UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y
PARASITOLOGÍA
Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus
thuringiensis producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de
muerte de larvas de Spodoptera frugiperda
TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
AUTOR: Br. FERNANDO NIEVES RODRÍGUEZ
ASESORA: Dra. EVA ELIZABETH VILLANUEVA TARAZONA
Trujillo - Perú
2015
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Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO
Dr. Orlando Gonzáles Nieves
RECTOR
Dr. Rubén Vera Véliz
VICERECTOR ACADÉMICO
Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas
VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN
Dr. Steban Ilich Zerpa
SECRETARIO GENERAL
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
Dr. José Mostacero León
DECANO
Dr. William Zelada Estraver
SECRETARIO
Dra. Bertha Soriano Bernilla
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos
de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de
Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración
y criterio el presente trabajo de tesis titulado:
“Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus thuringiensis
producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de muerte de larvas de
Spodoptera frugiperda” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo
Microbiólogo.
Trujillo, Diciembre del 2015
Br. Fernando Nieves Rodríguez
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MIEMBROS DEL JURADO
Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en
concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y
Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.
_________________________________
Ms. C. Pedro Alvarado Salinas
PRESIDENTE
_________________________________
Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona
SECRETARIO
_________________________________
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
VOCAL
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente
Informe de Tesis titulado: “Efecto tóxico del cristal parasporales de cuatro cultivos
de Bacillus thuringiensis producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de
muerte de larvas de Spodoptera frugiperda”, ha cumplido con los requisitos formales y
fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
_________________________________
Ms. C. Pedro Alvarado Salinas
PRESIDENTE
_________________________________
Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona
SECRETARIO
_________________________________
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
VOCAL
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CERTIFICACION DE LA ASESORA
El que suscribe, profesora asesora de la tesis titulada:
“Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus thuringiensis
producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de muerte de larvas de
Spodoptera frugiperda”
Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias
Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su
correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones
y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo a Fernando Nieves Rodríguez continuar con el trámite del
reglamento correspondiente.
Trujillo, Diciembre del 2015
_________________________________
Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona
ASESORA
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DEDICATORIAS
A Dios por brindarme el apoyo espiritual hasta este momento tan importante de
mi formación profesional y por haberme dado las oportunidades necesarias para
desarrollarme como ser humano.
A mis padres Fernando y María Antonieta por enseñarme que los sueños se
logran a base de esfuerzo y dedicación; y por darme la oportunidad de crecer al lado
de ellos y ser mejor día a día.
A mis hermanos Rosa Melva y Julio, por enseñarme la fuerza y fortaleza que los
pasajes de la vida nos conllevan a afrontar, por compartir cada momento de alegría y
por ser parte de este camino profesional, que hace unos años decidí recorrer.
A mis Abuelos, Sebastián y José Manuel, los pilares de mi familia y quienes
espiritualmente están conmigo les agradezco su infinito amor, cariño y enseñanzas,
para ellos que siempre estarán en mis pensamientos, les dedico todo mi esfuerzo y a
mis abuelas Luisa e Isabel, por sus consejos y compañía a lo largo de mi vida.
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AGRADECIMIENTO
A mi asesora de tesis, Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona, por su dedicación,
apoyo incondicional y por haberme brindado la orientación necesaria para desarrollar de la
mejor manera la realización de esta investigación.
A los maestros MsC. Julio Arellano Barragán, Dr. Carlos León Torres y el Dr. Carlos
Nomberto Rodríguez, por su gran apoyo y motivación para la culminación de mis estudios
profesionales y por impulsar el desarrollo de mi formación profesional y científica.
A la Ing. Diana Ivonne Moreno Baca Gerente de la empresa Soluciones
Agrosostenibles S.A.C. quien me brindo toda su confianza y me dio la oportunidad de
desarrollarme profesionalmente y de realizar la tesis de la mejor manera; así mismo, a toda
la familia SolAgro con quienes compartí conocimientos y experiencias.
A Danitza Plasencia, Mirelly Silva, Carlos Rebaza, César Pérez y Luis Paredes, mis
amigos, por haberme permitido conocerlos y hacer de esta vida universitaria y profesional
una de las etapas más hermosas de mi vida.
Finalmente, a la Universidad Nacional Trujillo por abrirme sus puertas y permitirme
ser parte de ella, hoy y siempre. Gracias
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ÍNDICE
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ......................... ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ........................... iii
PRESENTACIÓN ............................................................................................................ iv
MIEMBROS DEL JURADO ............................................................................................. v
APROBACIÓN ................................................................................................................ vi
CERTIFICACIÓN DE LA ASESORA ............................................................................ vii
DEDICATORIA ............................................................................................................ viii
AGRADECIMIENTO ...................................................................................................... ix
ÍNDICE ............................................................................................................................. x
RESUMEN ..................................................................................................................... xii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 4
MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................................... 5
1. Material biológico .................................................................................................... 5
2. Procedimiento .......................................................................................................... 5
2.1. Tratamiento de las semillas de Z. mays “maíz amarillo” y siembra en vivero ..... 5
2.2. Reactivación y verificación de la pureza de los cultivos de B. thuringiensis ....... 6
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2.3. Preparación y estandarización de los pre-inóculos de los cultivos de B.
thuringiensis ..................................................................................................... 6
2.4. Preparación de los inóculos de los cultivos de B. thuringiensis .......................... 7
2.5. Esterilización de los biorreactores...................................................................... 7
2.6. Preparación de los medios de cultivo ................................................................. 7
2.7. Inoculación en los biorreactores......................................................................... 8
2.8. Proceso de producción de cristales..................................................................... 9
2.9. Inoculación de los cultivos B. thuringiensis en las plantas de Z. mays “maíz
amarillo” ........................................................................................................... 9
2.10. Aplicación de S. frugiperda en estadio 3 en las plantas de Z. mays “maíz
amarillo” tratados con cristales de B. thuringiensis ........................................... 9
2.11. Recuperación de los cultivos de B. thuringiensis a partir de larvas de S.
frugiperda muertas ......................................................................................... 10
2.12. Análisis ........................................................................................................... 10
RESULTADOS ............................................................................................................... 11
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 16
ENUNCIADO RESUMEN ............................................................................................. 19
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 20
ANEXOS ........................................................................................................................ 25
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RESUMEN
En esta investigación se determinó el efecto tóxico del cristal parasporal de Bacillus
thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A, producidos en Caldo nutritivo (CN) y Caldo harina de
soya (CHS) sobre el porcentaje de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda
en plantas de Zea mays “maíz amarillo”. Los pre-inóculos se prepararon en Plate Count
Agar y los inóculos en CN y CHS. Cada inóculo (40 mL) se adicionó a biorreactores
estériles conteniendo 360 mL de CN y CHS, se incubaron durante 72 horas a 30°C y en
agitación constante (130 rpm). Luego, los cultivos de B. thuringiensis, fueron aplicados en
plantas de Z. mays “maíz amarillo” a las que posteriormente se introdujo una larva de S.
frugiperda en estadio 3. Se logró producir cristales parasporales de B. thuringiensis 1K,
2K, 14B y 4A en CN y CHS; los cristales producidos en CN, ocasionaron el 40, 40, 50 y
30% de muerte de larvas de estadio 3 de S. frugiperda, y los producidos en CHS, el 70, 50,
80 y 50%. Los signos observado en las larvas de S. frugiperda aplicados en plantas de Z.
mays “maíz amarillo”, a lo largo de los nueve días de evaluación, fueron, movimiento
errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación. A partir de las larvas
muertas de S. frugiperda se recuperaron los cultivos de B. thuringiensis con características
iguales a las inoculadas.
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INTRODUCCIÓN
Los agentes de control biológico utilizados en el manejo integrado de plagas son
de gran importancia debido a que el uso indiscriminado de insecticidas químicos
además de producir un efecto residual en el ambiente genera resistencia y daño a
organismos no blancos, tales como predatores, polinizadores, etc. Así mismo, debido a
su bajo costo en el mercado, en comparación con los insecticidas químicos, resulta
económico para su producción a mayor escala 1, 2, 3, 4.
Entre los agentes que tienen capacidad de ser utilizados en el control biológico
con característica de entomopatógeno, existen aproximadamente 300 especies de
bacterias, de las cuales las más importantes desde el punto de vista comercial pertenecen
al género Bacillus, tales como B. popilliae, B. moritai, B. sphaericus y B. thuringiensis;
esta última, debido a su inocuidad para e1 hombre, los animales domésticos, la flora y
fauna silvestre; y al ataque específico al estado larvario de lepidópteros y dípteros
perjudiciales, a la velocidad de acción y ausencia de efectos sobre otros organismos no
blanco, representa el entomopatógeno de mayor producción en el mundo5 y se
constituye en una buena alternativa, en comparación al uso de los insecticidas
químicos1, 2.
B. thuringiensis es un bacilo Gram positivo que habita la flora normal del suelo,
mide de 3 a 5 µm de largo por 1 a 1,2 µm de ancho; además, presenta flagelos peritricos
y su espora elipsoidal central es no deformante6. Metabólicamente posee la capacidad
de utilizar como fuente de carbono glucosa, fructosa, trealosa, maltosa y ribosa, así
como hidrolizar almidón7. Como fuente de nitrógeno se ha reportado que requiere de
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aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de nitrógeno, tales como, harina de
maíz, extracto de levadura y caseína8; y como los minerales importantes para su
crecimiento y esporulación, se mencionan al magnesio, manganeso, hierro, zinc y
calcio9.
En relación al valor del pH, B. thuringiensis presenta un crecimiento óptimo
entre 5.6 – 8.5 siendo el valor promedio óptimo 7.0, durante el crecimiento este valor
decrece por la formación de ácidos como el ácido láctico10. Para la temperatura se
reportan valores entre 20 a 42°C, sin embargo, a temperaturas cercanas a 42°C se
produce una disminución en la producción de la delta – endotoxina, la cual forma parte
del cristal o inclusión parasporal11. En cuanto a la velocidad de agitación en el medio de
fermentación, se ha demostrado que una velocidad de 150 rpm produce una buena
esporulación y producción de cristales12, mientras que otros autores, recomiendan
utilizar una velocidad de agitación de 200 rpm, debido a que una velocidad de agitación
superior causa un decremento gradual en la producción de cristales13, 14.
Durante el proceso de esporulación B. thuringiensis presenta como principal
característica la producción de una inclusión parasporal que tiene efecto tóxico para
insectos específicos15. Estas inclusiones se sintetizan desde que ocurre el englobamiento
de la pre-espora hasta su maduración; se ubican en el interior de la célula, los cuales son
liberados cuando ocurre la lisis celular7, 15.
Entre las plagas ampliamente distribuidas en América se puede mencionar la
causada por Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae); esta plaga afecta
numerosos cultivos, siendo su hospedante preferencial el maíz, al que ataca con niveles
variables en las regiones tropicales y subtropicales de América Latina, constituyendo un
factor limitante del cultivo16, 17, 18, 19, 20.
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En los dos primeros estadios larvarios de S. frugiperda, las larvas se alimentan
de la epidermis de las hojas de maíz, dejando manchas translúcidas; a partir del tercer
estadio, consumen la mayor parte de la lámina foliar, produciendo orificios irregulares
en el follaje. Al cumplir el cuarto estadio, las larvas migran al cogollo de la planta de
maíz, donde encuentran protección y se desarrollan alimentándose del cogollo hasta los
estadios larvarios siete y ocho. En consecuencia, producen perforaciones transversales
que debilitan y quiebran las hojas, reduciendo la capacidad fotosintética de la planta;
siendo estos daños significativos21.
Considerando que B. thuringiensis es usado en el control biológico de plagas
debido a su capacidad de producir inclusiones parasporales o cristales que contienen
una proteína con capacidad insecticida contra insectos específicos14 y que la
composición del medio de cultivo afecta la capacidad toxica del cristal producido, es
necesario determinar el efecto tóxico del cristal parasporal de B. thuringiensis,
producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya sobre el porcentaje de muerte de
larvas de estadio 3 de S. frugiperda en plantas de Zea mays “maíz”.
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OBJETIVOS
- Producir cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus
thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A en
Caldo nutritivo y Caldo harina de soya.
- Determinar el porcentaje de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera
frugiperda por efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K,
Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A
producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de
Zea mays “maíz amarillo”.
- Registrar los signos que presentan las larvas de estadio 3 de Spodoptera
frugiperda por efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K,
Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis
4A, producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e inoculados en plantas
de Zea mays “maíz amarillo”.
- Recuperar los cultivos de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K,
Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A a partir de larvas muertas
de Spodoptera frugiperda por efecto de los cristales parasporales producidos en
Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de Zea mays “maíz
amarillo”.
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MATERIAL Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
- Cultivo de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus
thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A, proporcionados por la empresa
Soluciones Agrosostenibles S.A.C.
- Larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda, proporcionados por el Área de
Crianza de la Empresa Soluciones Agrosostenibles S.A.C.
- Semillas de Zea mays “maíz amarillo” proporcionados por el Área de Crianza
de la Empresa Soluciones Agrosostenibles S.A.C.
2. MÉTODOS
2.1. Tratamiento de las semillas de Z. mays “maíz amarillo” y siembra en
vivero
Las semillas de maíz fueron colocadas en un beacker estéril y remojados en
agua corriente durante 24 horas. Posteriormente, se desinfectaron con el
fungicida agrícola “Homai” (metil tiofanato) durante un minuto, y después
se realizó un lavado de las semillas con ADE.
En bolsas de siembra de 4 Kg de capacidad, se agregó 2 Kg de arena de
duna y humus, a una proporción de 1.5:0.5 y se adicionó 250 mL de agua
corriente con la finalidad de humedecer la mezcla.
Luego de ello se sembraron cuatro semillas de maíz en cada bolsa de
siembra, bajo 2 cm de profundidad. El crecimiento de las plantas de maíz se
realizó en condiciones de vivero (Temperatura 27°C ± 2, Humedad relativa
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74%) durante 30 días. Por cada cultivo de B. thuringiensis en cada medio de
cultivo se utilizaron 10 plantas de maíz para el problema y 10 para el testigo
(sin inoculación de B. thuringiensis). Obteniendo finalmente 80 plantas para
el problema y 80 para el testigo.
2.2. Reactivación y verificación de la pureza de los cultivos de B.
thuringiensis
Los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A, conservados en
refrigeración a -4°C, fueron sembrados en placas de Petri, conteniendo Plate
Count Agar (PCA) e incubados a 30°C durante 48 horas. Culminado el
tiempo de incubación se realizaron observaciones de sus características
macromorfológicas, como aspecto, borde y color (Anexo 1) y
micromorfológicas, como tinción de Gram29 y forma del cristal parasporal
(Anexo 2).
2.3. Preparación y estandarización del pre-inóculo de los cultivos de B.
thuringiensis
Los cultivos puros de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A se sembraron por
agotamiento, en placas de Petri conteniendo PCA y se incubaron a 30°C
durante 24 horas. Después de la incubación, los cultivos se cosecharon con
5 mL de agua destilada estéril (ADE) por placa; dichas suspensiones fueron
estandarizadas en espectrofotómetro a una absorbancia de 0.7 a 600 nm
constituyendo los pre-inóculos. A estas suspensiones se le realizaron
recuentos de unidades formadoras de colonias en placa (UFC/mL) en PCA,
obteniendo un valor de 3.3 x 108 UFC/mL.
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2.4. Preparación y estandarización de los inóculos de los cultivos de B.
thuringiensis
Cada uno de los cuatro pre-inóculos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A
se adicionaron a matraces conteniendo 36 mL de los siguientes medios de
cultivo: Caldo nutritivo (CN) y Caldo harina de soya (CHS). Todos los
medios de cultivo fueron ajustados a un valor de pH: 7.0 y se incubaron a
30°C y 130 rpm en una incubadora con agitación constante durante 12
horas. Después de la incubación se realizaron recuentos de unidades
formadoras de colonias en placa (UFC/mL), de los cultivos de B.
thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A obteniéndose los siguientes recuentos: 5.07,
2.85, 4.35 y 4.65 x 108 UFC/mL respectivamente.
2.5. Esterilización de los biorreactores
Los ocho biorreactores de 1.0 L de capacidad, fueron esterilizados a 121°C
por 15 minutos; y divididos en dos grupos, de cuatro sistemas cada uno,
según el medio de cultivo, y rotulados como CN y CHS.
2.6. Preparación de los medios de cultivo
Los dos medios de cultivo se prepararon como se describe a continuación:
CALDO NUTRITIVO (CN)
CALDO HARINA DE SOYA (CHS)
Extracto de carne 3.0 g
Peptona de carne 5.0 g
Agua destilada 1.0 L
Harina de soya 2.9 g
Maltodextrina 2.0 g
KH2PO4 8.0 g
K2HPO4 2.0 g
Agua destilada 1.0 L
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El valor del pH se ajustó a 7.0; el medio de cultivo CN fue esterilizado a
121°C durante 15 minutos y el medio de cultivo CHS durante 20 minutos.
2.7. Inoculación en los biorreactores
Los inóculos de los cuatro cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A
preparados según lo descrito en el numeral 2.4, se adicionaron en cada uno
de los biorreactores como se describe a continuación:
Todos los biorreactores contuvieron 360 mL del medio de cultivo
correspondiente y 40 mL del inóculo de B. thuringiensis correspondiente,
haciendo un volumen final de 400 mL.
Biorreactor Medio de cultivo B. thuringiensis
1
2
3
4
CN
1K
2K
14B
4A
5
6
7
8
CHS
1K
2K
14B
4A
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2.8. Proceso de producción de cristales
Los ocho biorreactores, debidamente acondicionados e inoculados fueron
incubados a 30°C a 130 rpm en una incubadora con agitación constante
durante 72 horas.
Cumplidas las 72 horas de incubación se procedió a trasvasar el producto de
la fermentación, vertiéndolo en recipientes estériles rotulados con los
números correspondientes a los biorreactores (1 al 8), los cuales fueron
sellados herméticamente y se conservaron hasta el momento de su uso.
2.9. Inoculación de los cultivos B. thuringiensis en las plantas de Z. mays
“maíz amarillo”
De los ocho recipientes se extrajo 1.5 mL y se suspendió en 100 mL de agua
destilada estéril (ADE), luego se adicionó 0.02 mL del adherente “Break
thru” (Poliéter polimetilsiloxano copolímero). Se agitó hasta obtener una
solución homogénea, y con la ayuda de un rociador de gota fina, se inoculó
cuidadosamente en cada planta de Z. mays “maíz amarillo” obtenidos según
lo descrito en 2.1.
2.10. Aplicación de S. frugiperda en estadio 3 en las plantas de Z. mays “maíz
amarillo” tratados con cristales de B. thuringiensis.
Se aplicó una larva de estadio 3 de S. frugiperda por planta de maíz y
posteriormente se monitoreo durante nueve días; este monitoreo consistió en
realizar conteos del número de larvas muertas y registrar los signos
observados en cada una de ellas. Las larvas muertas fueron colectadas,
individualmente, en frascos estériles conteniendo solución salina fisiológica
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0.9% se rotularon y se llevaron al laboratorio para la posterior recuperación
de los cultivos de B. thuringiensis correspondientes.
2.11. Recuperación de los cultivos de B. thuringiensis a partir de larvas de S.
frugiperda muertas
Las larvas muertas de S. frugiperda se desinfectaron con una solución de
hipoclorito de sodio al 3% durante 2 minutos, y se enjuagaron tres veces con
ADE. Cada larva fue homogeneizada mediante un machacado utilizando
1.0 mL de ADE con la ayuda de una varilla de vidrio estéril; luego se
sometieron a tratamiento térmico a 80°C durante 10 minutos, seguido de 5
minutos en baño de hielo. Posteriormente fueron sembrados por estria en
placas de Petri conteniendo Plate Count Agar (PCA), e incubadas a 30° C
por 24 horas.
Cumplido el tiempo de incubación se compararon las características
macromorfológicas de las colonias que desarrollaron, con las características
de los cultivos originales (cultivos madres); así mismo, se realizaron
coloraciones de Gram con la finalidad de evaluar la similitud de las
características micromorfológicas.
2.12. Análisis de datos
Los porcentajes de muerte de las larvas de estadio 3 de S. frugiperda por
efecto de los cristales parasporales de cuatro cultivos de B. thuringiensis
producidos en los medios CN y CHS, fueron organizados en Tablas y
representados en figuras para su análisis correspondiente. Además se aplicó
el análisis estadístico, ANOVA22.
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RESULTADOS
Para determinar el efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de B.
thuringiensis producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya sobre el porcentaje
de muerte de larvas de estadio 3 de S. frugiperda, se produjeron en primer lugar, los
cristales parasporales de los cuatro cultivos en los dos medios de cultivo, antes
indicados, como se muestra en la Figura 1.
Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda aplicadas
en plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales
producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya se presentan en la Figura 2; se
observa que los valores varían con el cultivo de B. thuringiensis y con el medio de
producción. El mayor porcentaje de muerte se observa en B. thuringiensis 14B en Caldo
harina de soya y el menor porcentaje de muerte se observa en B. thuringiensis 4A en
Caldo nutritivo.
En la tabla 1, se describe los signos que presentan las larvas en estadio 3 de S.
frugiperda, por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K, B.
thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A, producidos en Caldo
nutritivo y Caldo harina de soya durante los nueve días de evaluación.
En la tabla 2, se describe las características macromorfológicas y
micromorfológicas de los cultivos originales de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A y los
cultivos de B. thuringiensis recuperados a partir de larvas muertas de S. frugiperda en
Plate Count Agar (PCA) e incubados a 30°C durante 24 horas.
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Figura 1. Cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K
(b), B. thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d) producidos en Caldo
nutritivo y Caldo harina de soya a las 72 horas de incubación a 30°C y 130
rpm.
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Figura 2. Porcentajes de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda en
plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales
parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B.
thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A producidos en Caldo nutritivo y
Caldo harina de soya durante nueve días de evaluación.
Testigo: Sin aplicación de B. thuringiensis
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Tabla 1. Signos observados en las larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por
efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus
thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A,
producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e inoculados en
plantas de Zea mays “maíz amarillo”.
Signos
Movimiento errático
Inmovilidad
Diarrea
Cesamiento de la alimentación
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Tabla 2. Características macromorfológicas y micromorfológicas de los cultivos de
Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus
thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A, recuperados a partir de
larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por efecto de los cristales
parasporales producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e
inoculados en plantas de Zea mays “maíz amarillo”.
Cultivo de
Bacillus thuringiensis Características
Original Recuperado Macromorfológicas Micromorfológicas
1K 1K
Aspecto cremoso
Colonias blanquecinas,
opacas y de bordes
irregulares
Forma bacilar
Cristal bipiramidal
Gram positivo
2K 2K
Aspecto cremoso
Colonias blanquecinas,
opacas y de bordes
irregulares
Forma bacilar
Cristal bipiramidal
Gram positivo
14B 14B
Aspecto seco
Colonias blanquecinas,
opacas y de bordes
irregulares
Forma bacilar
Cristal bipiramidal
Gram positivo
4A 4A
Aspecto seco
Colonias blanquecinas,
opacas y de bordes
irregulares
Forma bacilar
Cristal bipiramidal
Gram positivo
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DISCUSIÓN
Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda aplicadas en
plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales producidos
en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, varían con el cultivo de B. thuringiensis y
con el medio de producción. Tal es así, que se observó que los cristales parasporales de
los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A producidos en Caldo harina de soya
presentaron mayor toxicidad a diferencia de los que fueron producidos en Caldo
nutritivo, respaldando la teoría que el medio de cultivo a base de sales produce una
mayor toxicidad23.
Los cultivos de B. thuringiensis 1K y 14B producidos en Caldo harina de soya,
resultaron ser los ideales para su producción, debido al efecto toxico producido en
larvas de estadio 3 de S. frugiperda de un 70 y 80% respectivamente; esto debido a que
en su composición el Caldo harina de soya posee nutrientes tales como, harina de soya,
maltodextrina y sales. La harina de soya contiene alrededor del 40 % de proteína y la
mayoría de los nutrientes que requiere la bacteria para su crecimiento y desarrollo. Así
mismo, la maltodextrina como fuente de carbono, y sales minerales que son necesarias
en el medio de cultivo para la producción del cristal paraesporal23.
Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda, en plantas de
Z. mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K
y 4A producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, a través de los días se
observa que incrementan hasta los cuatro días, y las producidas por B. thuringiensis 14B
y 2K, hasta los cinco días (Anexo 3 y 4).
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Se observó que las larvas de estadio 3 de S. frugiperda entre el tercer y quinto
día de haber consumido las hojas de maíz con cristales parasporales de B. thuringiensis
1K, 2K, 14B y 4A producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, murieron, lo
que conlleva a concluir que una vez ingerido el alimento inoculado, tardan en hacer
efecto alrededor de cinco días.
Se observó que las larvas de estadio 3 de S. frugiperda presentaron signos, tales
como, movimiento errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación,
dichas características corresponden al efecto entomopatógenos de los cristales
parasporales de B. thuringiensis. Esto debido a que al ser ingeridos los cristales de B.
thuringiensis son solubilizados en el intestino medio del insecto, tras lo cual se liberan
las proteínas cristalinas en forma de protoxinas, que estas al ser procesadas por
proteasas intestinales, generaran las toxinas activas que llevarán a la muerte de la larva
de S. frugiperda24. Bajo su forma monomérica, las toxinas atraviesan la membrana
peritrófica y se unen de forma univalente a la caderina, con gran afinidad en la cara
apical de la membrana epitelial24, 25. Luego, de acuerdo con estudios realizados en
cultivos de células de insectos, se inicia una cascada de señalización dependiente del ion
magnesio que sería responsable de la muerte celular26, como consecuencia, el tejido
intestinal resulta dañado gravemente, lo que impide la asimilación y retención de
compuestos vitales para la larva y lleva a la muerte del insecto. La muerte puede
acelerarse al germinar las esporas y proliferar las células vegetativas en el hemocele del
insecto27, 28 (Anexo 5).
Al recuperar los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A a partir de larvas
muertas de S. frugiperda por efecto de los cristales parasporales de los cuatro cultivos
de B. thuringiensis producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en
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plantas de Zea mays “maíz amarillo”, se observa micromorfológicamente que los cuatro
cultivos de B. thuringiensis presentan forma bacteriana bacilar, forma del cristal
parasporal bipiramidal y tinción Gram positiva. Por otro lado, se observa
macromorfológicamente que los dos primeros cultivos antes mencionados de B.
thuringiensis presentan aspecto cremoso, y los dos últimos aspecto seco. Además, los
cuatro cultivos de B. thuringiensis presentan colonias blanquecidas y opacas y de bordes
irregulares.
La prueba estadística ANOVA detecto diferencia estadísticamente significativas
(p<0.05) (Anexo 6) entre los porcentajes de mortalidad de larvas de estadio 3 de S.
frugiperda por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K, B.
thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A producidos en Caldo
nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de Z. mays “maíz amarillo”.
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ENUNCIADO RESUMEN
En la presente investigación se logró producir cristales parasporales de B.
thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A en Caldo
nutritivo y Caldo harina de soya; los cristales producidos por estos cuatro cultivos de B.
thuringiensis, en Caldo nutritivo, ocasionaron el 40, 40, 50 y 30% de muerte de larvas de
estadio 3 de S. frugiperda, mientras que los producidos en Caldo harina de soya, el 70, 50,
80 y 50%. Los signos observado en las larvas de S. frugiperda aplicados en plantas de Z.
mays “maíz amarillo”, a lo largo de los nueve días de evaluación, fueron, movimiento
errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación. A partir de las larvas
muertas de S. frugiperda se recuperaron los cultivos de B. thuringiensis con características
iguales a las inoculadas.
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ANEXOS
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Anexo 1. Colonias de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K (b), B.
thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d).
a) Aspecto cremoso, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.
b) Aspecto cremoso, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.
c) Aspecto seco, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.
d) Aspecto seco, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.
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Anexo 2. Tinción de Gram de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K (b), B.
thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d), observado al microscopio con
objetivo de inmersión.
a) Gram positivo, forma bacilar.
b) Gram positivo, forma bacilar.
c) Gram positivo, forma bacilar.
d) Gram positivo, forma bacilar.
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Anexo 3. Porcentaje de mortalidad de larvas en estadio 3 de Spodoptera frugiperda en
plantas de Zea mays “maíz” por efecto de los cristales parasporales de
Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B.
thuringiensis 4A, producidos en Caldo nutritivo; durante nueve días de
evaluación.
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uer
te
Tiempo (Días)
Testigo 1K 2K 14B 4A
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Anexo 4. Porcentaje de muerte de larvas en estadio 3 de Spodoptera frugiperda en
plantas de Zea mays “maíz” por efecto de los cristales parasporales de
Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B.
thuringiensis 4A, producidos en Caldo harina de soya; durante nueve días
de evaluación.
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Anexo 5. Signos presentados por larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por efecto
de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K,
B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A, producidos en Caldo nutritivo y
Caldo harina de soya e inoculados en plantas de Zea mays “maíz amarillo”.
a) Diarrea
b) Parálisis
c) Cesamiento de la alimentación
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Anexo 06. Valor P análisis estadístico, ANOVA
FV SC GL CM F VALOR P
M 1.125 1 1.125 22.0909091 0.01821985 < 0.05
P 0.81944444 3 0.27314815 0.20921986 0.88965953
MP 0.15277778 3 0.05092593 0.03900709 0.98961616
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