas que se originan por gemaciónoriginan por gemaciónFormación de hifas Formación de hifas verdaderas ( micelio)verdaderas ( micelio)Formación de Formación de artroconidiasartroconidias
Características sexualesCaracterísticas sexuales
Formación de ascos/ascosporasFormación de ascos/ascosporas
Agar gorodkowa Agar acetato de sodioAgar harina de maíz(Hansenula anomala, S cerevisiae)
Cultivo en lámina o Cultivo en lámina o microcultivomicrocultivo
Portaobjetos
agar
Trazo con el cultivo de levadura
Morfología, producción de Morfología, producción de clamidosporos, pseudohifas y clamidosporos, pseudohifas y blastoconidias blastoconidias
Medios de cultivo APG, Agar Medios de cultivo APG, Agar Morfología, Agar harina de maíz, Agar Morfología, Agar harina de maíz, Agar leche + Tween 80 al 1%leche + Tween 80 al 1%
Algoritmo para la identificación de Algoritmo para la identificación de levaduraslevaduras
Muestra clínica
Siembra en agar cromogénico Siembra en Sabouraud con ATB
Observación examen directo Levaduras
Reaislamiento en agar Sabouraud con ATB
Levadura cultivo puroObservación aspecto de la colonia
*
Pigmentadas de color rosa o salmón
Urea +
No pigmentada.Color Blanco o crema
Rhodotorula spp Identificación
En agar cromogénico c/atb se visualiza a las 24 hs colonias puras, la siembra del material original permite detectar mas de un tipo de levadura e identificación presuntiva de C albicans, C krusei y C tropicalis
Agar CromogénicoAgar Cromogénico
Otras levaduras Otras levaduras +Cryptococcus, +Cryptococcus, +Trichosporon+Trichosporon
CHROMagar Candida
Levadura no pigmentada
Tubo germinativo(suero bovino)
Negativo Positivo (h/3hs)
Micromorfología(AM+EXT Malta liq )+Agar cromogénico
Candida albicans
Identificación presuntiva Identificación definitiva
Colonias en Chromagar Colonias en Chromagar verde esmeraldaverde esmeralda
Tubo germinativoTubo germinativo : : positivopositivoCrecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película : formación de película : negativonegativo pseudohifas o hifas verdaderas : pseudohifas o hifas verdaderas :
positivopositivoCrecimiento a 45°C en SDA Crecimiento a 45°C en SDA Candida albicansCandida albicans : : positivopositivo
Candida dubliniensisCandida dubliniensis : : negativonegativo
Formación de clamidosporosFormación de clamidosporos en en agar harina de maíz . agar harina de maíz . clamidosporos terminales
Candida albicans
clamidosporos en paquetes de 3-5 Candida dubliniensis
Incubar a 25-28°C, 48-72 Observación al MO: 10x, 40x
Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar azulazul
Tubo germinativo : negativoTubo germinativo : negativo Crecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película : positivoformación de película : positivo pseudohifas o hifas verdaderas : positivopseudohifas o hifas verdaderas : positivo Formación de clamidosporos en agar harina de Formación de clamidosporos en agar harina de
maíz : negativomaíz : negativo Asimilación de trehalosa : positivo (+ 3 hs) Asimilación de trehalosa : positivo (+ 3 hs)
Candida tropicalisCandida tropicalis
Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar rosarosa
Tubo germinativo : negativoTubo germinativo : negativo
Crecimiento en extracto de maltaCrecimiento en extracto de malta formación de película formación de película pseudohifas o hifas verdaderaspseudohifas o hifas verdaderas
Asimilación de trehalosaAsimilación de trehalosa
Asimilación de melibiosaAsimilación de melibiosa
C krusei C glabrata C parapsilosis
Fotos :Guia de identificacion presuntiva de levaduras de interés médico.
Película (Ext de malta)
-+
Pseudohifas o hifas verdaderas
+ -
C guillermondii /C parapsilosisdespués de 7 ds
C glabratadespués de 14 ds
C parapsilosis /C guillermondii / C glabrataC krusei
Trehalosa
+ -
C glabrata (antes de las 3 hs) C krusei/ C guillermondiiC parapsilosis
Melibiosa
+ -
C parapsilosis / C glabrata C guillermondii
Colonias en CHROMagar Colonias en CHROMagar blanco marfilblanco marfil
Tubo germinativo : negativoCrecimiento en extracto de malta formación de película pseudohifas o hifas verdaderas Urea de Christensen: Agar semilla de girasol : positivo ( colonias marrones) Cryptococcus neoformans Asimilación de inositol Asimilación de trehalosa y otros sustratos
+ -
Urea
Cryptococcus sppRhodotorula glutinus
Rhodotorula rubra
C parapsilosis / C catenulata/ C famataC kefyr/ C lusitaneae/ C pintolopesii
C rugosa/ C zeylanoidesHansenula anomala/ P wickerhamii
+ -
Inositol
Cryptococcus spp Rhodotorula spp
Especie de Levadura Micromorfología CHROMagar Trehalosa Urea
Calbicans Pseudomicelio con blastoconidias agrupadas clamidoconidias
Verde Neg Neg
C tropicalis Pseudomicelio largo y ramificado, blastoconidias dispuestas a lo largo
Azul Pos +3hs
Neg
C parapsilosis Pseudomicelio corto ramificado, blastoconidias ovoides
Crema ND Neg Neg
C kruseiCélulas alargadas con blastoconidias terminales
Rosa seca Neg
Pos débil
C glabrataBlastoconidias pequeñas sin pseudomicelio
Rosa, crema, ND Pos 2 hs Neg
C guilliermondiiBlastoconidias pequeñas c/ pseudo micelio rudimentario
ND Neg Neg
Cryptococcus neoformans
Levaduras redondas brotantes
ND Neg Pos
Trichosporon
spp
Blastoartroconidias
Clamidoconidias
intercalares
Azul violáceoND
Neg Pos
ND: no se distingue por color
Marcha mínimaMarcha mínima
Crecimiento a 37°CAusencia de micelio verdadero o pesudomicelioFenoloxidasa (+)Test de ureasa(+)
Identificación presuntiva deCryptococcus neoformans
Cápsula de polisacárido visible Cápsula de polisacárido visible examen directo con tinta chinaexamen directo con tinta china
A: 100X
Identificación ID 32CIdentificación ID 32C
2 ml de H2O estérilInóculo 2 Mc Farland250 ul
135 ul porpocillo
92% de aislamientos comunes92% de aislamientos comunes85% de los aislamientos raros85% de los aislamientos raros
Resultados: biocódigo de 8 dígitos Resultados: biocódigo de 8 dígitos identificación a través de un identificación a través de un
manual de códigosmanual de códigosAPI WEB on lineAPI WEB on line
Pruebas diferenciales para Pruebas diferenciales para identificar levaduras por el identificar levaduras por el
método de referenciamétodo de referencia
1. Prueba de formación de tubogerminativo por Candida albicans.2. Prueba de formación declamidosporas por Candida albicans.3. Agar semillas de girasol paradiferenciación de Cryptococcusneoformans.4. Prueba de la producción de ureasapara Cryptococcus neoformans.5. Crecimiento a 28 ºC y 37 ºC.6. Crecimiento en extracto de malta paraestudio micromorfológico.7. Cultivo en lámina en agar morfología(Difco) para estudio micromorfológico.
8. Crecimiento en agar morfología (Difco)para macromorfología.9. Ensayo de asimilación de Glucosa,Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa,Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa,Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D-Xilosa,L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácidocítrico, eritritol y m-Inositol.10. Ensayo de asimilación de nitrato depotasio y peptona.11. Ensayo de fermentación de Glucosa,Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa yLactosa.12. Crecimiento en medio libre de vitaminas.13. Producción de ascosporas.
Características fisiológicas y Características fisiológicas y bioquímicasbioquímicas
Fermentación de compuestos Fermentación de compuestos carbonadoscarbonados(zimograma).(zimograma).
Utilización de azúcares en anaerobiosisUtilización de azúcares en anaerobiosis
Asimilación de compuestos Asimilación de compuestos carbonados y nitrogenados carbonados y nitrogenados (auxonograma)(auxonograma)
Utilización oxidativa (asimilación) de Utilización oxidativa (asimilación) de determinados compuestos C y Ndeterminados compuestos C y N
Marcha identificatoria de levadurasMarcha identificatoria de levaduras
Cepa pura Repique en YM
Extracto de Malta líquidoIncubar: 28°C, 72 hsObservar micromorfología
28°C y 37°C 24 hs Inóculo: 2-3 Mc Farland
5 ml de agua estéril
Medio ureaIncubar: 28°C, 72 hsMedio urea
Incubar: 28°C, 72 hs
Asimilación de azúcaresSembrar 0,5 ml / tubo
. . ..
Fermentación de:Glucosa- Galactosa-Maltosa-Sacarosa-Lactosa-CelobiosaLectura: 3-5-10 y 15 díasTemperatura: 28°CSembrar 0,1 ml /tubo
.
Asimilación de Nitrogenados
.0,5 mlLeer a las 48-72 hs a 28°C
.
C C C20
10
21
13
0
19
2 4
16
3
9 6
C C N17
14
18157 8
1
11
12
5
13 2013
0
1619
0
1620
AgradecimientosAgradecimientos
Departamento MicologíaINEI– ANLIS“Dr. Carlos G.
Malbran
Departamento de Microbiología IDIM A. Lanari
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