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MUTAGNESISHidroxilamina como agente mutagnico paraNeurospora crassaInduccin de mutantes en Escherichia coli
INSTITUTO POLITCNICONACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS
LABORATORIO DE GENTICA MICROBIANA
Grupo: 5QM2
Equipo:3 Seccin: 1
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Gen: Unidad fundamental dela herencia que ocupa unlocus en un cromosomaconcreto. Secuencia de DNAque codifica para unpolipptido.
Cromosoma: molcula de
DNA o RNA que constituye elgenoma. Almacenan lainformacin gentica.
Locus: lugar de un cromosoma
en donde se localiza un gen
Alelo: Formas alternativas deun gen. Figura 1.Gen Eucaritico
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Genoma: Conjunto de genes contenidos en loscromosomas . Totalidad de la informacin gentica.
Genotipo: Constitucin gentica de un organismo.
Fenotipo: Propiedades observables de unorganismo controladas genticamente.
Haploide: Clula u organismo que tiene una soladotacin de cromosomas .
Diploide: Clula u organismo con dos complementoscromosmicos.
Merodiploide: Organismo haploide que incorporaun segmento de DNA del exterior, de manera queahora posee dos copias de ese gen.
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MUTACIN Cambio de la
secuencia nucleotdicade una molcula deDNA que es heredabley NO se reproduce por
recombinacin.
Figura 4. Ejemplo de una mutacin.
IMPORTANCIA
Fuente primariade la variabilidad
gentica.
Materia prima dela evolucin
Anlisis gentico
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FRECUENCIADEMUTACIN
Es el nmero de mutaciones que aparecen por divisin celularen bacterias y organismos unicelulares
Ejemplo:Los genes vricos y bacterianos padecen un promedio de
mutaciones espontaneas en 1 de cada 100 millones (10-8) dedivisiones celulares aproximadamente.
La frecuencia de mutaciones espontneases de 10-7a 10-10.Sin embargo, en las mutaciones inducidas aumenta a unafrecuencia de 10-4a 10-7.
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POLIMORFISMOGENTICO Variaciones en una posicin o
regin especfica en la
secuencia de ADN que sepresentan en al menos un 1%de la poblacin.
Figura 2. Ejemplo de polimorfismo
gentico.
MARCADORGENTICO Segmento de ADN con una
ubicacin fsica identificable(locus) en un cromosoma ycuya herencia gentica sepuede rastrear.
Figura 3. Mapa gentico de tomatebasado en marcadores morfolgicos
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Antibiticos
Enzima conocida
mutacionesDeleccin
Insersin
Plsmido
Fenotipo
strsostrr
hisG+ o hisG-
his G 47
D lac pro
lac::amps
his -, arg-/F, lac+
His+o His -
NOMENCLATURADEGENESEn genotipo se escriben las tres iniciales del factor de crecimiento o
enzima de la que se trate con letras minsculas e italizadas his+o his-
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CLASIFICACIN
Grado de
lesin
Espontneas Inducidas
Orgen
Macrolesiones Microlesiones
Efectosobre el
fenotipo
Silenciosas Sentido equivocado Sin sentido
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MUTACIONES ESPONTNEAS
Son cambios en la secuencia nucleotdica de los genes y no
parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^-7 a 10^10(1 en 10 millones)
Errores por tautomerismo.
Daos oxidativos
TAUTOMRISMO Los cambios tautomricos pueden resultar en cambios en
el emparejamiento de bases, o mutaciones.
Ceto-enol en la Timina y Guanina
Amino-imino en la Citosina y Adenina
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Figura 5. Formas normales y tautomricas de las bases del DNA. La Adenina y
la Citosina pueden existir en la forma amino o en la rara forma imino; laguanina y la timina pueden presentarse en la forma ceto o en la mas rara enol.
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Figura 6. Comparacin de las relaciones de emparejamiento de bases normalescon las disposiciones producidas como resultado de cambios tautomericos. Laspuntas de flecha sealan los sitios de unin del azcar pentosido.
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MUTACIONESPORRADICALESLIBRES
Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el
perxido de hidrgeno (H2O2) y los superxidos (O2)generan rupturas en el enlace glicosdico por la oxidacindel azcar generando sitios apurnicos o apirimidnicos .
Figura 7.efecto de radicales en bases nitrogenadas.
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MUTACIONES INDUCIDAS
Mutgeno:
agente externo, puede ser fsico oqumico, que interacta con elDNA causando mutaciones.
Mutagnesis:
Proceso de formacin de unorganismo mutante.
Figura 8. Mutacin inducidapor radiacin UV
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Agentesmutagnicos.
Fsicos
Rayos UV, X
Humedad
Temperaturaextrema
pH
Biolgicos.
Qumicos.
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RAYOSX YRADIACIONESIONIZANTES:
o Tienen mayor poder depenetracin que los rayos UV
o Difcil manejo, por lo que seemplean poco en bacterias
o Producen radicales libres dehidroxilo hiperreactivos,responsables de la abertura deun anillo de una base, o
fracturas monocatenarias obicatenarias en el ADN, estopuede ocasionar mutacionespor delecin .
LUZUV Causa la unin o
dimerizacin de pirimidinasadyacentes en el DNA.Siendo los dimeros de timinalos de mayor incidencia.
Figura 9. Dmeros de timina
por radiacin UV
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CURVADESOBREVIVENCIADEUNABACTERIADESPUSDELAEXPOSICINALARADIACINULTRAVIOLETA
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La exposicin del material gentico a temperaturas superioresa 37C produce mutaciones puntuales en el ADN. Ejemplosde esas mutaciones son la prdida de bases pricas, procesoque se denomina despurinizacin, o bien desaminaciones,que consisten en la prdida de grupos aminos de las bases.
TEMPERATURA
Figura 11. mutaciones inducidas por una alta temperaturacomo despurinizacin (izquierda) y desaminacin (derecha)
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BIOLGICOS.
Transposones:
Los transposones son segmentos mviles de DNA.
Los transposones contienen cortas repeticiones invertidasterminales que son esenciales para el mecanismo deinsercin y que se utilizan para definir los lmites deltransposn.
Todos los transposones activos contienen al menos un genque codifica una TRANSPOSASA, una enzima necesaria paraque se produzca el salto o transposicin
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Figura 12. Esquema de accin de los transposones
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DESPURINIZACIN
Prdida de purina en una molcula de doble cadena de DNA,se produce por rompimiento del enlace glucosdico que une alcarbono 1 de la desoxirribosa a la posicin 9 del anillodepurina
Figura 13. Prdida de una purina en un desoxinucletido.
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Rotura del enlace glicosdico entre la base nitrogenada y elazcar al que esta unida con prdida de una A o una G.
Figura 14. Despurinizacin por prdida de una guanina.
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DESAMINACIN:
Prdida de grupos amino.La C se convierte en U y ste se
empareja con A producindosetransiciones: GCAT.
El U no forma parte del ADN,la glucosidasa de uracilo se
encarga de detectar U en elDNA y retirarlo producindoseuna base apirimidnica.
La 5-Me-C por se convierte en T.
La T es una base normal en elDNA y no se retira, por tanto estoserrores no se reparan.
Figura 15.Transformacin de algunasbases por desaminacin
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ANLOGOSDEBASES
Son compuestos qumicos que pueden remplazar auna base determinada. Por ejemplo, el 5-Bromouracilo(5BU) es anlogo de la Timina (T) y puede remplazarla.
El 5-Bromouracilo puede provocar un error tras lareplicacin del DNA, es inestable y provocatransiciones .
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5-BROMOURACILO
Figura 16. Posibles apareamientos del 5-Bromouracilo.
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2-AMINOPURINA
La 2-Aminopurina (2AP) es anlogo de la Adenina (A). La 2APaparea con la Timina (T) pero en su forma imno (2AP*) emparejacon la Citosina (C). Esta alteracin produce transiciones.
Figura 17. Posibles apareamientos de la 2-aminopurina
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DESAMINANTES: HNO2
Provoca transiciones mediante la sustitucin degrupos amino de nucletidos por grupos ceto, comoconsecuencia la citocina de convierte en uracilo, laadenina en hipoxantina y la guanina en xantina
Figura 18. Sustitucin del grupo amino por el grupo carbonilo en una
desaminacin con HNO2
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Figura 19. Cambios provocados por la desaminacin con HNO2
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HIDROXILAMINA HA.
NHOH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino esreemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de lacitosina se aparea con adenina producindose transicionesGC-AT.
Figura 20. Accin de la hidroxilamina en la citosina, provocandoun apareamiento con adenina
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ALQUILANTES. Etilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones:
transiciones y transversiones.
Nitrosoguanidina NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina :produce transiciones y transversionesGCTA
Figura 21. Cambio en el apareamiento de guanina
provocado por la alquilacin.
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INTERCALANTESCOLORANTESDEACRIDINA
La proflavina y el naranja de acridina son planas, por lo que inician la
mutacin insertndose en la doble hlice del DNA, provocando sudeformacin; provocando adiciones y deleciones en la replicacin.
Figura 22.Molculas planas policclicas que se intercalan entre las bases.
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Figura 23.Esquema de la accin delos agentes intercalantes
Clasificacin de mutgenos por su dao direccin y efecto
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Clasificacin de mutgenos por su dao, direccin y efecto
Mutgeno Clasificacin Dao Direccin Efecto
Luz UV Fsico Dmeros depirimdinas
Unidireccional Insercin,delecin,sustitucin
Hidroxilamina Qumico Hidroxilante Unidireccional Transiciones deGC-AT
cido nitroso Qumico Desaminante Bidireccional Transiciones deGC-AT y
trasversionesAT-CG
EMS Qumico Alquilante Bidireccional Transiciones deGC-AT, AT-GC
5-Bromouracilo Qumico Anlogo de base Bidireccional Transiciones deGC-AT, AT-GC
Nitrosoguanidina Qumico Alquilante Unidireccional Transiciones deGC-AT
ICR-170 Qumico Intercalante Bidireccional Insercin odelecin
9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Insercin odelecin
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MUTACINPORGRADODELESIN
Macrolesiones:
Alteraciones gravesen la molcula del
DNA o en unsegmento grande
En funcin de su magnitud, longitud o grado de lesin,permite clasificarlas en:
Microlesiones:
Alteracinproducida en una o
pocas bases delDNA.
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MICROLESIONES(PUNTUALES)
Sustituciones Transversiones Transiciones
Inserciones Deleciones Alteran el marco de
lectura
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SUSTITUCINEs aquella mutacin en la que donde debera haber una base seencuentra otra del mismo tipo. Por ejemplo, en lugar de la
citosina se instala una timina.
Figura 22. Esquema de las posiblestransversiones y transiciones
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INSERCIONESYDELECIONES
Este tipo de mutacin produce un corrimiento enel orden de lectura.
Pueden ser:
- Adiciones gnicas: Es la insercin de nucletidosen la secuencia del gen.
- Deleciones gnicas: Es la prdida de nucletidos.
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MARCOSDELECTURA
ORF: Secuencia nucleotdica organizada en tripletes quecodifica una secuencia aminoacdica de un polipptido,incluyendo un codn de inicio y un codn de terminacin.
Figura 23. Marco de lectura.
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Figura 24. Esquema de las consecuencias deuna delecin y de una insercin en la traduccin
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CORRIMIENTODELMARCODELECTURA.
Fig. 25Mutacin por corrimiento del marco de lectura.
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Mutacin Silenciosa:Son cambios sutiles en las secuencias de DNA,irrelevantes en un comienzo en cuanto a lacodificacin protenica, que poco a poco vancobrando importancia siendo determinantesen la enfermedad y la evolucin.
EFECTOSOBREELFENOTIPO
Figura 26. Esquema de una mutacin silenciosa donde sesintetiza el mismo aa.
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Mutacin Sin sentido
Son aquellas en las que tiene lugar una sustitucinde bases en un codn dado, en donde en vez deformar otro aminocido distinto, se crea uno de
los tres codones stop (UAA, UAG, UGA).
.
Fig. 27. Comparacin entre
un polipptido completo yuno truncado debido auna mutacin sin sentido alcambiar una guanina poruna adenina. (Tomada deSnyder & Champness,
2007, p. 157)
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Mutacin En sentido errneo
Mutaciones que cambian la secuencia de un codndado, sustituyendo una base por otra, lo que puede
producir que el aminocido codificado no sea el quese haba especificado antes.
.
Fig. 28. Cambio de una timina poruna citosina en una cadena deDNA, produciendo una mutacinen sentido errneo.(Tomada de
Snyder & Champness, 2007, p. 157)
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SELECCINDEMUTANTES.
Seleccin de auxtrofos.
Los organismos axtrofos son empleados con mayorrecurrencia para buscar un gen especficodefectuoso, motivo por el cual no puede sintetizar sus
factores de crecimiento.
Seleccin de prottrofos.
Estos microorganismos son empleados para lasecuenciacin del genoma del organismo en suforma silvestre.
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Seleccin de microorganismos susceptibles a antibiticos.
Los organismos susceptibles a antibiticos son estudiadospara poder identificar los genes que confieren esta
susceptibilidad y poder seguir posibles resistenciasadquiridas
Seleccin de microorganismos resistentes a antibiticosSon usados para estudio de los genes que confieren estaresistencia, ya que por medio de dichos estudios se puedenbuscar algunas alternativas de tratamiento.
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MUTACIONESNOREVERSIBLES(UNIDIRECIONALES)YREVERSIBLES(BIDIRECCIONALES).
Si se trata de una mutacin unidireccional noreversible, puede reemplazar al alelo del que seorigin. (A1 A2) pero muy a largo plazo.
Si se trata de una mutacin bidireccionalreversible, se puede establecer una situacin deequilibrio que depende solo de las tasas de
mutacin (u) y retromutacin (v) (A1 A2).
REVERSIN
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Es una segunda mutacin, se restaura total oparcialmente el genotipo y/o fenotipo daado por laprimera mutacin.
REVERSIN.
Verdadera: mutante que a revertido a su genotipoanterior, restauracin del genotipo (ADN) silvestre.
No verdadera (por supresin): reversin del fenotipo mutanteal silvestre a causa de una mutacin en otro lugar quesuprima o compense la deficiencia de la primera
Supresin intragnica: se produce cuando la segundamutacin se da dentro del mismo gen en que se dio laprimer mutacin.
Supresin intergnica: las segunda mutacin se da en un
gen diferente a donde se dio la primer mutacin.
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ARTCULO:
HIDROXILAMINACOMOAGENTEMUTAGNICODENEUROSPORACRASSA
H. V. MALLINGBiology 3' Division,
Oak Ridge National Laboratory),
Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)
(Received June 21st, I966)
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Neurospora crassa
o Es un hongo perteneciente a la divisin Ascomycota
o Es utilizado como organismo modelo por su haploida, su ciclode vida rpido y sencillo, y por la facilidad con la que sepuede cultivar.
o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de lamutacin es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 sonmorados y se detectan fcilmente.
Figura 29. Cultivo deNeurospora crassa.
I
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HA induce sustituciones en pares de bases GC- AT
La reaccin entre DNA y HA es con citocina y conRNA con uracilo
A un pH de 6.1 la reaccin es mas rpida concitocina que con uracilo
HA ha sido usada para inducir dao cromosmico
en clulas de mamferos
No se ha podido identificar la alteracin por HA eneucariotes a nivel molecular
INTRODUCCIN
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OBJETIVOS
Determinar la especificidad de HA paraproducir reversiones en mutantes
dependientes de adenina.
Obtener informacin ms detallada
sobre los efectos de HA en Neurospora
Prueba de Ames
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Prueba de Ames
Se basa en la observacin de que la exposicin delas bacterias mutantes a las sustancias mutagnicas
puede causar nuevas mutaciones que revierten elefecto de la mutacin original.
Figura 30. Prueba de Ames para observar revertientes.
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SELECCINDEMUTANTES.
Figura 31. Seleccin de mutantes por auxotrofa y Pototrofa
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RPLICAENPLACA
sta tcnicaconocida comorplica en placa,
(Joshua Lederberg),es una tcnica de
deteccin que haceposible determinarrpidamente si unadeterminada cepa
bacteriana es
auxtrofa paradado metabolito
Figura 32. Tcnica de rplica en placa para
seleccin de auxtrofo a X metabolito.
M
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MEDIODECULTIVO
Conidios
20ml de medioglicerolcompleto consulfato deadenina
Incubados1 da a30C, 6-9das a 25C
Conidios enagitacincon perlas
Rompimientode cadenas
suspendieronen solucinsalina (0.9%)
Filtrado en mallade platino
lavados 2veces porcentrifugacin
Resuspender ensolucin salina
Se utilizaron 7 cepas mutantes inducidas concido nitroso y una cepa de origen
espontneo.
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Mutantes Ad- 3difieren de las demspor el desarrollo de
un pigmentoprpura en el micelio
y conidios cuandocrece en glicerol
completo
La acumulacinde tal pigmento
se elimina al
agregar 250 mgde sulfato deadenina por
litro.
La densidad de suspensiones de conidios semidi en un fotocolormetro y el punto
mximo de absorcin se encontr a 750m.
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TRATAMIENTOS
Suspensin de conidiosen matraces deErlenmeyer en unagitador rotatorio enbao de agua a 25
5 min antes de
detener eltratamiento.
Despus delostratamientosNA, EMS oICR-170
Resuspender en suspensinsalina mnima de Friesajustada a un pH de 8 conNaOH.
Todos los tratamientos sellevaron a cabo consuspensiones conidiales(2X107/ml) en matracesErlenmeyer en un agitadorrotatorio
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TRATAMIENTOCONCIDONITROSO
Conidios fueron
suspendidos en0.05M de unregulador deacetato de sodiode un pH de 4.5
Cf: 0.005M de
NaNO2 y eltratamiento fueinactivado comoha sido descritopasados los 40minutos.
% S R/ 108
S
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TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA
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TRATAMIENTOCONHIDROXILAMINA
Antes deltratamiento
HA, los conidiosfueron
suspendidos enNaCl 3M
Dilucin 5 vecesen la mezcla de
reaccin HAconcentracin
final 1M
5 minutos antes de detenerel tratamiento, centrifug ydecantados y en el tiempode detener la reaccin (300minutos despus de
iniciado el tratamiento)
Los conidios
fueronresuspendidosen NaCl 3M
los conidios fueronresuspendidos en la
solucin salina mnima deFries ajustada a un pH de 8.
% S R/ S
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Tratamientocon ICR-170
Suspensin deconidios
Suspender en reguladorde fosfato 0.067M pH 7
Adicin de un volumen deICR-170 a 49 volmenes de
suspensin de conidia
Concentracinfinal de 10.58M
Tratamientoterminado130min.Despus
Procedimiento realizadoen luz Roja, y las cajas
incubadas en oscuridad
% S R/ S
ESTIMACINDE LAVIABILIDADDELOSCONIDIOS
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TRATADOSYNOTRATADOS.
Medios de cultivo
Fueron sembrados en medio mnimo deWestergaard suplementado con sorbosa(15g/l), glucosa (0.5 g/l), fructosa (0.5 g/l),cido casamino (200mg/l), una solucinvitaminada en glicerol completo (1 ml/l),y adenin sulfato (25 mg/l)
Para estimar el nmero derevertores los conidios fueronsembrados en el mismo sustratousado para los sobrevivientesanotados pero suplementado con0.2 mg/l de adenin sulfato en lugarde 25mg/l de adenin sulfato.
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CONTEO DE REVERTIENTES DESPUESDEL TRATAMIENTO CON NA, EMS E
ICR-170
Conidios sembrados a una densidad de106/ml y 2X105conidios/ml en unvolumen total de 100ml
CONTEO DE REVERTANTESDESPUES DEL TRATAMIENTO
CON HA
La densidad de los conidios fue de2X105en volumen total de 500ml
DETERMINACIN DESOBREVICENCIA
La densidad de los conidios fue de 5-10conidios por volumen de sustrato envolumen total alrededor de 100 mL
Supresores
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SEANALIZARON20 DIFERENTESMUTANTESINDUCIDOSENELLOCIAD-3PARAOBSERVARLAINCIDENCIADESUPRESORES
EXTRAGNICOSYNINGUNOFUEENCONTRADO.
PORLOTANTO, SEPUDEASUMIRQUELAREVERSINPORSUPRESINFUERADELOSLOCUSAD-3AAD-3BSONMUY
RAROSONOOCURREN.
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Alteraciones genticas inducidas por HA
Tabla 1: Porcentaje de sobrevivientes y frecuencias dereversin de las cepas despus del tratamiento conICR-170, NA, EMS e Hidroxilamina.
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Grafica 1: Incremento del nmero de reversiones (M)despus del tratamiento con HA sobre el nmero demutaciones espontneas (Mo) contra el tiempo de
tratamiento con HA.
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Grafica 2: Porcentaje de sobrevivientes contra eltiempo de tratamiento con HA.
L f i d i Hid il i i l l
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La frecuencia de reversin con Hidroxilamina no es proporcional altiempo en Neurospora, pero s para fagos.
Grafica 3: Cintica de las inducciones de reversiones por HA en lasustitucin par base de la cepa 2-17-155.
Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes contra elcuadrado del tiem o del tratamiento de HA.
Heterocarionte
Rpida penetracinde HA.
Reaccin con citosinocurre en dos pasos
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Prctica 2
Induccin demutantes enEscherichia coli
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OBJETIVOS
Conocer el manejo de algunas tcnicas paraproducir mutaciones
Analizar algunos parmetros que caracterizan
el proceso de mutacin como la frecuenciade mutacin y la relacin dosis-respuesta.
Caracterizar el dao producido por la luz UV yHA mediante pruebas de reversin.
MEDIOSDECULTIVO
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MACCONKEY MEDIOMNIMOLACTOSA Medio diferencial
Las bacterias capaces defermentar acidifican elmedio. Se formancolonias rojas o rosadas.
Medio mnimo
Slo crecenmicroorganismoscapaces de utilizar lalactosa como fuentede carbono.
Figura 30. Prueba positiva ynegativa de lactosa enmedio Mac Conkey
MEDIOLURIA(L)
Medio rico
Lac+ Lac-
CEPA
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Se trata de una enterobacteria que se encuentrageneralmente en los intestinos animales, y porende en las aguas negras, pero se lo puedeencontrar en todos lados, dado que es un
organismo ubicuo.
Escherichia coli W3350
Fenotipo: F-, Gal-, Su-, Sms
Escherichia coli
CEPA
DESARROLLOEXPERIMENTAL.T
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TRATAMIENTOCONHIDROXILAMINA
Colectarclulascultivo
E. coliW3350
4000 x g10 min
5 mlmedio L
1 ml
9200 x g3min
Tubo [ HA] MTapar con
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1 ml deHA pH 6
1 0.0
2 0.2
3 0.4
4 0.6
5 0.8
Tapar conpapel
aluminio.Incubar a 37C
en agitacin30 min.
9200 x g3min
Condicionesde
esterilidad
1 mlsol.
SalinaDeterminar el
numero de clulasviables en cada
tubo con dilucionesdecmales
0.5 ml
T b Dil i
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10-14.5 ml
medio L
Tubo Dilucin
1 10-5, 10-6
2 10-5, 10-6
3 10-4, 10-54 10-4, 10-5
5 10-4, 10-5
Sol.
salina
Por duplicado
0.1 ml
MacConkey
Incubar37C18 h
Incubar tuboscon dilucin 10-1
37C 18 h
DA1. TRATAMIENTOCONLUZULTRAVIOLETA
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Dilucin1:20 E.
coli
W3350
Medio L20 ml
Incubar a 37 conagitacin hasta
obtener una densidad
ptica de 60 unidadesKlett equivalente a
As600nm =1.12 (aprx15h)
4000 x g15 min
Resuspender6 ml Sol.salina
500 ul
4.5 ml
medio L 10-1
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5.5 ml Irradiar por 15, 30, 45 y 60 segundos
0.5 ml
4.5 mlmedio L
Tiempo deirradiacin
Dilucin
0 10-5, 10-6
15 10-5
, 10-6
30 10-5, 10-6
45 10-5, 10-6
60 10-4, 10-5
Sol.salina
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0.1 ml
MacConkey
Por duplicado
Incubar37C18 h
Incubar tuboscon dilucin 10-1
37C 18 h
DA2. CUENTADESOBREVIVIENTESYSIEMBRAPARASELECCIONARMUTANTES
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Cuenta desobrevivientes
colonias blancasLac-
Calcular el ttulode sobrevivientes ytrazar grfica de %
de sobrevivenciavs [HA] o tiempo
de irradiacin.
Prepara diluciones10-6, 10-7 y 10-8 De la
dilucin 10-1 Medio L
0.1 ml
MacConkey
Sembrar una cajade la dilucin 10-6 ydos de 10-7 y 10-8
incubar a 37C 18h
NOpicar lascolonias
DA3. REVERSINCalc lar frec encia de
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Cuenta desobrevivientes
colonias blancasLac-
NO
picar lascolonias
Calcular frecuencia demutacin (FM)
Elaborar la curva dosis-respuesta,considerando la dosis del mutgeno
empleadas y las frecuencias demutacin calculadas.
DETERMINACINDELTIPODEMUTACINPRODUCIDOPORLALUZUV Y HA
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UV YHA
Una coloniaaislada Lac-
0.5 ml medio L
Agar blandofundido
0.1 mL
Medio Mnimo Lactosa
Papel filtro estril
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Impregnar 20 ul
Estreptomicina y9-aminoacridina
Nitrosoguanidinay 5-bromouracilo
Hidroxilamina Nada
Incubar a 37C 5 das, observndolas diariamente para registrar laaparicin de revertantes. De acuerdo a los resultados obtenidos y
tomando en cuenta el tipo de lesin que produce cada mutgeno,proponer que tipo de lesiones produjeron la HA y la luz UV
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BIBLIOGRAFA
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