RESUMEN
Las enzimas, proteínas con la capacidad de transformar un sustrato en un producto
gracias a su potencial catalítico. Realizan la reacción en razón a una velocidad de
transformación del sustrato a producto traduciéndose en actividad enzimática. En este
informe se da a conocer el comportamiento de la enzima “Biolactasa NTL” de acuerdo a 2
diferentes temperaturas de operación y sustrato.
En la primera experiencia se da a conocer los efectos de la actividad y estabilidad de la
enzima. Se obtiene que a una mayor temperatura en el medio de reacción esta actividad
aumenta, donde a 55°C la actividad medida en leche semi-descremada y lactosa es de
8847 y 9987 [UI/mL] respectivamente. En cuanto a la perdida de estabilidad medida a los
10 minutos, se obtiene que a una temperatura de 45°C es de un 14,4%, mientras que a
temperatura de 55°C la perdida es mayor, alcanzando un 17%.
La puesta en marcha de un reactor enzimático en comparación con un reactor de cultivo
celular, a modalidad por lotes, su operación y control es más simple de acuerdo al manejo
de menores variables, ya que en este caso se monitorea factores como pH y temperatura.
Como segunda experiencia se evalúa el comportamiento del reactor en forma teórico-
práctica en relación al grado de conversión del sustrato lactosa a los monosacáridos,
glucosa y galactosa, alcanzando sólo un 52,9%, transcurrida 2,3 horas de operación del
reactor.
En la última experiencia, correspondiente a la elaboración de manjar, donde la hidrolisis
parcial de la lactosa resulta efectiva al momento de concentración de sólidos, pues por
medición en refractómetro, la leche tratada con enzima, alcanza la concentración
requerida de 60-70°Brix, en menor tiempo de operación. Proporcionando propiedades
organolépticas, que la leche sin tratamiento enzimático pierde durante el proceso, como lo
es el efecto nocivo de la cristalización de lactosa.
1
INDICE GENERAL
1. Introducción...............................................................................................................4
2. Materiales y métodos................................................................................................5
2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de miller (dns)......................5
2.2. Método de glucostat..................................................................................................5
2.3. Metodología analítica................................................................................................6
2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche.....................................................6
2.4. Metodología experimental.........................................................................................7
2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima..............................................................7
2.4.2. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando lactosa como sustrato). .7
2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato).....8
2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima...........................................................8
2.4.5. Puesta en marcha del reactor...................................................................................8
2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa................................................................................9
2.4.7. Fabricación del manjar..............................................................................................9
3. Resultados y discusiones........................................................................................10
3.1. Caracterización del preparado enzimático..............................................................10
3.1.1. Actividad enzimática................................................................................................10
3.1.2. Estabilidad enzimática.............................................................................................11
3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.....................................14
3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar..................................16
4. Conclusiones...........................................................................................................18
5. Bibliografía...............................................................................................................19
6. Anexos.....................................................................................................................20
2
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica con capacidad catalítica,
altamente específica y activa en condiciones moderadas, lo que hace favorable su uso
como catalizadores en la industria de procesos. Los progresos que están realizando
actualmente la ingeniería genética y la biotecnología permiten augurar un desarrollo cada
vez mayor del uso de las enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales
con la actividad deseada a precios razonables.
En el presente informe se muestra el trabajo realizado con el preparado enzimático
Biolactasa-NLT, que actúa de forma similar a la Lactasa en la leche, la cual es una
enzima producida de forma natural en el intestino delgado, y de forma artificial como
preparado enzimático, que juega un papel vital en el desdoblamiento de la lactosa,
mediante una reacción enzimática de hidrolisis, en sus dos componentes básicos: glucosa
y galactosa.
De forma experimental se contemplan tres prácticas de laboratorio, primero se determina
la actividad y la estabilidad al preparado enzimático comercial con el cual se está
trabajando, midiendo generación de producto por el método de glucostat utilizando leche
semi-descremada y lactosa como sustratos. Luego esta enzima se incuba de forma
soluble en un reactor por lotes, con leche semi-descremada como medio de reacción, bajo
condiciones ambientales controladas, donde se determina el grado de hidrólisis de la
leche en razón del tiempo (de lactosa a glucosa y galactosa), determinándose también la
generación de producto por el método de glucostat, y la concentración de lactosa por el
método de DNS.
Finalmente utilizando dos reactores por lotes en las mismas condiciones mencionadas
anteriormente, y cambiando solo que uno contiene la enzima y el otro no, y luego de un
determinado tiempo de reacción y grado de conversión, se lleva a cabo la elaboración de
manjar, hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%.
3
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Determinación de azucares reductores por la técnica de Miller (DNS)
El método DNS es una técnica colorimétrica que emplea 3,5-ácidodinitrosalicílico para la
hidrólisis de polisacáridos presentes en una muestra, seguido de la determinación
espectrofotométrica a 540 nm de los azúcares reductores.
Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.
Reacción del método
El acido 3,5-dinitrosalicilico en presencia de azúcares reductores se reduce a acido 3-
amino-5-dinitrosalicilico.
2.2. Método de Glucostat.
La glucosa oxidasa es una flavoproteina altamente específica que cataliza la oxidación de
la glucosa a β-D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en
extensión apreciable.
Reacción del método.
Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente
mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta
4
reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda
reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa
por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP),
que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un
colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:
Reacción del método.
Se podrían utilizar como aceptores de oxígeno benzidina, o-toluidina, o-dianisidina. Sin
embargo, la naturaleza carcinogénica de estos compuestos ha impulsado la búsqueda de
aceptores alternativos
2.3. Metodología analítica
2.3.1. Determinación del grado de hidrólisis de la leche.
Las muestras de leche (2 ml) se reciben en viales los cuales son colocados en un
baño con agua a 80°C para detener la reacción.
Se toman 0,2 ml de la muestras anterior, se le agrega 0,2 ml de una solución de
sulfato de zinc y 0,2 ml de hidróxido de bario, se centrifugan a 5000 rpm por 5
minutos y se retira el sobrenadante.
Se toman 0.1 ml del sobrenadante y se le adicionan 1 ml del reactivo enzimático
para determinar glucosa. Si fuese necesario la muestra de sobrenadante se debe
diluir con agua destilada antes de realizar la determinación de glucosa.
Se incuba la mezcla por 10 minutos a 37ºC y se determina la absorbancia a
505nm.
Se realiza un blanco utilizando tampón fosfato como muestra y una muestra
Standard con una solución de glucosa de 0.1 g/l
5
2.4. Metodología experimental2.4.1. Determinación de la actividad de la enzima.
Se adicionan 4 mL de una solución de Lactosa (100 g/L preparada en tampón
fosfato 0.1 M pH 6), en un tubo de ensayo.
Se incuba aproximadamente por 5 minutos a 45 °C o hasta que el sustrato alcance
la temperatura de reacción.
Adiciona 0.1 mL de la muestra enzimática, previamente diluida con tampón fosfato
0.1 M pH 6.
Agitar suavemente y dejar reaccionar por 5 minutos en un baño a 45 °C.
Cumplido el tiempo de reacción, tomar la solución y colocarla en un baño con agua
hirviendo, para detener la reacción.
Realizar un blanco de reacción sin enzima.
Determinar la concentración de glucosa mediante el metodo de glucostat.
Las experiencias se realizan por triplicado.
Se repite la experiencia a 55 °C.
Se repite la experiencia también utilizando leche semidescremada.
2.4.2. Determinación de la concentración de Glucosa (utilizando lactosa como sustrato)
En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL de la muestra de reacción enzimática
(inactivada).
Adicionar 1 mL del reactivo de determinación de glucosa.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón fosfato y 1 mL del reactivo, y
que también es incubado.
Interceptar en la curva de calibrado.
6
2.4.3. Determinación de la concentración de glucosa (utilizando leche como sustrato)
En un tubo de eppendorf colocar 0,2 mL de la muestra de reacción enzimática
(inactivada), adicionar sobre este 0,2 ml de una solución de sulfato de zinc y 0,2 ml
de hidróxido de bario, agitar en un vortex y luego centrifugar a 5000 rpm por 5
minutos.
En un tubo de eppendorf colocar 0.1 mL del sobrenadante anterior y adicionar 1
mL del reactivo de determinación de glucosa.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 505 nm.
Leer contra un blanco que lleva 0.1 mL de tampón y 1 mL del reactivo, y que
también es incubado.
Interceptar en la curva de calibrado.
2.4.4. Determinación de la estabilidad de la enzima.
Preparar 5 mL de una solución enzimática en tampón fosfato 0.1 M pH 6.
Tomar 0,5 mL de la muestra anterior y medir la actividad inicial (por triplicado),
como se describe previamente.
Incubar a 45ºC la solución enzimática restante (4,5 mL).
Cada 10 minutos tomar muestras de la solución enzimática (0,5 mL) y medir su
actividad enzimática residual, como se describe previamente.
Las experiencias deben ser realizadas por triplicado.
Repetir la experiencia a 55°C
2.4.5. Puesta en marcha del reactor.
Instalar el reactor.
Verificar las conexiones de las mangueras y el estado de los sellos.
Evaluar la potencia de agitación.
7
Instalar y calibrar el electrodo de pH.
Poner en marcha el sistema de calefacción.
Adicionar al reactor el medio de reacción que es la leche a hidrolizar.
Adicionar la cantidad de enzima lactasa, calculada previamente.
Instalar el termómetro para medir temperatura.
Poner en marcha el sistema de agitación que consiste en un agitador mecánico de
hélice.
Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.
2.4.6. Hidrólisis enzimática de lactosa.
Adicionar la leche descremada seleccionada y medir su pH.
Tomar una muestra para determinar la concentración de lactosa inicial (tiempo
cero).
Poner en marcha el sistema de agitación y calentamiento (45°C o 55°C).
Esperar que el sistema de reacción alcance la temperatura deseada.
Adicionar la enzima de acuerdo a la razón enzima sustrato entregada.
Mantener la leche bajo agitación suave y a temperatura constante durante el
tiempo necesario para alcanzar el grado de hidrólisis preestablecido.
Cada 10 minutos sacar muestras de 2 ml para determinar el grado de hidrólisis de la
lactosa.
2.4.7. Elaboración del manjar.
Una vez finalizada la etapa de hidrólisis se procede a la fabricación del manjar
Debemos:
Calentar la leche bajo agitación hasta 80ºC, en algún recipiente u olla, midiendo
temperatura constantemente.
Adicionar lentamente la cantidad de sacarosa de acuerdo a la dosificación
sugerida (200 g/l de leche).
Mantener bajo agitación hasta llegar a un contenido de sólidos de un 65-70%, el
que se determina mediante un refractómetro y corresponde a un valor de 70ºBrix.
8
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Caracterización del preparado enzimático
3.1.1. Actividad enzimática
En esta práctica se procede a determinar la actividad de la enzima a dos temperaturas,
45° y 55° Celsius, para el preparado enzimático comercial Biolactasa – NTL.
Como primera experiencia se procede a determinar la actividad de la enzima, la cual se
realiza adicionando 4 [ml] de una solución de Lactosa en un tubo de ensayo, el cual se
incuba por 5 minutos a 45°C, luego se procede a adicionar 0,1 [ml] de la muestra
enzimática previamente diluida con tampón fosfato, que en este caso la dilución aplicada
es de 1:1000, se agita suavemente y se deja reaccionar por 5 minutos en un baño
termostatizado a 45 °C. Una vez cumplido el tiempo, la muestra se lleva a un baño de
agua hirviendo para la detener la reacción. Finalmente se determina la glucosa existente
en la muestra mediante el método de glucostat.
La experiencia se realiza también para una muestra de leche descremada a la misma
temperatura (45°C) además de repetirla para 55°C junto a la de Lactosa.
Todas las muestras se realizan por triplicado. ¿ES NECESARIO QUE APAREZCA ACA
TAMBIEN?
Se desea analizar el comportamiento de la hidrólisis de la lactosa, cuantificando la
aparición de producto final en términos de concentración de glucosa. En la tabla siguiente
se muestran los datos obtenidos en laboratorio. (Ver Anexo D, Tabla D.5.)
Tabla 3.1: Datos obtenidos de actividad enzimática a dos temperaturas.
Actividad [UI/ml]Leche Lactosa
45 °C 9478,1 7894,655°C 8847,4 9987,4
De acuerdo a los datos presentados, se evidencia que el potencial catalítico de la enzima
aumenta en cuanto aumenta la temperatura del medio donde esta inserto el sustrato con
la enzima. Cabe señalar que al ser mayor esta temperatura cada vez más, llegará a un
punto donde esta última tiende a perder su conformación tridimensional por efectos
térmicos implicando que la conversión de sustrato a producto, en este caso la hidrólisis de
9
la lactosa a glucosa más galactosa, decrezcan notoriamente. Según bibliografía este
punto máximo de capacidad catalítica bordea los 60°, punto en que no conviene realizar
esta práctica pues su estabilidad también se ve afectada en gran medida.
Analizando la actividad en cuanto a tipo de sustrato, en este caso lactosa y leche semi-
descremada a concentraciones determinada de 100[g/L] y 45[g/L] respectivamente. Se
evidencia que la enzima mantuvo una mayor actividad para la leche, aunque lo esperado
es que la enzima al estar en un medio saturado de sustrato sea más activa. Se podría
pensar que se inhibe por sustrato, pero no es el caso pues de acuerdo a lo estudiado,
esta enzima se comporta de forma distinta, inhibiéndose posteriormente de forma
competitiva.
10
3.1.2. Estabilidad enzimática
Como segunda experiencia se procede a determinar la estabilidad de la enzima, la cual se
realiza preparando 5 [ml] de una solución enzimática en tampón fosfato, de la cual se
toma 0,5 [ml] y se procede a medir la actividad inicial, como se realizó en la experiencia
anterior. La solución enzimática sobrante se incuba en baño termostatizado a 45°C, luego
se toman muestras cada 10 minutos de esta solución y se mide su actividad enzimática
residual.
La experiencia se repite para una temperatura de 55 °C. Donde todas las muestras se
realizan por triplicado. NECESARIO DENUEVO?
Se entiende por actividad enzimática residual como la actividad a un determinado tiempo
de incubación. Y por actividad inicial la actividad a tiempo cero.
Los resultados serán expresados en actividad relativa, la cual se entiende por actividad
residual/actividad inicial.
A continuación se muestran los resultados obtenidos para la estabilidad de la enzima
respecto a la velocidad que se alcanza en la hidrólisis de la lactosa en el tiempo.
Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 45° Celsius.
45°C
Actividad enzimática
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/L] [%]
0 6,99 100
10 5,99 85,6
25 5,47 78,2
40 5,31 76,0
63 5,22 74,6
74 4,90 70,1
88 4,71 67,3
103 4,20 60,0
11
Tabla 3.2. Actividad enzimática residual y relativa a 55° Celsius.
55°C
Actividad enzimática
Tiempo Residual Relativa
[min] [UI/ml] [%]
0 6,47 100
10 5,37 83,0
25 5,08 78,6
40 4,87 75,4
63 4,75 73,5
74 4,44 68,7
103 3,71 57,4
Observando los porcentajes de actividad relativa existentes para cada temperatura, se
puede ver que la enzima pierde estabilidad a los pocos minutos, ejemplo de ello es a los
10 minutos la perdida de actividad para 45°C es de un 14,4% y para la temperatura de
55°C la perdida de actividad de un 17%. Esta pérdida mayor a 55°C se debe a que la
enzima es termolábil, por lo cual sufre una desnaturalización por causa de la temperatura
por lo cual decrece su actividad y ocurre en menor tiempo que a 45°C.
En la siguiente grafica (grafica 3.1) se muestra la comparación de la actividad a 45° y 55°
Celsius, para poder observar el comportamiento que tiene cada una.
De la gráfica siguiente se puede decir que la enzima a la temperatura de 45° Celsius es
más estable que la de 55°C por el comportamiento apreciado.
12
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
45°C
55°C
Tiempo [min]
Act
ivid
ad
rela
tiva
[%
]
Grafica 3.1. Comparación actividad relativa a dos temperaturas de reacción.
Las fluctuaciones que se aprecian en la Grafica 3.1. de la actividad enzimática a 55°C
pueden deberse al comportamiento normal de la enzima, ya que esta no permanece
estable dentro del medio.
13
3.2. Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.
Para comenzar esta experiencia de hidrólisis enzimática se calcula la cantidad de enzima
a agregar al reactor. De tal forma que presente una conversión del 99% en 2 horas de
operación en el reactor con leche semi-descremada (ver Anexo F), dando como resultado
a agregar 0,677 ml de enzima.
Luego de adicionar la enzima y dejar el reactor en las condiciones óptimas para operar, se
pone en marcha y se comienza experimentalmente la hidrólisis de la lactosa obteniendo el
grado de conversión de los azucares reductores en la hidrólisis enzimática, siendo los que
se muestran en el siguiente gráfico:
0 0.5 1 1.5 2 2.50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tiempo [h]
[%]
de
co
nv
ers
ión
Gráfica 3.2. Grado de conversión en el tiempo de operación del reactor, según
ANEXO F.
Para determinar la concentración de glucosa [g/L] se utiliza el método de glucostat, para
poder calcular los moles de glucosa, y para determinar la concentración de Lactosa [g/L]
se utiliza el método DNS, dando como resultado una concentración de lactosa inicial de
33,8 [g/L], valor que se utiliza para determinar el grado de conversión (moles de
glucosa/moles de lactosa) en función del tiempo, para poder llevar un seguimiento del
curso de la reacción. (Cálculos en ANEXO F).
14
Experimentalmente con 1 ml de enzima agregado al reactor, solo se logró un 52,9 % de
conversión en 2.3 horas, esperándose un 99% en 2 horas de operación, esto pudo haber
sucedido porque se agregó más enzima de lo que se debía, ya que al realizar los cálculos
la cantidad de enzima a adicionar era sólo de 0,677 ml, y como la enzima posee una
inhibición competitiva por producto, al haber más cantidad de enzima y ésta al estar en las
condiciones adecuadas para reaccionar, comenzó a hidrolizar la lactosa teniendo así
glucosa y galactosa, donde al pasar del tiempo y al haber más galactosa que lactosa está
la inhibió y no se alcanzó el porcentaje de conversión en el tiempo esperado.
15
3.3. Hidrólisis enzimática de lactosa para producción de manjar
Ésta práctica se desarrolla en dos etapas. Primero se realiza una hidrólisis parcial de
lactosa, donde se recomienda una disminución del 35%. Luego se procede a la
fabricación de manjar.
Con respecto al grado de hidrolisis de lactosa, se agrega 1 ml de enzima al reactor de
volumen de reacción de 2 litros, y temperatura de operación de 45°C, donde transcurrida
una hora de reacción se obtuvo un grado de hidrolisis de un 14%. Cabe mencionar que
para efectos de este cálculo se considera como concentración inicial de lactosa en la
leche 45 [g/L]. Luego se procede a la elaboración del manjar, y mediante un refractómetro
se determina el contenido de sólidos, finalizando con un valor de 70° Brix
aproximadamente.
Para comparar entre leche hidrolizada y sin hidrolizar, mantenidas a condiciones de
operación iguales. Se presenta el siguiente gráfico:
0 10 20 30 40 50 60 70 800
20
40
60
80
100
Chart Title
Tiempo [min]
Gra
do
s B
rix
[°B
rix]
Gráfico 3.3. Elaboración de manjar con leche hidrolizada y sin hidrolizar.
Medición de Grados Brix en el tiempo (Ver anexo E)
La leche hidrolizada presentó una mayor alza de grados Brix en menor tiempo que la
leche sin hidrolizar. Cabe mencionar que la medición de grados Brix representa la
concentración de azúcar presente en solución. Se mide con un refractómetro y la
concentración de azúcar es proporcional a su índice de refracción. Esto debido a que la
16
enzima Biolactasa – NTL hidroliza la lactosa, generando como producto monosacáridos
tales como glucosa y galactosa.
El mayor problema que presenta el “manjar” como anomalía de producto es la sobre-
estructuración de la lactosa y su consecuente cristalización como lactosa monohidratada.
Es por esto, que la hidrólisis enzimática constituye uno de los métodos más efectivos en
la elaboración de manjar, pues logra disminuir el efecto nocivo de la cristalización
excesiva de la lactosa sobre la estabilidad organoléptica del producto.
17
4. CONCLUSIONES
18
5. BIBLIOGRAFÍA
Acevedo F,Gentina Juan Carlos,Illanes A,2002,Fundamentos de Ingeniería
Bioquímica,1era edición, Capitulo 4 Cinética de Fermentaciones pp.94-118,Chile.
SENATI, Elaboración de manjar blanco, Documento de Consulta, 10 Junio de
2012, www.infolactea.com
19
6. ANEXOS
Anexo A
Curva calibrado DNS
Estándar glucosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla A.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,085 0,055 0,070
0,2 0,8 0,30 0,143 0,131 0,137
0,3 0,7 0,45 0,222 0,214 0,218
0,5 0,5 0,75 0,389 0,365 0,377
0,7 0,3 1,05 0,521 0,520 0,521
0,8 0,2 1,20 0,596 0,585 0,591
1,0 0,0 1,50 0,760 0,739 0,750
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.60.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
f(x) = 0.503824786324787 x − 0.00830769230769246R² = 0.999646970244746
Concentración glucosa [mg/ml]
Ab
sorb
anci
a [5
40 n
m]
Figura A.1. Curva de calibrado de glucosa por método DNS.
20
Anexo B
Curva calibrado para lactosa
Estándar lactosa: 1,5 [mg/ml]
Tabla B.1. Datos medidos de absorbancia a 540 [nm].
Vol. Estándar Vol. Tampón Conc. Glucosa Absorbancia [540 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
0,1 0,9 0,15 0,044 0,056 0,050
0,2 0,8 0,30 0,106 0,105 0,106
0,3 0,7 0,45 0,171 0,171 0,171
0,5 0,5 0,75 0,266 0,291 0,279
0,7 0,3 1,05 0,421 0,410 0,416
0,8 0,2 1,20 0,478 0,466 0,472
1 0 1,50 0,594 0,591 0,593
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.60.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
f(x) = 0.404159544159544 x − 0.013923076923077R² = 0.999331379259486
Concentración lactosa [mg/ml]
Ab
sorb
anci
a [5
40 n
m]
Figura B.1. Curva de calibrado para lactosa por método DNS
21
Anexo C
Curva de calibrado glucostat
Estándar glucosa: 0,25 [mg/ml]
Tabla C.1. Datos medidos de absorbancia a 505 [nm]
Volumen Absorbancia
Estánda
r Tampón Conc. Glucosa [505 nm]
[ml] [ml] [mg/ml] 1 2 Promedio
10 90 0,025 0,080 0,076 0,078
30 70 0,075 0,209 0,255 0,232
50 50 0,125 0,387 0,403 0,395
70 30 0,175 0,553 0,544 0,549
80 20 0,200 0,638 0,637 0,638
100 0 0,250 0,789 0,791 0,790
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.300.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
f(x) = 3.17795180722892 x − 0.00337650602409639R² = 0.999824841784365
Concentración de glucosa [mg/ml]
Ab
sorb
anci
a [5
05 n
m]
Figura C.1. Curva de calibrado para glucosa por método glucostat.
22
23
Anexo D
Determinación de actividad y estabilidad de la enzima.
Tabla D.1. Datos para estabilidad a 45° Celsius
Tiemp
o Absorbancia [nm]
Glucos
a
Actividad
enzimática
Activida
d
Muestr
a [min] a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T0 0
0,49
6
0,46
7
0,49
0 0,484 0,153 6,99 1,00
T1 10
0,33
8
0,44
5
0,46
0 0,414 0,131 5,99 0,856
T2 25
0,35
6
0,39
0
0,38
8 0,378 0,120 5,47 0,782
T3 40
0,31
8
0,39
4
0,39
0 0,367 0,117 5,31 0,760
T4 63
0,35
2
0,37
0
0,36
0 0,361 0,115 5,22 0,746
T5 74
0,36
0
0,34
0
0,31
5 0,338 0,108 4,90 0,701
T6 88
0,36
0
0,31
5
0,30
0 0,325 0,103 4,71 0,673
T7 103
0,27
1
0,28
8
0,30
9 0,289 0,0921 4,20 0,600
Tabla D.2. Datos para estabilidad a 55° Celsius
Tiemp
o Absorbancia [nm]
Glucos
a
Actividad
enzimática
Activida
d
Muestr
a [min] a b c Promedio [g/l] [UI] Relativa
T0 0
0,41
6
0,43
7
0,49
0 0,448 0,142 6,47 1,00
T1 10
0,36
2
0,36
3
0,38
8 0,371 0,118 5,37 0,830
24
T2 25 0,34
0,36
9
0,34
4 0,351 0,112 5,08 0,786
T3 40
0,33
4
0,30
1
0,37
5 0,337 0,107 4,87 0,754
T4 63
0,30
6
0,32
5
0,35
3 0,328 0,104 4,75 0,735
T5 74
0,29
4
0,30
0
0,32
5 0,306 0,097 4,44 0,687
T6 88
0,38
8 0,3
0,30
6 0,331 0,105 4,80 0,742
T7 103
0,20
4
0,31
3 0,25 0,256 0,0815 3,71 0,574
Tabla D.3. Actividad de la enzima en leche
Absorbancia
45°C 55°C
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,205 0,237 0,209 0,217 0,239 0,147 0,221 0,202
muestra 0,270 0,302 0,274 0,282 0,308 0,216 0,290 0,271
blanco 0,065 - - 0,065 0,0690 - - 0,0690
Tabla D.4. Actividad de la enzima en lactosa.
Absorbancia
45°C 55°C
25
1 2 3 Promedio 1 2 3 Promedio
muestra - blanco 0,52 0,535 0,587 0,547 0,696 0,652 0,732 0,693
muestra 0,542 0,557 0,609 0,569 0,743 0,699 0,779 0,740
blanco 0,0220 - - 0,0220 0,0470 - - 0,0470
Tabla D.5. Actividad enzimática enleche y lactosa a 45° y 55°Celsius
Temperatura Promedio Glucosa FD Actividad enzimatica[°C] abs [g/L] [UI]
Leche45
0,282 0,0694 3000 9478,1Lactosa 0,569 0,173 - 7894,8
Leche55
0,271 0,0647 3000 8847,4Lactosa 0,740 0,219 - 9985,8
26
Ejemplo calculo actividad enzimática:
Para la leche:
0,0694 [ gl ] ∙ 15 [min ] ∙
1 [molGlc ]180 [ g ] ∙
1 [mol Lac ]1 [molGlc ] ∙
106 [ μmol Lac ]1 [mol Lac ] ∙
4,1 [ml ]0,1 [ml ] ∙
1 [ l ]1000 [ml ] ∙1000=¿
¿3,159[ UImlenzima ] [¿ ] [ μmol
mlmin ]Agregando el factor de dilución de 3
3,159 ∙3=9478,1[ UIml ]
Para lactosa:
0,173 [ gl ]∙ 15 [min ] ∙
1 [molGlc ]180 [g ] ∙
1 [mol Lac ]1 [molGlc ] ∙
106 [μmol Lac ]1 [mol Lac ] ∙
4,1 [ml ]0,1 [ml ] ∙
1 [l ]100 [ml ] ∙1000=¿
¿7894,6 [ UImlenzima ] [¿ ] [ μmol
mlmin ]
27
Anexo E
Hidrolisis enzimática de lactosa para elaboración de manjar.
Tabla E.1. Medición de absorbancia por método glucostat y cálculo del
porcentaje de conversión de lactosa
GlucosaLactosa
Absorbancias [505 nm]
Tiemp
o [min]1 2 3 Prom
concentració
n glucosa
[g/L]
mol
glucos
a
% de
conversión
Concentració
n lactosa
[g/L]
mol
lactos
a
00,02
3
0,02
8
0,03
10,027 0,029 0,000 0,122 45,000 0,132
300,01
4
0,01
3
0,01
60,014 1,674 0,009 7,068
600,03
0
0,03
4
0,03
10,032 3,310 0,018 13,977
Utilizando curva de calibrado para determinación de glucosa por método glucotat se
obtiene la concentración de glucosa transcurrido 0, 30, 60 minutos de reacción. El cálculo
a tiempo 30 minutos se presenta a continuación:
Glucosa [ gL ]= (Absorbancia promedio+0,0034 )3,178
∗fd=(1,674+0,0034 )
3,178∗3=1,674 [ g
L]
El cálculo de porcentaje de conversión se realiza con los moles de glucosa y lactosa, lo
que se presenta a continuación:
28
%Conversi ó n=
Concentración glucosaMasamolar glucosaConcentación lactosaMasamolar lactosa
=
1,674[ gL]
180 [g
mol]
45 [ gL]
342[ gmol
]
∗100=7,07
Tabla E.2. Medición de grados Brix para leche hidrolizada y sin hidrolizar
Grados Brix [°Brix]
Tiempo
[min]
Leche
Sin Hidrolizar
Leche
Hidrolizada
0 26,2 27
15 28,2 29,2
30 32 37
40 42,6 45
50 60 66
60 63 84
75 71,4
29
Anexo F
Hidrólisis enzimática de la lactosa en un reactor por lotes.
Para una conversión del 99% en el reactor en 2 horas de operación, utilizando para esta
enzima los valores de parámetros cinéticos de Km 20 [g/L] y la velocidad máxima de
reacción se calculó según lo obtenido en el laboratorio anterior. La expresión que se
utilizó es:
Vm∗t
Km∗V rxn
=S0K m
∗X−ln (1−X )
X: Grado de Conversión, 99%, 0,99
S0: Sustrato inicial, 40 [g/L]
t: Tiempo, 120 [min]
Vrx: Volumen de reacción, 2 [L]
Km: constante de afinidad, 20 [g/L]
Vm: Velocidad máxima.
De esto calculamos Vm = 6418,3 UI.
El Vm obtenido, lo relacionamos con la actividad de la enzima en UI/ml enzima
(determinada en la experiencia anterior) de la siguiente forma:
9478,1 UI/ml enzima * X = 6418,3 UI
X = 0,677 ml de enzima.
Por lo que la cantidad de enzima a adicionar es 0,677 ml de enzima.
30
Determinación de lactosa por método de DNS.
Tabla F.1. Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 540 [nm].
Tiempo Absorbancia Lactosa Temperatura
[h] 1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd pH [°C]
00,179 0,157 0,168 0,450
25
33,7526,51 44
1,00,165 0,185
0,1750,423
30
38,0976,57 43
2,30,108 0,107
0,1080,230
60
41,4606,52 44
Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de Lactosa en [g/L], a través del tiempo:
Lactosa [g L]= (Abs+0 ,0139 )0 , 4042
∗fd
31
Determinación de glucosa por método de glucostat.
Tabla F.2: Absorbancias obtenidas a diferentes intervalos de tiempo a 505 [nm].
Tiempo Absorbancia Glucosa Porcentaje de
[h]1 2 Promedio [g/L] fd [g/L] *fd
mol glucosa
conversión
0 0,099 0,090 0,095 0,031 - 0,092 0,001 0,520
0,2 0,130 0,125 0,128 0,041 60 2,471 0,014 13,9
0,3 0,330 0,350 0,340 0,108 30 3,242 0,018 18,2
0,5 0,480 0,485 0,483 0,153 30 4,587 0,025 25,8
0,7 0,530 0,520 0,525 0,166 30 4,988 0,028 28,1
1,0 0,443 0,410 0,427 0,135 45 6,087 0,034 34,3
1,6 0,532 0,515 0,524 0,166 45 7,461 0,041 42,0
1,8 0,270 0,265 0,268 0,085 101 8,609 0,048 48,5
2,1 0,290 0,280 0,285 0,091 101 9,166 0,051 51,6
2,3 0,285 0,300 0,293 0,093 101 9,404 0,052 52,9
Mediante la siguiente ecuación se calculó la concentración de glucosa [g/L], a través del
tiempo:
Glucos a[g L]= (Abs+0 ,0034 )3 ,178
∗fd
Para calcular el grado de conversión en función del tiempo se utilizaron las siguientes
ecuaciones:
Grado de conversión = (moles de glucosa/moles de lactosa)
Por lo que la concentración de glucosa y lactosa en [g/L], se transformo a [moles/L] de la
siguiente forma:
32
Moles de lactosa =
Lactosa [g L]P .M . Lactosa
Ejemplo:
Moles de lactosa =
33 ,8[ g L]342[ gmol ] = 0,099 [mol/L]
Moles de glucosa =
Glucos a[g L]P .M .Glucos a
Ejemplo:
Moles de Glucosa =
0 ,092[g L]180[ gmol ]
=0 ,0005[molL]
Luego se realiza el cálculo para el grado de conversión:
Grado de conversión =
0 ,0005[molL]
0 ,099[molL]
=5,2∗10. 3
[%] de conversión= (5,2* 10-3)* 100 = 0,516
Todos los cálculos de conversión se realizaron con los [mol/L] de la concentración de
Lactosa inicial
33
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