LA CITOMETRIA DE FLUJO José Enrique O’Connor
Centro de Citometría y Citómica
Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad de Medicina
LA CELULA COMO UNIDAD FUNCIONAL DEL ORGANISMO
DIAGNOSTICO MORFOLOGICO
DIAGNOSTICO FUNCIONAL
LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO
DIAGNOSTICO BIOQUIMICO
DIAGNOSTICO GENOMICO
LA CELULA COMO UNIDAD INTEGRADORA DEL ORGANISMO
Se necesita una técnica de diagnóstico e investigación que permita:
• Integrar el nivel celular y molecular • Resolver la heterogeneidad celular de los tejidos • Detectar células muy infrecuentes
LA CELULA COMO UNIDAD DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO
CITOMETRIA DE FLUJO!!!!
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y
la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas
mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en
una y a gran velocidad frente a una o múltiples fuentes de iluminación.
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
• Proteínas extracelulares • Secuencias de ADN o ARN libres • Complejos inmunes circulantes
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
• Viriones individuales • Liposomas • Cromosomas aislados • Orgánulos aislados • Núcleos aislados
• Bacterias • Hongos unicelulares • Células humanas y animales • Protoplastos vegetales
• Hibridomas y fusiones celulares • Esferoides • Cuerpos embrioides • Larvas y embriones • Organismos pluricelulares
Método analítico que mide la emisión simultánea de múltiples fluorescencias y dispersión de luz
CITOMETRIA DE FLUJO
Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto óptimo de iluminación
Células o partículas biológicas individuales en suspensión
CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
• Partículas en suspensión individual que
• fluyen secuencialmente a través de
• un volumen iluminado donde
• dispersan luz y emiten fluorescencia
• que es dirigida y filtrada
• y convertida a valores digitales
• que se almacenan en un ordenador
Sistema de Fluidos
Sistema
Optico
Sistema Electrónico
FUNCIONAMIENTO DE UN CITOMETRO DE FLUJO
Inyección de la muestra y cámara de flujo
SISTEMA DE FLUIDOS
La base de la aplicación más común de la Citometría de Flujo es el uso de luz láser enfocada para iluminar células alineadas mediante un sistema de fluidos capaz de enfoque hidrodinámico
Cámara de Flujo
Fluorescencia
Laser enfocado
Líquido envolvente
SISTEMA DE FLUIDOS
Enfoque Hidrodinámico
SISTEMA DE FLUIDOS
Emisión de fluorescencia y bancada óptica: Epics XL
Lámparas: • Xenon, Mercurio Láser: • Refrigerados por aire:
•Ar, He-Ne • Refrigerados por agua:
•Ar, Kr, He-Cd • Diodos
Filtros: • Bloqueo • Dicroicos • Paso de Banda
SISTEMA OPTICO
Detección y Amplificación de señal: Transformación de señal luminosa en pulso eléctrico
SISTEMA ELECTRONICO
Eliminación de señales no deseadas: Discriminador
SISTEMA ELECTRONICO
Conversión Analógica-Digital
SISTEMA ELECTRONICO
Clasificación de las señales: Histograma de frecuencias
SISTEMA ELECTRONICO
Representación Logarítmica
Representación Lineal
Histogramas Dot-plots
SISTEMA INFORMATICO
Acotamiento de subpoblaciones de interés
SISTEMA INFORMATICO
Análisis Cinético
SISTEMA INFORMATICO
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
LA LUZ ES ENERGIA
Un fotón de energía hnEX es absorbido por la molécula fluorescente, creando un estado excitado (S’1)
Un fotón de energía hnEM es emitido para devolver la molécula fluorescente a su estado basal (S0)
El estado excitado tiene una duración de 1–10 × 10-9 segundos
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUORESCENCIA
1
2
3
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
LA LUZ ES COLOR
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
EL COLOR ES INFORMACION
FLUOROCROMOS, FLUOROFOROS Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUOROFORO
FLUOROCROMO
`PROPIEDAD BIOLOGICA
FLUOROCROMO
`PROPIEDAD BIOLOGICA
CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE MARCADORES FLUORESCENTES
• MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA
• MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL
• INDICADORES Y QUELANTES DE IONES
• SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES
• MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS
• FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
Excitación
Emisión
Longitud de onda
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
Ener
gía
Fluo
resc
encia
Estado Excitado
Molécula Dadora
PE
Molécula Aceptora Texas Red/Cy5/Cy7
Estado Basal
Transferencia de energía entre moléculas vecinas
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)
Wavelength
Absorbance
DONOR
Absorbance
Fluorescence Fluorescence ACCEPTOR
Molecule 1 Molecule 2
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA (FRET)
488 nm Argon
R-Phycoerythrin
The Visible Spectrum
Cy 5 675 nm
575 nm
760 nm
Cy 5.5
Cy 7
Fluorocromos en tándem Ficoeritrina + Cianinas
675 nm
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUOROCROMOS EN TANDEM: FICOERITRINA +CIANINAS
FITC 520
PE 575
ECD 615
PC5 665
LASER 488
<390 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620
620-750 >750
ultra- violeta azul verde amarillo naranja rojo infrarrojo violeta
LASER 630
APC 660
PC7 670
PE-AF610 615
APC-AF750 785
FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES
FLUOROCROMOS EN TANDEM PARA ROJO LEJANO
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Parámetros Citoplasmáticos
Parámetros Nucleares
Parámetros de Superficie
Parámetros Extracelulares
Moléculas de superficie
Enzimas
Enzimas
Enzimas
Proteinas
Proteinas
Pared celular
Proteinas secretadas
Moléculas de superficie
PARAMETROS ANALIZABLES POR CITOMETRIA DE FLUJO
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones clínicas de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES
APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las células de la sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO
Se realiza mediante el marcaje de antígenos de la membrana plasmática con anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparación de la muestra es mínimo en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de:
• Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) • Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido • Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos • Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa • Estimulación celular controlada: estudios de activación
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: METODOLOGIA
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar subpoblaciones específicas de células y determinar:
• Linaje celular
• Grado de maduración
• Grado de activación
• Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR
• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION
• Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas, síndromes linfoproliferativos y síndromes mielodisplásicos
• Detección de Enfermedad Mínima Residual
• Recuento absoluto de células CD34+ viables circulantes o en preparaciones celulares para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyéticos
• Diagnóstico de Hemoglobinuria Paroxística Nocturna
• Detección de fenotipo MDR (resistencia a fármacos) mediado por la glicoproteína-P
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMATOLOGIA
• Determinación de porcentaje y recuento absoluto de subpoblaciones linfocitarias T, B y NK en el seguimiento de inmunodeficiencias y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria
• Recuento absoluto de CD4+ y cociente CD4/CD8 en pacientes con VIH
• Detección de leucocitos activados en sangre periférica o en preparaciones celulares estimuladas
• Detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a células
• Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión
• Identificación de basófilos circulantes y detección de la desgranulación provocada por alergenos.
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INMUNOLOGIA
• Diagnóstico de deficiencias congénitas de glicoproteínas plaquetarias
• Detección ex vivo de plaquetas activadas circulantes in vivo
• Determinación de la reactividad plaquetaria ex vivo
• Cuantificación de receptores gpIIb/IIIa ocupados en la terapia antiagregante plaquetaria con antagonistas de gpIIb/IIIa
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: HEMOSTASIA
Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmática, citoplasma, vesículas o núcleo de las células de sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO
El proceso de preparación de la muestra requiere etapas de fijación y permeabilización para hacer accesibles los epitopos intracelulares. El proceso de preparación de la muestra es menor en la mayoría de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: • Concentración celular: líquidos biológicos (LCR, orina, etc.) • Dispersión celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido • Disgregación mecánica: tejidos linfoides, tejidos mucosos • Disgregación enzimática: tejidos sólidos, cultivos en monocapa • Estimulación celular controlada: estudios de activación • Bloqueo de la exportación de proteínas: proteínas de secreción (citoquinas)
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: METODOS
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis
permiten identificar:
• Linaje celular
• Grado de maduración
• Grado de activación
• Expresión de enzimas intracelulares
• Activación de enzimas intracelulares
• Expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular
• Expresión de antígenos relacionados con la apoptosis
• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: INFORMACION
• Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos
• Detección de Enfermedad Mínima Residual
• Detección de leucocitos activados en sangre o preparaciones celulares estimuladas
• Identificación de células productoras de citociinas
• Estudio de la polarización TH1/TH2/TH17 en linfocitos TH activados
• Identificación de células Tregs
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES
• Identificación de células en fase de proliferación
• Identificación de células tumorales en muestras complejas
• Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes en sangre y líquidos biológicos
• Estudio de la regulación del ciclo celular
• Identificación de células en apoptosis temprana o tardía
• Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES
• Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión leucocitarias
• Diagnóstico de anomalías congénitas en el citoesqueleto
• Diagnóstico de deficiencias congénitas de almacenamiento en plaquetas
• Identificación y cuantificación de eritrocitos con hemoglobina fetal en el adulto
DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES: APLICACIONES
Determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias y otras muestras de tejidos sólidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los ácidos nucleicos.
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO
La determinación de la ploidía o el ciclo celular, requieren el acceso estequiométrico del fluorocromo al núcleo celular, por lo que utilizan células fijadas y/o permeabilizadas, o suspensiones de núcleos aislados. Según la aplicación, el proceso de preparación de la muestra puede ser mínimo o requerir etapas de fijación y permeabilización. Los fluorocromos permeables de ácidos nucleicos penetran en células en fresco y permiten distinguir las células nucleadas en sangre entera u otras muestras hematológicas o detectar los ácidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras. Los fluorocromos impermeables de ácidos nucleicos se usan para detectar cambios en la permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: METODOLOGIA
Las técnicas de análisis basadas en el uso de fluorocromos específicos de ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten:
• Determinar la ploidía celular
• Detectar la presencia de células en proliferación
• Calcular la distribución en las fases del ciclo celular
• Identificar células nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos)
• Estimar el grado de maduración de precursores de eritrocitos y plaquetas
• Identificar y cuantificar células vivas, apoptóticas y necróticas
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: INFORMACION
• Pronóstico de leucemias, linfomas y síndromes linfoproliferativos.
• Cálculo de la ploidía en tumores sólidos y neoplasias hematológicas.
• Identificación de células en fases de proliferación en tumores sólidos y hematológicos.
• Determinación del ciclo celular en cultivos celulares in vitro.
• Determinación de la activación de linfocitos por mitógenos in vitro.
• Análisis de la proliferación de células tumorales en muestras complejas.
• Identificación y cuantificación de células tumorales circulantes
• Estudio de la regulación del ciclo celular
• Identificación de células en apoptosis temprana o tardía.
• Análisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis.
• Determinación de la viabilidad celular.
• Cuantificación de la actividad citotóxica de células NK y linfocitos CD8 activados.
• Identificación de reticulocitos y cálculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI).
• Identificación de plaquetas reticuladas y cálculo del Indice de Madurez Plaquetaria (PMI).
ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS: APLICACIONES
Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenómenos dinámicos o transitorios de la Bioquímica intracelular, cuya alteración sea causa, consecuencia o esté relacionada con situaciones fisiopatológicas de relevancia clínica.
+ADP
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: OBJETIVO
Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o partículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de: • Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes, reductoras • Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas • Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos • Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares
El proceso de preparación de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematología, el análisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulación mínima. En estudios de activación, se puede requerir una etapa de estimulación celular controlada.
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: METODOS
• Fluidez y permeabilidad de membrana
• Fagocitosis de microorganismos
• Transporte de partículas y moléculas solubles al interior de la célula
• Retención intracelular de moléculas
• Extrusión de sustratos a través de bombas de eflujo
• Potenciales de membrana plasmática y mitocondrial
• pH intracelular y su regulación dinámica
• Movimientos de iones a través de membrana o desde depósitos intracelulares,
• Generación de especies reactivas de oxígeno y óxido nítricoNiveles de glutátion
• Citoenzimología de flujo
• Síntesis de ADN
• Niveles de depósitos de lípidos metabólicos y estructurales
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: INFORMACION
• Identificación de blastos en el diagnóstico de leucemias.
• Seguimiento de la activación de leucocitos o plaquetas.
• Análisis del contenido en iones y la regulación del equilibrio iónico celular.
• Detección de la expresión de superficie procoagulante en plaquetas.
• Seguimiento y cuantificación de fagocitosis de microbios o partículas sintéticas.
• Análisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo").
• Análisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos.
• Análisis de la actividad proteolítica intracelular en células tumorales invasivas.
• Determinación del pH intracelular y su regulación.
• Análisis del estrés oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares.
• Identificación y cuantificación de células en apoptosis.
ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES: APLICACIONES
• Concepto de citometría de flujo
• Funcionamiento de un citómetro de flujo
• Fluorescencia y marcadores fluorescentes
• Parámetros analizables por citometría de flujo
• Aplicaciones de la citometria de flujo
• La citometría del futuro
ASPECTOS BASICOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
CITOLOGIA CITOMETRIA CITOMICA
• Aumento de complejidad técnica y de información generada • Demanda de mejor rendimiento y mayor capacidad de análisis de datos • Búsqueda de nuevos parámetros biológicos y nuevas áreas de aplicación
LA EVOLUCION DE LA CITOLOGIA ANALITICA
Flow Cytometry Confocal Microscopy
Laser Scanning Cytometry
High Content Analysis by Automated Bioimage Analysis
Multispectral Image-in-flow Cytometry
Mass-Spectrometry Flow Cytometry
NUEVA INSTRUMENTACION
Acoustic focusing cytometry uses ultrasound waves (over 2 MHz) to position cells into a single focused line along the central axis of a flow channel without high velocity or high volumetric sheath fluid, which can damage cells. The acoustic focusing actually concentrates the cells in the center of the fluid with sound energy. This means considerable flexibility in the sample concentration. The end result is more accurate and precise data. Acoustic focusing separates the alignment of cells from the particle flow rate. This allows to increase or decrease flow without disrupting the focus of cells in the capillary.
CITOMETRIA ACÚSTICA: AUMENTO DE VELOCIDAD
CITOMETRIA DE ALTO RENDIMIENTO: SCREENING
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS: MAYOR INFORMACION
• Cells are hydrodinamically focused into a core stream and orthogonally illuminated for both darkfield and fluorescence imaging. The cells are simultaneously transilluminated via a spectrally limited source for brightfield imaging.
• Light is collected from the cells with an imaging objective lens and is projected on a charge coupled detector(CCD).
• Prior to projection on the CCD, the light is passed through a spectral descomposition optical system that directs different spectral bands to different lateral positions across the detector.
CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN
200+ params/cell population statistics object values
Tabular Data
see every cell flexible viewing enhance & color tag populations virtual cell sort
Workspace uni + bivariates flexible gating click dot to view cell custom parameters
CITOMETRIA DE IMAGEN EN FLUJO: FORMA Y FUNCIÓN
http://www.uv.es/~oconnor/IES-JJ-2012
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