Materia de Especialización
CEBI-E4b
Dra. M. Carolina Di Santo
Lab. Interdisciplinario de Dinámica Celular y
Nano-Herramientas, Departamento de Química
Biológica, FCEN-UBA, IQUIBICEN-CONICET
Carrera de
Especialización en
Biotecnología Industrial
(CEBI)
FCEyN -INTI
Ingeniería Metabólica
Clase 3: MCA (Análisis
del control Metabólico)
Análisis del control Metabólico
Sustrato
(S)
Enzima (E)
Producto
(P)
Niveles de Regulación
• La velocidad de reacción
• El Control Alostérico
dependerá del pH
de las concentraciones intracelulares del sustrato, del
producto y del cofactor
Enzimas claves son reguladas por
activadores e inhibidores alostéricos
• Regulación de la expresión genética la velocidad de síntesis de la enzima
• Regulación endócrina En los organismos multicelulares
Hormonas estimulan o inhiben actividades metabólicas específicas
IM
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Metabolito de
Interés
Objetivo:
Sobreproducción
Estrategia 1:
Desrregular la ruta directamente asociada con la síntesis del mismo
Estrategia I1:
Sobreexpresar los genes asociados a la síntesis del producto de interés
Fracasan a menudo
Concepto de Rigidez
Rend (mol P/mol S) =
Las distribuciones de flujos metabólicos en los puntos ramales o nodos del
metabolismo primario (glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ruta de
los fosfatos de pentosa) se redireccionan para asegurar un crecimiento
balanceado de la célula
M. Carolina Di Santo
Concepto de Rigidez
“Resistencia inherente del sistema de estudio particular a la
alteración de los flujos metabólicos”
------ “El rendimiento del producto es una función de las particiones o
distribuciones de flujos que ocurren en los nodos de la red”
Nodos flexibles
Nodos rígidos
N
Estrategia: Basta con inhibir el
feedback negativo por P o si P es el
precursor del metabolito deseado
se soluciona el problema. M. Carolina Di Santo
N
Nodo débilmente Rígido
Rama
dominante
Estrategia:
Es preciso retroinhibir la
rama dominante B
Rama
subordinada
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Nodo débilmente Rígido
Ejemplo en el ciclo de Krebs
Aún cuando la rama subordinada GLU
esté desrregulada (eliminanándose su
retroinhibición) o GLU sea el
precursor del producto deseado una
fracción significativa del flujo seguirá
entrando a la rama dominante y
limitará el Rendimiento
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Estrategia: el rendimiento del producto puede ser
mejorado si se atenúa la actividad enzimática de la rama
dominante ( SucCoA , en el ej.) y se amplifica la
actividad enzimática de la rama subordinada (GLU) lo
suficiente para que canalice el incremento del flujo.
Los nodos débilmente rígidos son
generalmente tratados con técnicas de
mutación-selección
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N
+ +
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Ejemplo en la glucólisis
Nodo fuertemente Rígido
Estrategia:
La eliminación de la
retroinhibición de ASP y el
bloqueo de la activación de
AcCoA podrían tener algún en
efecto en redireccionar el nodo
PEP
M. Carolina Di Santo
La determinación de la rigidez de los nodos se
realiza solamente por la vía experimental
Se proponen las modificaciones genéticas a
realizar en la célula para lograr el objetivo
de la sobreproducción del producto de
interés
M. Carolina Di Santo
M. Carolina Di Santo
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Estrategias en Ingeniería Metabólica
M. Carolina Di Santo
Experimentos de
sobreexpresión de
enzimas glucolíticas
Experimentos
en levaduras
Obj: aumentar
el flujo en la
producción de
etanol
Enzimas
Claves
Glucólisis
Extraído de Rafael Moreno-S´anchez et al., 2008
Journal of Biomedicine and Biotechnology
M. Carolina Di Santo
Extraído de Rafael Moreno-S´anchez et al., 2008
Journal of Biomedicine and Biotechnology
Flujo Hacia la Formación de Etanol
7 genes
Resultado: “unsuccessful”
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Estrategia de suprimir un inhibidor enzimático
Experimentos en levaduras,
Obj: aumentar el flujo en la producción de etanol
Enzima glucolítica HK -------------- Inhibición por Tre6P
Síntesis de Tre6P
G1P Tre6P
E1: Tre6P synthase
E2: Tre6P phosphatase
X Depleción de
genes
Las cepas mutantes, crecimiento celular defectivo y baja producción de
etanol al crecer con glucosa y fructosa en el MC
“Efecto Turbo” Desbalance en el consumo y la producción de ATP
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Importante Conclusión
“La sobreexpresión de un paso limitante o de
algunos pasos elegidos arbitrariamente lleva a la
redistribución del Control del flujo Metabólico y
entónces nuevos pasos del camino metabólico se
vuelven limitantes”
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Algunos casos de Éxito en la sobreexpresión de enzimas (SE)
SE (23 fold) de 5 genes de la síntesis de Triptofáno en Levaduras (9-fold)
SE de enzimas de síntesis de aa + enzimas mutadas para ser insensibles a
inhibición por producto (Sobreproducción de Trp, Ile, Lys, Val, Thr y
Trealosa y excreción de los metabolitos acelerada) en Corynebacterium
glutamicum
SE de enzimas de síntesis de Manitol (mannitol 1-phosphate
dehydrogenase and mannitol 1-phosphatase) aumento su producción 27-
50 % en cepas de Lactobacilos deficientes en LDH
SE de sorbitol-6P-dehydrogenase (250 fold) en LDH-deficient
Lactobacillus plantarum aumentó 5 veces las producción de Sorbitol
SE de PFK (14 fold) y LDH (3.5 times) aumentó 2-3 times el flujo de la
producción de a. láctico in Lactococcus lactis creciendo en maltosa, y
paralelamente disminuyeron los flujos hacia la producción de etanol y
ácidos secundarios
Extraído de Rafael Moreno-S´anchez et al., 2008
Journal of Biomedicine and Biotechnology M. Carolina Di Santo
Experimentos de disminución de actividad de enzimas glicolíticas (Downregulation of enzymes to manipulate metabolism)
En el 70 % de
los Tumores
11 Enzimas Glicolíticas (desde HK a LDH)
Varía según el tipo de tumor
-Los experimentos apuntan a disminuir la
expresión de factores de transcripción
asociados a las actividades enzimáticas-
Parásitos
Drug targets for chagas
-Búsqueda de Enzimas Glicolíticas con propiedades
estructurales, cinéticas o regulatorias únicas sin
contraparte en humanos para la síntesis de
inhibidores específicos-
F. Lakhdar-Ghazal, C. Blonski, M. Willson, P. Michels, and J. Perie, “Glycolysis and proteases as targets for the design of new anti-trypanosome drugs,” Current Topics in Medicinal
Chemistry, vol. 2, no. 5, pp. 439–456, 2002.
B. Altenberg and K. O. Greulich, “Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes,” Genomics, vol. 84, no. 6, pp. 1014–1020, 2004.
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Teoría del análisis del control Metabólico (MCA)
H. Kacser and J. A. Burns, “The control of flux” Symposia of
the Society for Experimental Biology, vol. 27, pp. 65–104, 1973.
H. Kacser and J. A. Burns, “Molecular democracy: who shares
the controls?” Biochemical Society Transactions, vol. 7, no. 5,
pp. 1149–1160, 1979.
MCA
Establece un marco teórico (matemático) que intenta explicar
los resultados obtenidos en experimentos de sobreexpresión
o supresión de enzimas en un camino metabólico complejo.
Ayuda a identificar estrategias experimentales para la
manipulación de un proceso en un organismo
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MCA
Se basa en determinar y cuantificar el grado de control de una
determinada enzima sobre un flujo metabólico o sobre la
concentración de los metabolitos implicados
La aplicación de este análisis intenta evitar los experimentos de
“prueba y error”
Evalúa la estructura del control de un determinado pathway
mediante el uso de algunos parámetros o coeficientes matemáticos
• Coeficiente de Control de Flujo
• Coeficiente de Control de Concentración
• Coeficiente de elasticidad
M. Carolina Di Santo
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• El control del flujo metabólico puede ser compartido entre
todas las enzimas que forman parte de una vía metabólica.
• Varias enzimas pueden ejercer un control significativo del flujo.
• La distribución del control del flujo puede variar al producirse
algún cambio en el estado metabólico de la célula o por
cambios en las condiciones experimentales.
• Es posible cuantificar la distribución del control mediante la
aplicación de una perturbación mientras se mide o estudia el
efecto en la variable de interés después de que el sistema ha
alcanzado un nuevo estado estacionario.
• Considera a los sistemas metabólicos como un todo, donde un
cambio en la actividad o en la concentración de una enzima o
de cualquier intermediario será transmitido a través de todo el
sistema
• Coeficiente de Control de Flujo
Es el grado de control que la velocidad (v) de una dada enzima (i ) ejerce sobre un
flujo (J)
Expresa cuanto varía el flujo metabólico J cuando se
aplica un cambio infinitesimal en la concentración de
la enzima i o en su actividad
• Si un pequeño cambio en
vi produce una variación
significativa en J
entónces la enzima i
ejerce un elevado control
sobre le flujo J
Factor de
normalizacion
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Teorema de la suma
El valor de cualquier coeficiente de control no es una propiedad individual
de una enzima per se; depende de las actividades de todas las otras
enzimas en la vía metabólica, y de sus coeficientes de control.
Si incluimos todas las enzimas y transportadores del camino
metabólico la sumatoria de todos los Coeficientes de Control
de Flujo es igual a 1
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Determinación experimental de Coeficientes de Control
• Adición de enzimas purificadas a homogeneizados de tejido o a
células y posterior cuantificación del cambio de flujo de la vía
medido por la velocidad de producción de algún metabolito
final
• Se debe cuantificar la actividad enzimática endógena y medir el
flujo antes y después de agregar enzima adicional
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• Coeficiente de elasticidad
Es el grado de sensibilidad de una dada enzima (i ) en respuesta a la variación
de alguno de sus ligandos (X= Sustrato, producto o inhibidor alostérico).
La sensibilidad se entiende como su habilidad para cambiar su Vi
• Coeficiente de Control de Concentración
Es el grado de control que una dada enzima (i ) ejerce sobre la concentración de
un metabolito (X)
Es una propiedad de la enzima a
diferencia de los otros coeficientes,
que expresan una propiedad del
sistema
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• Coeficiente de elasticidad
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Una enzima con bajo Coef. de elasticidad no puede
modificar su velocidad al cambiar las concentraciones de
S o P en consecuencia tiene un gran control del flujo
metabólico---Enzima Rígida –Nodo Rígido
Relación inversa o Teorema de la Conectividad
Alto CCF -------------Bajo CE
Bajo CCF--------------Alto CE
Existe una conexión entre el coeficiente de elasticidad y
entre el coeficiente de control de flujo
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Dificultad: Analizar una por una la ecuación de velocidad de cada
enzima en una ruta metabólica para predecir y explicar el comportamiento
del sistema como un todo.
Modelado de Pathways usando MCA (Modelado Cinético)
• Computing program
• Requires the knowledge of the stoichiometries, rate equations, and Keq
values of each reaction in the pathway (or the Vmax in the forward and
reverse reactions), as well as the intermediary concentrations reached under
a given steady state.
• Some currently used softwares are Copasi (http://www.copasi.org/tiki-
index.php) based on Gepasi (http://www.gepasi.org/); Metamodel; WinScamp,
and Jarnac (both available at http://www.sys-bio.org/); and PySCeS
(http://pysces.sourcesforge.net/). For other programs and links, go to
http://sbml.org/index.psp.
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• Es necesario fijar una concentración inicial de metabolito y
marcar como irreversible la remoción de los productos finales
• Excepto para los productos finales (cuya remoción es
irreversible) todo el resto de reacciones se consideran
reversibles, a pesar de que tengan gran Keq (si hay una
reacción irreversible bajo condiciones fisiológicas), luego una
ecuación de velocidad reversible que incluye el Keq es
suficiente para mantener la reacción prácticamente
irreversible.
• Se agrega información sobre los coeficientes de elasticidad
de las enzimas
• El modelado requiere la consideración de todos los datos
experimentales informados e interacciones que se han
descrito para los componentes de una vía específica
Modelado in sílico
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Modelado in sílico
- Resultados experimentales a veces difieren del modelo obtenido
Limitaciones
• Los parámetros cinéticos de la vía enzimática y transportadores y los
valores de Keq utilizados provienen de distintos grupos de
investigación, bajo diferentes condiciones experimentales y en
diferentes tipos de células
• Los ensayos cinéticos se llevan a cabo a bajas concentraciones de
enzimas descartando o ignorando interacciones proteína-proteína que
pueden ser relevantes)
• El pH y la temperatura puede no reflejar los valores fisiológicos
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Modelado de la glicólisis en
Ambos tipos celulares tienen una glicólisis muy activa y son muy
dependientes de este pathway para el suministro de ATP
Resultados:
En ambos casos las enzimas tradicionalmente consideradas
como limitantes del flujo HK, PFK y PyK no contribuyeron
preponderantemente al control del mismo mientras que el
principal control residía en GLUT (54 % en el parásito y
85-100 % en levaduras)
En levaduras HK ejercía algo del control total (15 %)
En parásitos enzimas NO alostéricas resultaron tener algo de distribución
en el control del flujo (ALDO,GAPDH,PGK)
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Ejemplos
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