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Inmovilizacin
de enzimas
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Inmovilizacin de enzimas
Se entiende por enzima inmovilizada (EI)aquella fsica/qumicamente asociada a, ocontenida en, un soporte/matriz noesencial para su actividad.
La inmovilizacin permite la utilizacin delas enzimas en procesos continuos, lo quepermite aumentar su productividad, bienpara facilitar la separacin del catalizadorde sus productos, simplificando la etapa
posterior de purificacin.
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Inmovilizacin de enzimas
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Inmovilizacin de enzimas
La utilizacin de enzimasinmovilizadas o no depender deuna evaluacin econmica de lasalternativas, donde se considerarn
datos de cintica y estabilidad,costo, propiedades fisicoqumicas,eficiencia de inmovilizacin y cargadel soporte.
Se torna evidente que si el costo deuna enzima es muy bajo, lafactibilidad de su utilizacin en formainmovilizada es poco probable.
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Inmovilizacin de enzimas
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Ejemplos de enzimas
inmovilizadas
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Soportes
Un soporte para inmovilizacin debe tener lassiguientes propiedades:
Elevada resistencia mecnica, qumica ybiolgica
Insolubilidad Hidrofilicidad
Elevada razn rea/volumen
Regenerabilidad
Bajo costo
Por regla, no todas estas propiedades estnsimultneamente presentes en undeterminado soporte: necesario evaluartodas las alternativas.
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Soportes
Los soportes orgnicos presentan:
Buena relacin rea/volumen
Muy flexibles en su configuracin
Bajo costo en algunos casos(residuos orgnicos)
Los soportes inorgnicos a su vezpresentan:
Mayor resistencia
Mayor regenerabilidad
Propiedades fsicas (ej. porosidad)controlables
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Sistemas de inmovilizacin
Las enzimas normalmente se inmovilizan atravs de algn tipo de interaccin entresus residuos aminoacdicos y el soporte.
Esto puede producir perdidas
considerables de actividad, alcomprometer los aminocidos en el, ovecinos del, sitio activo.
Para minimizar este problema seinmoviliza por intermedio de las molculas
de carbohidratos (enzimas glicoproteicas)o por la utilizacin de espaciadores.
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Sistemas de inmovilizacin
Los mtodos de inmovilizacin
se pueden dividir en:
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Sistemas de inmovilizacin
- Adsorcin
Este un mtodo simple de inmovilizacin,en el que el soporte es mezclado con lasenzimas, en condiciones apropiadas de pHy fuerza inica, dejados en contacto por un
determinado periodo y despus lavadopara remover la protena no adsorbida.
Este mtodo permite valores elevados decarga enzimtica (hasta 1 gramo deenzima por gramo de soporte).
Las interacciones implicadas sonresultantes de fuerzas de van der Waals,efectos hidrofbicos y de carga inica
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Sistemas de inmovilizacin
- Adsorcin
La seleccin del soporte pasa por sucapacidad de retener la enzima, sin dejardesorber nuevamente al seno del liquido,actividad enzimtica obtenida, posibilidad
de regeneracin y costo. Como ejemplos de soporte tenemos
materias orgnicas neutras (carbn activoy celulosa) y cargadas (quitina,intercambiadores aninicos y catinicos),
adems de materia inorgnica (bentonita,almina, vidrio y slica porosa).
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Sistemas de inmovilizacin
- Adsorcin
Ejemplo: preparacin de invertasa
inmovilizada
Soporte
DEAE-Sephadex
(intercambiador aninico)
CM-Sephadex
(intercambiador
catinico)
pH 2.5 0 100
pH 4.7 100 75
pH 7.0 100 34
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Sistemas de inmovilizacin
Enlace Covalente
La unin covalente se produce entregrupos funcionales del soporte ydeterminados grupos en los residuosaminoacdicos de la molcula enzimtica.
Estos grupos son reactivos segn lasiguiente orden:
-S- > -SH > -O-> -NH2> -COO-> -OH >> -NH3+
La reacciones qumicas que se puedenutilizar incluyen la acilacin, la alquilacin,
la diazotacin, la disulfuracin y laactivacin a travs de sales de metales detransicin.
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Sistemas de inmovilizacin
Enlace Covalente
Ejemplo de qumicos son la carbodiimida yel glutaraldedo.
Este ultimo es ampliamente utilizado para,adems de inmovilizar enzimas a soportes,
hacer el entrecruzamiento entre lasenzimas mezcladas con otras protenasinertes, hasta se producir agregadosinsolubles de tamao considerable.
Se puede combinar la adsorcin con la
formacin de enlaces covalente, con lo quese obtiene un aumento sustancial de laestabilidad del catalizador.
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Sistemas de inmovilizacin
Enlace Covalente
Como ejemplo tenemos la
inmovilizacin de invertasa en
quitina de camarn:
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Sistemas de inmovilizacin
Inclusin en matrices
En este mtodo, la enzima escontenida entre las cadenas de unared polimrica, lo suficientementecompacta para retener la enzima,pero capaz de permitir el libre flujode reactantes.
Esto tiene la implicacin que solo estil este tipo de inmovilizacincuando se pretende procesarsustratos y productos de muy bajopeso molecular.
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Sistemas de inmovilizacin
Inclusin en matrices
Este mtodo es ms adecuado parainmovilizar clulas, donde el alginatode calcio es ampliamente utilizado.
Otros ejemplos de matrices son losgeles de poliacrilamida y el almidn.
Estos presentan las desventajas de:ser no regenerables, una baja
estabilidad, tener pobrespropiedades mecnicas y severasrestricciones difusionales.
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Sistemas de inmovilizacin
Retencin por membranas
En este tipo de sistemas la enzimaspermanece libre el solucin, separada delmedio de reaccin por una membranaprotectora que solo permite el libre paso delos reactantes (sustrato/producto).
Como ejemplo, tenemos las membranasde ultrafiltracin y dilisis.
Otro mtodo consiste en lamicroencapsulacin, en la cual se produceuna reaccin de polimerizacin en la
superficie de las gotas de solucinenzimtica, dispersas en un solventeinmiscibles con agua, que produce unadelgada pelcula (nylon), casi sinrestricciones difusionales.
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Principales caractersticas de
los mtodos de inmovilizacin:
Caractersticas Adsorcin Enlace
covalente
Inclusin en
matrices
Retencin por
Membranas
Preparacin Simples dificil dificil Simples
Costo bajo elevado moderado elevado
Fuerza deligacin
variable fuerte flaca fuerte
Liberacin de
enzima
si no si no
Aplicabilidad amplia selectiva amplia Muy amplia
Problemas en la
utilizacin
elevados bajos elevados elevados
Efectos de la
matriz
si si si no
Restricciones
difucionales
no no si si
Proteccin
microbiana
no no si si
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Parmetros de inmovilizacin
Hay dos parmetros a considerar en la
inmovilizacin: el rendimiento de
inmovilizacin y la capacidad de carga del
soporte.
El rendimiento de inmovilizacin (RI) esdada por:
Algunos autores usan:
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Parmetros de inmovilizacin
Ejemplo del rendimiento de
inmovilizacin (%) de
glucoamilasa:
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Parmetros de inmovilizacin
La capacidad de carga (CC) del soporte sedefine como la actividad cargadaexpresada en el catalizador (EI) por unidadde peso seco del soporte (W), lo que viene
dada por:
Ambos los parmetros, EI y CC, estnfrecuentemente en compromiso, es decir,para aumentar la CC se tiene quesacrificar el EI y viceversa.
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