MORFOLOGIA SOMÁTICA NEURONAL NA AMÍGDALA MEDIAL DE SERES
HUMANOS
Autora: Denise Gomes Rodrigues Ferme Orientador: Prof. Dr. Alberto Antônio Rasia Filho
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito
para a obtenção do grau de Mestre
2010
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DEDICATÓRIA
______________________________
Aos meus pais Argeu e Arzony por terem me ensinado a persistência e
retidão para alcançar meus objetivos.
Ao meu marido Dionísio por ser incansável, trabalhar arduamente para
viabilizar e facilitar o andamento de meus estudos, além do companheirismo,
amizade e amor incondicional.
iiiII
AGRADECIMENTOS
______________________________
Ao meu orientador, Professor Doutor Alberto Antônio Rasia Filho,
pela confiança depositada em meu trabalho, pela orientação aos meus estudos
e elaboração desta dissertação.
À Aline Dall’Oglio, Doutoranda em Neurociências pela UFRGS, por
haver exercido, de fato, o papel de co-orientadora na elaboração desta
dissertação.
À Professora Helena Hubert Silva, professora da UFCSPA e Diretora
Técnico-Científica do DML/POA, por haver gentilmente aberto as portas
daquela instituição e haver favorecido o bom andamento do estudo naquele
ambiente.
Ao Professor Jorge Eduardo Moreira, professora da USP/Ribeirão
Preto, por haver cedido seu laboratório para realização de parte dos
experimentos que resultaram nas técnicas aqui descritas.
À Janaína Brusco, Doutoranda em Neurociências e Ciências do
Comportamento pela USP/Ribeirão Preto, por sua dedicação e apoio no
laboratório de Ribeirão Preto.
À Carmen Rocha, laboratório de Fisiologia da UFCSPA, por propiciar as
condições e materiais para o desenvolvimento dos experimentos.
Equipes de peritos e técnicos do DML.
Ao Professor Léder Leal Xavier, da PUCRS, pelo apoio técnico na
avaliação da técnica de Nissl.
Em especial aos familiares e responsáveis dos doadores que, mesmo
em um momento de pesar, compreenderam a dimensão do presente estudo.
III
SUMÁRIO
______________________________
DEDICATÓRIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II
AGRADECIMENTOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III
SUMÁRIO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .IV
RESUMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .V
ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .VII
ABREVIATURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX
LISTA DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XI
LISTA DE TABELAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XII
1. INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1.1. A AMÍGDALA HUMANA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
1.1.1. Histórico, Anatomia e Função Geral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2. Subdivisões da amígdala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1.3. Populações neuronais da amígdala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.2. GRUPO DE NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . .16
1.2.1. O Núcleo Medial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
1.2.1.1. Caracterização neuroquímica da amígdala medial. . . . .20
1.2.1.2. Citoarquitetura da amígdala medial. . . . . . . . . . . . . . . . .26
1. 3. MORFOLOGIA NEURONAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
2. REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
4. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
5. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
6. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
7. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
8. CONCLUSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
9. ANEXOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123
IV
RESUMO
______________________________
MORFOLOGIA SOMÁTICA NEURONAL NA AMÍGDALA MEDIAL
EM SERES HUMANOS
Palavras-chave: 1. Neurociências; 2. Amígdala humana; 3. Amígdala
medial; 4. Método de Golgi; 5. Método de Nissl-Tionina.
Introdução: A amígdala é uma estrutura neural no telencéfalo basal,
subcortical no lobo temporal anterior a médio, que compreende subnúcleos,
dentre eles o núcleo medial (Me). Até o momento não estão descritos os tipos
celulares nem as medidas básicas do soma neuronal locais em seres
humanos. Isto importa muito porque a descrição dos neurônios e células da glia
forma a base para a compreensão da funcionalidade de uma região nervosa
e/ou suas alterações anátomo-patológicas. Objetivos: Os objetivos do
presente estudo foram identificar o Me humano em cortes coronais seriados e
corados pela técnica da tionina, além de implantar e desenvolver uma técnica
de Golgi que pudesse ser aplicada para amostras de tecido nervoso
armazenadas em formol por um longo período. Com base nas imagens obtidas
pelas duas técnicas procurou-se descrever os tipos neuronais e quantificar
parâmetros morfológicos dos somas neuronais do Me de seres humanos.
Métodos: Amostras de lobo temporal foram obtidas durante necropsias após
autorização por parte de familiares ou responsáveis e com plenas condições
éticas de pesquisa. Após, o tecido foi submetido aos diferentes passos dos
métodos da tionina e de Golgi do tipo “single-section” anteriormente aplicados a
outros animais, mas agora adaptados para nossa espécie. Após a obtenção
das lâminas contendo cortes de tecido nervoso humano, estas foram
observadas em microscopia de luz para análise. Resultados: Os resultados da
técnica de tionina evidenciaram coloração celular adequada e homogênea no
Me humano. Os achados indicam que o Me de seres humanos apresenta
neurônios de tamanho médio a grande com corpos celulares que permitem sua
classificação como de neurônios multipolares de tipo “bitufted” ou estrelados.
Com a técnica de Golgi os neurônios e a glia aparecem bem impregnados,
V
confirmando e avançando os dados obtidos com a técnica da tionina. Dendritos
de comprimentos variados e com espinhos dendríticos, assim como astrócitos,
foram igualmente observados, alguns destes próximos a vasos sanguíneos.
Esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o estudo das células do
tecido nervoso humano com as mesmas vantagens descritas para o método de
Golgi “single-section”. Ou seja, é tecnicamente fácil, rápida, exequível, que
requer equipamentos mínimos e fornece dados confiáveis a partir de tecido
fixado em formaldeído por longo período. Em conjunto, os presentes dados
iniciam a descrição da morfologia neuronal do Me de seres humanos e
direciona futuros esforços para a elucidação plena de sua organização celular.
VI
ABSTRACT
______________________________
NEURONAL SOMATIC MORPHOLOGY IN THE HUMAN MEDIAL
AMYGDALA
Keywords: 1. Neuroscience; 2. Human amygdala; 3. Medial amygdala;
Golgi method; 4. Thionin-Nissl staining.
Introduction: The amygdala is a telencephalic area, located
subcortically in the anterior to the intermediate part of the temporal lobe,
composed by different nuclei, among which is the medial one (Me). Currently, it
is not described the cellular types nor the basic morphometric data for the cell
body in the human Me. This is a relevant issue since revealing the neurons and
glial cells located in a brain region impacts on the comprehension of its
functionality and/or pathological conditions. Objectives: The aims of the
present study were to identify the human Me in coronal serial sections stained
by the thionin method, to develop another Golgi method suitable for the human
nervous tissue long-term fixed in formol. Based on the results from these two
experimental approaches, it was intended to describe the cellular types in the
Me and to quantify morphological parameters of the cell bodies from this human
brain area. Methods: Samples of the temporal lobe were obtained during
necropsies after formal authorization by the relatives or legal representatives,
obeying all ethical conditions for research. Tissue was submitted to the
procedures of the thionin technique and the "single-section” Golgi method
previously employed to other species, but now adapted to our own one.
Following them, brain slices were observed under light microscopy for further
study. Results: Thionin results showed an homogeneous staining in the Me
and revealed multipolar neurons with medium to great size that can be
classified as bitufted or stellate ones. Based on the Golgi method outcomes,
neurons and glia appeared well impregnated, supporting and advancing the
findings obtained with the thionin technique. Dendrites with variable lengths and
with spines as well as astrocytes could be observed, these latter sometimes
VII
near blood vessels. The present contribution adds to the other techniques
available for the study of the human brain cellular composition with the same
advantages that were already reported for the "single-section" Golgi method.
That is, it is rapid, easy, suitable, needs minimal equipments and allows the
obtention of reliable data from formalin-fixed human nervous tissue.
Altoghether, the present results provide the initial description of the neuronal
morphology of the human Me and address future efforts of the complete
elucidation of the cellular organization of this brain area.
VIII
ABREVIATURAS
______________________________
AAA = amigdaloide anterior
ACE = enzima conversora de angiotensina
AChE = acetilcolinesterase
ACo = núcleo cortical anterior
AHi = área de transição amigdalohipocampal
AMe = amígdala medial
ASP = aspartato
BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro
BSTM = divisão medial do núcleo do leito da estria
BuChE = butirilcolinesterase
CAB = calbindina
CART = transcrito regulado por cocaína e anfetamina
Ce = amígdala central
ChAT = colinoacetiltransferase
CR = calretinina
CRF = fator liberador de corticotropina
CSpVCo = subdivisão superior caudal do núcleo cortical ventral
DMeP = amígdala medial posterior dorsal
GABA = ácido gama-aminobutírico
GLU = glutamato
icm = massas fibrosas intermediárias caudomediais
Me = núcleo medial
MeA = amígdala medial anterior
MeP = amígdala medial posterior
MExA = amígdala medial estendida
NADPH-d = nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase
NT = neurotensina
OT = ocitocina
PALL = paladina
PAV = parvalbumina
IX
PMAHi = haste rostrodorsal da divisão posteromedial da área
amigdalohipocampal
SLEAM = amígdala estendida sublenticular medial
SP = substância P
SpVCo = região superior do núcleo cortical ventral
TH = tirosina hidroxilase
VCo = núcleo ventral cortical
VMeP = amígdala medial posterior ventral
VP = vasopressina
X
LISTA DE FIGURAS
______________________________
Figura 1. Localização da amígdala e sua adjacência
do hipocampo, em secções em ressonância
magnética.
......................................3
Figura 2. Fotomicrografias de secções coronais
humanas coradas pela técnica de Nissl para
demonstrar a localização dos núcleos
amigdalianos.
...................................12
Figura 3. Desenho esquemático da ultraestrutura do
espinho dendrítico.
...................................30
Figura 4. Representação das diferentes morfologias
dos espinhos dendríticos.
...................................31
XI
LISTA DE TABELAS
______________________________
Tabela 1. Subdivisões da amígdala humana
baseadas em Sorvari (1997).
................................111
Tabela 2. Quadro demonstrando a equivalência na
nomenclatura das áreas amigdalianas de seres
humanos em diferentes estudos.
...............................13
Tabela 3. Principais peptídeos encontrados na
amígdala humana. 15
...............................15
Tabela 4. Aspectos relevantes da quimioarquitetura
da amígdala medial de seres humanos.
...............................22
XII
1. INTRODUÇÃO
______________________________
1.1. A AMÍGDALA HUMANA
1.1.1. Histórico, Anatomia e Função Geral
Em 1878, Paul Broca chamou a atenção para o fato de que, na
superfície medial do cérebro dos mamíferos, logo abaixo do córtex, existe uma
área contendo diversos núcleos de substância cinzenta, os quais ele
denominou de lobo límbico (do latim limbus, aquilo que circunda, bordo).
Johnston (1923) foi um dos pioneiros a descrever a morfologia de um grupo
desses núcleos em mamíferos que, devido a seu aspecto lembrar o formato de
uma amêndoa, recebeu o nome de “amígdala”. A maior parte das descrições
incipientes do papel do lobo límbico nas emoções foi desenvolvida apenas em
1937, quando James Papez descreveu seu modelo anatômico da emoção, o
que veio a ser chamado de circuito de Papez. Basicamente nesta mesma
época, Klüver e Bucy relataram experimentos de lesão do terço anterior do lobo
temporal e suas conseqüências comportamentais marcantes em macacos. Em
1952, Paul D. MacLean expandiu essas ideias para incluir estruturas adicionais
em um “sistema límbico” mais disperso, as quais se desenvolveram com a
emergência dos mamíferos inferiores. A amígdala era parte do sistema límbico
nos mamíferos (Ledoux, 1998).
A amígdala (ou complexo amigdaloide ou amigdaliano1) dos primatas é
um conglomerado relativamente grande de substância cinzenta que se
encontra na base do lobo temporal anteromedial de forma ventral ao núcleo
piriforme, do qual é separado pelo complexo neuronal magnocelular basal do
prosencéfalo, constituindo o núcleo basal de Meynert e grupos celulares
relacionados, ou a chamada substantia innominata sensu ampliori (de Olmos,
2004).
1 Embora a terminologia anatômica nomeie esta estrutura como “corpo amigdaloide” na parte
basilar do telencéfalo, por definição encontrada em dicionário da língua portuguesa, “amigdaliano” é algo relativo ou pertencente à amígdala, enquanto “amigdaloide” é semelhante à amígdala (Rasia-Filho e Hilbig, 2005).
1
Feixes de axônios separam a amígdala dos demais elementos do
prosencéfalo basal e fazem parte de radiações telencefálicas e
diencefalotegumentais, conectando bidirecionalmente a amígdala e outras
formações cinzentas do lobo temporal com aquelas do telencéfalo basal e
medial, do diencéfalo, da ponte e até mesmo da medula espinal (Gloor, 1997).
A amígdala não faz parte do córtex cerebral, mas é uma estrutura telencefálica
basal subcortical. De forma filogênica e ontogênica, ela ocupa a porção caudal
do assoalho do ventrículo lateral (Gloor, 1997; Figura 1).
A amígdala é uma estrutura que compreende subnúcleos situados no
lobo temporal, lateral ao hipotálamo e ventral ao estriado, no prosencéfalo
basal de mamíferos (Alheid et al., 1995). Em primatas, é caracterizada como
uma massa ovoide de substância cinzenta, localizada na porção terminal e
rostral da formação hipocampal (Alheid et al., 1995; de Olmos, 1999). A
amígdala humana está localizada no lobo temporal medial, a aproximadamente
1 cm da extremidade rostral do lobo temporal. Caudalmente ela se alinha ao
hipocampo. O comprimento completo rostrocaudal da amígdala é em torno de
10 mm. Sua largura mediolateral é de aproximadamente 18 mm em sua porção
maior, e sua altura dorsoventral máxima é de 15 mm (Sorvari, 1997).
Embora Völsch (1906, 1911) tivesse sido pioneiro, a primeira descrição
anatômica da amígdala humana foi publicada por Johnson (1923) e seu
trabalho influenciou investigações futuras, incluindo as de Brockhaus (1938),
Crosby e Humphrey (1941) e de Olmos (1990). Entretanto, a nomenclatura dos
núcleos amigdalianos sempre foi confusa pelo uso de terminologia múltipla
pelos diferentes investigadores. A amígdala humana não é tão bem estudada e
detalhada como a dos primatas ou de ratos. Em geral, a nomenclatura utilizada
para os macacos foi adaptada para a amígdala humana (Gloor, 1997;
Schumann & Amaral, 2005; Sorvari et al., 1995). Segundo Whalen (2009), a
amígdala pode ser dividida em 13 núcleos e áreas corticais em humanos e
primatas, com diferenças em subdivisões de acordo com a espécie.
2
Figura 1. Localização da amígdala e, em sua adjacência do hipocampo, em secções em ressonância magnética. (a) é uma reconstrução tridimensional de imagens onde as linhas indicam a posição do plano horizontal (b), plano sagital (c) e plano coronal (d). A flecha em (b) indica a linha ao longo da substância branca que separa a amígdala do putâmen; a flecha em (c) representa a substância branca que forma a fronteira ventral da amígdala rostral. A = amígdala; EC = córtex entorrinal; H = hipocampo; PU = putâmen; TLV = corno temporal do ventrículo lateral; WM = substância branca subamigdaloide. Reproduzido de Whalen & Phelps, 2009.
3
De Olmos (2004) reconhece na amígdala humana quatro grupos
nucleares maiores: complexo nuclear amigdaloide laterobasal, amígdala
estendida, amígdala olfatória superficial “tipo” cortical e formações
amigdaloides não classificáveis. O núcleo amigdaliano medial (Me), tema
principal desta dissertação, não parece receber projeções aferentes diretas do
bulbo olfatório principal em primatas. O Me é apenas uma parte de um grupo
nuclear maior, a amígdala medial estendida (MExA), que também compreende
a região sublenticular medial (SLEAM) e a divisão medial do núcleo intersticial
da estria terminal (BSTM).
A nomenclatura empregada por de Olmos está baseada no importante
estudo neuroanatômico comparativo de Johnston (1923). Da mesma forma, as
proteínas que se ligam ao cálcio parvalbumina, calretinina e calbindina mantêm
uma distribuição semelhante nas amígdalas humana e dos primatas, apenas
com diferenças sutis na frequência dos tipos celulares. Sorvari (1997) adota a
nomenclatura de Price et al. (1987), modificada por Amaral et al. (1992). Esse
autor divide a amígdala em núcleos profundos, superficiais e os demais. Os
núcleos profundos incluem os lateral, basal, basal acessório e paralaminar. Os
núcleos superficiais incluem: anterior, medial (Me) e cortical posterior, o córtex
periamigdaloide e o núcleo do trato olfatório lateral. Os demais núcleos incluem
o central, a área amigdaloide anterior, a área amígdalo-hipocampal e os
núcleos intercalados, como será descrito mais detalhadamente adiante no
texto.
Embora as fronteiras estruturais e funcionais da amígdala humana
permaneçam em debate, existe consenso que ela: (1) recebe informações de
diversas estruturas corticais e subcorticais; (2) desempenha um importante
papel na integração e na avaliação de estímulos sensoriais interoceptivos e
exteroceptivos e, desta forma, permite que o indivíduo atribua significados
emocionais aos eventos; (3) coordena respostas comportamentais e
emocionais adaptativas; e (4) modula o processamento cognitivo envolvendo
outras regiões do encéfalo (Whalen & Phelps, 2009).
Registros eletroencefalográficos na amígdala humana revelaram que ela
geralmente responde melhor a estímulos mais complexos, tais como a palavras
faladas, escritas ou sinalizadas do que a simples pulsos de luz ou estalidos.
Ainda, a estimulação elétrica da amígdala no decurso de neurocirurgias ou
4
crises epilépticas locais revelaram uma grande variedade de fenômenos,
incluindo-se alucinações de diversas formas, medo intenso acompanhado de
sensações viscerais (epigástricas e cardíacas) correlatas, sensação de dèja vu,
movimentos oro-mastigatórios e/ou perda de contato social momentânea
(Yakovlev, 1954; Sorvari, 1997). Lesões que comprometem a estrutura
amigdaliana em seres humanos parecem produzir uma diminuição na
agressividade, placidez, indiferença, alterações nos hábitos alimentares,
diminuição no desejo sexual, alteração nas respostas
simpáticas/parassimpáticas e distúrbio na modulação dos comportamentos
sociais emocionais (Sorvari, 1997; Gloor, 1997).
O papel potencial da amígdala em processos cognitivos e mnemônicos
sempre foi um assunto de interesse geral (Sorvari, 1997; Gloor, 1997). Em
estudos de lesão da amígdala nenhuma evidência até o momento demonstrou
convincentemente prejuízos, tais como déficits em inteligência, linguagem,
aprendizado ou de fluência verbal (Whalen & Phelps, 2009). Existe evidência
que sugere um papel modulador da amígdala na memória de longo prazo
envolvendo alguns neurotransmissores específicos, incluindo-se a
norepinefrina, os opioides e o GABA (Whalen & Phelps, 2009). Por outro lado,
maior atenção à atividade desta estrutura encefálica humana adveio de seu
envolvimento de forma importante em diversas doenças neurodegenerativas
em humanos, incluindo mal de Alzheimer, coreia de Huntington e lipofuscinose
ceroide neuronal (LCN) (de Olmos, 2004). Sabe-se que a amígdala pode se
apresentar alterada em diversas doenças neurológicas e psiquiátricas,
incluindo-se a epilepsia do lobo temporal, o mal de Alzheimer, a esquizofrenia,
o autismo e em casos de transtorno do estresse pós-traumático (de Olmos,
2004). Um achado comum post mortem em todas essas doenças é a perda
celular e gliose marcada ao longo da amígdala (Sorvari, 1997).
Baseado em estudos empregando ressonância magnética, identificou-se
a interrelação funcional entre a amígdala e as áreas corticais visuais do lobo
occipital, recebendo aferência diretamente do tálamo ou preferentemente da
via visual ventral para seu núcleo lateral. Tal informação sensorial que chega
ao núcleo lateral é avaliada para determinar se o estímulo ambiental é
conhecido ou é um risco potencial. Essa informação pode também ser avaliada
de outros modos (auditivo, por exemplo) que, de forma combinada, melhor
5
dimensionam a situação do ambiente e geram resposta mais rápida e precisa
(informações visuais e auditivas são segregadas ao núcleo lateral). Quando o
estímulo é sutil a porção ventral do núcleo lateral tem o potencial de integrar
outras modalidades para definir melhor o estímulo (à custa do atraso de um ou
mais processamentos sinápticos). Sendo de risco o estímulo percebido,
imediatamente surgem respostas neuroendócrinas, simpáticas/parassimpáticas
e comportamentais para gerar respostas de imobilidade (e evitar aproximação
com o estímulo aversivo), sobressalto (como indicação de medo) e atividades
motoras de esquiva ou luta contra o que for percebido (Gloor, 1997; de Olmos,
2004).
De fato, conexões com o neocórtex podem mediar atenção seletiva ao
estímulo de perigo, enquanto projeções para a área colinérgica basal do lobo
frontal podem aumentar a excitação generalizada cortical, em clara resposta de
alerta com direcionamento de atenção específica (Gloor, 1997; de Olmos,
2004). Projeções para diferentes núcleos do hipotálamo, especialmente
partindo do núcleo central, podem mobilizar componentes
simpático/parassimpático viscerais de uma resposta de fuga. Projeções para a
formação hipocampal podem amplificar memórias dos episódios perigosos
vivenciados, a fim de, pela avaliação das pistas sensoriais ambientais e sua
comparação com dados mnemônicos, tentar prevenir episódios semelhantes
no futuro ou, pelo menos, para modificar a emissão de comportamentos
quando o animal se sentir ameaçado novamente (Gloor, 1997; de Olmos,
2004). A amígdala pode também estar envolvida com o direcionamento da
atenção durante o aprendizado (Sorvari, 1997).
Já a principal informação cortical para o núcleo basal da amígdala vem
do córtex órbito-frontal, que pode fornecer informações sobre o contexto do
estímulo percebido. Assim, o núcleo basal recebe informações tanto do núcleo
lateral como de tal região cortical e age como um detector de coincidências. Se
um perigo potencial é detectado e o indivíduo estiver em uma situação perigosa
o núcleo basal ativa o núcleo central, o qual é o primeiro estágio na resposta do
medo. Se, por outro lado, o contexto não for perigoso o sinal de medo é filtrado
e impedido de atingir o núcleo central. É neste contexto que se tem descrito o
papel específico da amígdala nos processos de aprendizado e memória e seu
6
envolvimento na formação de respostas evocadas para estímulos
emocionalmente relevantes (Gloor, 1997; Whalen & Phelps, 2009).
Do ponto de vista filogenético, mesmo em roedores, evidências
envolvendo a amígdala no processamento emocional se baseiam em estudos
da resposta condicionada ao medo (Sorvari, 1997). Nesses casos, um estímulo
emocionalmente neutro, tal como som ou luz, é temporalmente associado
(condicionado) com um evento biologicamente adverso, como um choque
elétrico. O animal, quando posteriormente exposto apenas ao estímulo
condicionado, expressa os mesmos sinais de medo que quando exposto ao
choque. Esses sinais de medo incluem uma resposta aumentada de alerta com
vigília específica, aumento na frequência cardíaca e da pressão arterial,
taquipnéia, imobilização e, na ordem de horas, o desenvolvimento de úlceras
gástricas (Whalen & Phelps, 2009).
1.1.2. Subdivisões da amígdala
A organização morfológica básica da amígdala é a mesma em todos os
mamíferos, porém as principais mudanças que ocorrem filogeneticamente em
direção aos primatas, especialmente aos humanos, são os aumentos no
tamanho do grupo córtico-basolateral em contraste com o que ocorre no grupo
centro-medial (Sorvari, 1997; Gloor, 1997). Existe também uma redução no
volume do núcleo do trato olfatório lateral, o qual basicamente desaparece nos
símios e não é reconhecível/encontrado em seres humanos. Finalmente, uma
complexa rotação da amígdala em torno de um eixo anteroposterior e vertical
diferencia a amígdala dos primatas da dos mamíferos inferiores (de Olmos,
1990).
A amígdala humana pode ser dividida em alguns grupos nucleares
maiores, cada qual contendo diversos componentes (Sorvari, 1997; Gloor,
1997; Tabela 1; Figura 2). Por exemplo, a amígdala pode ser concebida como
tendo um grupo de núcleos basolateral e outro córtico-medial. Essa subdivisão,
introduzida por Humphrey em 1936, está baseada (embora com algumas
modificações) na terminologia de Johnston (1923). Com isso, o agrupamento
do núcleo cortical com os núcleos medial e central formou a subdivisão córtico-
7
medial da amígdala, enquanto o grupo basolateral incluía os núcleos basal,
lateral e basal acessório. Essa subdivisão se diferenciava daquela de Johnston,
que agrupava o núcleo cortical com os núcleos basal e lateral. O esquema de
Johnston de subdivisão serviu para os propostos por Stephan (1975) e Stephan
& Andy (1977), que também incluíam o núcleo cortical aos núcleos basolaterais
e, dessa forma, subdividiam a amígdala em grupos centro-medial e córtico-
basolateral. No esquema dos dois tanto as subdivisões centro-medial como
córtico-basolateral têm uma parte superficial que chega à superfície do cérebro
e outra parte profunda ou subcortical.
Brockhaus (1938) sugeriu que a amígdala haveria de conter dois
componentes de substância cinzenta cortical (ou pelo menos semelhante ao
córtex) e outro subjacente subcortical. A maior parte desses dois componentes
foi considerada como a amígdala propriamente dita, menos a área amigdaloide
anterior. O segundo menor componente que se posiciona de forma rostral à
amígdala imagina-se que esteja intimamente relacionado ao claustro e ao
córtex insular. Seu componente subcortical é representado pela área
amigdaliana anterior e parte do núcleo endopiriforme; seu componente cortical
em grande parte corresponde ao córtex periamigdaloide.
Outra subdivisão da amígdala foi proposta por de Olmos et al. (1985) e
pelo mesmo primeiro autor anos mais tarde (1990). Nessas, distinguem-se
quatro grupos nucleares principais: olfatório, medial, central e basolateral. O
grupo olfatório pode ainda ser subdividido em amígdala olfatória e amígdala
vomeronasal (de Olmos, 1990). Mesmo baseada em Sorvari (1997), a
subdivisão a ser empregada neste estudo acompanha aquela proposta por
Price et al. (1987), os quais subdividiram a amígdala em grupos basolateral,
córtico-medial e central. A principal diferença foi a exclusão da área
amigdaliana anterior do grupo central e sua inclusão entre as zonas
transicionais, bem como a diferente sobreposição (embora parcial) do córtex
periamigdaloide, o qual é incluído entre as zonas transicionais ao invés de
estar no grupo córtico-medial.
Não obstante, as terminologias utilizadas pelos diferentes autores
(Tabela 2) diferem e as fronteiras separando as subdivisões identificadas por
um determinado nome nem sempre são desenhadas por eles ao longo dos
mesmos bordos. Isso demonstra que as diferenças morfológicas entre os
8
vários núcleos que formam a amígdala são muitas vezes sutis. Para a definição
das subdivisões têm sido levadas em consideração diferenças
quimioarquitetônicas e as fronteiras criadas por sistemas de fibras mielinizadas
(Gloor, 1997). Por conta disso e outras considerações teóricas e experimentais,
persiste o debate sobre o que a amígdala realmente é, incluindo suas fronteiras
estruturais e funcionais (Swanson & Petrovich, 1998; de Olmos et al., 2004).
Desta forma, duas interpretações são possíveis. A primeira indica que a
amígdala não é nem uma unidade anatômica nem funcional. Já Aggleton e
Saunders (1997) afirmam que, embora exista considerável heterogeneidade
nas projeções de cada núcleo da amígdala, eles contêm intraconexões
múltiplas que de fato sustentam a noção de um todo coerente.
Embora matéria de debate ainda vigente (Alheid, 2003), dados obtidos
com ratos permitiram introduzir o termo “amígdala estendida” para se referir a
um grupo disperso de núcleos na área frontal basal e no estriado ventral que
parecem constituir uma extensão rostral dos núcleos central e medial (de
Olmos & Heimer, 1999). A amígdala estendida forma o leito de substância
cinzenta dos principais circuitos subcorticais da amígdala, núcleos da estria
terminal e o circuito ventral amigdalofugal. A porção dorsal da amígdala
estendida é muito reduzida no cérebro dos mamíferos até chegar a uma
minúscula e por vezes descontínua faixa de substância cinzenta que
acompanha a estria terminal em seu curso supracapsular ao longo do assoalho
do ventrículo lateral, o que representa a porção supracapsular do núcleo do
leito da estria terminal (Gloor, 1997). A extremidade ventral do núcleo do leito
parasseptal da estria terminal se funde com a área pré-óptica hipotalâmica e a
porção ventral da amígdala estendida (Gloor, 1997). A AMe, tema desta
dissertação, faz parte da amígdala estendida.
De fato, o núcleo central da amígdala e o Me constituem as extensões
posterior e inferior da chamada “amígdala estendida” (Alheid, 2003; de Olmos
& Heimer, 1999). Neurônios que são semelhantes àqueles encontrados nos
núcleos central e medial se estendem em uma direção superior e medial
através da região basal ventral do lobo frontal, permanecendo abaixo do núcleo
lentiforme enquanto seguem em direção à comissura anterior. Aqui uma
proporção desses neurônios se congrega para constituir parte do leito nuclear
da estria terminal. Esses neurônios então se estendem em uma direção
9
anterior, finalmente terminando no estriado ventral. Pela semelhança desses
neurônios com aqueles da amígdala central e do núcleo medial - em termos de
alvos de projeção e citoarquitetura e sua localização dentro da região basal
ventral do lobo frontal logo abaixo do núcleo lentiforme – esses neurônios
podem ser referidos como sendo da “amígdala estendida sublenticular” (de
Olmos & Heimer, 1999). Muito próximos e por vezes entremeados com esses
neurônios localizados imediatamente acima da extensão dorsal da amígdala
estão grandes neurônios corticopetais colinérgicos que formam o núcleo basal
de Meynert (Gloor, 1997).
Conforme anteriormente afirmado, a terminologia a seguir se baseia no
estudo de Sorvari (1997). A principal subdivisão da amígdala se faz entre a
amígdala principal ou temporal, localizada na porção média do lobo temporal, e
a amígdala estendida ou extratemporal, que ocupa o que corresponde ao
assoalho primordial do ventrículo lateral e partes da porção basal do lobo
frontal. O objeto de estudo desta dissertação será parte da amígdala estendida,
ou seja, a AMe humana.
10
Tabela 1. Subdivisões da amígdala humana baseadas em Sorvari (1997).
SUBDIVISÕES DA AMÍGDALA
NÚCLEOS BASOLATERAIS Núcleo lateral
Núcleo basal
Núcleo basal acessório
Núcleo paralaminar
NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS Núcleo do trato olfatório lateral*
Núcleo do trato olfatório acessório*
Núcleo cortical
Núcleo medial
NÚCLEOS CENTRAIS Núcleo central
Núcleo instersticial da estria terminal
Núcleos intercalados
ZONAS TRANSICIONAIS Área amigdaloide anterior
Zona amígdalo-estriatal
Área de transição córtico-amigdaloide
Córtex periamigdaloide
Área amígdalo-hipocampal
* Não demonstrável em humanos
11
Figura 2. Fotomicrografias de secções coronais humanas coradas pela técnica de Nissl para demonstrar a localização dos núcleos amigdalianos em plano rostral (a, b), intermediário (c, d) e caudal (e, f) ao longo de sua extensão. Abreviaturas: AAA = área amigdaloide anterior; AB = núcleo basal acessório; AHA = área amigdalohipocampal; B = núcleo basal; C = núcleo central; COa = núcleo cortical anterior; COp = núcleo cortical posterior; EC = córtex entorrinal; H = hipocampo; I = núcleos intercalados; L = núcleo lateral; M = núcleo medial; NLOT = núcleo do trato olfatório lateral; OT = trato óptico; PAC = córtex periamigdaloide; PL = núcleo paralaminar; PU = putâmen; SAS = sulco semianular; VC = claustro ventral. Reproduzido de Amaral & Schumann (2005).
12
Tabela 2. Quadro demonstrando a equivalência na nomenclatura das áreas amigdalianas de seres humanos em diferentes estudos. Reproduzido e adaptado de Sorvari et al. (1995).
SORVARI (1995) BROCKHAUS (1938) CROSBY E de OLMOS (1990) SIMS E
HUMPHREY (1941) WILLIAMS (1990)
Núcleo lateral Amygdaleum profundum Núcleo amigdaliano Núcleo amigdaliano lateral, sub- Núcleo lateral, subdivisões medial,
divisões lateral e medial laterale partes magno-, lateral núcleos dorsal anterior, ventral, dorsal, lateral e external
medio- parvo- e gracicelular e dorsomedial, dorso-lateral e
pars limitans intermediário e pars limitans (sub-
núcleo ventral dividido em partes
medial e lateral)
Núcleo basal Amygdaleum profundum Núcleo amigdaliano basal. Núcleo amigdaliano basolateral, Núcleo basal, subdivisões lateral e
divisões magnocelular, intermedium partes magno-, Pars lateralis e parte subnúcleos dorsal, dorsolateral, central
intermediária e parvicelular medio- e parvocelular profunda da pars medialis. intermediário, ventro-lateral e
ventro-medial
Núcleo acessório basal Amygdaleum profundum Núcleo acessório basal, pars Núcleo amigdaliano basomedial, Núcleo acessório basal, subdi-
divisões magnocelular, mediale partes magno-, médio-, lateralis e medialis subnúcleos dorsomedial, dorso- visões dorsal e ventral
parvicelular e ventro-medial misto- e densocelular (magno- lateral, ventromedial, ventrolateral e
dividida em lateral e medial). caudomedial
Núcleo paralaminar Partes granular, supragranular e Porção superficial da parte medial Divisão paralaminar do núcleo Subdivisão medial do núcleo basal
partes medial e lateral glomerular do amygdaleum do núcleo amigdaliano basal. basolateral na parte medial (dividida
profundum ventrale em partes anterior e posterior) e
parte glomerular.
Núcleo cortical anterior Parte rostral da área peri-supra- Parte anterior do núcleo medial. Divisão dorsal do núcleo amigda- Parte rostral do núcleo medial
amigdaliana intermediária e liano cortical anterior
ventral (parcialmente)
Núcleo medial Parte caudal da área peri-supra- Parte caudal do núcleo medial. Núcleo medial, divisões anterior e Núcleo medial
amigdaliana intermediária e posterior (dividido em partes dorsal
ventral (parcialmente) e ventral)
Núcleo cortical posterior Parte caudal da áreas periamigda- Incluído no núcleo amigdaliano Partes medial e dorsal do núcleo Parte caudal da subdivisão lateral
lianas oral dorsal e caudal cortical; parte caudal pode ser cortical caudal ventral; parte do núcleo cortical
incluída na área de transição póstero-medial da área amígdalo-
amígdalo-cortical. hipocampal
NLOT Camadas superficiais: parte rostral Incluído no núcleo amigdaliano Núcleo cortical anterior ventral; Parte rostral da subdivisão lateral
núcleo do trato olfativo da área periamigdaliana oral cortical e no próprio NLOT. parte rostral do núcleo cortical do núcleo cortical
lateral dorsal e área peri-supra-amigda- ventral
liana ventral. Camadas profundas:
incluídas no amygdaleum
superficiale
AHA Partes do amygdaleum Incluída no núcleo amigdaliano Parte ântero-lateral da área Incluída na subdivisão medial
área amigdalo-hipocampal superficiale intermediária e cortical. amígdalo-hipocampal; partes do núcleo cortical
caudal ventral e lateral do núcleo
cortical caudal ventral
PAC1 Incluída no claustrocortex Incluído no núcleo amigdaliano Incluído na área de transição Incluído no córtex piriforme ou no
preamygdaleus cortical. amígdalo-piriforme núcleo cortical
PAC3 Camadas superficiais: incluídas na Incluído no núcleo amigdaliano Incluído no núcleo cortical Incluído na subdivisão medial
área periamigdaliana oral ventral. cortical. ventral do núcleo cortical
Camadas profundas: incluídas na
amygdaleum superficiale
PACo Incluído no claustrocortex Incluído tanto na área de transição Incluído na área de transição Incluído no córtex piriforme
preamygdaleus amígdalo-cortical como no lobo amígdalo-piriforme
piriforme.
PACs Camadas superficiais: incluídas na Incluído no núcleo amigdaliano Parte pôstero-medial da área de Incluído na subdivisão medial do
área periamigdaliana oral ventral. cortical, exceto a parte ventral do transição amígdalo-piriforme núcleo cortical, exceto a parte
Camadas profundas: incluídas na PACs, que forma a área de ventral, incluída na área de
amygdaleum superficiale. Parte transição amígdalo-cortical. transição amígdalo-cortical
ventral do PACs incluída na área
preamigdaliana
Núcleo central Incluído no griseum supra- Núcleo central Núcleo central, divisão lateral Núcleo central, subdivisões medial
divisões lateral e medial amygdaleum (partes apical, central, capsular e e lateral, com 3 grupos satélites:
paracapsular), divisão medial (partes ventro-lateral, dorso-lateral e
dorsal e ventral) intersticial
Área amigdaliana anterior Incluídos no claustro Incluída na área amigdaliana Incluída na área amigdaliana
preamigdaliano anterior. anterior
Núcleos intercalados Massas celulares intercaladas Massas celulares intercaladas Grupos celulares intercalados
13
1.1.3. Populações neuronais da amígdala
Em seu estudo de 1997, Sorvari baseia-se nas observações de Braak e
Braak (1983), que permitiram classificar os neurônios da amígdala humana em
três classes, a saber:
(a) Neurônios da classe I são células com corpo em forma piramidal com
um dendrito apical espesso e dois ou mais dendritos basais mais
finos. Os dendritos secundários e suas ramificações mais distais
apresentam espinhos. Essas células piramidais são consideradas as
principais células da amígdala. Assim como suas contrapartes no
neocórtex, as células piramidais amigdalianas são imunorreativas
para os neurotransmissores excitatórios glutamato e aspartato.
(b) Neurônios da classe II são caracterizados por terem dendritos com
espinhos esparsos. Morfologicamente, essas células são ditas “não
piramidais”, algumas com aspecto de interneurônios, embora
heterogêneas. Elas podem ter corpos multipolares arredondados,
ovóides ou angulares, com muitos dendritos emanando em várias
direções, ou podem ter corpos fusiformes, de tipo “bitufted” de onde
emanam dois dendritos opostos primários2.
(c) Neurônios da classe III são células morfologicamente similares às da
classe II, porém sem depósitos de lipofuscina.
Quanto à quimioarquitetura neuronal amigdaliana, a qual serviu para
auxiliar na determinação dos seus núcleos, a maioria dos peptídeos já
encontrados no sistema nervoso central dos mamíferos é particularmente
abundante no núcleo central e no leito do núcleo da estria terminal. Conforme a
Tabela 3, os seguintes peptídeos foram identificados na amígdala (inclusive na
amígdala estendida), tanto no pericário como nas terminações neuronais.
Notavelmente, a amígdala basolateral é mais semelhante ao córtex, uma
vez que seus neurônios principais semelhantes aos piramidais contêm
2 Neurônios com aspecto dendrítico como “bitufted” não têm uma tradução adequada para o
português, razão pela qual a palavra em inglês é usada aqui. “Bipenachado” é o termo mais próximo em português, embora ainda seu emprego não seja consagrado nem a melhor representação para o que significa a imagem dos ramos dendríticos. “Bipolar” não pode ser empregado neste caso porque se usa para classificação quando um corpo celular dá origem a um dendrito de um pólo e, a partir do outro, um axônio. Não é o que corresponde aos neurônios estudados.
14
aminoácidos excitatórios, enquanto os interneurônios não piramidais são
amplamente GABAérgicos com muitos deles contendo peptídeos. Essas
distinções não podem ser feitas para o núcleo central e o Me para o núcleo do
leito da estria terminal, onde muitos, se não a maioria, dos neurônios de
projeção contêm peptídeos. Esses achados dão sustentação à noção de
Carlsen (1988) sobre a amígdala basolateral, uma estrutura semelhante ao
córtex. Em contraste, o núcleo central, o Me e o núcleo intersticial da estria
terminal são semelhantes a certas partes do hipotálamo por apresentarem
semelhanças com essa estrutura e outros grupos neuronais que são os
principais componentes subcorticais daquilo que Nieuwenhuys (1985) chama
de “centro do neuroeixo” no que diz respeito à riqueza e grande densidade de
substâncias neuroativas diferentes dos transmissores químicos clássicos em
seus corpos celulares, bem como seus circuitos de projeção.
Tabela 3. Principais peptídeos encontrados na amígdala humana, conforme Gloor (1997).
Colecistoquinina (CCK)
Polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP)
Somatostatina (SS)
Neuropeptídeo Y (NPY)
Neurotensina (NT)
Substância P (SP)
Galanina (GAL)
Fator liberador corticotrópico (CRF)
Peptídeo calcitonina relacionado ao gene (CGRP)
Vasopressina (VP)
Angiotensina II (ANG-II)
Polipeptídeo natriurético atrial (ANP)
Hormônio tireotrópico (TTH)
Hormônio luteinizante relacionado a hormônio (LHRH)
Bombesina (BOM)
Peptídeos opioides
15
Além de peptídeos, a substância cinzenta amigdaloide também contém
grupos de neurônios que concentram hormônios esteróides, especialmente
estrogênios e corticosteroides (Gloor, 1997).
1.2. GRUPO DE NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS
Esse grupo de núcleos constitui uma porção menor da substância
cinzenta amigdaliana que o grupo basolateral, especialmente no cérebro
humano. Os núcleos corticomediais de mamíferos são quatro: o núcleo do trato
olfatório lateral, o núcleo do trato olfatório acessório, o núcleo cortical e o
núcleo medial (Gloor, 1997). É difícil precisar seu tamanho comparativo, pois
em estudos de Stephan e cols. (1987) seu maior componente, o núcleo cortical,
foi anexado ao grupo de núcleos basolaterais dentro do grupo córtico-
basolateral, o qual é, num todo, mais desenvolvido na evolução dos primatas.
O grupo de núcleos corticomediais em mamíferos contém aquela parte
da substância cinzenta amigdaliana que é homóloga à amígdala primordial dos
anfíbios, o trato olfatório acessório, o qual media aferência quimiossensorial
preferentemente de feromônios e que se originam no órgão vomeronasal
(Gloor, 1997). Essa porção não está, porém, presente no cérebro humano pós-
natal, embora possa haver estado presente no embrião. Apenas uma parte dos
núcleos corticomediais, especialmente o Me, uma subdivisão do núcleo cortical
(o núcleo cortical posteromedial de roedores) e o núcleo do trato olfatório
acessório recebem sinais vomeronasais em mamíferos que possuem tal órgão
funcional (Winans e Scalia, 1970; Scalia e Winans, 1975; de Olmos et al.,
1978). Consequentemente, essa subdivisão do grupo de núcleos
corticomediais foi chamada “amígdala vomeronasal”. Apesar da ausência de
um órgão vomeronasal funcional nitidamente encontrável, esses núcleos
encefalina (ENK)
dinorfina (DYN)
β-endorfina (BE)
opiomelacortina (OPMC)
16
persistem nos cérebros de símios e humanos e, aparentemente, não
regrediram, à exceção do núcleo do trato olfatório acessório, o qual é
inexistente nessas formas.
O remanescente do grupo de núcleos corticomediais recebe os
principais sinais olfatórios pela via do trato olfatório lateral. As regiões que
recebem esses sinais olfatórios, nos mamíferos que possuem um órgão
vomeronasal, correspondem a parte do núcleo cortical e, nos roedores, aos
núcleos corticais anterior e posterior do trato olfatório lateral. Esses núcleos
foram, então, chamados de “amígdala olfatória”. Seus homólogos existem nos
cérebros de símios e de humanos, com a exceção do núcleo do trato olfatório
lateral, o qual não pode ser demonstrado na nossa espécie (de Olmos, 1990) e
tem sua demonstração apenas questionável em símios (Price et al., 1987). Em
símios e humanos, uma subdivisão entre uma amígdala “olfatória” e outra
“vomeronasal” pode ainda persistir, já que pelo menos parte do Me e uma
porção do núcleo cortical homólogos àqueles que recebem sinais
vomeronasais em roedores podem representar a homologia em símios e
humanos para a amígdala vomeronasal (de Olmos, 1990; Price et al., 1987).
Além de ser uma porção principal da amígdala para receber sinais
olfatórios e vomeronasais, o grupo de núcleos corticomediais ocupa uma
posição superficial e faz parte da superfície do cérebro, na porção do úncus
representada pelo giro semilunar e muito próximo do sulco entorrinal. Assim,
não surpreende que essa parte da amígdala tenha sido comparada ao córtex
periamigdaloide por alguns investigadores, especialmente Rose (1926, 1927a),
que a classificou como um exemplo de córtex “semiparietinus”. O principal
argumento para classificá-la como córtex, além de sua posição na superfície
cerebral, é que apresenta uma camada celular que lembra a da superfície
cortical, camada molecular. Existem, entretanto, outras estruturas de
substância cinzenta superficiais não-corticais telencefálicas que apresentam
uma camada similar a esta amigdaliana, como o tubérculo olfatório e parte do
septo pré-comissural e que, ainda assim, não são consideradas córtex.
Brockhaus (1938) considerou as camadas mais superficiais dos núcleos
cortical e medial (isto é, as camadas celulares molecular e a imediatamente
subjacente) como parte do semicortex amygdaleus, enquanto considerou a
17
porção mais profunda como parte do amygdaleum proprium, uma verdadeira
estrutura subcortical.
Uma vez que o núcleo do trato olfatório e o núcleo do trato olfatório
lateral não são demonstráveis em humanos, o grupo dos núcleos
corticomediais na espécie humana está reduzido a dois núcleos: o cortical e o
Me, este último tema desta dissertação.
1.2.1. O Núcleo Medial
O Me é uma zona relativamente pequena de substância cinzenta
localizada na profundidade e na adjacência do sulco entorrinal (Mai et al.,
2008). Forma a parede ventrolateral da fenda entre a amígdala e o trato óptico
assim que este entra nesse sulco. Em seres humanos e em macacos com um
úncus bem desenvolvido, o Me é uma estrutura alongada orientada de forma
rostrocaudal (Gloor, 1997). Sua fronteira medial com o núcleo cortical corre
longitudinalmente em uma direção rostrocaudal. Em não primatas essa
fronteira é mais oblíqua. Em primatas ela veio de uma rotação em torno do eixo
vertical no curso da evolução do úncus em primatas (Gloor, 1997).
O Me se estende ao longo da maior parte da extensão rostrocaudal da
amígdala humana. A fronteira rostral do núcleo é, entretanto, desenhada em
diferentes níveis por diferentes autores (de Olmos, 1990; Gloor, 1997). A
maioria a descreve como se tal núcleo se estendesse rostralmente na mesma
dimensão que a área amigdaloide anterior (Brockhaus, 1938; Crosby e
Humphrey, 1941; Sims e Williams, 1990). Porém, De Olmos (1990) descreve
como núcleo cortical anterior o que parece corresponder à porção rostral do
núcleo medial dos autores anteriores. A substância cinzenta da metade rostral
do núcleo medial continua imperceptivelmente em torno do fundo do sulco
entorrinal para a porção ventromedial da substantia innominata sublenticular,
uma parte da amígdala estendida. Uma vez que o trato óptico se acomoda no
fundo do sulco entorrinal, o Me ocupa apenas uma parte ventral, mas se
estende bastante caudalmente e alcança a extremidade caudal da amígdala.
No nível onde o núcleo central se junta à margem lateral do Me o limite entre
os dois é a princípio dificilmente definido (Gloor, 1997), o que explica porque é
desenhado diferentemente pelos diversos autores. Mais caudalmente os dois
18
núcleos são separados por algumas fibras mielinizadas. A margem
ventrolateral do Me em direção ao núcleo basal acessório é formada pela
porção dorsal da lâmina medular medial. A margem lateral do Me, a qual se
separa do núcleo cortical, é marcada por uma mudança no tamanho das
células e uma coloração mais escura das células do núcleo cortical. O Me é
formado de neurônios pequenos, alguns piramidais, outros fusiformes ou
poligonais. Não há laminação, embora a porção “cortical” tenha uma camada
molecular bastante ampla (Brockhaus, 1938; de Olmos, 1990, Sims e Williams,
1990).
Assim como faz com o núcleo cortical, Brockhaus (1938) subdivide a
substância cinzenta do Me em porções cortical superficial e subcortical
profunda, a primeira fazendo parte da sua semicortex amygdaleus e a segunda
como parte do supraamygdaleum. O componente “cortical”, conforme definido
por Brockhaus, tem, entretanto, uma extensão rostrocaudal muito mais limitada
que o subcortical e faz parte da superfície do sulco entorrinal apenas em sua
porção rostral antes que o trato óptico o invada. De Olmos (1990) divide o Me
em porções caudal e rostral.
Em seu estudo, de Olmos (2004) descreve que o Me é contínuo
dorsalmente à área amigdaloide anterior (AAA), é uma massa alongada de
substância cinzenta localizada na porção superficial da amígdala dorsomedial,
comprimindo-se através dos dois terços caudais do complexo amigdaliano. Em
secções coronais na altura de sua parte principal a Me apresenta um formato
de lua crescente, enquanto em secções sagitais ao longo de seu eixo
longitudinal principal o núcleo tem uma aparência colunar bastante regular. Em
seu terço rostral o Me está localizado adjacente ao sulco entorrinal, mas
próximo de sua extremidade caudal o Me ocupa apenas a elevação ventral
desse sulco e, finalmente, está deslocada de sua posição pela área de
transição amigdalohipocampal (AHi) que surge entre essa formação cinzenta e
a divisão medial da amígdala central (Ce). Ao longo de sua extensão, o Me
margeia ventralmente, sucessivamente, a subdivisão superior caudal do núcleo
cortical ventral (CSpVCo) e a haste rostrodorsal da divisão posteromedial da
área amigdalohipocampal (PMAHi). Dorsolateralmente a extensão estreita da
AAA surge entre o Me e a divisão medial da Ce. Na maior parte de sua
extensão rostral para caudal o Me é preenchido por um agrupamento
19
relativamente denso de fibras formando as “massas fibrosas intermediárias
centrais” de Brockhaus (1938), as quais rodeiam o núcleo dorsalmente,
lateralmente e, em parte, ventralmente. Em sua extremidade rostral esse
sistema de fibras desaparece em coincidência com a substituição do Me pelo
núcleo cortical anterior (ACo). Rostralmente e ventralmente um agrupamento
neuronal arredondado e pequeno, provavelmente representando a terminação
mais caudal da subdivisão ventral do ACo e da parte posterior do núcleo do
trato olfatório lateral emerge entre o Me e a subdivisão superior do núcleo
ventral cortical (VCo) (Gloor, 1997).
1.2.1.1. Caracterização neuroquímica da amígdala medial
Não há descrições completas para seres humanos para a característica
neuroquímica dos neurônios do Me. Não obstante, em outros animais, como
em ratos e outros roedores, o Me apresenta um conteúdo menor de glutamato
e aspartato que o grupo córtico-basolateral (Ottersen et al., 1986). GABA é
abundante na célula neuronal, mas há relativamente pouca coloração de GABA
no pericário (Ottersen et al., 1986; Nitecka & Bem-Ari, 1987; Nitecka &
Frotscher, 1989). O Me se cora menos para marcadores colinérgicos do que
qualquer outro núcleo amigdaliano (Hall & Geneser-Jensen, 1971; Parent, 1971
– não primatas e primatas; Nitecka e Narkiewicz, 1976 – humanos; Bem-Ari et
al., 1977; Girgis, 1980 – não primatas e primatas; Svendsen e Bird, 1985 –
humanos; Hellendall et al., 1986; Amaral & Bassett, 1989 – macacos; Nitecka e
Frotscher, 1989; Sims e Williams, 1990 – humanos). No cérebro humano, o Me
é corado intensamente com NADPH-d tanto no soma neuronal como nos
prolongamentos celulares (Sims e Williams, 1990).
O Me contém muitos peptídeos em seus neurônios. Em contraste com
os núcleos do grupo córtico-basolateral eles parecem estar localizados em
neurônios de projeção que emitem fibras que entram na estria terminal ou na
via amigdalofugal ventral ou ansa peduncularis (Lind et al., 1985; Caffé et al.,
1987; McDonald, 1985b). Ele compartilha essa propriedade com o núcleo
central. Os peptídeos a seguir foram demonstrados em quantidades grandes
ou moderadas no núcleo medial de diferentes animais, a saber:
20
Somatostatina (Roberts et al., 1981; Johansson et al, 1984;
McDonald, 1987b, 1989a; Amaral et al., 1989 – macacos).
Neuropeptídeo Y (Gustafsson et al., 1986; McDonald, 1989a;
Walter et al., 1990 – humanos), o qual é frequentemente colocalizado
com somatostatina na mesma célula (Mcdonald, 1989a).
Colecistoquinina (Roberts, 1981; Micevych et al., 1988; Oro et al.,
1988; Simerly et al., 1989; Simerly, 1990). É particularmente abundante
na porção posterodorsal do Me de ratos onde parece estar envolvido
com mecanismos de controle neuroendócrinos.
Substância P (Ljungdahl, 1978; Roberts et al., 1981; Shiosaka et
al., 1983; Malsbury & McKay, 1986, 1987; Neal et al., 1989; Simerly et
al., 1989; Simerly, 1990). Também é abundante na mesma porção
posterodorsal do Me de ratos e é frequentemente co-localizado com pró-
dinorfina nas mesmas células (Neal et al., 1989).
Pró-dinorfina (Neal & Newman, 1989 - abundante em hamsters,
mas não em ratos).
Peptídeo Intestinal Vasoativo (Roberts et al., 1980a; Shiosaka et
al., 1983; Sims et al., 1980). É moderadamente abundante no núcleo
medial de ratos.
Neurotensina (Shiosaka et al., 1983; Michel et al., 1986; Benzing
et al., 1990 – os dois últimos artigos realizados em humanos). É
igualmente moderadamente detectável no Me.
Vasopressina (De Vries et al., 1985; Caffé et al., 1985).
Desaparece do pericário de neurônios do Me em ratos adultos após a
castração.
Peptídeo Natriurético Atrial (Kawata et al, 1985; Skofitsch et al.,
1985).
Angiotensina II (Lind et al., 1985).
Fibras e terminações imunorreativas a alguns desses peptídeos
também se apresentam nos corpos celulares e os receptores
correspondentes estão presentes em quantidades abundantes ou
moderadas no Me. Alguns peptídeos também estão presentes em fibras
de passagem e em terminações no Me que não aparecem em números
21
significativos em suas células. Entre eles encontramos o hormônio de
liberação da corticotrofina (Swanson et al., 1983), a galanina (Gentleman
et al, 1989 – humanos) e o peptídeo relacionado ao gen da calcitonina
(Herkenham, 1987).
Em roedores, uma característica importante do Me, a qual está
indubitavelmente relacionada ao seu dimorfismo sexual, é sua capacidade de
responder com receptores específicos tanto a androgênios, estrogênios e
progesterona (Pfaff & Keiner, 1972, 1973; Stumpf, 1972; Keefer & Stumpf, 1975
– macaco; Sar & Stumpf, 1975, 1977; Stumpf et al., 1975; Krieger et al, 1976;
Pfaff et al, 1976 – macaco; Sheridan, 1979; Warembourg, 1981; Commins &
Yahr, 1985; Bonsall et al., 1986 – macaco; Morrell et al., 1986; Schleicher et al.,
1986; Michael et al., 1990 – macaco; Simerly et al., 1990 – receptores mRNA
para androgênio e estrogênio; Don Carlos et al., 1991; Fox et al., 1991; Rasia
Filho, et al., 2004, 2009). Somando-se aos esteróides gonadais, o Me3 de
humanos apresenta neurônios que contêm o hormônio liberador de
gonadotrofinas (Stopa et al., 1991). Algumas dessas células também estão
presentes no núcleo medial de macacos (Silverman et al., 1982).
Como complementação e mais especificamente para seres humanos, a
seguinte tabela descreve e comenta alguns parâmetros neuroquímicos
relevantes para o Me.
Tabela 4. Aspectos relevantes da quimioarquitetura da amígdala medial de seres humanos,
baseado em Gloor (1997) e demais autores indicados no texto.
Neurotransmissores e neuromoduladores
Marcadores colinérgicos
a) Acetilcolinesterase (AChE). A Me contém uma rede de ramificações que
se cora levemente com AChE e poucos neurônios isolados que contêm AChE.
b) Colinoacetiltransferase (ChAT). Conforme Emre et al. (1993), a Me em
humanos é a que contém a menor imunorreatividade (ir) para a ChAT dentre todos os
núcleos amigdalianos. Apenas alguns poucos axônios varicosos ChAT-ir estão
presentes nesse núcleo.
3 Stopa e cols. chamam a área de “núcleo cortical”, mas sua figura 2 sugere que a localização
corresponde ao núcleo medial.
22
Aminoácidos excitatórios
a) Glutamato e Aspartato (GLU / ASP). Um grupo considerável de neurônios
da Me, especialmente da divisão anterodorsal, são fonte de projeções
GLU/ASPérgicas tanto para o estriado ventral laterocaudal como para o pallidum
ventral, assim como para o núcleo hipotalâmico paraventricular e cercanias.
Aminoácidos inibitórios
a) Ácido γ-aminobutírico (GABA). Pitkännen e Amaral (1994) consideram
que nesse núcleo a distribuição padrão de GABA-ir é muito semelhante àquela da
ACo. Entretanto, encontraram que a densidade de neurônios expressando o mRNA
para sua enzima de síntese (GAD) é muito elevada.
Marcadores para monoaminas
a) Tirosina hidroxilase (TH). De acordo com Freeman e Shi (2001), existem
concentrações moderadas de fibras TH-ir na parte rostral da Me.
Neuropeptídeos
a) Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). De acordo com Murer et
al. (1999), neurônios e fibras BDNF-ir estão presentes em todos os núcleos da
amígdala humana, mas não há dados específicos em relação ao Me.
b) Cromogranina B. De acordo com Marksteiner et al. (1999), no cérebro
humano a AMe apresenta uma densidade moderada deste neuropeptídeo. Não
obstante, parece que a parte mais caudal da AMe contém uma alta densidade desse
neuropeptídeo e se dá exclusivamente devido às fibras presentes no local, mas não
em corpos celulares.
c) Transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART). De acordo com
Hurd e Fagergren (2000), a maior expressão mRNA para CART pode ser encontrada
na Me.
d) Fator liberador de corticotropina (CRF). No complexo amigdaliano
humano um denso acúmulo de fibras CRF-ir, com grandes varicosidades e
terminações pode ser encontrado em quase todos os núcleos amigdalianos. Esse
achado, junto ao fato de que o núcleo intersticial da estria terminal e a substantia
innominata sublenticular (SLEA) possuem uma grande quantidade de fibras e
terminações que contêm CRF, favorece a existência de um padrão de distribuição
23
semelhante na Me em componentes da amígdala estendida.
e) Neurotensina (NT). Mai et al. (1987) descreveram que a Me contém
grande quantidade de fibras NT-ir. Essa afirmação foi confirmada por Benzing et al.
(1992), que encontraram na Me uma densa rede de fibras NT-ir que é distribuída de
forma regular ao longo da extensão anteroposterior do núcleo. A maior parte da NT-ir
está confinada a pontos específicos, embora muitas fibras delgadas e algumas
grosseiras estejam presentes. Somando-se às fibras NT-ir, diversos neurônios com
coloração escurecida estão distribuídos por todo o núcleo, embora estejam
preferencialmente posicionados nas porções profundas (laterais) do núcleo. Como
pode ser deduzido pelas ilustrações e localização dos núcleos amigdaloides
apresentados por aqueles autores, sua área amigdaloide anterior não compreende
apenas a AAA conforme é aqui definido, mas também a ACo, enquanto seu
mapeamento do núcleo amigdaloide medial coincide aproximadamente com a Me aqui
definida. É interessante apontar as diferenças na densidade da NT-ir apresentadas
entre a AAA e sua Me, com a AAA se corando menos que os subnúcleos do grupo
centromedial. Além disso, de acordo com Heimer et al. (1999), as fibras e terminações
NT-ir se mesclam com o pericário NT-ir e formam uma coluna contínua partindo da
Me, através da AAA e, mais adiante, de forma medial até as ilhotas NT-ir na região
sublenticular do prosencéfalo basal.
f) Ocitocina (OT). De acordo com Fliers et al. (1986), na Me humana muito
poucas fibras e células OT-ir estão presentes.
g) Substância P (SP). De acordo com Bouras et al. (1986), no complexo
amigdaloide humano poucas células SP-ir de tamanho médio podem ser vistas em
setores dorsomediais, especialmente na Me.
h) Vasopressina (VP). De acordo com Sofroniev et al. (1981), podem ser
rastreadas fibras VP-ir que correm lateralmente sobre o trato óptico desde sua fonte
no hipotálamo medial – provavelmente dos neurônios VP-ir no núcleo
supraquiasmático – até a Me, que surge densamente inervada. De outra forma, Fliers
et al. (1986) encontraram poucas fibras VP-ir e nenhuma célula VP-ir na Me humana.
Enzimas
a) Enzima conversora de angiotensina (ACE). Assim como outros membros da
amígdala superficial, a Me apresenta pouca expressão dessa enzima. Isso contrasta
muito com os elevados níveis apresentados por qualquer divisão estriatal, com a qual
alguns autores propõem que a Me possa ser comparada.
b) Butirilcolinesterase (BuChE). A AMe contém poucos neurônios piramidais
BuChE positivos de tamanho pequeno a médio. Os processos de algumas dessas
24
células também foram corados. Aproximadamente 5% dos neurônios eram BuChE
positivos e foram encontrados predominantemente na porção medial da Me.
c) Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-d). À
exceção da AAA, uma densa rede de fibras NADPH-d-ir foi encontrada por todos os
núcleos amigdalianos, junto com uma distribuição bastante homogênea de células
NADPH-d-ir. De acordo com Brady et al. (1992), o Me apresenta uma atividade
moderada de NADPH-d. Além disso, essas células devem ser semelhantes em todas
as subregiões, e há uma sobreposição quase completa entre neurônios que contêm
NADPH-d e SOM ou NPY.
Proteínas que se ligam ao cálcio
a) Calbindina (CAB). De acordo com Sorvari et al. (1996b), o Me apresenta alta
densidade de neurônios CAB-ir. A coloração intensa da rede de ramificações auxiliou
Sorvari et al. (1996b) a distinguirem a Me dos núcleos vizinhos, como basomedial
(BM) e PMAHi. Não foram observados na Me feixes de fibras CAB-ir.
b) Calretinina (CR). De acordo com Sorvari et al. (1996a), o Me contém
consideravelmente menos células CR-ir que o DACo. A CR-ir no Me é
consideravelmente maior que nas áreas vizinhas, como o núcleo basomedial (BM) e a
PMAHi.
c) Parvalbumina (PAV). A AMe humana contém apenas alguns pequenos
neurônios PAV-ir sem dendritos visíveis, ou apenas alguns destes com menor
comprimento. A densidade de fibras e terminações PAV-ir é muito baixa, sendo
distribuída difusamente.
Outras proteínas
a) Paladina (PALL). Na AMe o padrão de distribuição Pall-ir é semelhante àquele
observado no estriado. A maior parte da paladina estava colocalizada (60%) com a
sinaptofisina distribuída por todo o núcleo. Essa proteína é predominantemente
presente nas sinapses excitatórias e é consistentemente encontrada em sinapses
glutamatérgicas.
1.2.1.2. Citoarquitetura da amígdala medial
Existe uma tendência dos neurônios da AMe de formarem camadas,
especialmente de forma superficial, permitindo a identificação de uma camada
molecular pobre em células (L1), uma camada celular densa superficial (L2) e
uma camada profunda (L3) com neurônios com menor densidade de
25
distribuição (Gloor, 1997). Baseando-se em critérios puramente morfológicos, a
AMe pode ser dividida em duas regiões: anterior (MeA) e posterior (MeP). Esta,
por sua vez, pode ser dividida em subnúcleos dorsal (DMeP) e ventral (VMeP).
O núcleo anterior da Me faz limite rostralmente com o núcleo cortical anterior
(ACo), o griseum amigdaloide superficial que ele substitui caudalmente até que
seja substituído pela subdivisão dorsal do subnúcleo posterior do Me. A MeP
se comprime até atingir o início da porção extramigdaloide da estria terminal na
terminação posterior da amígdala. É o subnúcleo ventral da amígdala medial
posterior que está separado da área de transição amigdalohipocampal por uma
cápsula de fibras destacada da lâmina medular medial, cuja densidade varia,
mas que sempre intervém entre essas duas formações cinzentas (Gloor, 1997).
A MeA, em contraste com a MeP, ainda apresenta uma camada
molecular relativamente ampla (L1), embora não tão ampla como aquela no
ACo (Gloor, 1997). Assim como nesse núcleo, ela é invadida, embora de
forma esparsa, por neurônios pequenos e alongados de várias conformações e
capacidade de coloração. As principais camadas celulares, a superficial (L2) e
a profunda (L3), são claramente segregadas da L1 e formam uma massa
celular relativamente homogênea, embora os neurônios localizados nos dois
terços superiores apresentem uma tendência de se agregarem de forma mais
compacta (Gloor, 1997). Ainda, as células de camadas mais profundas tendem
a ser levemente maiores e se coram de forma mais escura que as das
camadas mais superficiais.
A população neuronal da MeA é bastante heterogênea, sendo feita de
células de diferentes tamanhos piramidais, multiangulares, redondas e
fusiformes, mas ainda menores que aquelas da região superior do núcleo
cortical ventral (SpVCo) vizinha, e arranjadas de forma mais compacta e
regular que as da AAA. A MeA pode ser diferenciada do vizinho rostral, o ACo,
pela maior densidade celular da L2 e uma concomitante rarefação de sua
população neuronal mais profunda, bem como pelo estreitamento de L1 (Gloor,
1997).
Na MeP, sua subdivisão ventral ocupa o segmento mais dorsal da
elevação ventral do sulco entorrinal imediatamente antes que o trato óptico se
encontre com o fundo deste sulco, agora estreito (Gloor, 1997; Sorvari, 1997).
Ela é constituída por um agregado de células relativamente estreito,
26
encapsulado de forma ventromedial e lateral pelo septo fibroso que se ramifica
das massas fibrosas intermediárias caudomediais (icm) descritas por
Brockhaus (1938). Ela apresenta uma camada celular superficial bem definida
(L2) composta de neurônios de tamanho médio com coloração escurecida que
em setores mais caudais do subnúcleo VMeP tendem a se tornar arranjados de
forma mais densa ao se aprofundarem nesse griseum. A camada profunda (L3)
na VMeP é ainda mais densamente povoada e mais estreita que a L2,
contendo um corpo neuronal com coloração mais escura e sem orientação
especial. Finalmente, a área mais profunda da camada molecular (L1) da
VMeP parece invadida por células pequenas que apresentam o mesmo padrão
de distribuição e traços morfológicos gerais que os da L1 da MeA (Gloor,
1997).
Dorsalmente o subnúcleo VMeP se funde com sua contraparte dorsal
(DMeP). Este subnúcleo permanece, pela maior parte de sua extensão,
imediatamente adjacente à faceta lateroventral do trato óptico. Ele contém uma
população neuronal mais homogênea, formada por neurônios um pouco
maiores, agrupados mais densamente e com coloração mais escura que
aqueles do VMeP. Sua camada celular superficial (L2) contém neurônios
alongados e com orientação radial, de ovalados a fusiformes, agrupados mais
densamente que os da L3. Esta contém uma população mais heterogênea de
neurônios que se coram de forma escura e que não apresentam orientação
especial. Finalmente, a DMeP possui uma população glial mais rica que a de
sua contraparte ventral (Gloor, 1997).
A MeA apresenta um plexo moderadamente rico de fibras mielinizadas
de orientação aleatória que se tornam mais densas em suas camadas mais
superficiais (de Olmos, 1990). Esse padrão modifica-se dramaticamente no
nível da divisão MeP. Aqui a densidade do plexo de fibras mielinizadas
aumenta bruscamente em ambos os subnúcleos da MeP, embora
apresentando variações em relação a sua orientação predominante.
Consequentemente, enquanto o plexo de fibras mielinizadas na DMeP é
dominado por fibras de curso transversal, o plexo de fibras meduladas do
núcleo paraventricular (PV) é formado por fibras de orientação mais aleatória,
com alguma predominância de fibras de curso ventrodorsal que irradiam das
“massas fibrosas” de Brockhaus (1938). Ainda, a presença de feixes curtos de
27
fibras densamente mielinizadas intercaladas entre a camada celular superficial
e a margem lateral do trato óptico também marca a diferença entre os dois
subnúcleos da MeP. Corroborando o arranjo mieloarquitetônico acima descrito,
preparações neurofibrilares apresentam um arranjo semelhante, mas com uma
disposição muito mais densa (Gloor, 1997).
1. 3. MORFOLOGIA NEURONAL
Vários são os parâmetros morfológicos que servem para caracterizar os
neurônios presentes no sistema nervoso de vertebrados e invertebrados. As
descrições gerais iniciam-se pela localização e pelo aspecto do corpo celular,
sua área ou volume e a forma que apresenta. Muitas são as possibilidades de
descrição, como por exemplo, classificá-los com aspecto arredondado, ovóide,
fusiforme e, na medida em que vários ramos dendríticos primários surgem do
soma, conferem um aspecto piramidal ou estrelado com múltiplas variações.
Os dendritos primários podem ser igualmente contados e sua posição espacial
de surgimento descrita. Com isso neurônios multipolares de tipo “bitufted” ou
estrelados podem ser facilmente reconhecíveis. O primeiro tipo corresponde
àqueles neurônios que dão origem a dois ramos dendríticos geralmente em
pólos opostos do corpo celular. Os do segundo tipo são aqueles que originam
três ou mais ramos dendríticos primários. Nesta nomenclatura básica não se
pode confundir neurônios de tipo “bitufted” com os bipolares, uma vez que
nesses últimos um dos prolongamentos deve ser um dendrito, mas o outro é
um axônio (Rasia-Filho et al., 2004; Dall‟Oglio et a.l, 2007). Os dendritos
podem ser estudados quanto a seu padrão de ramificação e espalhamento em
relação ao soma e ao longo do neurópilo ou pela presença de espinhos
dendríticos (Rasia Filho et al., 2004; Dall‟Oglio et al., 2008).
O corpo celular representa o local de início do desenvolvimento de
prolongamentos neuronais (dendritos e axônios) e sua morfologia pode se
relacionar com o volume do núcleo e das organelas citoplasmáticas (Peters et
al., 1970; Hermel et al., 2006). Como os dendritos primários surgem a partir do
soma, pode-se interferir se um neurônio tem uma quantidade maior ou menor
de elementos de condução aferente ao corpo celular. Ademais, a área total e o
28
volume do soma podem se relacionar com as constantes de tempo e de
espaço para a computação da atividade sináptica e elétrica que se faz no
neurônio. Por isso, relacionada com a condutância de membrana celular, o tipo
e a quantidade de canais iônicos e o número de sinapses que se fazem
diretamente no corpo celular ou em dendritos, também a área do soma importa
para a ocorrência de potenciais de ação e a atividade neuronal dentro dos
circuitos neurais em que ela se enquadra funcionalmente (Peters et al., 1970;
Hermel et al., 2006; Peters et al., 1991).
Como revisado e descrito por Marcuzzo (2007), um espinho
característico tem a forma determinada pela presença de uma “cabeça”
(volume de aproximadamente 0,001 a 1 µm3) conectada ao neurônio por um
“pescoço” (diâmetro menor que 0,1µm; Harris & Kater, 1994). São encontrados
em várias populações neuronais, em praticamente todos os vertebrados e em
alguns invertebrados estudados até o momento (Nimchinsky et al., 2002). Sua
função específica é a transmissão sináptica e geralmente é um elemento pós-
sináptico (Nusser et al., 1998; Ethell & Pasquale, 2005; Popov et al., 2005;
Tada & Sheng, 2006). Os espinhos também podem funcionar como
compartimentos elétricos, onde a geometria do pescoço do espinho atua como
um elemento de resistência à passagem de corrente elétrica para o dendrito.
Assim, o pescoço do espinho pode causar uma diferença de potencial elétrico
localmente, podendo ativar canais iônicos dependentes de voltagem ou impor
uma diferença de capacitância com toda a árvore dendrítica, de acordo com as
propriedades ativa ou passiva existentes no local (Nimchinsky et al., 2002).
29
Figura 3. Desenho esquemático da ultraestrutura do espinho dendrítico onde se observam a cabeça e o pescoço do espinho que emergem do dendrito adjacente na base da figura. Alguns elementos constituintes da estrutura do espinho estão demonstrados. PSD, densidade pós-sináptica; REL, retículo endoplasmático liso; VE, vesícula endocítica. O aparelho do espinho, filamentos de actina e polirribossomos formam o citoesqueleto do espinho (adaptado de Hering & Sheng, 2001).
Os espinhos podem sofrer modificações em sua morfologia e esse
processo reflete o rearranjo rápido do citoesqueleto de actina em seu interior, o
que pode levar à mudança no tamanho e no número de espinhos (Oertner &;
Matus, 2005; Tada & Sheng, 2006). Em geral, os espinhos são classificados de
acordo com sua morfologia com a seguinte nomenclatura: “filopódio”, que não
apresenta uma cabeça definida e é fino e comprido, acredita-se que seja a
forma precursora dos espinhos; “fino”, o qual apresenta pescoço fino e pode
não ter uma cabeça bem definida; “espesso”, que não apresenta pescoço
diferenciado, e se mostra como uma elevação a partir do contorno dendrítico;
em forma de “cogumelo”, como se depreende da sua nomenclatura e que
parece ser o espinho mais estável (em termos de mudanças numéricas e
contatos sinápticos duradouros); e, “ramificado”, onde um pescoço pode dar
origem a mais de uma cabeça de espinho (Peters & Kaiserman-Abramof, 1970;
Peters et al., 1991; Hering; Sheng, 2001; González-Burgos, 2004).
30
Figura 4. Representação esquemática das diferentes morfologias dos espinhos dendríticos, como se observa à microscopia de luz, surgindo a partir de uma linha de base que representa o tronco dendrítico (adaptado de Hering & Sheng, 2001 e reproduzida de Marcuzzo, 2006).
O estudo dos espinhos dendríticos configura-se numa área muito
importante para o entendimento das bases celulares de funcionamento do
sistema nervoso. A determinação do número de espinhos por segmento
dendrítico (e, daqui, sua densidade por µm dendrítico) tem servido para estimar
a maior ou menor ocorrência de sinapses (Wooley & McEwen, 1993; Rasia
Filho et al., 2004; Hermel et al., 2006; de Castilhos, 2006; Marcuzzo, 2006).
Detalhes como as medidas de área do soma, aspecto dos ramos
dendríticos primários e classificação neuronal baseada nesses parâmetros,
além da presença e do tipo dos espinhos dendríticos, ainda não são
conhecidos para o Me de seres humanos. Aclarar esses pontos é o objetivo da
presente dissertação. Ao mesmo tempo em que todos esses dados são
inéditos e pioneiros em nosso meio, procurou-se desenvolver o protocolo de
uma técnica para a identificação da morfologia neuronal. Trata-se de uma
variante da técnica de Golgi originalmente nomeada “single-section Golgi
method” por causa de seus princípios técnicos. A técnica de Golgi se baseia na
reação entre o cromo e a prata, que pode ser intensificada pelo ósmio, e que
permite, quando gera resultados adequados, a identificação dos neurônios e de
células da glia que compõem a população do local em estudo. Isto foi feito em
seres humanos e está nos artigos a seguir.
FILOPÓDIO FINO ESPESSO COGUMELO RAMIFICADO
31
2. REFERÊNCIAS
______________________________
Aggleton, JP & Saunders, RC. The relationships between temporal lobe and
diencephalic structures implicated in anterograde amnesia. Memory, 1997; 5:
49-71.
Alheid DGF, De Olmos JS, Beltramino CA. Amygdala and extended amygdala.
In: Paxinos G. The Rat Nervous System. San Diego: Academic Press.
1995;495-498.
Alheid GF. Extended amygdala and basal forebrain. Ann NY Acad Sci, 2003;
985:185–205.
Amaral D, Schumann C. Stereological estimation of the number of neurons in
the human amygdaloid complex. J Comp Neur. 2005; 491: 320-329.
Amaral DG & Bassett JL. Cholinergic innervation of the monkey amygdale: an
immunohistochemical analysis with antisera to choline acetyltransferase. J
Comp Neurol, 1989; 281: 337-361.
Amaral DG, Price JL, Pitkanen A, Carmichael ST. The Amygdala:
Neurobiological aspects of emotion, memory, and mental disfunction. Aggleton
JP (ed) Wiley-Liss: New York, 1992, ch1, p-1-66.
Arpini M. Estudo sobre a densidade de espinhos dendríticos de neurônios da
amígdala medial póstero-dorsal de ratos: efeito da lateralidade entre os sexos e
nas regiões dorsal e ventral em ratas. Dissertação. (Mestrado em Ciências
Biológicas: Neurociências), Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009.
Ben-Ari Y, Zigmond RE, Shute CCD & Lewis PR. Regional distribution of
choline acetyltransferase and acetylcholinesterase within the amygdaloid
complex and stria terminalis system. Brain Res, 1977; 120: 435-445.
Benzing WC, Mufson EJ, Jennes L & Armstrong DM. Reduction of neurotensin
immunoreactivity in the amygdala in Alzheimer‟s disease. Brain Res, 1990; 537:
298-302.
32
Bonsall RW, Rees HD & Michael RP. [3H] Estradiol and its metabolites in the
brain, pituitary gland, and reproductive tract of the male rhesus monkey.
Neuroendocrinology, 1986; 43: 98-109.
Braak H & Braak E. Neuronal types in the basolateral amygdaloid nuclei of
man. Brain Res Bull, 1983; 11: 349-365.
Brockhaus H. Zur normalen und pathologischen Anatomie des
Mandelkerngebietes. J Psychol Neurol (Leipzig), 1938; 49: 1-136.
Burgoyne RD, Gray EG, Barron J. Cytochemical localization of calcium in the
dendritic spine apparatus of the rat cerebral cortex and at synaptic sites in the
cerebellar cortex. J Anat. 1983; 136: 634-635.
Caffé AR, van Leeuwen FW & Luiten PGM. Vasopressin cells in the medial
amygdale of the rat project to the lateral septum and ventral hippocampus. J
Comp Neurol, 1987; 261: 237-252.
Carlsen J. New perspectives on the functional organization of the basolateral
amygdale. Acta Neurol Scand, Suppl 122, 1989; 79: 5-27.
Commins D & Yahr P. Autoradiographic localization of oestrogen and androgen
receptors in the sexually dimorphic area and other regions of the gerbil brain. J
Comp Neurol, 1985; 231: 473-489.
Crosby EC, Humphrey T. Studies of the vertebrate telencephalon. II. The
nuclear pattern of the anterior olfactory nucleus, tuberculum plfactorium and
amygdaloid complex in adult man. J Comp Neurol, 1941; 74: 309-352.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of posterodorsal medial amygdala neurons of adult male and female
rats: Further data based on the Golgi method. Neurosci. Lett., 2008a; 430: 151–
56.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of Golgi-impregnated neurons from the “ventral” medial amygdala
subnuclei of adult male and female rats. Neurosci. Lett., 2008b; 439: 287-92.
de Castilhos J, Marcuzzo S, Forti CD, Frey RM, Stein D, Achaval M et al.
Further studies on the rat posterodorsal medial amygdala: Dendritic spine
density and effect of 8-OH-DPAT microinjection on male sexual behavior. Br
Res Bull. 2006; 69 (2):131-139.
33
De Olmos J, Hardy H & Heimer L. The afferent connections of the main and the
accessory olfactory bulb formations in the rat: na experimental HRP-study. J
Comp Neurol, 1978; 181: 213-244.
de Olmos J. In: Paxinos G, Mai J. Hum nerv sys. 2004; 2 San Diego: Elsevier.
de Olmos JS, Heimer RL. The concepts of the ventral striatopallidal system and
extended amygdala. Ans NY Aca Sci. 1999; 877: 1-32.
De Olmos JS. Amygdala. In: Paxinos G (ed) The Human Nervous System.
Academic Press, Inc., San Diego–New York–London–Toronto, 1990: 583-710.
de Vries GJ, Bujis RM, van Leeuwen FW, Caffé AR & Swaab DF. The
vasopressinergic innervation of the brain in normal and castrated rats. J Comp
Neurol, 1985; 233: 236-254.
DonCarlos LL, Monroy E & Morrell JI. Distribution of estrogen receptor-
immunoreactive cells in the forebrain of the female guinea pig. J Comp Neurol,
1991; 305: 591-612.
Ethell IM, Pasquale EB. Molecular mechanisms of dendritic spine development
and remodeling. Prog Neurob. 2005; 75:161–205.
Fox CA, Ross LR, Handa RJ & Jacobson CD. Localization of cells containing
estrogen receptor-like immunoreactivity in the Brazilian opossum brain. Brain
Res, 1991; 546: 96-105.
Gentleman SM, Falkai P, Bogerts B, Herrero MT, Polak JM & Roberts GW.
Distribution of galanin-like immunoreactivity in the human brain. Brain Res,
1989; 505: 311-315.
Girgis M. acetylcholinesterase enzyme localization in the amygdale: a
comparative histochemical and ultrastructural study. Acta Anat, 1980; 106: 192-
202.
Gloor P. The temporal lobe and limbic system. OUP: 1997 New York and
Oxford.
González-Burgos I, Alejandre-Gómez M, Cervantes M. Spine-type densities of
hippocampal CA1 neurons vary in proestrus and estrus rats. Neurosc Let. 2004;
379:52-54.
Gray EG. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the
cerebral cortex. Nature. 1959, v. 183, p. 1592–1593.
34
Gustafsson B & Wigström H. Hippocampal long-lasting potentiation produced
by pairing single volleys and brief conditioning tetani in separate afferents. J
Neurosci, 1986; 6: 1575-1582.
Hall E & Geneser-Jensen FA. Distribution of acetylcholinesterase and
monamine oxidase in the amygdale of the guinea pig. Z Zellforsch, 1971; 120:
204-221.
Harris KM, Kater SB. Dendritic spines: cellular specializations imparting both
stability and flexibility to synaptic function. A Rev Neurosc. 1994; 17:341-71.
Hayashi Y, Majewska AK. Dendritic spine geometry: functional implication and
regulation. Neuron. 2005; 46: 529-532.
Hellendall RP, Godfrey DA, Ross CD, Armstrong DM & Price JL. The
distribution of choline acetyltransferase in the rat amygdaloid complex and
adjacent cortical areas, as determined by quantitative microessay and
immunohistochemistry. J Com Nerol, 1986; 249: 486-498.
Hering H, Sheng M. Dendritic spines: structure, dynamics and regulation. Nat
Rev Neurosc. 2001; 2: 880-888.
Herkenham M. Mismatches between neurotransmitter and receptor localizations
in brain: observations and implications. Neuroscience, 1987; 23: 1-38.
Hermel E, Marcuzzo S, Heuser MCF, Rasia FA, Achaval, M. Ultrastructural
features of neurones and synaptic contacts in the posterodorsal medial
amygdala of adult male rats. J Anat. 2006;2008:565-575.
Hermel EES, Ilha J, Xavier LL, Rasia Filho AA, Achaval M. Influence of sex and
estrous cycle, but not laterality, on the neuronal somatic volume of the
posterodorsal medial amygdala of rats. Neurosci. Lett., 2006; 405: 153-58.
Johansson O, Hökfelt T & Elde RP. Immunohistochemical distribution of
somatostatin-like immunoreactivity in the central nervous system of the adult
rat. Neuroscience, 1984; 13: 265-339.
Johnston JB. Further contributions to the study of the evolution of the forebrain.
J Comp Neurol, 1923; 35: 337-481.
Kasai H, Matsuzaki M, Noguchi J, Yasumatsu N, NAKAHARA, H. Structure–
stability–function relationships of dendritic spines. Tren Neur. 2003, v. 26, n. 7.
35
Kawata M, Nakao K, Morii N, Kiso Y, Yamashita H, Imura H et al. Atrial
nattriuretic polypeptide: topographical distribution in the rat brain by
radioimunnoassay and immunohistochemistry. Neuroscience, 1985; 16: 521-
546.
Krieger MS, Morrell JI & Pfaff DW. Autoradiographic localization of estradiol
concentrating cells in female hamster brain. Neuroendocrinology, 1976; 22:
193-205.
Lautin A. The Limbic Brain. Kluver Academic: Dordrecht, 2001.
Ledoux J. O Cérebro Emocional: os misteriosos alicerces da vida emocional. 2.
ed. Rio de Janeiro: Objetiva, 1998.
Lin H, Huganir R, Liao D. Temporal dynamics of NMDA receptor-induced
changes in spine morphology and AMPA receptor recruitment to spines. Bioch
Biophys Res Commun. 2004, v. 316, p. 501–511.
Lind RW, Swanson LW & Ganten D. Organization of angiotensin II
immunoreactive cells and fibers in the rat central nervous system.
Neuroendocrinol, 1985; 40: 2-24.
Ljungdahl A, Hökfelt T & Nilsson G. Distribution of substance P-like
immunoreactivity in the central nervous system of the rat. I. Cell bodies and
nerve terminals. Neuroscience, 1978; 3: 861-943.
Mai JK, Paxinos G, Voss T. Atlas of the Human Brain. Amsterdam: Elsevier,
2008.
Malsbury CW & McKay K. A sex difference in the pattern of substance P
immunoreactivity in the bed nucleus of the stria terminalis. Brain Res, 1987;
420: 365-370.
Malsbury CW & McKay K. Sex differences in the substance P innervation of the
bed nucleus of the stria terminalis and medial nucleus of amygdala. Soc
Neurosci Abstr, 1986; 12: 292.
Marcuzzo S, Dall‟Oglio A, Ribeiro MF, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic
spines in the posterodorsal medial amygdala after restraint stress and ageing in
rats. Neuros Letter. 2007, v.424, p.16-21.
Marcuzzo S. Estudo sobre a densidade de espinhos dendríticos de neurônios
da amígdala medial póstero-dorsal de ratos em diferentes condições
36
experimentais. Dissertação. (Mestrado em Ciências Biológicas: Neurociências),
Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, 2006.
Matus A. Growth of dendritic spines: a continuing story. Curr Op Neurobiol.
2005, v. 15, p. 67-72.
McDonald AJ. Coexistence of somatostatin with neuropeptide Y, but not with
cholecystokinin or vasoactive intestinal peptide, in the neurons of the rat
amygdala. Brain Res, 1989a; 500: 37-45.
McDonald AJ. Morphology or peptide-containing neurons in the rat basolateral
amygdaloid nucleus. Brain Res, 1985b; 338: 186-191.
McDonald AJ. Somatostatinergic projections from the amygdale to the bed
nucleus of the stria terminalis and medial preoptic-hypothalamic region.
Neurosci Lett, 1987b; 75: 271-277.
McLean PD. The triune brain in evolution : role in paleocerebral functions. New
York : Plenum Press, 1990.
Micevych PE, Matt DW & Go VLW. Concentration of cholecystokinin, substance
P, and bombesin in discrete regions of male and female rat brain: sex
differences and estrogen effects. Exp Neurol, 1988; 100: 416-425.
Michael RP, Rees HD & Bonsall RW. Sites in the male primate brain at which
testosterone acts as an androgen. Brain Res, 1990; 502: 11-20.
Michel JP, Sakamoto N, Kopp N & Pearson J. Neurotensin immunoreactive
structures in the human infant striatumm septum, amygdala and cerebral cortex.
Brain Res, 1986; 397: 93-102.
Morrell JI, Krieger MS & Pfaff DW. Quantitative autoradiographic analysis of
estradiol retention by cells in the preoptic area, hypothalamus and amygdala.
Exp Brain Res, 1986; 62: 343-354.
Neal CR & Newmann SW. Prodynorphin peptide distribution in the forebrain of
the Syrian hamster and rat: a comparative study with antisera against dynorphin
A, dynosrphin B, and the C-terminus of the pro-dynorphin precursor molecule. J
Comp Neurol, 1989; 288: 353-386.
Neal CR, Swann JM & Newmann SW. The colocalization of substance P and
prodynorphin immunoreactivity in neurons of the medial preoptic area, bed
37
nucleus of the stria terminalis and medial nucleus of the amygdala in the Syrian
hamster. Brain Res, 1989; 496: 1-13.
Nieuwenhuys R. Chemoarchitecture of the Brain. Springer Verlag, Berlin-
Heidelberg-New York, 1985.
Nimchinsky EA, Sabatini BL, Svoboda K. Structure and function of dendritic
spines. An Revs Physiol, 2002, v. 64, p. 313-353.
Nitecka I & Ben-Ari Y. Distribution of GABA-like immunoreactivity in the rat
amygdaloid complex. J Comp Neurol, 1987; 226: 45-55.
Nitecka I & Frotscher M. Organization and synaptic interconnections of
GABAergic and cholinergic elements in the rat amygdaloid nuclei: single- and
double-immunolabeling studies. J Comp Neurol, 1989; 279: 470-488.
Nitecka L, Narkiewicz O. Localization of acetylcholinesterase activity in the
amygdaloid body of man. Acta Neurobiol Exp, 1976; 36: 333-352.
Nusser Z, Lujan R, Laube G., Roberts JD, Molnar E, Somogyi P. Cell type and
pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the
hippocampus. Neuron. 1998, v. 21, n. 3, p. 545-549.
Oertner T, Matus A. Calcium regulation of actin dynamics in dendritic spines.
Cell Calcium. 2005, v. 37, p. 477-482.
Oro AE, Simerly RB & Swanson LW. Estrous cycle variations in levels of
cholecystokinin immunoreactivity within cells of three interconnected sexually
dimorphic forebrain nuclei. Evidence for a regulatory role of estrogen.
Neuroendocrinology, 1988; 47: 225-235.
Ottersen OP & Storm-Mathisen J. Excitatory amino acid pathways in the brain.
In: Schwarcz R & Ben-Ari Y (eds) Excitatory Amino Acids and Epilepsy. Plenum
Press, New York-London, 1986: 263-284.
Parent A. Comparative histochemical study of the amygdaloid complex. J
Hirnforsch, 1971; 13: 89-96.
Peters A, Kaiserman-Abramof IR. The small pyramidal neuron of the rat
cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 1970, v. 127,
p. 321-356.
Peters A, Kaiserman-Abramof IR. The small pyramidal neuron of the rat
cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 1970, v. 127,
p. 321-356.
38
Peters A, Palay SL, Webster HD. Dendrites. In: The Fine Structure of the
Nervous System: Neurons and Their Supporting Cells. New York: Oxford
University Press, p. 70-100, 1991.
Pfaff D, Gerlach T, McEwen B, Ferin M, Carmel P & Zimmerman E.
Autoradiographic localization of hormone-concentrating cells in the brain of the
rhesus monkey. J Comp Neurol, 1976; 170: 279-294.
Pfaff DW & Keiner M. Atlas of estradiol-concentrating cells in the central
nervous system of the female rat. J Comp Neurol, 1973; 151: 121-158.
Pfaff DW & Keiner M. Estradiol-concentrating cells in the rat amygdala as part
of a limbic-hypothalamic hormone-sensitive system. In: Eleftherion (ed) The
Neurobiology of the Amygdala. Plenum Press, New York-London, 1972: 775-
785.
Popov VI, Deev AA, Klimenko OA, Kraev IV, Kuz‟minykh SB, Medvedev NI,
Patrushev IV et al. Three-dimensional reconstruction of synapses and dendritic
spines in the rat and ground squirrel hippocampus: new structural-functional
paradigms for synaptic function. Neuros Behavl Physio. 2005, v. 35, n. 4.
Price JL. The central olfactory and accessory olfactory systems. In: Finger TE &
Silver WL, (eds), Neurobiology of Taste and Smell, John Wiley & Sons, New
York, 1987: 179-203.
Rasia Filho AA et al..Método de Golgi In:Bittencourt JC. Métodos em
Neurosciência. São Paulo: Roca, 2007.
Rasia Filho AA, de Castilhos J, Rigon P, Xavier LL, Achaval M. Sex differences
in NADPH-diaphorase activity in the rat posterodorsal medial amygdala. Br Res.
2009, v. 1305, p 31-39.
Rasia Filho AA, Fabian C, Rigoti KM, Achaval M. Influence of sex, estrous cycle
and motherhood on dendritic spine density in the rat medial amygdala revealed
by the Golgi method. Neuros. 2004, v. 126, p. 839–847.
RASIA-FILHO, A. ; HILBIG, A. . Papel da Amígdala e do Hipocampo no
Transtorno do Estresse Pós-Traumático. In: Renato M Caminha &
Colaboradores. (Org.). Transtorno do Estresse Pós-Traumático (TEPT): da
Neurobiologia à Terapia Cognitiva. 01 ed. São Paulo: Casa do Psicólogo, 2005,
v. 01, p. 37-53.
39
Roberts GW, Polak JM & Crow TJ. The peptidergic circuitry of the amygdaloid
complex. In: Ben-Ari Y (ed) The Amygdaloid Complex. Elsevier/North Hilland,
Amsterdam-New York, 1981: 185-195.
Roberts GW, Woodhams PL, Bryant MG, Crow TJ, Bloom SR & Polak JM. VIP
in the rat brain: evidence for a major pathway linking the amygdala and
hypothalamus via the stria terminalis. Histochemistry, 1980a; 65: 103-119.
Rose M. Der allocortex bei Tier und Mensch. I Teil. J Psychol Neurol. 1926,
v34, p1-260.
Rose M. Die sog. Riechrinde beim Menschen und beim Affen. II Teil des
“Allocortex bei Tier und Mensch”. J Psychol Neurol. 1927a, v34, p261-401.
Sar M & Stumpf WE. Distribution of androgen target cells in rat forebrain and
pituitary after [3H]-dihydrotestosterone administration. J Steroid Biochem, 1977;
8: 1131-1135.
Sar M & Stumpf WE. Distribution of androgen-concentrating neurons in the rat
brain. In: Stumpf WE & Grant LD (eds) Anatomical Neuroendocrinology, Karger,
Basel, 1975: 120-131.
Schleicher G, Stumpf WE, Morin JK & Drews U. Sites of aromatization of [3H]
testosterone in forebrain of male, female and androgen-deficient Tfm mice: an
autoradiographic study. Brain Res, 1986; 397: 290-296.
Sheridan PJ. The nucleus interstitialis striae terminals and the nucleus
amygdaloideus medialis: prime targets for androgen in the rat forebrain.
Endocrinology, 1979; 104: 130-136.
Shiosaka S, Sakanaka M, Ingaki S, Senba E, Hara Y, Takatsuki K et al.
Putative neurotransmitters in the amygdaloid complex with special reference to
peptidergic pathways. In: Emson PC (ed) Chemical Neuroanatomy, Raven
Press, New York, 1983: 359-389.
Silverman AJ, Antunes JL, Abrams GM, Nilaver G, Than R, Robinson JA et al.
The luteinizing hormone-releasing hormone pathways in rhesus (Macaca
mulatta) and pigtailed (Macaca nemestrina) monkeys. New observations on
thick unembedded sections. J Comp Neurol, 1982; 211: 309-317.
Simerly RB, Young BJ, Capozza MA & Swanson LW. Estrogen differentially
regulates neuropeptide gene expression in a sexually dimorphic olfactory
pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86: 4766-4770.
40
Simerly RB. Hormonal control of neuropeptide gene expression in sexually
dimorphic olfactory pathways. Trends Neurosci, 1990; 13: 104-110.
Sims KB, Hoffman, DL, Said SI & Zimmerman EA. Vasoactive intestinal
polypeptide (VIP) in mouse and rat brain: an immunocytochemical study. Brain
Res, 1980; 186: 165-183.
Sims KS, Williams RS. The human amygdaloid complex: a cytologic and
histochemical atlas using Nissl, myelin, acetylcholinesterase and nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate diaphorase staining. Neuroscience, 1990; 36:
449-472.
Skofitsch G, Jacobowitz DM, Eskay RZ & Zamir N. Distribution of atrial
natriuretic factor-like immunoreactive neurons in the rat brain. Neuroscience,
1985; 416: 917-648.
Sorvari H, Soininen H, Paljärvi L, Karkola K, Pitkänen A. Distribution of
parvalbumin immunoreactive cells and fibers in human amygdaloid complex. J
Comp Neurol. 1995;360:185-212.
Sorvari H. Neurons containing calcium-binding proteins in the human
amygdaloid complex. Dissertação. 1997, Universidade de Kuopio: Kuopio.
Stephan H, Frahm HD & Baron G. Comparison of brain structure volumes in
insectivores and primates. VII. Amygdaloid components. J Hirnforsch, 1987; 28:
571-584.
Steward O, Schuman EM. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. An
Rev Neur, 2001, v. 24, p. 299–325.
Stopa EG, Koh ET, Svendsen CN, Rogers WT Schwaber JS & King JC.
Computer-assisted mapping of immunoreactive mammalian gonadotropin-
releasing hormone in adult human basal forebrain and amygdala.
Endocrinology, 1991; 128: 3199-3207.
Stumpf WE, Sar M & Keefer DA. Atlas of estrogen target cells in rat brain. In:
Stumpf WE & Grant LD (eds) Anatomical Neuroendocrinology, Karger, Basel,
1975: 104-119.
Stumpf WE. Estrogen, androgen and glucocorticosteroid concentrating neurons
in the amygdala, studied by autoradiography. In: Eleftherion BE (ed) The
Neurobiology of th Amygdala. Plenum Press, New York-London, 1972:763-774.
41
Svendsen CN, Bird ED. Acetylcholinesterase staining of the human amygdale.
Neurosci Lett, 1985; 54: 313-318.
Svoboda K, Tank DW, Denk W. Direct measurement of coupling between
dendritic spines and shafts. Science. 1996, v. 272, p. 716–719.
Swanson LW, Petrovich GD. What is the amygdala? Trends Neurosci, 1998;
21:323–331.
Swanson LW, Sawchenko PE, Rivier J & Vale WW. Organization of ovine
corticotropin-releasing factor immunoreactive cells and fibers in the rat brain: an
immunohistochemical study. Neuroendocrinology, 1983; 36: 165-186.
Tada T, Sheng M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.
Curr Opin Neur, 2006, v. 16, p. 1-7.
Völsch M. Zur vergleichenden Anatomie dês Mandelkerns und seiner
Nachbargebilde. I Teil. Arch mikrosk Anat Entx gesch, 1906; 68: 573-683.
Völsch M. Zur vergleichenden Anatomie dês Mandelkerns und seiner
Nachbargebilde. II Teil. Arch mikrosk Anat Entx gesch, 1911; 76: 373-523.
Walter A, Mai JK & Jiménez-Härtel W. Mapping of neuropeptide Y-like
immunoreactivity in the human forebrain. Brain Res Bull, 1990; 24: 297-311.
Warembourg M. Localization of steroid receptors in the amygdaloid complex. In:
Ben-Ari Y (ed) The Amygdaloid Complex. Elsevier/North Holland, Amsterdam-
New York, 1981: 203-208.
WhalenPJ, Phelps EA. The Human Amygdala. The Guilford Press: New York,
2009.
Winans SS, Scalia F. Amygdaloid nucleus: new afferent input from the
vomeronasal organ. Science, 1970; 170: 330-332.
Winans SS, Scalia F. The differential projections of the olfactory bulb and
accessory olfactory bulb in mammals. J. Comp. Neurol. 161:31-56, 1975.
Wooley CS, McEwen BS. Roles of estradiol and progesterone in regulation of
hippocampal dendritic spine density during the estrous cycle in the rat. J
Compar Neur. 1993, v. 336, n. 2, p. 293-306.
Yakovlev, PI et al., Physiological evidence concerning importance of the
amygdaloid nuclear region in the integration of circulatory function and emotion
in man. Science. 1954 Dec 3;120(3127):949-50.
42
Yuste R, Majewska A. On the function of dendritic spines. The Neuroscientist.
2001, v.7, n. 5, p. 387-395.
43
3. OBJETIVOS
______________________________
Os objetivos do presente estudo foram:
1) Implantar e desenvolver uma técnica de Golgi que pudesse ser
aplicada para amostras de tecido nervoso armazenadas em formol por um
longo período;
2) Identificar o Me humano em cortes coronais seriados e corados pela
técnica da tionina; e, com base nas imagens obtidas pela técnica anterior e
esta identificação
3) Descrever os tipos neuronais e quantificar parâmetros morfológicos
do soma neuronal do Me de seres humanos ao longo de seu comprimento
rostrocaudal. Como complementação, aspectos morfológicos relacionados às
células da glia foram igualmente relatados.
44
--- On Mon, 11/30/09, Greg Gerhardt <[email protected]> wrote:
From: Greg Gerhardt <[email protected]>
Subject: JNEUMETH-D-09-00549
To: [email protected], [email protected]
Date: Monday, November 30, 2009, 4:51 PM
Ref.: Ms. No. JNEUMETH-D-09-00549
THE "SINGLE-SECTION" GOLGI METHOD ADAPTED FOR FORMALIN-FIXED
HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY
Journal of Neuroscience Methods
Dear Dr. Rasia-Filho,
Your manuscript entitled "THE "SINGLE-SECTION" GOLGI METHOD ADAPTED
FOR FORMALIN-FIXED HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY" has been
assigned the following manuscript number: JNEUMETH-D-09-00549. Please use this
reference number for any correspondence to the Journal Office.
You will be able to check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier
Editorial System as an author.
The URL is http://ees.elsevier.com/jneumeth/.
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Greg A. Gerhardt
Co-Editor-in-Chief
Journal of Neuroscience Methods
45
4. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS
______________________________
THE “SINGLE-SECTION” GOLGI METHOD ADAPTED FOR FORMALIN-
FIXED HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY
Aline Dall‟Oglio1+, Denise Ferme2+, Janaína Brusco3,5, Jorge E. Moreira3,5,
Alberto A. Rasia Filho1,2,4
1Program in Neuroscience, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Brazil
2Program in Pathology, Universidade Federal de Ciências da Saúde, Porto
Alegre, Brazil
3Laboratory of Synaptic Structure, Ribeirão Preto School of Medicine,
Universidade de São Paulo, Brazil
4Department of Basic Sciences/Physiology, Universidade Federal de Ciências
da Saúde, Porto Alegre, Brazil
5Program in Neuroscience & Behavior, Ribeirão Preto School of Medicine,
Universidade de São Paulo, Brazil
+ These authors contributed equally to the present study.
Number of pages: 19
Number of figures: 2
Corresponding author: Alberto A. Rasia Filho. UFCSPA/Physiology, R.
Sarmento Leite 245 (room 308), Porto Alegre 90170-050 RS, Brazil. Phone: +
55 51 91161643. Fax: + 55 51 33038752. E-mail: [email protected]
Aline Dall’Oglio, M.Sc.
Program in Neuroscience, Institute of Basic Sciences, Federal University of Rio
Grande do Sul, R. Sarmento Leite 500, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil
Denise Ferme
Program in Pathology, Federal University of Health Sciences, R. Sarmento
Leite 245, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil
46
Janaína Brusco
Laboratory of Synaptic Structure, Department of Cell/Molecular Biology and
Biopathogens, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av.
Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto SP 14049-900, Brazil
Jorge E. Moreira, Ph.D.
Laboratory of Synaptic Structure, Department of Cell/Molecular Biology and
Biopathogens, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av.
Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto SP 14049-900, Brazil
Alberto A. Rasia-Filho, M.D., Ph.D.
Department of Basic Sciences/Physiology, Federal University of Health
Sciences, R. Sarmento Leite 245, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil
Phone: + 55 51 91161643
Fax: + 55 51 33038752
E-mail: [email protected]
47
ABSTRACT
The Golgi method has been used for over a century to describe the
general morphology of neurons in the nervous system of different species. The
“single-section” Golgi method of Gabbott and Somogyi (1984) and the
modifications made by Izzo, Graybiel and Bolam (1987) are easy, rapid to
perform, and able to produce consistent results when used in rats, ferrets, and
cats. Here, we describe procedures for revealing cortical and subcortical
neurons in unbuffered formalin-fixed human brains stored for months. The
tissue was sectioned with vibratome, post-fixed in a combination of
paraformaldehyde and picric acid in phosphate buffer, immersed in osmium
tetroxide and in potassium bicromate, “sandwiched” between microscopic cover
slips, and impregnated in silver nitrate. All these steps take between 5 and 11
days to provide good results. The Golgi method has its characteristic pitfalls but,
with this procedure, neurons and glia can appear well-impregnated, allowing
further qualitative and quantitative studies under light microscopy. This
contribution adds to the basic techniques for the study of human nervous tissue
with the same advantages described for the “single-section” Golgi method in
other species; it is easy, fast, and feasible, requires minimal equipments, and
provides reliable results from formalin-fixed material.
KEY WORDS: Golgi procedure, osmication, silver impregnation, neuronal
morphology, glial cells.
Running title: “Single-section” Golgi method for the human brain
48
1. INTRODUCTION
The colorazione nera from the silver impregnation procedure has been,
for a long time, the method used to reveal the general morphology of neurons
and glia in various areas of the nervous system of several species (Golgi, 1873;
Ramón y Cajal, 1909; Valverde, 1962; Fairén et al., 1977; Scheibel & Scheibel,
1978; Szentágothai, 1978; McDonald, 1982). Phylogenetic and ontogenetic
studies under normal or pathological conditions benefited from the Golgi
method (Ramón y Cajal, 1909). When successfully done, the Golgi method is a
reliable tool to identify different types of neurons, the detailed shape of single
cells, and to highlight some functional meanings from morphological data
(Woolley and McEwen, 1994; Dall‟Óglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008;
Gómez-Villalobos et al., 2009; Rasia Filho et al., 2009).
As other techniques, the Golgi method has advantages and restrictions.
Although it was demonstrated that the silver precipitation occurs intracellularly
(Fairén et al., 1977; Bolam, 1992), not all the factors that impact on the ultimate
results of the impregnation procedure are known. This leads to an unpredictable
number of usable colored neurons and not a homogeneous pattern of cellular
staining in each tissue section. Some variations have been made in the “family”
of Golgi techniques to serve as alternatives to provide useful results (Nauta &
Ebbesson, 1970; Rosoklija et al., 2003), such as the use of different solutions in
the “rapid Golgi” and the Golgi-Cox variations (Valverde, 1962; McDonald,
1982), the control of the diffusion rate, and the pH of the chromation solution
(Angulo et al., 1996), or the establishment of the best technique according to
the fixation and storage condition of the tissue along time (Rosoklija et al., 2003;
Melendez-Ferro et al., 2009). Further comments and relevant contributions
based on the Golgi method results can be found in different neuroanatomical
and citological reports and references (Kolb et al., 1981; Millhouse, 1986;
Somogyi, 1990; Jacobs et al., 1997; Fairén, 2005; Larriva-Sahd, 2008).
After the work of Freund and Somogyi (1983), Gabbott and Somogyi
(1984) merit the development of the “single-section” Golgi method that proved
to be easy to execute, reliable, and relatively unexpensive. For example, it was
succesfully applied to clue the notable neuroendocrine modulation of the
number of dendritic spines in different brain areas of male and female rats
49
(Woolley and McEwen, 1994; Rasia Filho et al., 2004; Brusco et al., 2007). This
technique consists in sectioning the brain following perfusion with a
paraformaldehyde and picric acid fixation solution, placing sections in
potassium bicromate and, afterwards, between microscopic cover slips to
“sandwich” them prior to the impregnation in silver nitrate (e.g., Rasia Filho et
al., 1999, 2004). Izzo, Graybiel and Bolam developed an elegant modification of
the “single-section” technique that provided other rapid and consistently good
Golgi tool (Izzo et al., 1987). In this method, osmium tetroxide was added to the
reaction prior to silver nitrate and brain slices were placed between microscopic
slides, which would also allow an easier handling of serial sections (see detailed
data in Bolam, 1992). This technique could be combined with
immunocytochemistry for neurotransmitters or related substances, as was the
case of Golgi-impregnated substance P- and [Met]enkephalin-immunoreactive
neurons in the caudate nucleus of cats and ferrets (Izzo et al., 1987). Electron
microscopy images could also be obtained using this protocol after a
deimpregnation procedure (Bolam, 1992).
Efforts have been devoted to provide a more suitable Golgi method to
reveal the neuronal morphology in cortical and subcortical areas of human
brains kept stored under different conditions (Rosoklija et al., 2003; Friedland et
al., 2006; Melendez-Ferro et al., 2009). Here we describe that a combination of
the original “single-section” Golgi method (Gabbott and Somogyi, 1984) and the
procedure proposed by Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) is useful to study
the human brain and can be easily applied to formalin-fixed tissue stored for
months. Osmication provided best results. This contribution adds to the basic
procedures for the study of the human nervous tissue already available but with
the same advantages that made the original “single-section” Golgi method
useful and employed in other animals, i.e., it is easy, fast, requires minimal
equipments, and provides consistent results. Advantages and drawbacks of this
procedure will be depicted below.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Subjects
The subjects were 2 males, aged 47 and 68 years-old, who died of non
violent causes or acute/chronic neurologic diseases (in these cases, congestive
50
heart failure and heart infarction). Part of the temporal lobes from human brains
were obtained during necropsies from the Department of Legal Medicine from
the “General Institute of Legal Investigation” (Rio Grande do Sul, Brazil). No
perfusion of fixative solution was done prior to tissue removal. The interval
between the death and the necropsies varied from at least 6 h, according to
Brazilian laws, to 8 h at the most. Previous clinical and co-morbid data were
obtained during an interview directed to the relatives or legal representatives,
who also signed an informed consent prior to the inclusion in this study. All the
legal and ethical procedures were followed in accordance to international and
local regulations. regulatory standards (based on the 1964 Declaration of
Helsinki) and ethical committee approvals obtained from the Department of
Legal Medicine from the State of Rio Grande do Sul (process number 03/08),
the Federal University of Health Sciences of Porto Alegre (process number
541/07), and the Federal University of Rio Grande do Sul (process number
2008009), Brazil.
2.2. Tissue fixation and the impregnation procedure
Blocks containing the temporal lobe (appoximately 5 cm of length from
the anterior pole) were immediately immersed in unbuffered 10% formalin and
kept stored in this same fixative solution for approximately 20 months (fixative
solutions were around pH 4.0). Small samples were trimmed to ~1.5 cm3 to
contain the temporal cortex and the adjacent striatum (DeArmond et al., 1989).
Tissue samples were coronally sectioned in slices 200 µm thick using a
vibratome (Leica, Germany), and submitted to the following steps: (1) Free-
floating sections were post-fixed with 4% paraformaldehyde and 1.5% picric
acid in 0.1 M phosphate buffer solution (PBS, pH = 7.4) either for 24 h or 72 h in
the dark at 4°C. (2) The sections were quickly rinsed in PBS, transferred to a
0.02% osmium tetroxide solution in PBS for 10 to 30 min under gentle shaking
in the dark; quickly rinsed in PBS for 1 to 2 min, and (3) immersed in 3%
potassium dichromate (Merck, Germany) in deionized water, and kept in the
same solution in the dark at 4°C either for 24 h or 72 h after which the sections
were quickly rinsed again in distilled water (if necessary to remove excess of
chromation, repeat this step) and “sandwiched” between glass coverslips glued
51
(epoxy glue) in the four corners to allow small diffusion rate of solution. (4) The
slides were gently placed in the impregnation solution of 1.5% silver nitrate
(Merck, Germany) in deionized water at room temperature (RT) in the dark
either for 24 h or 72 h. After that period, the coverslips were broken, the
sections were removed and rinsed in distilled water to remove the excess of
crystals with a soft paintbrush and mounted on slides. Finally, the slides were
dried at RT (caution was taken to avoid overdrying), immersed in distilled water
(3 min, once) and dehydrated in ascending series of ethanol as follows: 70%
and 80% 3 min each; 95% and 100% twice, 3 min each; diaphanized in
xylene/ethanol 1:1 and 2:1, 3 min each; xylene 100%, two rinses of 3 and 6 min
each; mounted with coverslips and non-acidic synthetic balsam avoiding
bubbles, and left to dry at RT for 24 h.
As noted above, if the steps 1, 3, and 4 are going to be done at the
minimum time required (24 h), 5 days will be needed to finish the Golgi stain. If
72 h is going to be the choice as preferred time for these steps, 11 days will be
needed to obtain the final results.
2.3. Imaging
Slides were observed with a Nikon Eclipse E-600 microscope (400 X,
Japan) coupled to a Pro-Series High Performance CCD camera (or other of
high quality). Stacks of photomicrographs provided the final image using the
Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, USA). Sharpening,
brightness or background contrast were slightly adjusted using the Adobe
Photoshop 7.0 software (USA).
3. RESULTS
As with other Golgi techniques, the present method impregnated a small
percentage of neurons and glial cells in the slices of cortex and striatum
(Figures 1 and 2), sometimes near the borders of the sections. The worst
images were produced without osmication (Figure 1A). However, even after all
methodological steps, some cells were not completely visible. That is, neurons
52
could appear with a fading staining or with “cut-off” branches. An example of
that can be found in Figure 1B, where it is shown a pyramidal neuron from the
temporal cortex with relatively short basal dendrites and the apical dendrite with
uncharacteristic short branches after bifurcation. Deceptive results can occur
when the formalin solution was renewed before processing the tissue.
Unbuffered 10% formalin solution with pH around 2.5 led to no remarkable
impregnation even after testing different variations in time of processing and/or
solute concentrations; also, unwanted silver crystals over the tissue or blood
vessels impregnated occurred in all samples tested.
On the other hand, after osmication, several well-impregnated cells
(neurons and glial cells) appeared black stained against a minimal soft yellow
background and with scatered non specific precipitation in the neuropil (Figures
1B-1F and 2). The quality of impregnation was very similar when visually
comparing the results obtained along 5 to 11 days of chromation/silver nitrate
after osmication. Different neuron types could be observed within the same
brain section, cell bodies with emerging dendrites that radiate in different
directions and branched accordingly, pleomorphic dendritic spines (even at a
lower microscopic magnification) and a profusion of thin axons and their
collateral processes (Figures 1C and D). In the striatum (head of the caudate
nucleus based on DeArmond et al., 1987), more complete multipolar medium-
spiny neurons were impregnated (Figures 2A and B). They appeared as in other
classical descriptions, with a round cell body and various primary dendrites that
branched and tapered along the section. Dendritic spines with a continuum of
different shapes and sizes could be easily identified, allowing the different
classifications by shape as thin, stubby, mushroom-like or wide (Figure 2C).
Glial cells in close apposition to blood vessels or perineuronal appeared
also well-impregnated (Figures 1E-F and 2A). Astrocytes with a profuse
ramification (Figure 1E) and with notable end-feet processes (Figure 1F) were
found in different areas.
4. DISCUSSION
The present use of the original “single-section” Golgi method (without
osmium) and its adaptation after Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) represents
53
another technique to be used for the study of the morphology of human brain
cells. One of its advantages is that it can be applied to formalin-fixed human
tissue stored for a long time, allowing the study of neurons and glial cells in
brain samples maintained under the routinely fixation procedure done for
anatomical pieces. While we developed this technique in brain samples stored
for almost 2 years in formalin solution, other time periods could be tested as
well. The osmication provided the best results and all the experimental steps
could be done in few days. Drawbacks of using the Golgi method are the
absence of a complete neuronal impregnation or the intra- and inter-experiment
variability in the results (Scheibel and Scheibel, 1978; Rasia Filho et al. 1999).
Other intervening variables might affect final results, such as the age of the
subjects, their past health condition or use of uninformed medication, the
degree of cellular post-mortem necrosis, and/or variations in the diffusion rate of
the fixative solution.
Nevertheless, morphological data from Golgi results can allow relevant
insights regarding the cytoarchitectonic organization and function of different
brain areas (Ramón y Cajal, 1909; Szentágothai, 1978; Somogyi, 1990; Larriva-
Sahd, 2008). As previously stated, “Golgi staining requires a significant
investment in tissue, time, and materials, and unless great care is taken, it can
fail completely” (reviewed in Rosoklija et al., 2003). This is true under many
circumstances. Here, it is presented another procedure, which adds to the basic
ones for the study of the human nervous tissue, with the same advantages
described for the “single-section” Golgi method in other species. It is relatively
easy, fast (5-11 experimental days), and feasible, requires minimal equipments,
and provides suitable data from formalin-fixed human brain tissue. Moreover,
qualitative and quantitative studies can be conducted in well-impregnated
neurons under light microscopy (see examples in Rasia Filho et al., 2004; de
Castilhos et al., 2006; Brusco et al., 2008; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; de
Castilhos et al., 2008).
Comparatively to other current protocols, the Golgi-Cox method on long-
term fixed human tissue (10% neutral buffered formalin for up to 15 years) did
not render satisfactory results even when pretreatments (citrate bufferand
sodim borohydre) are used to remove excess of fixation prior to chromation
(Melendez-Ferro et al., 2009). Other procedures as the rapid Golgi and the
54
Golgi-Kopsch (also named Colonnier-Golgi or aldehyde Golgi) gave nice results
with tissues that were fixed in formalin, which lost its buffering capacity overt
time, and that were stored from 15 months up to 55 years (Rosoklija et al.,
2003). Here, sections were obtained without prior embedding in polymerized
plastic (Moss and Whetsell, 2004) and impregnation did not require microwave
heating for 6-8 h (Armstrong & Parker, 1986). The present method also allowed
the observation of glial cells, which can be compared to the Golgi-Hortega-
Lavilla silver impregnation technique for glutaraldehyde-paraformaldehyde
prolonged fixed brain tissue (D‟amelio, 1983). At the same time, the “single-
section” Golgi method provided akin and complementary data to other
stereological, immunocytochemical or immunohistochemical techniques for
confocal or electron microscopy (Fairén et al., 1977; Kisvárday et al., 1990;
Hermel et al., 2006; Martinez et al., 2006; Cunningham et al., 2007).
5. CONCLUSION
In conclusion, this contribution adds to other basic techniques for the
study of the human nervous tissue celularity, but has the advantages of the
“single-section” Golgi method previoulsy employed for other species. We would
like to consider it a procedure open to additional contributions, as occurred for
the original descriptions of this method (Freund & Somogyi, 1983; Gabbott &
Somogyi, 1984; Izzo et al., 1987; Bolam, 1992). Because this technique has
some relevant advantages for its execution, we look forward for its use and
improvement elsewhere. Some adaptations probably will be needed to meet
specific research interests, having this present approach as a guide.
6. ACKNOWLEDGEMENTS
Authors are thankful to the relatives that donated the tissue that resulted
in the present experimental study. Also, to Dr. Matilde Achaval (University of
Rio Grande do Sul, Brazil) for helpful comments during the preparation of the
55
manuscript. Grants from the Brazilian Federal Agency CNPq. JEM and AARF
are CNPq researchers.
7. REFERENCES
Angulo A, Fernández E, Merchán JA, Molina M. A reliable method for Golgi
staining of retina and brain slices. J. Neurosci. Methods, 1996; 66: 55-59.
Armstrong E, Parker B. A new Golgi method for adult human brains. J.
Neurosci. Methods, 1986; 17: 247-54.
Bolam JP. Experimental Neuroanatomy: A Practical Approach. Oxford
University Press: New York, 1992: 296.
Brusco J, Wittmann R, de Azevedo MS, Lucion AB, Franci CR, Giovenardi M,
Rasia Filho AA. Plasma hormonal profiles and dendritic spine density and
morphology in the hippocampal CA1 stratum radiatum, evidenced by light
microscopy, of virgin and postpartum female rats. Neurosci. Lett., 2008;
438: 346-50.
Cunningham RL, Claiborne BJ, McGinnis MY. Pubertal exposure to anabolic
androgenic steroids increases spine densities on neurons in the limbic
system of male rats. Neuroscience, 2007; 150: 609-15.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of posterodorsal medial amygdala neurons of adult male and
female rats: Further data based on the Golgi method. Neurosci. Lett.,
2008a; 430: 151–56.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of Golgi-impregnated neurons from the “ventral” medial amygdala
subnuclei of adult male and female rats. Neurosci. Lett., 2008b; 439: 287-
92.
D‟amelio FE. The Golgi-Hortega-Lavilla technique, with a useful additional step
for application to brain tissue after prolonged fixation. Biotech. Histochem.,
1983; 58: 79-84.
DeArmond SJ, Fusco MM, Dewey MM. Structure of the Human Brain, third ed.
Oxford University Press: New York, 1989: 208.
56
de Castilhos J, Forti CD, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic spine density of
posterodorsal medial amygdala neurons can be affected by gonadectomy
and sex steroid manipulations in adult rats: A Golgi study. Brain Res.,
2008; 1240: 73-81.
de Castilhos J, Marcuzzo S, Forti CD, Frey RM, Stein D, Achaval M, Rasia Filho
AA. Further studies on the rat posterodorsal medial amygdala: dendritic
spine density and effect of 8-OH-DPAT microinjection on male sexual
behavior. Brain Res. Bull., 2006; 69: 131–39.
Fairén A, Peters A, Saldanha J. A new procedure for examining Golgi
impregnated neurons by light and electron microscopy. J. Neurocytol.,
1977; 6: 311-37.
Freund TF, Somogyi P. The Section-Golgi impregnation procedure. 1.
Description of the method and its combination with histochemistry after
intracellular iontophoresis or retrograde transport of horseradish
peroxidase. Neuroscience, 1983; 9: 463-74.
Friedlander DR, Los JG, Ryugo DK. A modified Golgi staining protocol for use
in the human brain stem and cerebellum. J. Neurosci. Methods, 2006; 150:
90-5.
Gabbott PL, Somogyi J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure:
methodological description. J. Neurosci. Methods, 1984; 11: 221-30.
Kisvárday ZF, Gulyas A, Beroukas D, North JB, Chubb IW, Somogyi P.
Synapses, axonal and dendritic patterns of GABA-immunoreactive
neurons in human cerebral cortex. Brain, 1990; 113: 793-812.
Golgi C. Sulla struttura della sostansa grigia del cervello. Gazzetta Medica
Italiana, 1873; 33: 244-46.
Gómez-Villalobos MJ, Gordillo AC, López Jr, Flores G. The utility of the Golgi-
Cox method in the morphological characterization of the autonomic
innervation in the rat heart. J. Neurosci. Methods, 2009; 179: 40-4.
Hermel EES, Ilha J, Xavier LL, Rasia Filho AA, Achaval M. Influence of sex and
estrous cycle, but not laterality, on the neuronal somatic volume of the
posterodorsal medial amygdala of rats. Neurosci. Lett., 2006; 405: 153-58.
Izzo PN, Graybiel AM, Bolam JP. Characterization of substance P- and
[Met]enkephalin-immunoreactive neurons in the caudate nucleus of cat
57
and ferret by a single section Golgi procedure. Neuroscience, 1987; 20:
577-87.
Jacobs B, Driscoll L, Schall M. Life-span dendritic and spine changes in areas
10 and 18 of human cortex: A quantitative Golgi study. J. Comp. Neurol.,
1997; 386: 661–680.
Kolb H, Nelson R, Mariani A. Amacrine cells, bipolar cells and ganglion cells of
the cat retina: A Golgi study. Vision Res., 1981; 21: 1081-1114.
Larriva-Sahd J. Histological and cytological study of the bed nuclei of the stria
terminalis in adult rat. II. Oval nucleus: extrinsic inputs, cell types, neuropil,
and neuronal modules. J. Comp. Neurol., 2006; 497: 772-807.
Martinez FG, Hermel EE, Xavier LL, Viola GG, Riboldi J, Rasia Filho AA,
Achaval M. Gonadal hormone regulation of glial fibrillary acidic protein
immunoreactivity in the medial amygdala subnuclei across the estrous
cycle and in castrated and treated female rats. Brain Res., 2006; 1108:
117-26.
McDonald AJ. Cytoarchitecture of the central amygdaloid nucleus of the rat. J.
Comp. Neurol., 1982; 208: 401-18.
Melendez-Ferro M, Perez-Costas E, Roberts RC. A new use for long-term
frozen brain tissue: Golgi impregnation. J. Neurosci. Methods, 2009; 176:
72-7.
Millhouse OE. The intercalated cells of the amygdala. J. Comp. Neurol., 1986;
247: 246-71.
Moss TL, Whetsell Jr WO. Techniques for thick-section Golgi impregnation of
formalin-fixed brain tissue. In Kohwi Y, editor. Methods in Molecular
Biology, volume 277. Humana Press: Totowa, 2004: 277-285.
Nauta WJH, Ebbesson SOE. Contemporary Research Methods in
Neuroanatomy, first edition. Springer-Verlag: New York, 1970: 386.
Ramón y Cajal S. Histologie du système nerveux de l´Homme et des vertébrés.
Maloine: Paris, 1909: 986.
Rasia Filho AA, Brusco J, Moreira, JE. Spine plasticity in the rat medial
amygdala. In Baylog RL, editor. Dendritic Spines: Biochemistry, Modeling
and Properties. Nova Science Publishers: Hauppauge, 2009, ISBN 978-1-
60741-406-5.
58
Rasia Filho AA, Fabian C, Rigoti K, Achaval M. Influence of sex, estrous cycle
and motherhood in dendritic spine density in the rat medial amygdala
revealed by the Golgi method. Neuroscience, 2004; 126: 839-47.
Rasia Filho AA, Londero RG, Achaval M. Effects of gonadal hormones on the
morphology of neurons from the medial amygdaloid nucleus of rats. Brain
Res. Bull., 1999; 48: 173-83.
Rosoklija G, Mancevski B, Ilievski B, Perera T, Lisanby SH, Coplan JD, Duma
A, Serafimova T, Dwork AJ. Optimization of Golgi methods for
impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J. Neurosci.
Methods, 2003; 131: 1-7.
Scheibel ME, Scheibel AB. The Methods of Golgi. In Robertson RT, editor.
Neuroanatomical Research Techniques. Academic Press: New York,
1978: 89-114.
Somogyi P. Synaptic connections of neurons identified by Golgi impregnation:
Characterization by immunocytochemical, enzyme histochemical, and
degeneration methods. J. Electron Microsc. Techn., 1990; 15: 332-51.
Szentágothai J. The neuron network of the cerebral cortex: A functional
interpretation. Proc. R. Soc. Lond. B., 1978; 201: 219-48.
Valverde F. Intrinsic organization of the amygdaloid complex. A Golgi study in
the mouse. Trab. Inst. Cajal Invest. Biol., 1962; 54: 291-314.
Woolley CS, McEwen BS. Estradiol regulates hippocampal dendritic spine
density via an N-methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism. J.
Neurosci., 1994; 14: 7680-87.
59
LEGENDS
Figure 1. Reconstructed digitized microscopic images of Golgi-impregnated
cells from the human cerebral cortex (temporal lobe) and striatum (head of the
caudate nucleus). An adaptation of the “single-section” Golgi method was used
in formalin-fixed samples, either without previous osmication (A, which
presented the worst results) or after osmication (B-F) and along different
processing periods (5-11 days). Compared to the local estimated population of
neurons, a small percentage of them were impregnated in the sampled brain
areas. Although some neurons showed branching dendrites, they still appeared
incomplete (B, C). Otherwise, a more extensive impregnation could be obtained
as well, revealing the axonal network close to a neuron (C) or the general
morphology of a neuronal subpopulation (D). Dark impregnated astrocytes were
found close to blood vessels (E) with characteristic end-feet processes (F). As a
rule, the lighter background enabled an adequate contrast for the cellular
impregnation result.
Figure 2. (A) Reconstructed digitized microscopic images of impregnated
neurons from the human caudate nucleus using an adaptation of the “single-
section” Golgi method for formalin-fixed samples. The selected area in A (dark
box) was zoomed up to show details of the neuronal morphology, i.e, cell body,
branching dendrites, and spines (B). Note the presence of pleomorphic dendritic
spines (C) classified as thin (t), “mushroom-like” (m), stubby (s) or wide (w).
60
Figure 1.
61
Figure 2.
62
5. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS
______________________________
MÉTODO DE GOLGI “SINGLE-SECTION” ADAPTADO PARA ENCÉFALO
HUMANO FIXADO EM FORMALDEÍDO E PARA MICROSCOPIA DE LUZ
Aline Dall‟Oglio1+, Denise Ferme2+, Janaína Brusco3,5, Jorge E. Moreira3,5,
Alberto A. Rasia Filho1, 2, 4
1 Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
2 Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências
da Saúde, Porto Alegre, Brasil
3 Laboratório de Estrutura Sináptica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Brasil
4 Departamento de Ciências Básicas/Fisiologia, Universidade Federal de
Ciências da Saúde, Porto Alegre, Brasil
5 Programa de de Pós-Graduação em Neurociência e Comportamento,
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil
+ Esses autores contribuíram igualmente para o presente estudo
Autor para correspondência: Alberto A. Rasia Filho, UFCSPA / Fisiologia.
Rua Sarmento Leite, 245 (sala 308), Porto Alegre 90170-050 RS, Brasil. Fone:
+ 55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail: [email protected]
Aline Dall’Oglio, M.Sc.
Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Instituto de Ciências Básicas,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Rua Sarmento Leite, 500, Porto
Alegre, RS, Brasil, CEP 90.050-110
Denise Gomes Rodrigues Ferme
Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências
da Saúde. Rua Sarmento Leite, 245, Porto Alegre, RS, Brasil, CEP 90.050-110
63
Janaína Brusco
Laboratório de Estrutura Sináptica, Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, SP,
Brasil, CEP 14.049-900
Jorge E. Moreira, Ph.D.
Laboratório de Estrutura Sináptica, Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, SP,
Brasil, CEP 14.049-900
Alberto A. Rasia-Filho, M.D., Ph.D.
Departamento de Ciências Básicas / Fisiologia, Universidade Federal de
Ciências da Saúde, Rua Sarmento Leite, 245, Porto Alegre, RS, Brasil, CEP
90.050-110
Fone: + 55 51 9116-1643
Fax: + 55 51 3303-8752
E-mail: [email protected]
64
RESUMO
O método de Golgi tem sido utilizado por mais de um século para
descrever a morfologia geral dos neurônios no sistema nervoso de diferentes
espécies. O método de Golgi nomeado “single-section” por Gabbot & Somogyi
(1984) e as modificações feitas por Izzo, Graybiel & Bolam (1987) é um
procedimento fácil, rápido de ser realizado e capaz de produzir resultados
consistentes quando usado em ratos, furões e gatos. Descrever-se-á a técnica
para que sejam impregnados neurônios corticais e subcorticais em encéfalos
humanos fixados em formaldeído não tamponado e armazenados nessa
condição por meses. O tecido foi seccionado em vibrátomo, pós-fixado em uma
combinação de paraformaldeído e ácido pícrico em tampão fosfato, imerso em
tetróxido de ósmio e em bicromato de potássio, submetido a “sanduíche” entre
lamínulas histológicas e impregnado em nitrato de prata. Todos esses passos
levaram entre 5 e 11 dias para fornecerem resultados úteis. O método de Golgi
tem algumas desvantagens características, mas, com o presente
procedimento, os neurônios e a glia aparecem bem impregnados,
possibilitando estudos quantitativos e qualitativos mais aprofundados sob
microscopia de luz. Esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o
estudo das células do tecido nervoso humano com as mesmas vantagens
descritas para o método de Golgi “single-section” já empregado em outras
espécies. Ou seja, é técnica fácil, rápida, exequível, que requer equipamentos
mínimos e fornece dados confiáveis a partir de tecido fixado em formaldeído.
PALAVRAS CHAVE: método de Golgi, ósmio, impregnação por prata,
morfologia neuronal, células gliais
Título abreviado: Método de Golgi “single-section” para encéfalo humano
65
1. INTRODUÇÃO
A “colorazione nera”, termo original para o procedimento de
impregnação nervosa pela prata, tem sido há muito tempo o método utilizado
para revelar a morfologia geral de neurônios e glia em diferentes áreas do
sistema nervoso de diversas espécies (Golgi, 1873; Ramón y Cajal, 1909;
Scheibel & Scheibel, 1978; Somogyi, 1990). Estudos filogenéticos e
ontogenéticos sob condições normais ou patológicas tem se beneficiado dos
resultados obtidos com o método de Golgi (Ramón y Cajal, 1909). Quando
realizado com bom sucesso, o método de Golgi é uma técnica confiável para
revelar diferentes tipos de neurônios, sua estrutura geral detalhada e para
indicar possíveis relações funcionais para dados morfológicos (Wooley &
McEwen, 1994; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008; Gómez-
Villalobos et al., 2009; Rasia Filho et al., 2009).
Assim como acontece com outras técnicas, o método de Golgi tem
vantagens e restrições. Embora tenha sido demonstrado que a precipitação da
prata ocorra no interior celular (Fairén et al., 1977; Bolam, 1992), nem todos os
fatores que modificam os resultados finais do procedimento para tal
impregnação são conhecidos. Isso leva a um número imprevisível de neurônios
corados utilizáveis e um padrão não homogêneo de coloração celular em cada
secção de tecido nervoso. Algumas variações foram feitas na “família” das
técnicas de Golgi para servirem como alternativas para a obtenção de
resultados úteis (Nauta & Ebbesson, 1970; Rosoklija et al, 2003), tais como o
uso de diferentes soluções no método de Golgi „rápido” e as variações de
Golgi-Cox (Valverde, 1962; McDonald, 1982), o controle da velocidade de
difusão e o pH da solução de coloração (Angulo et al., 1996) ou o
estabelecimento da melhor técnica de acordo com as condições de fixação e
armazenamento do tecido ao longo do tempo (Rosoklija et al., 2003; Melendez-
Ferro et al., 2009). Comentários adicionais e contribuições relevantes baseadas
nos resultados do método de Golgi podem ser encontrados em outras
referências (Kolb et al., 1981; Izzo et al., 1987; Jacobs et al., 1997; Rosoklija et
al., 2003; Fairén, 2005; Larriva-Sahd, 2008).
Após o trabalho de Freund & Somogyi (1983), Gabbott & Somogyi
(1984) tiveram o mérito do desenvolvimento do método de Golgi nomeado
66
“single-section” que provou ser fácil de ser executado, confiável e relativamente
barato. Por exemplo, ele foi e ainda tem sido aplicado para estudar a notável
modulação neuroendócrina do número de espinhos dendríticos em diferentes
áreas do cérebro de ratos machos e fêmeas (Woolley & McEwen, 1994; Rasia
Filho et al., 2004; Brusco et al., 2007). Essa técnica consiste na secção do
encéfalo seguida da perfusão com uma solução de fixação de paraformaldeído
e ácido pícrico, com as secções sendo colocadas em bicromato de potássio e,
após, entre lamínulas de vidro como se fora um “sanduíche” antes da
impregnação com nitrato de prata (vejam-se Rasia Filho et al., 1999, 2004).
Izzo, Graybiel & Bolam desenvolveram uma elegante modificação da técnica
“single-section” que gerou uma alternativa rápida, com boa qualidade e
consistentemente reproduzível (Izzo et al., 1987). Nesse método foi adicionado
tetróxido de ósmio à reação antes do nitrato de prata e secções do encéfalo
foram colocadas entre lâminas de vidro, o que também permitiu um manuseio
mais fácil de secções seriadas (ver detalhes em Bolam, 1992). Essa técnica
pode ser combinada com imunocitoquímica para neurotransmissores ou
substâncias relacionadas, como ocorreu para o estudo da substância P e de
neurônios imunorreativos à [Met]-encefalina do núcleo caudado de gatos e
furões (Izzo et al., 1987). Imagens de microscopia eletrônica também podem
ser obtidas utilizando-se esse protocolo e após um procedimento de remoção
parcial da impregnação pela prata (Bolam, 1992).
Vários esforços têm sido feitos para que se desenvolva um método de
Golgi que revele a morfologia neuronal em áreas corticais e subcorticais de
encéfalos humanos armazenados em diferentes condições laboratoriais
(Rosoklija et al., 2003; Friedland et al., 2006; Melendez-Ferro et al., 2009). Aqui
descrever-se-á que uma combinação do método de Golgi “single-section”
original (Gabbott & Somogyi, 1984) e o procedimento proposto por Izzo et al.
(1987) e Bolam (1992) é útil para o estudo do cérebro humano e pode ser
facilmente aplicada a tecidos fixados em formaldeído armazenados por meses.
O emprego concomitante de ósmio gerou os melhores resultados. Esta
contribuição soma-se às técnicas básicas para o estudo das células do tecido
nervoso humano já disponíveis, mas com as mesmas vantagens que tornaram
o método de Golgi “single-section” original útil e aplicado em outras espécies,
ou seja, é fácil, rápido, requer equipamentos mínimos e fornece dados
67
confiáveis. Vantagens e desvantagens desse procedimento serão descritos a
seguir.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Indivíduos
Foram estudados dois homens, com idades de 47 e 68 anos, que
morreram de causas não violentas e sem doenças neurológicas agudas ou
crônicas (nesses casos, advindos de insuficiência cardíaca congestiva e infarto
do miocárdio). Partes dos lobos temporais bilaterais foram obtidas durante as
necropsias no Departamento de Medicina Legal do Instituto Geral de Perícias
(Estado do Rio Grande do Sul, Brasil). Nenhuma solução de fixação ou
perfusão foi utilizada antes da remoção do tecido. O intervalo entre a morte e a
necropsia variou do mínimo de 6 horas (de acordo com a legislação brasileira)
até no máximo 8 horas. Dados clínicos e de comorbidades prévios foram
obtidos por meio de entrevista dirigida a familiares ou representantes legais, os
quais também assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, o qual
foi detalhado anteriormente à inclusão neste estudo. Todos os procedimentos
éticos e legais foram seguidos de acordo com os padrões regulatórios
internacionais (baseados na Declaração de Helsinki de 1964), além da
aprovação dos Comitês de Ética do Departamento de Medicina Legal do
Estado do Rio Grande do Sul (processo nº 03/08), da Universidade Federal de
Ciências da Saúde de Porto Alegre (processo nº 541/07) e da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (processo nº 2008009).
2.2. Fixação do tecido e procedimento de impregnação
Blocos contendo o lobo temporal (aproximadamente 5 cm de distância a
partir do seu polo anterior) foram imediatamente imersos em formaldeído 10%
não tamponado e mantidos armazenados nessa mesma solução de fixação por
aproximadamente 20 meses (neste momento, as soluções de fixação estavam
com pH em torno de 4,0). Do bloco original, pequenas amostras com
68
aproximadamente 1,5 cm3 foram retiradas onde estavam o córtex temporal e o
estriado adjacente (DeArmond et al., 1989). As amostras de tecido foram
seccionadas (cortes coronais de 200 µm de espessura) utilizando-se um
vibrátomo (Leica, Alemanha) e submetidas às seguintes etapas: (1) Pós-
fixação com paraformaldeído a 4% e ácido pícrico a 1,5% em solução de
tampão fosfato (PBS) 0,1 M (pH = 7,4) por 24 h ou 72 h, protegidas da luz e à
4°C. (2) A seguir, as secções foram rapidamente lavadas em PBS, transferidas
para uma solução de tetróxido de ósmio a 0,02% em PBS entre 10 a 30
minutos com agitação suave e protegidas da luz, novamente lavadas com PBS
por 1 a 2 minutos e, (3) foram imersas em dicromato de potássio a 3% (Merck,
Alemanha) dissolvido em água deionizada e mantidas na mesma solução, no
escuro, à 4°C por 24 h ou 72 h. Após, as secções foram novamente lavadas
com água destilada (esse passo podia ser repetido, se necessário, para
remover o excesso de coloração) e delas foram feitos “sanduíches” entre
lamínulas de vidro, nos quais foi colocado cola epóxi nos quatro cantos para
permitir uma pequena velocidade de difusão da próxima solução a ser
empregada. (4) As lâminas foram cuidadosamente colocadas na solução de
impregnação de nitrato de prata a 1,5% (Merck, Alemanha) diluído em água
deionizada, à temperatura ambiente (TA) e no escuro por 24 h ou 72 h. As
lamínulas foram então quebradas, as secções foram removidas, lavadas em
água destilada e, para remoção de cristais sobre os cortes, utilizou-se um
pincel macio. Finalmente, os cortes foram colocados em lâminas, secos à
temperatura ambiente tomando-se cuidado para evitar secagem excessiva,
imersos em água destilada (3 minutos, uma única vez), desidratados em séries
ascendentes de álcool (70% e 80%, uma vez, 3 minutos cada; 95% e 100%,
duas vezes, 3 minutos cada), diafanizados em solução de xilol/álcool absoluto
1:1 e 2:1 (3 minutos, uma vez) e xilol 100% (2 vezes de 3 a 6 minutos cada),
acrescentado bálsamo sintético não ácido e lamínulas, evitando-se bolhas de
ar, e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h.
Conforme descrito, se os passos 1, 3 e 4 forem feitos no tempo mínimo
necessário (24 h), serão utilizados 5 dias para a conclusão deste procedimento
de Golgi. Se a escolha for de 72 h como o tempo preferencial para esses
passos, 11 dias serão necessários para a obtenção dos resultados finais.
69
2.3. Obtenção de imagens
As lâminas foram observadas em um microscópio Nikon Eclipse E-600
(400 X, Japão) acoplado a uma câmara Pro-Series High Performance CCD (ou
outra de alta qualidade). O somatório das sequências de fotomicrografias
forneceu a imagem final utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media
Cybernetics, EUA). Pequenos ajustes de bordo, brilho ou contraste de fundo
foram obtidos utilizando-se o software Adobe Photoshop 7.0 (EUA).
3. RESULTADOS
Assim como ocorre com outras técnicas de Golgi, o presente método
impregnou um pequeno percentual de neurônios e células gliais nas amostras
de córtex cerebral e estriado estudadas (Figuras 1 e 2) e, em algumas vezes,
próximos das bordas das secções. As piores impregnações foram obtidas sem
o emprego do ósmio (Figura 1A). Não obstante, mesmo após todos os passos
metodológicos, algumas células não ficaram completamente visíveis. Isto é, os
neurônios podiam aparecer evidenciando uma perda gradual da impregnação
pela prata, com ramos seccionados ou evidenciando uma parada abrupta da
impregnação. Um exemplo disso é encontrado na Figura 1B, onde é mostrado
um neurônio piramidal do córtex temporal com dendritos basais relativamente
curtos e o dendrito apical com ramos anormalmente curtos e não
característicos logo após uma ramificação. Resultados decepcionantes
ocorreram quando a solução de formaldeído foi substituída antes do
processamento do tecido. Solução de formaldeído a 10% não tamponada e
com pH em torno de 2.5 não permitiu uma impregnação celular satisfatória,
mesmo após serem testadas diferentes variações de tempo de processamento
e/ou concentrações do solutos. Também foram encontrados cristais de
cromo/prata indesejados sobre o tecido ou vasos sanguíneos impregnados em
todas as amostras testadas.
Por outro lado, após o emprego de ósmio, diversas células bem
impregnadas (neurônios e células gliais) apareceram coradas de pardo ou
preto contra um fundo amarelo claro e com pouca precipitação inespecífica em
70
seu entorno (Figuras 1B-1F e 2). A qualidade da impregnação era semelhante
quando visualmente comparados os resultados obtidos ao longo de 5 ou 11
dias de processamento histológico. Diferentes tipos de neurônios puderam ser
observados na mesma secção tecidual, com corpos celulares dos quais
dendritos primários emergentes se projetavam em diferentes direções e se
ramificavam a seguir. Espinhos dendríticos pleomórficos (observáveis mesmo
com um pequeno aumento microscópico) e uma profusão de axônios finos e
seus processos colaterais foram igualmente encontrados (Figuras 1C e D). No
estriado (cabeça do núcleo caudado, segundo DeArmond et al., 1987),
neurônios multipolares mais completos e com uma quantidade média de
espinhos foram impregnados (Figuras 2A e B). Eles apareceram como em
outras descrições clássicas, com um corpo celular arredondado e vários
dendritos primários que, ao se ramificarem, tornavam-se menos espessos ao
longo da secção. Espinhos dendríticos com um continuum de diferentes
formatos e tamanhos foram facilmente identificados, permitindo as diferentes
classificações por formato como finos (“thin”), arredondados e sem um pescoço
definido (“stubby”), em forma de cogumelo (“mushroom-like”) ou largos (“wide”;
Figura 2C).
Células gliais em íntima aposição a vasos sanguíneos ou em localização
perineuronal apareceram igualmente bem impregnadas (Figuras 1E-F e 2A).
Astrócitos com uma ramificação profusa (Figura 1E) e com notáveis processos
em direção a vasos sanguíneos (“end-feet”) foram encontrados em diversas
áreas (Figura 1F).
4. DISCUSSÃO
O emprego do método de Golgi denominado originalmente de “single-
section” (sem ósmio) e sua adaptação segundo Izzo et al. (1987) e Bolam
(1992) representa outra técnica que pode ser empregada para o estudo da
morfologia das células do encéfalo de seres humanos. Uma de suas vantagens
é que ela pode ser aplicada a tecido humano fixado em formaldeído e
armazenado por longo tempo, permitindo o estudo de neurônios e células gliais
em amostras de encéfalo mantidas sob procedimento de fixação simples e
71
rotineiro aplicado a peças anatômicas. Embora se tenha desenvolvido esta
técnica em amostras armazenadas por quase 2 anos, outros períodos de
tempo poderiam também ser testados. O uso do ósmio forneceu os melhores
resultados e todas as etapas experimentais puderam ser realizadas em poucos
dias. As desvantagens do uso do método de Golgi são a ausência de
impregnação neuronal completa ou a variabilidade nos resultados intra e inter-
experimento (Scheibel & Scheibel, 1978; Rasia Filho et al., 1999). Outras
variáveis que podem ter interferido e afetado os resultados finais são a idade
dos indivíduos, sua condição de saúde passada ou o uso de medicação não
informada, o grau de necrose celular post-mortem e/ou variações na difusão da
solução fixadora.
Não obstante, os dados morfológicos obtidos a partir dos resultados da
técnica de Golgi permitem inferências em relação à organização
citoarquitetônica e à função de diferentes áreas encefálicas (Ramón y Cajal,
1909; Szentágothai, 1978; Larriva-Sahd, 2008). Conforme descrito por
Rosoklija et al. (2003), “a coloração pelo método de Golgi requer um
investimento significativo de amostras teciduais, de tempo e de materiais e, a
menos que grande cuidado seja tomado, ela pode falhar completamente”. Isso
é uma verdade sob muitas circunstâncias. Aqui, entretanto, é apresentado um
outro procedimento que se soma às técnicas básicas para o estudo do tecido
nervoso humano com as mesmas vantagens descritas para o método de Golgi
“single-section” em outras espécies. Ele é relativamente fácil, rápido (5–11 dias
de experimento) e exequível, requer equipamentos mínimos e fornece dados
confiáveis de tecido cerebral humano fixado em formaldeído. Além disso,
estudos qualitativos e quantitativos podem ser conduzidos em neurônios bem
impregnados sob microscopia de luz (ver exemplos em Rasia Filho et al., 2004;
de Castilhos et al., 2006; Brusco et al., 2008; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; de
Castilhos et al., 2008).
Em comparação com outros protocolos atualmente em uso, o método de
Golgi-Cox para tecido humano após longo período de fixação (formaldeído 10%
tamponado por até 15 anos) não forneceu resultados satisfatórios mesmo
quando foram usados pré-tratamentos (tampão citrato e boroidro de sódio) para
remoção de excesso dos fixadores teciduais antes da coloração (Melendez-
Ferro et al., 2009). Outros procedimentos, como o Golgi “rápido” e o de Golgi-
72
Kopsch (também chamado Colonnier-Golgi ou Golgi-aldeído), forneceram bons
resultados com tecidos que foram fixados em formaldeído, o qual perdeu sua
capacidade de tamponamento ao longo do tempo, e que foram armazenados
de 15 meses a 55 anos (Rosoklija et al., 2003). Aqui as secções foram obtidas
sem inclusão prévia em plástico polimerizado (Moss & Whetsell, 2004) e a
impregnação não necessitou de aquecimento em micro-ondas por 6-8 h
(Armstrong & Parker, 1986). O presente método também permitiu a observação
de células gliais que puderam ser comparadas à técnica de impregnação com
prata de Golgi-Hortega-Lavilla para tecido cerebral com fixação prolongada
com glutaraldeído e paraformaldeído (D‟amelio, 1983). Ao mesmo tempo, o
método de Golgi “single-section” forneceu dados similares e complementares
para outras técnicas estereológicas, imunocitoquímicas ou imunoistoquímicas e
para a microscopia eletrônica ou confocal (Fairén et al., 1977; Kisvárday et al.,
1990; Hermel et al., 2006; Martinez et al., 2006; Cunningham et al., 2007).
5. CONCLUSÃO
Em conclusão, esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o
estudo das células do tecido nervoso humano, mas tem as vantagens do
método de Golgi “single-section” previamente aplicado a outras espécies.
Prefere-se considerá-la um procedimento aberto a contribuições adicionais,
como ocorreu com as descrições originais desse método (Freund & Somogyi,
1983; Gabbot & Somogyi, 1984; Izzo et al., 1987; Bolam, 1992). Uma vez que
esta técnica tem algumas vantagens relevantes para sua execução, esperamos
que seja utilizada e aprimorada de acordo com as necessidades de
experimentos futuros. Algumas adaptações provavelmente se farão
necessárias para que sejam atingidos objetivos específicos de pesquisa,
embora tendo a presente abordagem como um guia.
73
6. AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos aos familiares que doaram o tecido que resultou
no presente estudo experimental. Também à Dra. Matilde Achaval
(Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil) pelos comentários úteis
recebidos durante o preparo deste artigo. Apoio financeiro da Agência Federal
Brasileira CNPq. JEM e AARF são pesquisadores do CNPq.
7. REFERÊNCIAS
Alheid DGF, De Olmos JS, Beltramino CA. Amygdala and extended amygdala.
In: Paxinos G. The Rat Nervous System. San Diego: Academic Press.
1995;495-498.
Angulo A, Fernández E, Merchán JÁ, Molina M. A reliable method for Golgi
staining of retina and brain slices. J. Neurosci. Methods, 1996; 66: 55-59.
Bolam JP. Experimental Neuroanatomy: A Practical Approach. Oxford
University Press: New York, 1992: 296.
Brusco J, Wittmann R, de Azevedo MS, Lucion AB, Franci CR, Giovenardi M,
Rasia Filho AA. Plasma hormonal profiles and dendritic spine density and
morphology in the hippocampal CA1 stratum radiatum, evidenced by light
microscopy, of virgin and postpartum female rats. Neurosci. Lett., 2008;
438: 346-50.
Cunningham RL, Claiborne BJ, McGinnis MY. Pubertal exposure to anabolic
androgenic steroids increases spine densities on neurons in the limbic
system of male rats. Neuroscience, 2007; 150: 609-15.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of posterodorsal medial amygdala neurons of adult male and
female rats: Further data based on the Golgi method. Neurosci. Lett.,
2008a; 430: 151–56.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of Golgi-impregnated neurons from the “ventral” medial amygdala
74
subnuclei of adult male and female rats. Neurosci. Lett., 2008b; 439: 287-
92.
D‟amelio FE. The Golgi-Hortega-Lavilla technique, with a useful additional step
for application to brain tissue after prolonged fixation. Biotech. Histochem.,
1983; 58: 79-84.
DeArmond SJ, Fusco MM, Dewey MM. Structure of the Human Brain, third ed.
Oxford University Press: New York, 1989: 208.
de Castilhos J, Forti CD, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic spine density of
posterodorsal medial amygdala neurons can be affected by gonadectomy
and sex steroid manipulations in adult rats: A Golgi study. Brain Res.,
2008; 1240: 73-81.
de Castilhos J, Marcuzzo S, Forti CD, Frey RM, Stein D, Achaval M, Rasia Filho
AA. Further studies on the rat posterodorsal medial amygdala: dendritic
spine density and effect of 8-OH-DPAT microinjection on male sexual
behavior. Brain Res. Bull., 2006; 69: 131–39.
Fairén A, Peters A, Saldanha J. A new procedure for examining Golgi
impregnated neurons by light and electron microscopy. J. Neurocytol.,
1977; 6: 311-37.
Freund TF, Somogyi P. The Section-Golgi impregnation procedure. 1.
Description of the method and its combination with histochemistry after
intracellular iontophoresis or retrograde transport of horseradish
peroxidase. Neuroscience, 1983; 9: 463-74.
Friedlander DR, Los JG, Ryugo DK. A modified Golgi staining protocol for use
in the human brain stem and cerebellum. J. Neurosci. Methods, 2006; 150:
90-5.
Gabbott PL, Somogyi J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure:
methodological description. J. Neurosci. Methods, 1984; 11: 221-30.
Kisvárday ZF, Gulyas A, Beroukas D, North JB, Chubb IW, Somogyi P.
Synapses, axonal and dendritic patterns of GABA-immunoreactive
neurons in human cerebral cortex. Brain, 1990; 113: 793-812.
Golgi C. Sulla struttura della sostansa grigia del cervello. Gazzetta Medica
Italiana, 1873; 33: 244-46.
75
Gómez-Villalobos MJ, Gordillo AC, López Jr, Flores G. The utility of the Golgi-
Cox method in the morphological characterization of the autonomic
innervation in the rat heart. J. Neurosci. Methods, 2009; 179: 40-4.
Hermel EES, Ilha J, Xavier LL, Rasia Filho AA, Achaval M. Influence of sex and
estrous cycle, but not laterality, on the neuronal somatic volume of the
posterodorsal medial amygdala of rats. Neurosci. Lett., 2006; 405: 153-58.
Izzo PN, Graybiel AM, Bolam JP. Characterization of substance P- and
[Met]enkephalin-immunoreactive neurons in the caudate nucleus of cat
and ferret by a single section Golgi procedure. Neuroscience, 1987; 20:
577-87.
Jacobs B, Driscoll L, Schall M. Life-span dendritic and spine changes in areas
10 and 18 of human cortex: A quantitative Golgi study. J. Comp. Neurol.,
1997; 386: 661–680.
Kolb H, Nelson R, Mariani A. Amacrine cells, bipolar cells and ganglion cells of
the cat retina: A Golgi study. Vision Res., 1981; 21: 1081-1114.
Larriva-Sahd J. Histological and cytological study of the bed nuclei of the stria
terminalis in adult rat. II. Oval nucleus: extrinsic inputs, cell types, neuropil,
and neuronal modules. J. Comp. Neurol., 2006; 497: 772-807.
Martinez FG, Hermel EE, Xavier LL, Viola GG, Riboldi J, Rasia Filho AA,
Achaval M. Gonadal hormone regulation of glial fibrillary acidic protein
immunoreactivity in the medial amygdala subnuclei across the estrous
cycle and in castrated and treated female rats. Brain Res., 2006; 1108:
117-26.
McDonald AJ. Cytoarchitecture of the central amygdaloid nucleus of the rat. J.
Comp. Neurol., 1982; 208: 401-18.
Melendez-Ferro M, Perez-Costas E, Roberts RC. A new use for long-term
frozen brain tissue: Golgi impregnation. J. Neurosci. Methods, 2009; 176:
72-7.
Moss TL, Whetsell Jr WO. Techniques for thick-section Golgi impregnation of
formalin-fixed brain tissue. In Kohwi Y, editor. Methods in Molecular
Biology, volume 277. Humana Press: Totowa, 2004: 277-285.
Nauta WJH, Ebbesson SOE. Contemporary Research Methods in
Neuroanatomy, first edition. Springer-Verlag: New York, 1970: 386.
76
Ramón y Cajal S. Histologie du système nerveux de l´Homme et des vertébrés.
Maloine: Paris, 1909: 986.
Rasia Filho AA, Brusco J, Moreira, JE. Spine plasticity in the rat medial
amygdala. In Baylog RL, editor. Dendritic Spines: Biochemistry, Modeling
and Properties. Nova Science Publishers: Hauppauge, 2009, ISBN 978-1-
60741-406-5.
Rasia Filho AA, Fabian C, Rigoti K, Achaval M. Influence of sex, estrous cycle
and motherhood in dendritic spine density in the rat medial amygdala
revealed by the Golgi method. Neuroscience, 2004; 126: 839-47.
Rasia Filho AA, Londero RG, Achaval M. Effects of gonadal hormones on the
morphology of neurons from the medial amygdaloid nucleus of rats. Brain
Res. Bull., 1999; 48: 173-83.
Rosoklija G, Mancevski B, Ilievski B, Perera T, Lisanby SH, Coplan JD, Duma
A, Serafimova T, Dwork AJ. Optimization of Golgi methods for
impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J. Neurosci.
Methods, 2003; 131: 1-7.
Scheibel ME, Scheibel AB. The Methods of Golgi. In Robertson RT, editor.
Neuroanatomical Research Techniques. Academic Press: New York,
1978: 89-114.
Somogyi P. Synaptic connections of neurons identified by Golgi impregnation:
Characterization by immunocytochemical, enzyme histochemical, and
degeneration methods. J. Electron Microsc. Techn., 1990; 15: 332-51.
Szentágothai J. The neuron network of the cerebral cortex: A functional
interpretation. Proc. R. Soc. Lond. B., 1978; 201: 219-48.
Valverde F. Intrinsic organization of the amygdaloid complex. A Golgi study in
the mouse. Trab. Inst. Cajal Invest. Biol., 1962; 54: 291-314.
Woolley CS, McEwen BS. Estradiol regulates hippocampal dendritic spine
density via an N-methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism. J.
Neurosci., 1994; 14: 7680-87.
77
LEGENDAS
Figura 1. Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas em computador
de células do córtex cerebral humano (lobo temporal) e estriado (cabeça do
núcleo caudado) impregnados pela prata após uso de uma adaptação do
método de Golgi “single-section” para tecido fixado em formaldeído, tanto sem
emprego de ósmio (A, o que gerou os piores resultados) como após sua
utilização (B-F), e ao longo de diferentes períodos de processamento
histológico (5-11 dias). Comparada com a população neuronal local estimada,
um pequeno percentual de células foi impregnado nas áreas cerebrais
estudadas. Embora alguns neurônios tenham apresentado dendritos com suas
ramificações, eles ainda apareceram incompletos (B, C). Por outro lado, uma
impregnação mais extensa pôde também ser obtida, revelando a rede axonal
próxima a um neurônio (C) ou a morfologia geral de uma subpopulação
neuronal (D). Astrócitos impregnados pela prata foram encontrados próximos a
vasos sanguíneos (E) com processos terminais em direção a vasos sangüíneos
(“pés-vasculares”) característicos (F). Como regra, um fundo mais claro
permitiu um contraste adequado para o resultado da impregnação celular.
Figura 2. (A) Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas em
computador de neurônios do núcleo caudado humano impregnados pela prata
após uso de uma adaptação do método de Golgi “single-section” para tecido
fixado em formaldeído. A área selecionada em A (quadro escuro) foi ampliada
para demonstrar detalhes da morfologia neuronal, ou seja, corpo celular,
dendritos e suas ramificações e espinhos dendríticos (B). Observe-se a
presença desses espinhos dendríticos pleomórficos (C) classificados como
finos (t), em forma de cogumelo (m), curtos e grossos (s) ou largos (w).
78
Figura 1.
79
Figura 2.
80
6. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS
______________________________
STUDY ON CELL TYPES AND THE SOMATIC AREA OF NEURONS IN THE
HUMAN MEDIAL AMYGDALA
Denise Ferme1+, Aline Dall‟Oglio2+, Janaína Brusco3, 4, Jorge E. Moreira3,
4, Alberto A. Rasia-Filho1, 2, 5
1 Program in Pathology, Universidade Federal de Ciências da Saúde de
Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil
2 Program in Neuroscience, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, Brazil
3 Program in Neuroscience and Behavior, Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil
4 Laboratory of Synaptic Structure, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Brazil
5 Department of Basic Sciences / Physiology, Universidade Federal de
Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil
+ These authors contributed equally to this study
Correspondence to: Prof. Alberto A. Rasia-Filho, UFCSPA / Physiology. Rua
Sarmento Leite, 245 (room 308), Porto Alegre RS 90170-050, Brazil. Phone: +
55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail: [email protected]
81
ABSTRACT
The medial nucleus of the human amygdala (Me) is one of the superficial
components of the amygdaloid complex and part of the "extended amygdala".
There are no detailed reports in the literature on the cells that make up this
nucleus in our species, which is relevant to normal conditions and pathological
aspects involving this structure. In this work we studied the cell types and the
area of the soma of neurons present in the Me in both right and left sides using
the thionin technique and an adaptation of the “single-section” Golgi method.
The studied Me neurons had cell bodies showing soma shape of rounded
contour, ovoid, fusiform or multiform and, adjacent to neurons in a satellite
position, somatic features with morphological characteristics identical to normal
glial cells. Dendrites with varying lengths and with spines were also observed.
The neurons of the Me presented different soma sizes, ranging from medium
(around 15 µm at the greatest length) to large (approximately 30 µm at the
greatest lenght) aspects. The mean (± standard deviation) cell body areas of
the neurons in the right Me was 208.5 + 86.1 µm2, while in the left Me it was
215.2 + 92.5 µm2. The minimum and maximum values for the soma areas of the
neurons from the right Me were 38.6 and 549.7 μm and for the left Me were
35.2 and 619.1 μm, respectively. The use of the Golgi technique turned
apparent protoplasmic astrocytes with extensive local branching and basically
two types of multipolar neurons classified as "bitufted" or stellate. These results
suggest a local cellular organization with little morphological variability along the
rostrocaudal axis and reveal some basic features of the neuro-glial composition
of the human Me in both hemispheres.
KEY WORDS: neuronal morphology, glial cells, thionin technique, “single-
section” Golgi method, hemispheric laterality, morphometry.
Running Title: Neurons in the human medial amygdala
82
1.INTRODUCTION
The primate amygdala is a relatively large cluster of gray matter that lies
at the base of the anteromedial temporal lobe, ventrally to the piriform nucleus,
from which it is separated by the basal magnocellular neuronal complex of the
prosencephalon, forming the nucleus basalis of Meynert and associated cell
groups, or the so-called substantia innominata sense ampliori (de Olmos,
2004). The amygdala is not part of the cerebral cortex and is rather a basal
telencephalic subcortical structure. Bundles of axons separate the amygdala
from other elements in the basal prosencephalon, establishing reciprocal
connections of the temporal lobe with the medial and basal telencephalon, the
diencephalon, the pons and spinal cord (Gloor, 1997). The amygdala is a
structure that includes different subnuclei in the temporal lobe, laterally to the
hypotalamus and ventrally to the striatum in the basal prosencephalon,
occupying the caudal floor of the lateral ventricle close to the rostral
hippocampal formation (Alheid et al., 1995; Gloor, 1997; de Olmos, 1999).
Similarly, the human amygdala is located in the medial temporal lobe, near 1
cm from the rostral end of the temporal lobe (Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de
Olmos, 2004).
According to Amaral et al. (1992), some nuclei in the amygdala can be
divided into deep and superficial located ones. For example, the deep nuclei
include the lateral, the basal, the basal accessory and the paralaminar, whereas
the superficial nuclei include the anterior, the medial (Me), the posterior cortical,
the periamigdaloid cortex and the nucleus of the lateral olfactory tract. The
remaining nuclei include the central, the anterior amygdaloid area, the
amygdalohippocampal transition area and the intercalated nuclei. Besides being
a major portion of the amygdala to receive olfactory and vomeronasal signals,
the corticomedial nuclear group occupies a superficial position where the uncus
is represented by the semilunar gyrus and in close association with the
entorhinal sulcus, forming the ventrolateral wall in the sulcus where the optic
tract runs through (Gloor, 1997; Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos,
2004). It is not surprising that this part of the amygdala was compared to the
periamigdaloid cortex (Rose, 1926, 1927a). The Me is considered part of a
larger group, the extended amygdala (MExA), which also includes the medial
83
sublenticular area and the medial division of the interstitial nucleus of the stria
terminalis (de Olmos, 2004).
However, it was not already described the cellular types present in the
human Me. This is a relevant issue since neurons and glial cells form the basis
of the functional organization of any nervous structure, also yielding relevant
information for both physiological and pathological conditions. That is,
morphological features of the neuronal cell body area, the aspects of primary
dendritic branches and neuronal classification based on these parameters, as
well as the presence and type of dendritic spines are currently unknown for the
human Me. In this study, we used two techniques to study neuronal
morphology, the thionin technique to locate and to study the neuronal
cytoarchitecture and a variant of the Golgi technique originally known as "single-
section Golgi method" to describe cell morphology. This latter is based on the
reaction between chromium and silver potentiated by osmium, which enables
the identification of brain neurons and glial cells. These novel results for the
human Me are described below.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1.Individuals
The criteria for inclusion in this study were arbitrarily determined to
include men aging over 25 years, not deceased from violent cause, previously
healthy relating to their neurological condition, with no previous neurosurgical
intervention, no treatment for any neuropsychiatric disorders, nor presented
infectious disease as the cause of death.
For the thionin technique 5 men were studied, aged 47, 52, 52, 56 and
68 (mean of 55 years-old), who matched the criteria for inclusion and who died
due to complications of cardiovascular diseases For the “single-section" Golgi
method 2 men we studied according to the including criteria, aged 47 and 68
years-old and that died due to worsening of congestive heart failure or
myocardial infarction, respectively. Parts of the bilateral temporal lobes were
obtained during necropsies at the Department of Forensic Medicine of the
84
Instituto Geral de Perícias (Rio Grande do Sul, Brazil). No perfusion procedure
or use of fixation solutions were employed before the removal of the tissue. The
time interval between death and necropsy ranged from a minimum of 6 hours
(in accordance to Brazilian laws) to a maximum of 8 hours. Clinical data and
information regarding previous comorbidities were obtained by direct interviews
with family members or legal representatives, who also signed a detailed
consentment form. Each necropsy received a code to protect the individual
identification, including medical and legal information obtained. All ethical and
legal procedures were followed according to international regulatory standards
(based on the Helsinki Declaration of 1964), in addition to the approval of the
Ethics Committees of the Departamento de Medicina Legal (State of Rio
Grande do Sul, process number 03/08), the Universidade Federal de Ciências
da Saúde de Porto Alegre (process number 541/07), and the Universidade
Federal do Rio Grande do Sul (processo number 20080/09).
2.2 The thionin technique and morphometric measures
Bilateral blocks containing the temporal lobe (approximately 5 cm away
from its rostral pole) were immediately immersed in 10% unbuffered
formaldehyde solution and stored in this same fixative solution along
approximately 20 months. From the original tissue block, small samples of
approximately 1.5 cm3 were removed from the medial and ventral temporal
cortex, using as anatomical references the parahippocampal formation, the
entorhinal sulcus and the optic tract (DeArmond et al., 1989; Figure 1). Both left
and right hemispheres were studied. Tissue samples were sectioned (coronal
sections of 50 and 200 μm thick, at a ratio of 4 slices to 1 slice cut in this order)
using a vibratome (Leica, Germany). The thinner sections were used for the
thionin technique, which produces results identical to those of the Nissl
technique and serves for to stain the rough endoplasmic reticulum and
polyribosomes in the cytoplasm of the cell body and proximal dendritic
branches. The thicker sections were used for the “single-section” Golgi method,
as depicted below.
The sections were placed on slides coated with gelatin and left to dry at
room temperature (RT) for 24 h. These slides were then dipped in a solution
85
containing 4% paraformaldehyde diluted in 0.2 M phosphate buffer solution
(PBS, pH 7.4), where they were left for 7 days under refrigeration (4°C) and
protected from light. After this period, they were left to dry for 24 hours at RT
and were placed in a 70% alcohol solution for 24 more h. Staining involved the
following subsequent steps: immersion in solutions of increasing concentration
of alcohol (95% and 100% for 3 min each); diaphanization in absolute xylene
for 3 min once, which was followed by an increasing period of 30 min.
Immersion in solutions of decreasing alcohol concentration (100, 95, 70 and
50% for 2 min each); washing in distilled water; immersion in a solution of
0.25% thionin for 3 min, removal of excess staining with distilled water, and
immersion in solutions of increasing concentration of alcohol (50, 70 and 95%
for 2 min each), immersion in a solution of 95% alcohol with acetic acid 1%,
immersion in a solution of 95% alcohol to remove the excess of acetic acid, and
in absolute alcohol 1 min each, another diaphanization time with absolute
xylene for 2 min and, afterwards, for 30 to 60 min, and, finally, mounting of the
slides with synthetic balsam and coverslips.
From each cerebral hemisphere, 9 serial sampling sections were studied
from the rostral to the caudal Me. Once identified the Me, 3 representative
images were obtained from each section under light microscopy (400 X,
Olympus BX -41, Japan). Each image was recorded on a computer and
subsequently analyzed for the neuronal soma measurements. In this regard,
each neuronal soma should have visible and sharp edges that would allow the
measuring of the corresponding area in the image obtained (Figure 2). A total of
523 cell bodies were measured on the right Me and 590 cell bodies on the right
side using the software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).
2.3. The “single-section” Golgi technique
The use of the “single-section” Golgi technique followed the
methodological steps depicted in the companion article of this work. That is,
coronal slices of the Me of both hemispheres and with 200 μm in thickness were
submitted to post-fixation with 4% paraformaldehyde and 1.5% picric acid in
PBS (0.1 M, pH = 7.4) for 24 h or 72 h, protected from light and at 4°C.
Afterwards, the sections were quickly rinsed in PBS, transferred to a solution of
86
0.02% osmium tetroxide in PBS from 10 to 30 minutes under gentle agitation
and protected from light, washed again in PBS for 1 to 2 minutes, immersed in
3% potassium dichromate (Merck, Germany) dissolved in deionized water, and
kept in the same solution in the dark at 4°C for 24 h or 72h. Brain sections were
washed again in distilled water and were "sandwiched" between coverslips, in
which epoxy glue was placed at the four corners to allow a low rate of diffusion
of the impregnation solution. Then, the slides were carefully placed in a solution
of 1.5% silver nitrate (Merck, Germany) diluted in deionized water at RT and in
the dark for 24 h or 72 h. The coverslips were broken, the sections were
removed, washed in distilled water and a soft brush served to remove
unspecific crystals on the slices. Finally, the sections were placed on slides,
dried at RT, immersed in distilled water (3 minutes, once), dehydrated in
ascending series of alcohol (70% and 80% once, 3 minutes each; 95% and
100% twice, 3 minutes each), cleared in a solution of xylene/absolute alcohol
1:1 and 2:1 (3 minutes, once) and 100% xylene (twice, 3 to 6 minutes each),
covered with non-acid synthetic balsam and coverslips and left to dry at RT for
24 h.
2.4. Me location and imaging
The location of the Me in left and right brain hemispheres followed the
previous descriptions and recommendations found in the literature (Gloor, 1997;
Sorvari, 1997; de Olmos, 2004) and, as noted in this study, coincided with the
description provided by Mai et al. (2008). For this reason, an overlapping of
sequential images as those obtained in that atlas that shows the Me location in
the human brain is presented in Figure 1. Images and measures were done
employing a Nikon Eclipse E-600 optic microscope (400 X, Japan) coupled to a
Pro-Series High Performance CCD camera. The sum of the stacking
photomicrographs provided the final images by using the software Image-Pro
Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA). Small adjustments of borders, brightness
and background contrast were done using the Adobe Photoshop 7.0 software
(USA).
87
3. RESULTS
The results obtained with the thionin technique showed suitable and
homogeneous cellular staining along the rostrocaudal length of the human Me.
In both hemispheres were observed neurons whose cell bodies had well-
defined cytoplasm, soma shape of rounded contour, ovoid, fusiform or multiform
(these latter according to the number of primary dendritic branches emerging
from the soma), large and vesicular nuclei, with smooth chromatin and an
evident nucleolus (Figure 3). Forming a continuum of different sizes of cell
bodies, these neurons showed primary dendrites that allowed their classification
as "bitufted" (with two primary dendrites emerging from the cell body) or stellate
ones (with three or more dendrites emerging from the neuronal soma). No cell
bodies were recognized with an evident pyramidal aspect. In a rather satellite
position, many evident nuclei with little adjacent cytoplasm and with denser
chromatin were also observed, being recognized as the classical description for
normal glial cells (Figure 3). The neuropil proved to be homogeneous, with the
presence of blood vessels and their endothelial cells.
The neurons of the human Me on both sides showed various soma sizes,
ranging from medium (around 15 µm at greatest length) to large (approximately
30 µm at greatest length; Figure 3) values. The mean (± standard deviation)
somatic area of the neurons in the right Me was 208.5 ± 86.1 µm2, while in the
left Me it was 215.2 ± 92.5 µm2. The minimum and maximum values for the
soma of the neurons in the right Me were 38.6 and 549.7 μm and in the left Me
were 35.2 and 619.1 μm, respectively.
Inherent to the Golgi technique, a small percentage of neurons and glial
cells were observed in the human Me (Figure 4). When successfully
impregnated, protoplasmic astrocytes could be identified with extensive local
branching characterized by delicate and thin extensions, some of them adjacent
to blood vessels (Figure 4A). Also, isolated neurons with dendritic branches of
varying lengths (Figure 4B) were observed stained brown or black constrasting
against a light yellow background with few unspecific precipitation in their
surroundings. Basically two types of multipolar neurons were observed in the
studied sections, confirming the images obtained by the thionin technique.
Again, the corresponding morphological descriptions allowed the neuronal
88
classification as ¨bitufted or stellate cells. From the cell bodies, emerging
primary dendrites protruded in different directions and then branched
accordingly (Figure 4B). Pleomorphic spines were also observed covering
different dendritic branches (Figure 4C). These spines seemed to be rather of
small size, with a stubby and/or thin shape, and whose heads were not bulky.
4. DISCUSSION
The present findings indicate that the human Me is composed by
neurons of medium to large size with cell bodies that allowed their classification
as multipolar neurons with a bitufted or a stellate appearance. There were no
neurons with a pyramidal aspect that could allow the identification of a local
cortical-like organization. When properly impregnated, the neurons observed
showed dendritic branches of varying length. Astrocytes with a general aspect
as protoplasmic ones were also impregnated in the human Me.
It is interesting to note that the description of the neurons from the human
Me is coincident with that already reported in rats (Rasia-Filho et al., 1999,
2004; Dall'Oglio et al., 2008a, b). In these two species, there is no evidence for
a cortical organization in the Me (Marcuzzo et al., 2007). Likewise, the presence
of protoplasmic astrocytes with long and thin branches was described in the Me
of rats (Rasia-Filho et al., 2002, Martinez et al., 2006). Altogether, these data
suggest an homology and/or phylogenetic conservation on the cellular types
that compose the Me. In effect, the basic morphological organization of the
amygdala is the same in all mammals, but the main changes that occur
phylogenetically toward the primates, specially humans, are the increases in the
size of the proportional volume of the cortico-basolateral nucleus in contrast to
what occurs in the medial-central group (Sorvari, 1997; Gloor, 1997).
It seems clear that in both right and left hemispheres, neurons show cell
body area with values close to each other. This is especially relevant because it
may suggest that laterality effects on morphology and/or functioning of the
human Me (Kandel et al., 2000) do not involve the soma area as their main
determinant. Similarly, the volume of the cell body did not show inter-
hemispheric differences in the posterior Me in rats (Hermel et al., 2006). In
89
addition, it could not be found striking differences in the general appearance or
other apparent morphological features in the cell bodies along the rostrocaudal
axis of the human Me. De Olmos (2004) had divided the Me in a anterior and a
posterior part according to citoarchitectonic criteria. Based solely on the
neuronal soma area, it does not serve as the neuronal morphological parameter
to support such a division.
The number of neurons and glial cells can be estimated by stereological
technique based on the results obtained with the thionin technique, the
description of the Me cell types, and the possibility of establishing the ultimate
borders for this nucleus (Mai et al., 2008). This is one future implication for the
present data. Another perspective is to compare and complement the images
obtained by impregnation of astrocytes with the results of an
immunohistochemical technique for glial fibrillary acidic protein (GFAP). Also,
silver impregnated neurons can be useful to associate the Golgi technique with
ultrastructural studies (adapting the technique described by Bolam, 1992).
Regarding the Golgi method employed here, some additional comments
are necessary. As with other techniques, it has advantages and limitations. The
Golgi method originally named "single-section" (without the use of osmium) and
its further adaptation by Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) is another
technique that can be used to study the morphology of cells in the brain of
human beings. One of its advantages is that it can be applied to human tissue
fixed in formaldehyde and stored for a long time, allowing the study of neurons
and glial cells in brain samples kept in simple and routine fixative solutions.
When suitable results are obtained, the Golgi method reveals the different types
of neurons that constitute a brain area and their general morphology, which can
indicate relevant relationships between shape and neuronal function (Wooley &
McEwen, 1994; Dall'Oglio et al., 2008a, b; Larriva-Sahd, 2008, Gómez-
Villalobos et al., 2009; Rasia-Filho et al., 2009). On the other hand, one of the
Golgi method drawbacks is the unpredictable number of neurons that will
became properly impregnated and that can be studied in details, besides the
non-homogeneous cellular impregnation in each brain section.
Here, a small number of cases was studied, and in each one, a small
number of neurons could be observed. The best result for the neuronal
impregnation is shown in Figure 4. This indicates that new experiments are
90
needed to support the conclusions about the cell types that compose the Me
along its rostrocaudal location. Nevertheless, the results are consistent with the
morphology of neurons revealed by the thionin technique, indicating that some
random Golgi-impregnated neurons representative of the Me could already be
observed. The dendritic spines, an important neuronal component that can
increase the synaptic surface, are relevant for post-synaptic response and
plastic responses (Oertner &; Matus, 2005, Tada & Sheng, 2006), an initial but
insufficient amount of data was obtained in this study. These dendritic spines
appeared to have rather stubby or thin shapes. If this observation can be
confirmed, this may suggest that dendritic spines in the human Me belong to
less dynamic/plastic types than the mushroom-like ones (Peters, Kaiserman-
Abramof, 1970, Peters et al, 1991, Hering, Sheng, 2001, González-Burgos,
2004). Although electrophysiological studies are needed to clarify this issue,
they run into serious ethical restrictions and/or technical difficulties for obtaining
living tissue during neurosurgical procedures for removal of tissue with
epileptogenic features that commonly occur in the temporal lobe, for example.
In conclusion, these results suggest that the human Me has multipolar
neurons with cell bodies of medium to large sizes that, at principle, suggest a
local cellular organization with little morphological variability in both
hemispheres and along its rostrocaudal axis. These initial and novel data serve
to direct future efforts involving other methodologies in order to reveal the
neuro-glial components for the functioning of the human Me, as was done for
other species.
5. ACKNOWLEDGMENTS
The authors are thankful to the relatives who donated the tissue samples
that resulted in this experimental study. Grants from the Brazilian Agency
CNPq. JEM and AARF are CNPq researchers.
91
6. REFERENCES
Alheid GF, de Olmos JS, Beltramino CA. Amygdala and extended amygdala. In:
Paxinos G. The rat nervous system. San Diego: Academic Press, p495-498,
1995.
Amaral DG, Price JL, Pitkanen A, Carmichael ST. The Amygdala:
Neurobiological aspects of emotion, memory, and mental disfunction. Aggleton
JP (ed) Wiley-Liss: New York, 1992, ch1, p-1-66.
Bolam JP. Experimental Neuroanatomy: A Practical Approach. Oxford
University Press: New York, 1992: 296.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of posterodorsal medial amygdala neurons of adult male and female
rats: Further data based on the Golgi method. Neurosci. Lett., 2008a; 430: 151–56.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of Golgi-impregnated neurons from the “ventral” medial amygdala
subnuclei of adult male and female rats. Neurosci. Lett., 2008b; 439: 287-92.
de Olmos JS, Heimer RL. The concepts of the ventral striatopallidal system and
extended amygdala. Ans NY Aca Sci. 1999; 877: 1-32.
de Olmos J. In: Paxinos G, Mai J. Hum nerv sys. 2004; 2 San Diego: Elsevier.
DeArmond SJ, Fusco MM, Dewey MM. Structure of the Human Brain, third ed.
Oxford University Press: New York, 1989: 208.
Gloor P. The temporal lobe and limbic system. OUP: 1997 New York and
Oxford.
Gómez-Villalobos MJ, Gordillo AC, López Jr, Flores G. The utility of the Golgi-
Cox method in the morphological characterization of the autonomic innervation
in the rat heart. J. Neurosci. Methods, 2009; 179: 40-4.
González-Burgos I, Alejandre-Gómez M, Cervantes M. Spine-type densities of
hippocampal CA1 neurons vary in proestrus and estrus rats. Neurosc Let. 2004;
379:52-54.
Hering H, Sheng M. Dendritic spines: structure, dynamics and regulation. Nat
Rev Neurosc. 2001; 2: 880-888.
Hermel EES, Ilha J, Xavier LL, Rasia Filho AA, Achaval M. Influence of sex and
estrous cycle, but not laterality, on the neuronal somatic volume of the
posterodorsal medial amygdala of rats. Neurosci. Lett., 2006; 405: 153-58.
92
Izzo PN, Graybiel AM, Bolam JP. Characterization of substance P- and
[Met]enkephalin-immunoreactive neurons in the caudate nucleus of cat and
ferret by a single section Golgi procedure. Neuroscience, 1987; 20: 577-87.
Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM. Principles of Neural Science, 4th ed.,
pp.178–180. McGraw-Hill, New York, 2000.
Larriva-Sahd J. Histological and cytological study of the bed nuclei of the stria
terminalis in adult rat. II. Oval nucleus: extrinsic inputs, cell types, neuropil, and
neuronal modules. J. Comp. Neurol., 2006; 497: 772-807.
Mai JK, Paxinos G, Voss T. Atlas of the Human Brain. Amsterdam: Elsevier,
2008.
Marcuzzo S, Dall‟Oglio A, Ribeiro MF, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic
spines in the posterodorsal medial amygdala after restraint stress and ageing in
rats. Neurosc Letter. 2007, v.424, p.16-21.
Martinez FG, Hermel EE, Xavier LL, Viola GG, Riboldi J, Rasia Filho AA,
Achaval M. Gonadal hormone regulation of glial fibrillary acidic protein
immunoreactivity in the medial amygdala subnuclei across the estrous cycle
and in castrated and treated female rats. Brain Res., 2006; 1108: 117-26.
Oertner T, Matus A. Calcium regulation of actin dynamics in dendritic spines.
Cell Calcium. 2005, v. 37, p. 477-482.
Peters A, Kaiserman-Abramof IR. The small pyramidal neuron of the rat
cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 1970, v. 127,
p. 321-356.
Peters A, Palay SL, Webster HD. Dendrites. In: The Fine Structure of the
Nervous System: Neurons and Their Supporting Cells. New York: Oxford
University Press, p. 70-100, 1991.
Rasia Filho AA, Brusco J, Moreira, JE. Spine plasticity in the rat medial
amygdala. In Baylog RL, editor. Dendritic Spines: Biochemistry, Modeling and
Properties. Nova Science Publishers: Hauppauge, 2009, 406-5.
Rasia Filho AA, Fabian C, Rigoti K, Achaval M. Influence of sex, estrous cycle
and motherhood in dendritic spine density in the rat medial amygdala revealed
by the Golgi method. Neurosci, 2004; 126: 839-47.
93
Rasia Filho AA, Londero RG, Achaval M. Effects of gonadal hormones on the
morphology of neurons from the medial amygdaloid nucleus of rats. Brain Res
Bull, 1999; 48: 173-83.
Rasia Filho AA, Xavier LL, Santos P, Gehlen G, Achaval M. Glial fibrillary acidic
protein immunodetection and immunoreactivity in the anterior and posterior
medial amygdala of male and female rats. Brain Res Bull, 2002, v58, n1, p67-
75.
Rose M. Der allocortex bei Tier und Mensch. I Teil. J Psychol Neurol. 1926,
v34, p1-260.
Rose M. Die sog. Riechrinde beim Menschen und beim Affen. II Teil des
“Allocortex bei Tier und Mensch”. J Psychol Neurol. 1927a, v34, p261-401.
Sorvari H. Neurons containing calcium-binding proteins in the human
amygdaloid complex. Dissertação. 1997, Universidade de Kuopio: Kuopio.
Tada T, Sheng M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.
Curr Opin Neur, 2006, v. 16, p. 1-7.
Woolley CS, McEwen BS. Estradiol regulates hippocampal dendritic spine
density via an N-methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism. J.
Neurosci., 1994; 14: 7680-87.
94
LEGENDS
Figure 1. Schematic representation of the human left cerebral
hemisphere and the location of the medial nucleus of the amygdala (filled with
black) along the rostrocaudal axis (anterior images above, posterior ones below
in the figure). Values in the right correspond to the scale presented in the atlas
of Mai et al. (2008), from which these images were obtained and adapted,
referenced to the section plan used in this same atlas (behind the anterior pole
of the temporal lobe and before the hypothalamic mammillary bodies). Ot =
optic tract.
Figure 2. Digitized microscopic image of the neurons in the human
medial amygdala stained with the thionin technique. From this sort of image the
area of the cell body were measured, bounded by closed lines on its border,
and emplying a software for morphometry (Image-Pro Plus 6.0, Media
Cybernetics, USA).
Figure 3. Digitized microscopic images of cells in the medial nucleus of
the human amygdala stained by the thionin technique. (A-B) Cell bodies of
larger size and with histological features that allowed their classification as
neurons with different shapes and with two or more primary dendrites. Cell
bodies in perineuronal position, with more intense staining of the nucleus and
without nucleolus apparently correspond to local glial cells. (C) Polymorphic cell
bodies with primary dendrites corresponding to stellate neurons. (D) Evident cell
body with two primary dendritic extensions corresponding to a bitufted neuron.
The same scale in (D) can be applied to all images.
Figure 4. Digitized and reconstructed microscopic images of the human
medial nucleus after the use of an adaptation of the "single-section" Golgi
method. Compared to the local neuronal population observed by the technique
of thionin, a small percentage of cells resulted impregnated. Protoplasmic
astrocytes became visible, some of them close to blood vessels (A). A notable
multipolar neuron of the stellate type is shown in (B), whose insert box was
placed in greater amplification in (C) to observe the presence of pleomorphic
95
dendritic spines. As a rule, a lighter background allowed an appropriate contrast
to the result of the cellular impregnation.
96
Figure 1.
97
Figure 2.
98
Figure 3.
99
Figure 4.
100
7. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS
______________________________
ESTUDO SOBRE OS TIPOS CELULARES E A ÁREA SOMÁTICA DE
NEURÔNIOS NA AMÍGDALA MEDIAL DE SERES HUMANOS
Denise Ferme1+, Aline Dall‟Oglio2+, Janaína Brusco3,4, Jorge E. Moreira3,4,
Alberto A. Rasia-Filho1, 2, 5
1 Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências
da Saúde, Porto Alegre, Brasil
2 Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
3 Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Comportamento, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil
4 Laboratório de Estrutura Sináptica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Brasil
5 Departamento de Ciências Básicas/Fisiologia, Universidade Federal de
Ciências da Saúde, Porto Alegre, Brasil
+ Esses autores contribuíram igualmente para o presente estudo
Endereço para correspondência: Prof. Alberto A. Rasia-Filho, UFCSPA /
Fisiologia. Rua Sarmento Leite, 245 (sala 308), Porto Alegre 90170-050 RS,
Brasil. Fone: + 55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail:
101
RESUMO
O núcleo medial da amígdala (Me) humana é um dos componentes
superficiais do complexo amigdaliano, parte da “amígdala estendida”. Não há
relatos detalhados na literatura sobre as células que compõem este núcleo na
nossa espécie, o que é relevante para o funcionamento normal e para quadros
patológicos que envolvem esta estrutura. No presente trabalho foram
estudados os tipos celulares e a área do soma neuronal presentes no Me dos
lados direito e esquerdo utilizando-se a técnica da tionina e uma adaptação da
técnica de Golgi de tipo “single-section”. Foram observados neurônios cujos
corpos celulares apresentavam formato do soma com contorno arredondado,
ovoide, fusiforme ou multiforme e, adjacentes aos neurônios e em posição
satélite, somas e núcleos com características morfológicas idênticas a células
gliais normais. Dendritos com comprimentos variados e com espinhos foram
igualmente observados. Os neurônios do Me apresentaram-se com tamanhos
do soma diversos, variando desde médios (em torno de 15 μm no maior
comprimento) a grandes (aproximadamente 30 μm no maior comprimento). A
média (+ desvio padrão) da área do soma dos neurônios do Me direito foi de
208,5 + 86,1 μm2 enquanto no Me esquerdo foi de 215,2 + 92,5 μm2. Os
valores mínimo e máximo para as áreas do soma dos neurônios do Me direito
foram de 38,6 e 549,7 μm e no Me esquerdo foram de 35,2 e 619,1 μm,
respectivamente. Pela técnica de Golgi evidenciaram-se astrócitos
protoplasmáticos com extensa ramificação local e basicamente dois tipos de
neurônios multipolares classificados como “bitufted” e estrelados. Os presentes
resultados sugerem uma organização celular local com pouca variabilidade
morfológica ao longo do eixo rostrocaudal, apresentando algumas
características básicas da composição neuroglial do Me humano AM ambos os
hemisférios.
PALAVRAS-CHAVE: morfologia neuronal, células gliais, técnica da tionina,
método de Golgi, lateralidade hemisférica, morfometria.
Título abreviado: Neurônios da amígdala medial humana
102
1. INTRODUÇÃO
A amígdala dos primatas é um conglomerado relativamente grande de
substância cinzenta que se encontra na base do lobo temporal anteromedial de
forma ventral ao núcleo piriforme, do qual é separado pelo complexo neuronal
magnocelular basal do prosencéfalo, constituindo o núcleo basal de Meynert e
grupos celulares relacionados, ou a chamada substantia innominata sensu
ampliori (de Olmos, 2004). A amígdala não faz parte do córtex cerebral, mas é
uma estrutura telencefálica basal subcortical. Feixes de axônios separam-na
dos demais elementos do prosencéfalo basal, ao mesmo tempo em que
estabelecem conexões recíprocas do lobo temporal com o telencéfalo basal e
medial, o diencéfalo, a ponte e a medula espinal (Gloor, 1997). A amígdala é
uma estrutura que compreende subnúcleos situados no lobo temporal, lateral
ao hipotálamo e ventral ao estriado no prosencéfalo basal, que ocupa a porção
caudal do assoalho do ventrículo lateral e que se localiza na porção terminal e
rostral da formação hipocampal (Alheid et al., 1995; Gloor, 1997; de Olmos,
1999). Identicamente, a amígdala humana está localizada no lobo temporal
medial, a aproximadamente 1 cm da extremidade rostral do lobo temporal
(Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos, 2004).
De acordo com Amaral et al. (1992), alguns núcleos da amígdala podem
ser dividida em núcleos profundos, superficiais e os restantes. Os núcleos
profundos incluem o lateral, o basal, o basal acessório e o paralaminar; os
núcleos superficiais incluem o anterior, o medial (Me), o cortical posterior, o
córtex periamigdaloide e o núcleo do trato olfatório lateral. Os demais núcleos
incluem o central, a área amigdaloide anterior, a área de transição amígdalo-
hipocampal e os núcleos intercalados. Além de ser uma porção principal da
amígdala para receber sinais olfatórios e vomeronasais, o grupo de núcleos
corticomediais ocupa uma posição superficial onde o úncus é representado
pelo giro semilunar e muito próximo do sulco entorrinal, formando a parede
ventrolateral da fenda entre a amígdala e o trato óptico assim que este entra
nesse sulco (Gloor, 1997; Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos, 2004).
Assim, não surpreende que essa parte da amígdala tenha sido comparada ao
córtex periamigdalóide (Rose, 1926, 1927a). O Me é considerado parte de um
grupo nuclear maior, a amígdala estendida (MExA), e que também compreende
103
a região sublenticular medial e a divisão medial do núcleo intersticial da estria
terminal (de Olmos, 2004).
Não obstante, não estão ainda descritos quais os tipos celulares
presentes no Me de seres humanos. Isso é assunto relevante, uma vez que
neurônios, juntamente com as células da glia, formam a base da organização
funcional de qualquer estrutura nervosa, também fornecendo importante
informação tanto em condição fisiológica como para quadros patológicos
diversos. Ou seja, detalhes morfológicos da área do soma neuronal, aspecto
dos ramos dendríticos primários e classificação neuronal baseada nesses
parâmetros, além da presença e do tipo dos espinhos dendríticos, ainda não
são conhecidos para a Me de seres humanos. No presente trabalho foram
utilizadas duas técnicas para estudo da morfologia neuronal, a da tionina para
localização e estudo da citoarquitetura neuronal e uma variante da técnica de
Golgi originalmente nomeada “single-section Golgi method” para a descrição da
morfologia celular. Esta se baseia na reação entre o cromo e a prata,
intensificada pelo ósmio, e que permite a identificação dos neurônios e de
células da glia. Os primeiros resultados, ainda inéditos, para o Me de seres
humanos são descritos a seguir.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Indivíduos
Inicialmente, os critérios para inclusão neste estudo foram
arbitrariamente determinados e incluíam homens, com idade acima de 25 anos,
não terem sofrido morte violenta, terem sido previamente hígidos quanto à
condição neurológica bem como inexistência de intervenção cirúrgica
neurológica prévia, não ter estado sob tratamento para transtornos
neuropsiquiátricos nem ter apresentado doença infecto-contagiosa como causa
mortis.
Para o desenvolvimento da técnica da tionina foram estudados cinco
homens, com idades de 47, 52, 52, 56 e 68 anos (média = 55 anos), que se
enquadravam nos critérios de inclusão e que vieram a falecer devido a doenças
104
cardiovasculares. Para a técnica de Golgi de tipo “single-section” foram
estudados dois homens, com idades de 47 e 68 anos, que igualmente estavam
dentro dos critérios de inclusão deste trabalho e que faleceram por causa de
agravamento de insuficiência cardíaca congestiva e por infarto do miocárdio,
respectivamente. Partes dos lobos temporais bilaterais foram obtidas durante
as necropsias no Departamento de Medicina Legal do Instituto Geral de
Perícias (Estado do Rio Grande do Sul, Brasil). Nenhuma solução de fixação
ou perfusão foi utilizada antes da remoção do tecido. O intervalo entre a morte
e a necropsia variou do mínimo de 6 horas (de acordo com a legislação
brasileira) até no máximo 8 horas. Dados clínicos e de comorbidades prévios
foram obtidos por meio de entrevista dirigida a familiares ou representantes
legais, os quais também assinaram um termo de consentimento livre e
esclarecido. Cada perícia recebeu código para proteção de identificação, em
especial das informações médico-legais. Todos os procedimentos éticos e
legais foram seguidos de acordo com os padrões regulatórios internacionais
(baseados na Declaração de Helsinki de 1964), além da aprovação dos
Comitês de Ética do Departamento de Medicina Legal do Estado do Rio
Grande do Sul (processo nº 03/08), da Universidade Federal de Ciências da
Saúde de Porto Alegre (processo nº 541/07) e da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (processo nº 2008009).
2.2. Emprego da técnica de tionina e medida morfométrica
Blocos contendo o lobo temporal (aproximadamente 5 cm de distância a
partir do seu polo anterior) bilateral foram imediatamente imersos em
formaldeído 10% não tamponado e mantidos armazenados nessa mesma
solução de fixação por aproximadamente 20 meses. Do bloco original,
pequenas amostras com aproximadamente 1,5 cm3 foram retiradas onde
estavam as porções medial e ventral do córtex temporal, tomando-se como
referencial a formação parahipocampal, o sulco entorrinal e o trato óptico
(DeArmond et al., 1989). Ambos os hemisférios direito e esquerdo foram
selecionados para estudo. As amostras de tecido foram seccionadas (cortes
coronais alternados de 50 e 200 µm de espessura, na proporção de 4 cortes
para 1 corte, nesta ordem) utilizando-se um vibrátomo (Leica, Alemanha). Os
105
cortes de menor espessura foram destinados à técnica da tionina, a qual gera
resultados idênticos àqueles da técnica de Nissl e serve para identificação por
coloração azulada da localização do retículo endoplasmático rugoso e de
polirribossomos no citoplasma do corpo celular e de ramos dendríticos
proximais. As secções mais espessas foram utilizadas para o método de Golgi
“single-section”, conforme descrito a seguir.
Os cortes obtidos foram colocados em lâminas histológicas cobertas
com gelatina e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h. Tais
lâminas foram então mergulhadas em solução contendo paraformaldeído a 4%
diluído em tampão fosfato 0,2 M (pH = 7,4), onde foram deixadas por 7 dias
sob refrigeração (4oC) e ao abrigo da luz. Após esse período, foram retiradas
da solução e deixadas para secar por 24 h à temperatura ambiente (TA), tendo
sido colocadas a seguir em álcool 70% por mais 24 h. A coloração envolveu as
seguintes etapas subsequentes: imersão em soluções de concentração
crescente de álcool (95% ((I e II)) e 100% ((I e II)) por 3 min. cada);
diafanização em xilol absoluto por 3 min. uma vez; imersão em soluções de
concentração decrescente de álcool (100, 95, 70 e 50% por 2 min. cada);
lavagem com água destilada; imersão em tionina 0,25% (por 3 min.) e retirada
de excesso de corante com água destilada; imersão em soluções de
concentração crescente de álcool (50, 70 e 95% por 2 min. cada); imersão em
uma solução de álcool 95% com ácido acético 1%; imersão em álcool 95%
para retirada do excesso de ácido acético, e 100% 1 min. cada; nova
diafanização com xilol absoluto por 2 min. e, a seguir, por 30 a 60 min. e, por
fim, montagem das lâminas com bálsamo sintético e lamínulas.
De cada hemisfério cerebral foram estudadas 9 secções obtidas por
amostragem uniforme desde a parte anterior do Me até sua parte posterior.
Uma vez localizado o Me, foram obtidas 3 imagens de cada secção (400 x,
Olympus BX -41, Japão). Cada imagem era gravada em computador e
posteriormente analisada quanto às medidas do soma neuronal. Para tanto,
cada soma neuronal deveria ter seus bordos visíveis e nítidos para que fosse
medida a área correspondente na imagem obtida (Figura 2). Um total de 523
corpos celulares foram medidos no Me do lado direito e 590 corpos celulares
no Me do lado esquerdo, utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media
Cybernetics, EUA).
106
2.3. A técnica de Golgi “single-section”
O emprego da técnica de Golgi de tipo “single-section” seguiu a
descrição do método apresentado em artigo anterior. Ou seja, cortes coronais
do Me de ambos os hemisférios e com 200 µm de espessura foram submetidos
a pós-fixação com paraformaldeído 4% e ácido pícrico 1,5% em solução de
tampão fosfato (PBS) 0,1 M (pH = 7,4) por 24 h ou 72 h, protegidas da luz e a
4°C. A seguir, as secções foram rapidamente lavadas em PBS, transferidas
para uma solução de tetróxido de ósmio 0,02% em PBS entre 10 a 30 minutos
com agitação suave e protegidas da luz, novamente lavadas com PBS por 1 a
2 minutos e foram imersas em dicromato de potássio 3% (Merck, Alemanha)
dissolvido em água deionizada e mantidas na mesma solução, no escuro, a
4°C por 24 h ou 72 h. Após, as secções foram novamente lavadas com água
destilada e delas foram feitos “sanduíches” entre lamínulas de vidro, nos quais
foi colocada cola epóxi nos quatro cantos para permitir uma pequena
velocidade de difusão da próxima solução a ser empregada. As lâminas foram
cuidadosamente colocadas em uma solução de nitrato de prata 1,5% (Merck,
Alemanha) diluído em água deionizada, à TA e no escuro por 24 h ou 72 h. As
lamínulas foram então quebradas, as secções foram removidas, lavadas em
água destilada e, para remoção de cristais sobre os cortes, utilizou-se um
pincel macio. Finalmente, os cortes foram colocados em lâminas, secos à
temperatura ambiente, imersos em água destilada (3 minutos, uma única vez),
desidratados em séries ascendentes de álcool (70% e 80%, uma vez, 3
minutos cada; 95% e 100%, duas vezes, 3 minutos cada), diafanizados em
solução de xilol/álcool absoluto 1:1 e 2:1 (3 minutos, uma vez) e xilol 100% (2
vezes de 3 a 6 minutos cada), acrescentado bálsamo sintético não ácido e
lamínulas, e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h.
2.4. Localização do Me e obtenção de imagens
A localização do Me nos hemisférios cerebrais direito e esquerdo seguiu
as descrições prévias e as recomendações encontradas na literatura (Gloor,
107
1997; Sorvari, 1997; de Olmos, 2004) e, como observado no presente estudo,
coincidiram com a descrição apresentada por Mai et al. (2008). Por esta razão
uma sobreposição de imagens sequenciais como obtidas nesse atlas e
demonstrando sua localização no encéfalo humano está apresentada na Figura
1. Imagens e as medidas foram processadas utilizando um microscópio Nikon
Eclipse E-600 (400 X, Japão) acoplado a uma câmara Pro-Series High
Performance CCD. O somatório das sequências de fotomicrografias forneceu a
imagem final utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics,
EUA). Pequenos ajustes de bordo, brilho ou contraste de fundo foram obtidos
utilizando-se o software Adobe Photoshop 7.0 (EUA).
3. RESULTADOS
Os resultados da técnica de tionina evidenciaram coloração celular
adequada e homogênea ao longo do comprimento rostrocaudal do Me humano.
Em ambos os hemisférios cerebrais foram observados neurônios cujos corpos
celulares apresentavam citoplasma bem delimitado, formato do soma com
contorno arredondado, ovoide, fusiforme ou multiforme ( estes de acordo com o
número de ramos dendríticos primários surgindo do soma), núcleos grandes e
vesiculares, com cromatina frouxa e nucléolo evidente (Figura 3). Como que
formando um continuum de tamanhos diferentes do corpo celular, esses
neurônios apresentaram-se com dendritos primários que permitem a
classificação como sendo de tipos “bitufted” (com dois dendritos primários
surgindo do corpo celular) ou estrelados (com três ou mais dendritos surgindo
do soma neuronal). Não foram reconhecidos corpos celulares com aspecto
piramidal evidente. Em posição satélite, vários núcleos evidentes com pouco
citoplasma adjacente e com cromatina mais densa foram igualmente
observados e reconhecidos como classicamente descritos para células gliais
normais (Figura 3). O neurópilo mostrou-se homogêneo e com a presença de
vasos sanguíneos e suas células endoteliais.
Os neurônios do Me humano de ambos os lados apresentaram-se com
tamanhos do soma diversos, variando desde médios (em torno de 15 μm no
maior comprimento) a grandes (aproximadamente 30 μm no maior
108
comprimento; Figura 3). A média (+ desvio padrão) da área do soma dos
neurônios do Me direito foi de 208,5 + 86,1 μm2, enquanto no Me esquerdo foi
de 215,2 + 92,5 μm2. Os valores mínimo e máximo para as áreas do soma dos
neurônios do Me direito foram de 38,6 e 549,7 μm e no Me esquerdo foram de
35,2 e 619,1 μm, respectivamente.
Inerente à técnica de Golgi, um pequeno percentual de neurônios e
células gliais foram observados no Me humano (Figura 4). Quando bem
impregnados, foi possível identificar astrócitos protoplasmáticos com extensa
ramificação local, caracterizada por prolongamentos delicados e finos, alguns
deles na adjacência de vasos sanguíneos (Figura 4A), e neurônios isolados
com ramos dendríticos com comprimentos variados (Figura 4B) corados de
pardo ou preto contra um fundo amarelo claro e com pouca precipitação
inespecífica em seu entorno. Basicamente dois tipos de neurônios multipolares
puderam ser observados nessas secções, confirmando as imagens obtidas
pela técnica da tionina, e que correspondem às descrições morfológicas que
permitem a classificação como sendo de tipos “bitufted” ou estrelados. Desses
corpos celulares, dendritos primários emergentes se projetavam em diferentes
direções e se ramificavam a seguir (Figura 4B). Espinhos dendríticos
pleomórficos foram igualmente identificados (Figura 4C). Tais espinhos
pareceram ser preferentemente de pequeno tamanho, de aspecto arredondado
e/ou fino, com cabeças não muito volumosas.
4. DISCUSSÃO
Os presentes achados indicam que o Me de seres humanos apresenta
neurônios de tamanho médio a grande com corpos celulares que permitem sua
classificação como de neurônios multipolares, com aspecto “bitufted” ou
estrelados. Não foram observados neurônios com aspecto piramidal que
pudessem ser claramente relacionados com uma morfologia neuronal ou com
uma organização cortical local. Quando bem impregnados, os neurônios
observados apresentaram-se com ramos dendríticos com comprimento
variado. Astrócitos com aspecto que permite a classificação como de tipo
protoplasmático foram igualmente impregnados no Me humano.
109
É interessante notar que a descrição feita para os neurônios do Me em
nossa espécie é coincidente com aquela já elaborada em detalhes para ratos
(Rasia-Filho et al., 1999, 2004; Dall‟Oglio et al., 2008a,b). Nessas duas
espécies, não há evidência de uma organização cortical no Me (Marcuzzo et
al., 2007). Da mesma forma, a presença de astrócitos protoplasmáticos com
extensa e fina ramificação já foi descrita no Me de ratos (Rasia-Filho et al.,
2002; Martinez et al., 2006). Isto pode sugerir que, a princípio, há alguma
homologia e/ou conservação filogenética quanto aos tipos celulares que
compõem o Me, tomando-se o rato como modelo mais estudado até o
momento. De fato, a organização morfológica básica da amígdala é a mesma
em todos os mamíferos, porém as principais mudanças que ocorrem
filogeneticamente em direção aos primatas, especialmente aos humanos, são
os aumentos no tamanho do volume proporcional do núcleo córtico-basolateral
em contraste com o que ocorre no grupo centro-medial (Sorvari, 1997; Gloor,
1997).
Parece claro que tanto no hemisfério direito como no hemisfério
esquerdo os neurônios apresentam área do corpo celular com valores próximos
entre si. Esse é um fato relevante porque pode sugerir que efeitos de
lateralidade na morfologia e/ou funcionamento do Me humano (Kandel et al.,
2000) não têm na área do soma seu principal determinante. Similarmente, em
ratos o volume do corpo celular não apresenta diferenças inter-hemisféricas na
parte posterior do Me (Hermel et al., 2006). Aparentemente, tampouco
puderam ser encontradas diferenças notáveis quanto ao aspecto ou à
morfologia geral dos corpos celulares ao longo do eixo rostrocaudal do Me
humano. De Olmos (2004) havia dividido o Me em uma parte anterior e outra
posterior de acordo com critérios citoarquitetônicos. Baseado unicamente na
área do soma neuronal, isso não serve como parâmetro morfológico para dar
suporte a esta divisão.
O número de neurônios e células gliais pode ser estimado por técnica
estereológica baseada nos resultados obtidos pela técnica da tionina, pela
descrição dos tipos celulares do Me e pela possibilidade de serem
estaqbelecidos os limites externos desse núcleo (Mai et al., 2008). Essa é uma
implicação futura para os dados atuais. Outra perspectiva é a comparação e a
complementação das imagens obtidas pela impregnação de astrócitos com os
110
resultados de técnica imunohistoquímica para a proteína ácida fibrilar glial
(GFAP). Também neurônios impregnados pela prata no Me podem ser úteis
para associar a técnica de Golgi com estudos ultraestruturais (adaptando
técnica descrita por Bolam, 1992).
Com relação ao método de Golgi empregado aqui, alguns comentários
se fazem necessários. Assim como outras técnicas, ele apresenta vantagens e
restrições. O método de Golgi denominado originalmente de “single-section”
(sem ósmio) e sua adaptação segundo Izzo et al. (1987) e Bolam (1992)
representa outra técnica que pode ser empregada para o estudo da morfologia
das células do encéfalo de seres humanos. Uma de suas vantagens é que ela
pode ser aplicada a tecido humano fixado em formaldeído e armazenado por
longo tempo, permitindo o estudo de neurônios e células gliais em amostras de
encéfalo mantidas sob procedimento de fixação simples e rotineiro. Quando se
obtêm resultados adequados, a técnica de Golgi revela os diferentes tipos de
neurônios que constituem uma região nervosa e a morfologia celular detalhada,
o que pode indicar importantes relações entre a forma e a função neuronal
(Wooley & McEwen, 1994; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008;
Gómez-Villalobos et al., 2009; Rasia-Filho et al., 2009). Por outro lado, uma
das suas desvantagens é o número imprevisível de neurônios que se tornam
adequadamente impregnados pela prata e passíveis de serem estudados em
detalhes, além do padrão não homogêneo de impregnação celular em cada
secção de tecido nervoso.
No presente trabalho, um número reduzido de casos foi estudado e,
nesses, um número pequeno de neurônios pôde ser observado. O melhor
resultado foi apresentado na Figura 4. Isso indica que novos experimentos são
necessários para alicerçar as conclusões sobre os tipos celulares que
compõem o Me ao longo de sua distribuição rostrocaudal. Não obstante, os
resultados são congruentes com a morfologia dos neurônios revelada pela
técnica da tionina, o que indica que alguns neurônios aleatórios impregnados
por Golgi são representativos do Me e já puderam ser observados. Os
espinhos dendríticos, importante componente neuronal que pode aumentar a
superfície sináptica, são relevantes para o tipo de resposta pós-sináptica e
respostas plásticas (Oertner &; Matus, 2005; Tada & Sheng, 2006), uma
quantidade inicial, mas ainda insuficiente foi observada no presente estudo.
111
Esses espinhos dendríticos pareceram ser preferentemente classificáveis como
arredondados e/ou finos. Se este tipo de observação se confirmar em estudos
posteriores, isso pode sugerir que os espinhos dendríticos no Me humano
sejam preferencialmente menos plásticos que os com formato de cogumelo
(Peters, Kaiserman-Abramof, 1970; Peters et al., 1991; Hering; Sheng, 2001;
González-Burgos, 2004). Embora estudos eletrofisiológicos sejam necessários
para aclarar este ponto, eles esbarram em restrições éticas irrevogáveis ou
dificuldades técnicas sérias para obtenção de tecido vivo no decurso de
neurocirurgias para remoção de tecido com característica epileptogênica que
ocorrem comumente no lobo temporal, por exemplo.
Em conclusão, os presentes resultados sugerem que o Me de seres
humanos apresenta neurônios multipolares, com corpos celulares médios a
grandes e que indicam, aparentemente, uma organização celular local com
pouca variabilidade morfológica emambos os hemisférios e ao longo de seu
eixo rostrocaudal. Esses dados, embora iniciais, devem servir para direcionar
esforços futuros envolvendo outras metodologias no intuito de revelar os
componentes neurogliais para o funcionamento do Me humano, assim como foi
feito para outras espécies.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores são gratos aos familiares que doaram o tecido que resultou
no presente estudo experimental. Apoio financeiro da Agência Federal
Brasileira CNPq. JEM e AARF são pesquisadores do CNPq.
6. REFERÊNCIAS
Alheid GF, de Olmos JS, Beltramino CA. Amygdala and extended amygdala. In:
Paxinos G. The rat nervous system. San Diego: Academic Press, p495-498,
1995.
112
Amaral DG, Price JL, Pitkanen A, Carmichael ST. The Amygdala:
Neurobiological aspects of emotion, memory, and mental disfunction. Aggleton
JP (ed) Wiley-Liss: New York, 1992, ch1, p-1-66.
Bolam JP. Experimental Neuroanatomy: A Practical Approach. Oxford
University Press: New York, 1992: 296.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of posterodorsal medial amygdala neurons of adult male and female
rats: Further data based on the Golgi method. Neurosci. Lett., 2008a; 430: 151–
56.
Dall'Oglio A, Gehlen G, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic branching
features of Golgi-impregnated neurons from the “ventral” medial amygdala
subnuclei of adult male and female rats. Neurosci. Lett., 2008b; 439: 287-92.
de Olmos JS, Heimer RL. The concepts of the ventral striatopallidal system and
extended amygdala. Ans NY Aca Sci. 1999; 877: 1-32.
de Olmos J. In: Paxinos G, Mai J. Hum nerv sys. 2004; 2 San Diego: Elsevier.
DeArmond SJ, Fusco MM, Dewey MM. Structure of the Human Brain, third ed.
Oxford University Press: New York, 1989: 208.
Gloor P. The temporal lobe and limbic system. OUP: 1997 New York and
Oxford.
Gómez-Villalobos MJ, Gordillo AC, López Jr, Flores G. The utility of the Golgi-
Cox method in the morphological characterization of the autonomic innervation
in the rat heart. J. Neurosci. Methods, 2009; 179: 40-4.
González-Burgos I, Alejandre-Gómez M, Cervantes M. Spine-type densities of
hippocampal CA1 neurons vary in proestrus and estrus rats. Neurosc Let. 2004;
379:52-54.
Hering H, Sheng M. Dendritic spines: structure, dynamics and regulation. Nat
Rev Neurosc. 2001; 2: 880-888.
Hermel EES, Ilha J, Xavier LL, Rasia Filho AA, Achaval M. Influence of sex and
estrous cycle, but not laterality, on the neuronal somatic volume of the
posterodorsal medial amygdala of rats. Neurosci. Lett., 2006; 405: 153-58.
Izzo PN, Graybiel AM, Bolam JP. Characterization of substance P- and
[Met]enkephalin-immunoreactive neurons in the caudate nucleus of cat and
ferret by a single section Golgi procedure. Neuroscience, 1987; 20: 577-87.
113
Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM. Principles of Neural Science, 4th ed.,
pp.178–180. McGraw-Hill, New York, 2000.
Larriva-Sahd J. Histological and cytological study of the bed nuclei of the stria
terminalis in adult rat. II. Oval nucleus: extrinsic inputs, cell types, neuropil, and
neuronal modules. J. Comp. Neurol., 2006; 497: 772-807.
Mai JK, Paxinos G, Voss T. Atlas of the Human Brain. Amsterdam: Elsevier,
2008.
Marcuzzo S, Dall‟Oglio A, Ribeiro MF, Achaval M, Rasia Filho AA. Dendritic
spines in the posterodorsal medial amygdala after restraint stress and ageing in
rats. Neurosc Letter. 2007, v.424, p.16-21.
Martinez FG, Hermel EE, Xavier LL, Viola GG, Riboldi J, Rasia Filho AA,
Achaval M. Gonadal hormone regulation of glial fibrillary acidic protein
immunoreactivity in the medial amygdala subnuclei across the estrous cycle
and in castrated and treated female rats. Brain Res., 2006; 1108: 117-26.
Oertner T, Matus A. Calcium regulation of actin dynamics in dendritic spines.
Cell Calcium. 2005, v. 37, p. 477-482.
Peters A, Kaiserman-Abramof IR. The small pyramidal neuron of the rat
cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 1970, v. 127,
p. 321-356.
Peters A, Palay SL, Webster HD. Dendrites. In: The Fine Structure of the
Nervous System: Neurons and Their Supporting Cells. New York: Oxford
University Press, p. 70-100, 1991.
Rasia Filho AA, Brusco J, Moreira, JE. Spine plasticity in the rat medial
amygdala. In Baylog RL, editor. Dendritic Spines: Biochemistry, Modeling and
Properties. Nova Science Publishers: Hauppauge, 2009, 406-5.
Rasia Filho AA, Fabian C, Rigoti K, Achaval M. Influence of sex, estrous cycle
and motherhood in dendritic spine density in the rat medial amygdala revealed
by the Golgi method. Neurosci, 2004; 126: 839-47.
Rasia Filho AA, Londero RG, Achaval M. Effects of gonadal hormones on the
morphology of neurons from the medial amygdaloid nucleus of rats. Brain Res
Bull, 1999; 48: 173-83.
Rasia Filho AA, Xavier LL, Santos P, Gehlen G, Achaval M. Glial fibrillary acidic
protein immunodetection and immunoreactivity in the anterior and posterior
114
medial amygdala of male and female rats. Brain Res Bull, 2002, v58, n1, p67-
75.
Rose M. Der allocortex bei Tier und Mensch. I Teil. J Psychol Neurol. 1926,
v34, p1-260.
Rose M. Die sog. Riechrinde beim Menschen und beim Affen. II Teil des
“Allocortex bei Tier und Mensch”. J Psychol Neurol. 1927a, v34, p261-401.
Sorvari H. Neurons containing calcium-binding proteins in the human
amygdaloid complex. Dissertação. 1997, Universidade de Kuopio: Kuopio.
Tada T, Sheng M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis.
Curr Opin Neur, 2006, v. 16, p. 1-7.
Woolley CS, McEwen BS. Estradiol regulates hippocampal dendritic spine
density via an N-methyl-D-aspartate receptor-dependent mechanism. J.
Neurosci., 1994; 14: 7680-87.
115
LEGENDAS
Figura 1. Representação esquemática do hemisfério cerebral esquerdo
humano e a localização do núcleo medial da amígdala (preenchido com preto)
ao longo do eixo rostro-caudal (imagens anteriores acima, imagens posteriores
abaixo na figura). Os valores à direita correspondem à escala igualmente
apresentada no atlas de Mai et al. (2008), de onde foram obtidas e adaptadas
essas imagens, e com referência ao plano de corte usado neste mesmo atlas
(atrás do pólo anterior do lobo temporal e antes dos corpos mamilares
hipotalâmicos). Ot = trato óptico.
Figura 2. Imagem microscópica digitalizada de neurônios do núcleo medial da
amígdala humano corados pela técnica da tionina. A partir deste tipo de
imagem foram feitas as medidas em computador da área do corpo celular,
delimitadas pelas linhas fechadas no seu bordo, e empregando-se programa
para morfometria (software Image-Pro Plus 6.0, Media Cybernetics, EUA).
Figura 3. Imagens microscópicas digitalizadas de células do núcleo medial da
amígdala humano coradas pela técnica da tionina. (A-B) Corpos celulares de
maior tamanho e com características histológicas que permitem a classificação
como neurônios de cujos corpos celulares de diferentes formas e com dois ou
mais dendritos primários. Corpos celulares em posição perineuronal e com
coloração mais intensa do núcleo sem nucléolo correspondem aparentemente
a células da glia locais. (C) Somas com aspecto polimórfico com dendritos
primários correspondem a células estreladas. (D) Corpo celular evidente com
dois prolongamentos dendríticos primários, correspondendo ao de tipo
“bitufted”. A escala presente em (D) é válida e idêntica para todas as imagens.
Figura 4. Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas de células do
núcleo medial da amígdala humano após o uso de uma adaptação do método
de Golgi “single-section”. Comparada com a população neuronal local
observável pela técnica da tionina, um pequeno percentual de células resultou
impregnado. Astrócitos protoplasmáticos se tornaram visíveis, alguns próximos
a vasos sanguíneos (A). Um neurônio multipolar de tipo estrelado é mostrado
116
em (B), e colocada em maior amplificação em (C) para observar a presença de
espinhos dendríticos pleomórficos. Como regra, um fundo mais claro permitiu
um contraste adequado para o resultado da impregnação celular.
117
Figura 1.
118
Figura 2.
119
Figura 3.
120
Figura 4.
121
8. CONCLUSÃO
______________________________
A técnica da tionina e o método de Golgi de tipo “single-section” foram
adaptados para permitir sua utilização satisfatória em tecido nervoso humano
não perfundido e armazenado em formol por longo período. Ambas as
metodologias puderam ser aplicadas ao estudo do Me humano e geraram
resultados inéditos sobre a organização celular desta estrutura. O Me em
ambos os hemisférios cerebrais possui neurônios multipolares com corpos
celulares com citoplasma bem delimitado, soma com contorno arredondado,
ovoide, fusiforme ou multiforme. Neurônios de tamanho médio a grande foram
observados e, baseado na morfologia dos corpos celulares e do número de
ramos dendríticos primários, foram classificados como “bitufted” ou estrelados.
Não foram observados neurônios com aspecto piramidal que pudessem ser
claramente relacionados com uma organização cortical local. Foram igualmente
observados ramos dendríticos com espinhos de aspecto arredondado ou
afilado bem como células gliais em situação perineuronal ou astrócitos
protoplasmáticos, alguns próximos a vasos sanguíneos. Esses dados
embasam e direcionam esforços futuros para compreensão da morfologia
celular e sua repercussão no funcionamento do Me humano.
122
9. ANEXOS
______________________________
ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título da pesquisa: Morfologia de neurônios da amígdala medial em seres
humanos
I. Justificativa e objetivos da pesquisa.
O sistema nervoso é composto por células que coordenam todos os
comportamentos do ser humano. No cérebro há uma região pequena chamada
amígdala que ainda não se sabe completamente sua função, mas que regula
atividades como o medo, por exemplo. A amígdala e as áreas vizinhas têm
cerca de 2 cm e ficam numa região mais anterior do cérebro que pode ser
estudada com técnicas que permitem ver os neurônios que a compõem para
que se possa avançar nos conhecimentos científicos. Isso pode ajudar a
compreender sua função normal e em casos de algumas doenças
neurológicas, como o mal de Alzheimer. O objetivo deste trabalho é estudar
essas células da amígdala e descrever como elas são em nós, seres humanos.
II. Os procedimentos a serem utilizados e guarda do material
Durante o procedimento habitual da necropsia deve-se analisar as
partes do cérebro também. Neste momento, uma pequena porção de não mais
do que 5 cm poderia ser retirada para este estudo. Nesta porção cerebral está
a amígdala. O material obtido será após analisado em laboratório para avançar
pesquisa científica. No laboratório, as células do cérebro serão vistas em
microscópio após serem empregadas técnicas que identificam as suas partes
e, com isso, serão estudadas. Todo esse material ficará guardado em
laboratório de pesquisa científica na Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, R. Sarmento Leite, 245, Porto Alegre - RS, guardado
o sigilo do doador.
III. Os desconfortos ou riscos esperados
123
Não há desconfortos ou riscos esperados para os familiares ou
responsáveis legais da pessoa falecida. O procedimento de necropsia a ser
realizado é o habitual e indicado por normas técnicas/acadêmicas e legais.
IV. Os benefícios que podem ser obtidos
O estudo desta pequena parte do cérebro pode contribuir para que se
entenda o tipo de célula que compõe e que faz funcionar esta região, a
amígdala. Com isso, o conhecimento científico pode aumentar e ajudar a
entender como a amígdala funciona normalmente e em casos patológicos. Esta
é uma das primeiras etapas de estudo de um órgão do ser humano, ou seja, de
saber como são as células que compõem esse órgão.
V. Os procedimentos alternativos que possam ser vantajosos (descrever)
Os procedimentos alternativos a este tipo de estudo são a realização
dos mesmos experimentos em animais, como ratos, camundongos, gatos e
cachorros. Esses experimentos já foram feitos. Neste momento, não há
alternativa para estudar como são as células da amígdala do ser humano a não
ser conseguir observá-las ao microscópio.
VI. Garantia de resposta a qualquer pergunta
Trata-se de uma pesquisa científica com finalidade de estudo da forma
das células da amígdala em nós, seres humanos. O familiar ou responsável
legal pela pessoa falecida tem assegurada a resposta a qualquer tipo de
pergunta que queira fazer sobre o procedimento de retirada desta pequena
parte do cérebro, da forma como vai ser estudada em laboratório e quais são
os resultados que se espera obter com esse tipo de pesquisa. A Dra. Helena
Terezinha Hubert Silva, médica legista do DML e/ou Denise Gomes Rodrigues
Ferme, que são co-autoras deste projeto e estão capacitadas a responder
todas as perguntas que se quiserem fazer sobre o procedimento aqui descrito.
VII. Liberdade de abandonar a pesquisa sem prejuízo para si
O familiar ou responsável legal pela pessoa falecida tem toda a
liberdade para não querer participar deste estudo, negando a retirada da
amígdala para estudo científico de suas células em laboratório. Isso não
124
implicará qualquer tipo de prejuízo no procedimento de necropsia. Da mesma
forma, têm a liberdade de abandonar esta pesquisa no momento que bem
entender, sem que isso acarrete necessidade de justificativas ou qualquer tipo
de indenização.
VII. Garantia de privacidade
Ressaltamos também que a concordância em participar deste estudo
não implica necessariamente qualquer modificação no procedimento de
necropsia que já está sendo feito, nem tampouco os resultados desse estudo
terão efeito de qualquer forma sobre ele. Da mesma forma, a não concordância
em participar deste estudo não irá alterar de forma alguma o procedimento de
autópsia já estabelecido.
Eu,......................................................(familiar ou responsável) fui
informado dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada.
Recebi informação a respeito de como será retirada parte do tecido cerebral
para estudo, como o estudo será feito, e esclareci minhas dúvidas. Sei que em
qualquer momento poderei solicitar novas informações e modificar minha
decisão se assim eu o desejar. A Dra. Helena Terezinha Hubert Silva (médica
legista e uma das pesquisadoras responsáveis pelo estudo) certificou-me de
que todos os dados desta pesquisa serão confidenciais e o procedimento de
necropsia não será modificado em razão desta pesquisa e terei liberdade de
retirar meu consentimento de participação na pesquisa, em face de estas
informações.
125
ANEXO 2 - ANAMNESE
PROTOCOLO DE IDENTIFICAÇÃO
Caso n°_________
IDENTIFICAÇÃO - Nome do familiar que informa dados: ___________________________ - Endereço: ________________________________________________ - Fone: _____________ - Nome da vítima: ___________________________________________ - Idade: ______ Profissão: ____________________________________ - Escolaridade: _____________________________________________
ANTECEDENTES - Clínicos: ( ) cefaléia freq. ( ) tonturas/vertigens
( ) desmaios ( ) tremores/ déficits motores ( ) convulsões ( ) deficiência de mobilidade congênita ( ) coma ( ) acidentes de trânsito ( ) meningites ( ) outros _______________________
- Patologias: ( ) AVC ( ) HAS ( ) diabetes ( ) Parkinson ( ) Alzheimer ( ) epilepsia ( ) depressão ( ) medo/stress pós-traumático ( ) HIV+ ( ) outros _______________________
- Psicossociais: ( ) tabagismo ( ) violência/agressividade ( ) bebidas alcoólicas ( ) desnutrição infantil ( ) abuso sexual ( ) drogas ilícitas/quais __________________ * Intervenções: ( ) internação hospitalar ______________________ ( ) UTI/motivo ______________________________ ( ) cirurgia/data _____________________________ ( ) medicamentos ___________________________
CONDIÇÕES DO ÓBITO - Data: ___/___/___ - Hora: ___:___ - Situação do óbito: __________________________________________
ENTREVISTADOR:
- Nome: ________________________________ - Assinatura: ______________________ - Data: ___/___/___ - Hora: ___:___
126
ANEXO 3 – PARECER UFCSPA
127
ANEXO 4 – PARECER DML
128
129
ANEXO 5 – PARECER UFRGS
130
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
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