Inmunoensayos
Análisis forense
Servicio Medico Legal Santiago,Chile
Ethel Guerrero-Víctor Vidal
Test preliminares
Basados en la exactitud de los hallazgos analíticos, un procedimiento analítico puede ser considerado preliminar o método concluyente.
Los métodos de análisis preliminares son útiles para propósitos de “screening”
Test preliminares
Los ejemplos típicos de la categoría
de métodos preliminares donde no es necesaria la instrumentación son
Test de color y los inmunoensayos
de panel
Test preliminares
Métodos preliminares que requieren instrumentación
Radio inmunoensayo Enzimo inmunoensayo Fluorescencia polarizada Luminiscencia
El protocolo en el cual es usado un método preliminar, requiere de dos pasos cuando un resultado es positivo
Los presuntivos positivos tiene que ser testeado para una droga especifica y sus metabolitos por cromatografía gaseosa /espectrometría de masasSolo esas drogas pueden ser reportadas como positivas
Valores de corte
Si se utiliza un inapropiado valor de corte (cutoff)
Si es adoptado un bajo nivel de corte, habrá un exceso de resultados negativos analizados por GC/MS
Por el contrario si el cutoff es muy alto en el test preliminar, las muestras positivas pueden ser reportadas como negativa sin el proceso de GC/MS
Causando al proceso de testeo de drogas una técnica ineficiente
ADULTERANTES
La presencia de adulterante comunes y accesibles afectan la respuesta del común de los inmunoensayos .
El efecto del adulterante varía con la categorías de las drogas testeada y la metodología de inmunoesayos usados
Los adulterantes que causan interferencias significativas han sido revisada (1)
1.Cody J T, : Specimen adulteration in drug uranalysis ; forensic Sci Rew 2:63,90
Adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
amonio 5,10%
5,10,14%
10%
14%
RIA
RIA
FPIA
FPIA
COC
THC
BAR
THC
-
+/-
+/-
+/-
- -+++
+++/++
+++/+
2
2,3
3
4
Hidróxido de potasio
0.5,5M
5M
RIA
FPIA
THC
THC+/-
+/-
++++
+++
3
3
Bicarbonato
de sodio
40mg/ml
40mg/ml
EMIT
RIA
BAR
AMF,
BAR
THC
+
+/-
++
++
5
5
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
Blanqueador liq
12ul/ml
23UL/ML
24ul/ml
125ul
10%
5%
50%
5,10,50%
EMIT
EMIT
EMIT
EMIT
RIA
RIA
RIA
FPIA
THC
AMF
BAR OP
COC
BEN
THC OP
AMF
THC
THC
THC
+
+
+
+
-
+/-
+
- - - --- - -
-- - --- - -
-
+++++
----
6
6
6
6
2
2
3
3
adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
Vanish 1-10%
1-10%
5%
10%
RIA
RIA
RIA
FPIA
AMF,OP
THC
THC
THC
+
+
-
-
--
--
+++
+
2
2
2
4
Detergent iónico
10%
10-5%
10%
10%
RIA
RIA
FPIA
FPIA
COC
THC
BAR
THC
+
+/-
+/-
-
--
+
++
2
2
4
4
Vinagre 125ul/ml
0.5gotas/ml
50%
10%
EMIT
EMIT
RIA
FPIA
THC
THC
THC
THC
+
+
-
+
--
-f
++
---
6
7
3
4
adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
SAL 025%
50mgml
50mg/ml
50mg/ml
75mg/ml
50mg/ml
10%
50mg/ml
10%
EMIT
EMIT
EMIT
EMIT
THC
OP,BAR
AMF
COC
OPI
THC
BEN
BAR
A,BARCOP,THC
THC
BEN
THC
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
-f
----
----
----
----
----
--
--
--
7
8
9
9
6
6
2
9
4
AdulterantesI
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
Detergente y jabón liq
1got/10ml EMIT THC + -f 7
1got/5ml EMIT THC + -f 7
10% RIA THC +/- +++ 2
5-10% RIA THC + ---- 3
5-10% FPIA THC - ++ 3,4
10% FPIA BAR +/- ++++ 4
Adulterante II
cantidad método droga muestra efecto ref
12ul/ml EMIT THC + ---- 4
23ul/ml EMIT BAR + ---- 4
42ul/ml EMIT BEN + ---- 4
2% EMIT THC,BEN +/- ---- 9
2% EMIT BAR + ++ 9
2% RIA THC,BEN +/- ++++ 9
2% FPIA ANF,BAR,THC,BEN +/- +++ 9
sustancia cantidad método droga muestra efecto refFosfato 5%10%
5% 10%
10%
10%
10%
RIA
RIA
RIA
RIA
FPIA
COC
THC
AMF
BAR
OP
+
+/-
+/-
+/-
+
----
+++
++
+++
----
2
2
2
2
4
Etilen glicol 20%
20%
RIA
FPIA
THC
THC
+
+
+
+
9
9
2-propanol 20%
50%
20%
50%
RIA
RIA
FPIA
FPIA
THC
THC
THC
THC
+
+/-
+
+/-
+
+++
+
++
9
3
9
3
adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto refEtanol 20%
20%
RIA
FPIA
THC
THC
+
+
+
+
9
9
SANGRE 1gota/10ml
10%EMIT
FPIA
THC
THC
+
+/-
-
--
7
4
Ácido ascórbico
10%
10%
10%
RIA
RIA
FPIA
AF OP
THC
THC
THC
+
-
+
-
--f
2
2
3
7
adulterantes
sustancia cantidad método droga muestra efecto ref
Visine 125ul/ml
107ul/ml
10%
10%
EMIT
EMIT
RIA
FPIA
THC
BEN
THC
THC
+
+
+
+
----
---
--
--
6
6
2
7
Agua
oxigenada
6ul/ml
6ul/ml
6ul/ml
6ul/ml
EMIT
RIA
FPIA
FPIA
BEN
THC
BEN
THC
+
+
+/-
+
--
++
++
++
9
9
9
9
Adulterantes
La mayoría de los estudios analizados no han comparado los efectos de los adulterantes bajo las mismas condiciones
Dificulta hacer declaraciones generales concerniente a la robustez de una metodología sobre otra.
Sin embargo los ensayos de marihuana son más susceptibles a los efectos de los adulterantes
Realidad Médico Legal
En el departamento de laboratorios de Santiago se realizaron 6762 pericias toxicológicas
de los cuales 33% de estas pericias, no es para determinar la causa de muerte, sino para entregar más elementos a la investigación
1007 corresponden a informes sobre consumo de drogas de abuso
Análisis toxicológico
Grupo G1 tanatología
Diagnóstico de muerte por arma blanca, arma de fuego, golpe contundente y atropello
clínica y sexología forense pericias que corresponde a consumo de
drogas de abuso, psiquiatría forense
son sometidas a un rastreo de drogas de abuso incluyendo alcohol
Toma de decisión
La Administración de Justicia necesita de respuestas oportunas
debido a la gran cantidad de peritajes, se tomó la decisión de utilizar la técnica de inmunoanálisis, para el rastreo de drogas de abuso.
por GC-MS considerada actualmente el “gold standar” de la técnicas confirmatorias.
INMUNOENSAYOS
en la actualidad la mayoría de los laboratorios forenses realizan screening de drogas de abuso mediante técnicas de inmunoensayo debido que dichas técnicas presentan una elevada sensibilidad y son rápidas de usar (10)
Orina
La orina es el fluido biológico preferido para el análisis de uso de drogas ilegales y sus metabolitos.
Mientras la tendencia reciente ha sido aplicar tecnología de laboratorio a nuevos medios biológicos, debería tenerse en cuenta que el análisis de orina es una tecnología bien conocida en la que la mayoría de los problemas ha sido descubiertos y resueltos ,o por lo menos , definido.
Orina
La importante ventaja de la orina para los test de detección de drogas es que generalmente esta disponible en cantidad suficiente, es fácil de recoger y las drogas y sus metabolitos tienden a estar presente en concentraciones relativamente altas
Comparación de inmunoensayo y equivalencia
Cada analito de los paneles fue evaluado en comparación entre panel EMITR y CG/MS
Todos los resultados fueron confirmados por CG/MS
Opiáceos
PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL
(+) 7 0 7
(-) 1 70 71
TOTAL 8 87.5% 70 100% 78 98.7%
PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL
(+) 7 0 7
(-) 0 70 70
TOTAL 7 100% 70 100% 77 100%
Cocaína
PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL
(+) 29 4 33
(-) 0 67 67
TOTAL 29 100% 71 94.3% 100 96%
PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL
(+) 33 0 33
(-) 1 66 67
TOTAL 34 97% 66 100% 100 99.0%
Marihuana THC
PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL
(+) 32 0 32
(-) 6 63 69
TOTAL 38 84.21% 63 100% 101 98.4%
PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL
(+) 30 2 32
(-) 0 69 69
TOTAL 30 100% 71 98.3% 101 99%
ANFETAMINAS
PANEL EMIT(+) EMIT(-) TOTAL
(+) 25 0 25
(-) 3 70 73
TOTAL 28 89.2% 70 100% 98 97%
PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL
(+) 21 4 25
(-) 0 73 73
TOTAL 21100% 81 90.1% 98 96%
METANFETAMINAS
PANEL CG/MS(+) CG/MS(-) TOTAL
(+) 14 1 14
(-) 0 26 26
TOTAL 14 100% 27 97% 3098.3%
Cada método de screening tiene sus ventajas y desventajas
Unos u otros pueden ser más económico bajo diferentes series de circunstancias
Cada laboratorio tendrá que considerar esas circunstancias y elegir el método que le entregue el screening mas eficiente para un grupo de drogas en particular
SANGRE
La sangre es considerada como la muestra más útil para la identificación de drogas en análisis cuantitativo.
Dado que Las sustancias psicoactivas que se testean a menudo abandonan la sangre rápidamente esta es más útil para para la identificación del consumo reciente
Generalmente los valores de están en la sangre en concentraciones bajas, típicamente en un rango de 5ng (10-9) -5g(10-6)
sangre
Existen diversos procedimientos de detección de drogas en sangre para las drogas que se abusa más frecuentemente
La CL es una de las técnicas más empleadas, ya que es capaz de identificar al mismo tiempo diversos compuestos similares
La GC-MS por si misma permite el análisis de sangre pero se debe realizar una derivatización para incrementar la sensibilidad
inmunoensayo
Los inmunoensayo para las drogas de abuso están diseñados para la determinaciones en orina y en sangre,
Es con la sangre con lo que la versatilidad y la sensibilidad del RIA y posteriormente del ELISA son particularmente ventajosa
Sangre En1978 se publicó la aplicación de inmunoensayo a un
fluido distinto de la orina (10).desde esa fecha la comunidad toxicológica ha manifestado interés hacia la aplicación de los inmunoensayos a diversas muestras biológicas como; suero , sangre total, bilis, humor vítreo y tejidos (11)
La extensión de los inmunoensayos a las muestras de sangre conlleva la modificación de los procedimientos utilizados en el análisis de orina, por lo que las muestra de sangre total no pueden ser analizadas de forma directa.
Presentan altos niveles de absorbancia que interfieren con los medidas a realizar por los métodos inmunoenzimaticos, por lo que es necesario una preparación de la muestra antes de someterla al análisis(12)
sangre
Durante estos últimos meses en nuestro Laboratorio ha estado desarrollando un método para detectar presencia de de drogas de abuso en sangre mediante la aplicación de técnica de inmunoensayo
DROGAS DE ABUSO ESTUDIADAS
DROGA Cut-off (ng/mL)
Conc. Terap.
(ng/mL)
LD a pH 9
(ng/mL)
LD a pH 11
(ng/mL)
ANFETAMINA 1000 200-1000 NEG(1050) 230
BENZOILECG 300 44* 20 20
OXAZEPAM 300 230* 230 180
NORTRIPTIL 1000 50-250 408 408
FENOBARBIT 100 20000-40000 75 15
METAMFET 1000 500-1000 NEG (1020) 968
MORFINA 300 10-120 207 207
METADONA 300 100-450 293+- 43
MDMA 500 500-1000* 460+- 80
COCAINA 300 350 NEG(1200)
referencia
11.Vogel J, Hednett CN;Detection of drugs in blood, bile and tssues with an enzyme inmunoassay technique, J Anal Toxicol,:5;307-309;81
12.Lillsunde P, Michenson L, ForsstronT, KurteT SchultzE, Ariniemi K .. Comprehensive drug screening in blood for detecting abused drugs or drug potencially hazardous for traffic safety. Forensic Scien Innt,77,191-210
13. Screenig de drogas de abuso en sangre total mediante inmunoesayo enzimático CEDIA originalmente diseñados para el análisis de orina .aplicación en caso forense.R Garcia E Moreno T Soriano
referencias
2. Cody JT Schawarzhopff R:Impact of adulterants on RIA analysis of urine for drugs of abuse; J Anal. Toxicol13:277;89
3. Bronner W,Nyman P.,von Minden D.Dectectability of phencyandclidine 11-nor-9-tetrahidrocannabinol-9-carboxylic acid in adulteratedurineby
radioinmunoassay and flurescence polarization inmunoassay; J AnalToxicol 14:368;90
4. Schawarzhopff R, Cody JT; the effects of adulterrants agents on FPIAanalysisof urine drugs of abuse: J Anal Toxicol 17:14;93
5. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89
6. MIKKELSEN s l,Ash KO: Adulterants causingfalse negative in ilicite drugs testing: Clin Chem:34:2333;88
7. Schwarts R H, Hayden GF , RiddileM:Laboratory detection marijuana use ;Am J D iseases of Children 139:1093;85
8. Kim HJ ,Cerceo E: Interference by NaCl with the Emit method od f analysis for drugs of abuse; Clin Chem: 22:1935,76
9. WarnerM:Interference of common household chemicals i inmunoassay methods for drugsof abuse: Clin Chem35:648;89
10 iwerse-Bergman A, Schomolldt: Direct semiquantitative screening of drugs of abuse in serum and whole blood by means of CEDIA DAU urine inmunoassays; J Anal Toxicol, 23;247-256:99
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