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Evaluacin de tres ensayos de diagnostico basados enPCR para la deteccin de infecciones mixtas de
PlasmodiumGonzlez Silvia Deynali Patricia
Olmos Garca Francisco Xavier
Valds Rives Silvia Anahi
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Antecedentes y Descubrimientos
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AntecedentesAntecedentes
Aproximadamente 2 millones depersonas estn expuestas a lamalaria con un estimado de 250
millones de casos clnicos yalrededor de 800.000 muertes alao
Cuatro especies de Plasmodiumse sabe que causan la malariaen humanos: P. falciparum, P.
vivax, P. malariae y P. ovale.
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Muchas regiones endmicascon malaria tienen informe de
infecciones mixtas de estasespecies y la prevalencia deinfecciones mixtas vara segnla regin geogrfica.
Las presentaciones clnicasde la malaria son a
menudo inespecficas y, en
consecuencia muchasenfermedades febriles deetiologa desconocida seatribuyen a la malaria (que
resulta en el diagnstico
presuntivo y tratamiento)
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Los instrumentos existentespara el diagnstico de la
malaria incluyen microscopa,
pruebas de diagnsticorpido (PDR) y herramientasmoleculares
Desde hace ms de un siglo,la microscopa se ha
mantenido como el estndar
para la deteccin de lamalaria y la determinacinde especies en reasendmicas.
Sin embargo, existen varios
desafos en el desempeo deldiagnstico microscpicopara el uso clnico de rutina.
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Las PDR son pruebasinmunocromatogrficas
diseadas para detectar
parsitos en los productosde la sangre humana.
Las PDR se utilizan cada
vez para el diagnstico dela malaria debido a que
son rpidos y fciles deusar sobre todo enentornos de recursos
limitados.
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Debido a que las PDR sonslo pruebas cualitativas, la
densidad de la parasitemiano puede determinarse conprecisin.
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Los mtodos moleculareshan demostrado ser tiles en
la identificacin de especies y
la deteccin precisa de lasinfecciones de especiesmixtas, adems de ladeteccin de infecciones
subclnicas.
Sin embargo, el uso deherramientas moleculares se veobstaculizada por algunos factores,
incluido el costo elevado de lacolocacin del equipamiento inicialy la imposibilidad de obtenerreactivos debido a unainfraestructura en entornos demuchos campos.
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La prueba ms utilizada para eldiagnstico molecular de la malariaes la reaccin en cadena de lapolimerasa (PCR)-basada en la
amplificacin del ADN ribosomal18S (ADNr) y del gen que permitela deteccin de las diferentesespecies de parsitos de la malariahumana, basados en productos dediferentes tamaos de PCR.
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El mtodo de PCR anidadadesarrollada por Snounou hasido ampliamente utilizadoen estudios de laboratorio y
en el diagnstico clnico,incluso en una referencia dediagnstico de laboratorio enlos Estados Unidos.
Sin embargo, este mtodorequiere mucho tiempo, costoso yes laborioso, ya que requiere decinco reacciones de PCR por
separado para detectar P.falciparum, P. vivax, P. ovale y P.malariae.
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El mltiplex de una solaronda utiliza un gnero
Plasmodium primer
especfico inversa con cuatroespecies con inters encebadores especficos.
Padley afirma la sensibilidadde que el ensayo sea de:
0,02 p / l para P. falciparum
P. ovale 0,004 p / l
Y no prueba de sensibilidadde la prueba para P. vivax yP. malariae.
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Adems de los tradicionalesherramientas moleculares
basados en PCR y PCR en
tiempo real han demostradorecientemente ser unaalternativa slida para eldiagnstico de la malaria.
Sin embargo, varios factoresimpiden el uso de estemtodo en las regionesendmicas de malaria,
incluido el costo, la falta deinfraestructura y falta deapoyo tcnico debido aproblemas deinfraestructura.
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Los tres mtodos descritosanteriormente basadas en la PCRson buenas alternativas a lamicroscopa y PDR.
Sin embargo, nadie ha evaluado
que estos mtodos de PCRtradicional es mejor en la deteccinde infecciones mixtas porPlasmodium.
Por lo que se han comparado eneste artculo los dos mtodos conel mtodo multiplex anidadautilizando cantidades conocidasdel laboratorio de ADN derivadosPlasmodium solo y mixtos cctelesque contienen las cuatro especiesde ADN.
Mtodos:
Anidada
Semi-anidada Un slo tubo mltiple
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Mtodos
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Cultivo de Parsitos y extraccin de
ADN
ADN extrado de :
Cultivos P. Falciparum(3D7)
Derivados de monos P.vivax (SV4)
P. malariae (Uganda)
P. ovale (Nigeria)
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Para las cuatro especies:
Frotis delgados
Tinciones
Conteo
Para conteo de glbulos infectados
El # total de glbulos rojospor micro litro se determinopara cada especie usando un
Coulter counter
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ADN aislado:
Un total de 8x106 parsitos porespecia
Suspendido en 200l estril deTE
Se tomaron alcuotas y seguardo a -20c
Diluciones hasta: 0.04genomas/
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Evaluacin de limites dediagnstico:
Detecciones individuales
Deteccin de mltiplesespecies
7 repeticiones
Cocteles mixtos: 2l de cada especieen dif. concentraciones
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Discusiones y Resultados
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Comparacin de tcnicas para el diagnstico de
diferentes especies dePlasmodium
1. Nested PCR2. Semi-nested multiplex
3. One tube multiplex
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1. Nested PCR
Especies de Plasmodium 0.4 p/l
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2. Semi-Nested PCR
P. falciparum y P. Vivax (o.4p/l)
P.Malariae (0.4 p/l)
P. Ovale ( 4 p/l)
Diferencia desensibilidad
especies
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3.Multiplex PCR
Menos especificidad
Al menos detecta 2especiessimultneamente
Detecta correctamenteP. falciparum en una
mezcla, pero no aP. malariae y P. Vivax.
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Confiabilidad: Menos de 50% de las pruebasrealizadas.
Identificacin de P. Ovale si laconcentracin del DNA era
igual o mayor que 10 p/ul.
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Con las pruebas detectaron:
1 p/l. De P. Ovale en mezclas usando: el semi-nested PCR, y el multiplex PCR.
1ro: 22/42
2do: 7/42
de las concentraciones esperadas para P. Vivax
9/42
Valoracin : 7 replicaciones
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Limitaciones
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Costos
Reactivos + plsticosconsumidos (muestra)
Nested PCR $8 dll/m
Semi-nested PCR $5dll/m
Multiplex PCR $4 dll/m
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CONCLUSIONES
Se demostr que El Nested PCR method es lamejor prueba basada en PCR para la deteccin de
diversas especies causantes de la malaria.
Promoviendo la optimizacin de nuevas tcnicasmoleculares puede incrementar el xito en las
pruebas de PCR tradicionales.
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Gracias
Preguntas?
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