Búsqueda computacional de inhibidores de la bomba de expulsión
MtrCDE de Neisseria gonorrhoeae
Manuel José Ruiz Munevar
Director: Dr. Gian Pietro Miscione Codirector: Dr. Alejandro Reyes Muñoz
Trabajo de tesis presentado para el grado de Microbiólogo
Departamento de Ciencias Biológicas
Facultad de Ciencias Universidad de los Andes
Colombia
Mayo, 2018
i
Abstract
Neisseria gonorrhoeae is the etiologic agent of the sexually transmitted infection gonorrhea.
Current treatments are composed, mainly, of azithromycin and ceftriaxone, but recently
azithromycin resistant isolates have been found. This resistance is due to the overexpression of
the MtrCDE efflux pump, which made it an important druggable target so that azithromycin’s
efficacy could be restored. We conducted virtual screenings (VS) targeting MtrD’s proximal and
distal binding sites, on molecular dynamics (MD)-generated conformations. The VS was
performed with the Asinex Elite Library, using different docking scoring functions. Potential
inhibitors were found that could lock the protein’s conformation, preventing extrusion and
further binding of the pump’s substrates. This occurs through interactions with a hydrophobic
trap and a GLY-rich loop, important characteristics of inhibition in a similar pump. Further
analyses are required to assess inhibition efficacy of the compounds found, but the results
obtained are encouraging thanks to the interactions with the GLY-rich loop and the hydrophobic
trap.
ii
Resumen
Neisseria gonorrhoeae es el agente etiológico de la infección de transmisión sexual gonorrea.
Los tratamientos actuales están compuestos, principalmente, por azitromicina y ceftriaxona, pero
recientemente aislamientos resistentes a la azitromicina han sido encontrados. Esta resistencia ha
sido asociada a la sobreexpresión de la bomba de expulsión MtrCDE, de forma que esta proteína
se convirtió en un objetivo farmacológico importante para restaurar la eficacia de la azitromicina.
Se llevaron a cabo tamizajes in silico sobre el bolsillo distal y bolsillo próximo de MtrD, a partir
de conformaciones generadas por dinámicas moleculares. El tamizaje in silico se realizó con la
librería Elite de Asinex, utilizando diferentes funciones de puntuación de docking. Se
encontraron potenciales inhibidores, que podrían bloquear la conformación de la proteína,
previniendo la extrusión de estos y evitando la unión de sustratos de la bomba. Esto ocurre a
través de interacciones con una trampa hidrofóbica y con un loop rico en glicina, características
importantes de la inhibición de una bomba de expulsión similar. Análisis experimentales son
necesarios para evaluar la eficiencia de inhibición de los compuestos encontrados, pero los
resultados encontrados son alentadores gracias a las interacciones con la trampa hidrofóbica y el
loop rico en glicina.
iii
Agradecimientos
Madre y Padre, gracias por todo el apoyo, consejos y ayuda que me dieron durante toda la
carrera. Nada de esto hubiera sido posible sin ustedes. Infinitas gracias por todo!
Dr. Gian Pietro Miscione, infinitas gracias por todo el apoyo en los últimos dos años. Gracias por
darme la oportunidad de trabajar en el COBO y darme todas las herramientas para aprender de
Química Computacional. Gracias por toda la confianza para poder desarrollarme como
investigador. Gracias por todas las oportunidades y puertas que me abriste.
Dr. Alejandro Reyes Muñoz, infinitas gracias por abrirme la puerta al mundo académico en
segundo semestre y por el apoyo para entregar la tesis. También, muchas gracias por dictar la
clase que me cambió la vida (Biología Celular) y que me puso en este rumbo.
Dorian Armando Acevedo, gracias por todos los consejos y apoyo durante el desarrollo de la
tesis. Gracias por toda la ayuda con las partes más químicas y por todas las horas que invertimos
en aprender como usar bien todas las herramientas.
Sebastián Franco Ulloa, gracias por enseñarme como usar Schrödinger y a hacer dinámicas
moleculares con GROMACS. Gracias por la paciencia en resolver mis dudas y por todo el apoyo
en la etapa final de la tesis.
Santiago Movilla y Luis Castañeda, gracias por siempre atender mis dudas y por estar pendientes
durante el desarrollo de la tesis. Gracias por el buen ambiente de trabajo y por todos los buenos
momentos.
Jonathan Hurtado y Andrés Ballesteros, gracias por la constante ayuda y apoyo con todos los
problemas con los que me enfrenté.
COBO, sin ustedes esta experiencia, indudablemente, no hubiera sido tan productiva y
disfrutable. Gracias por todo el aprendizaje!
iv
Contenido
Abstract ............................................................................................................................................ i
Resumen .......................................................................................................................................... ii
Agradecimientos ............................................................................................................................ iii
1. Introducción ................................................................................................................................ 1
2. Métodos....................................................................................................................................... 7
2.1 Simulación de docking .......................................................................................................... 7
2.2 Tamizaje in silico .................................................................................................................. 7
2.3 Dinámica molecular .............................................................................................................. 8
3. Metodología y Resultados........................................................................................................... 9
3.1 Preparación de la estructura de MtrD ................................................................................... 9
3.2 Obtención de conformaciones de MtrD para el tamizaje virtual. ....................................... 12
3.2.1 Generación de complejos MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135 .............................. 13
3.2.2 Dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135 .................. 15
3.2.3 Análisis de clustering de las cavidades A e I en las dinámicas moleculares ............... 29
3.3 Tamizaje in silico para encontrar potenciales inhibidores de MtrD ................................... 38
3.3.1 Preparación de la librería Asinex Elite Library para el tamizaje in silico ................... 39
3.3.2 Preparación de grids para las cavidades A e I ............................................................. 40
3.3.3 Resultados tamizaje in silico ........................................................................................ 40
4. Discusión................................................................................................................................... 48
4.1 Estructura de MtrD y conformaciones obtenidas por MD .................................................. 48
4.2 Tamizaje in silico ................................................................................................................ 48
5. Conclusiones ............................................................................................................................. 50
6. Referencias ................................................................................................................................ 52
7. Anexos ...................................................................................................................................... 55
7.1 Tablas .................................................................................................................................. 55
7.2 Figuras................................................................................................................................. 58
1
1. Introducción
Neisseria gonorrhoeae es un diplococo Gram negativo y es el agente etiológico de la enfermedad
de transmisión sexual (ETS) gonorrea, también conocida como gonococia. La infección por este
patógeno se da por contacto, y la colonización ocurre en el sitio anatómico de exposición (puede
ocurrir en la faringe, recto, uretra y cuello uterino); alternativamente puede haber infección en
los ojos de recién nacidos (Workowski, 2013). Complicaciones por esta ETS en mujeres
incluyen infertilidad, embarazos ectópicos, y dolor pélvico crónico (Workowski, 2013).
Recientemente el tratamiento de la gonococia ha sufrido disminuciones en su eficacia por la
evolución y prevalencia de cepas de N. gonorrhoeae resistentes a antibióticos (Kirkcaldy, 2016).
El único tratamiento aprobado por el CDC (Centers for Disease Control and prevention, Centro
de Control y prevención de Enfermedades) es una terapia dual, que incluye la aplicación de
ceftriaxona (cefalosporina) por inyección y azitromicina (macrolido) por vía oral (Kirkcaldy,
2016). La función de este tipo de terapias duales gira en torno a la dificultad probabilística de
que una población de bacterias que están en un proceso infectivo activo desarrolle
simultáneamente resistencia a dos antibióticos, cuyos mecanismos de acción difieran. De forma
que, si en la población de N. gonorrhoeae algunos individuos tienen una menor susceptibilidad a
la ceftriaxona, la azitromicina será capaz de disminuir la población bacteriana hasta un nivel que
el sistema inmune pueda manejar, y vice versa. El tratamiento dual tiene la ventaja de tratar la
gonococia eficientemente en todos los sitios de infección, pocos efectos colaterales, bajo precio y
facilidad de administración; características no compartidas por otros tratamientos (Kirkcaldy,
2016). Además, no se recomienda el uso de otros tratamientos por la alta prevalencia de
gonococos resistentes a demás antibióticos (Kirkcaldy, 2016).
En 2013, el 0.6% de los casos reportados de gonococia a la CDC presentaban una reducción en
la susceptibilidad a la azitromicina (Kirkcaldy, 2016). Esta reducción se toma como un MIC
2.0 g/mL, siendo MIC (de las siglas en inglés Minimum Inhibitory Concentration) la
concentración más baja de un antibiótico que inhibe visiblemente el crecimiento del
microorganismo en un cultivo (Kirkcaldy, 2016). En 2014, el 2.5% de los casos reportados
presentaban reducción en la susceptibilidad a la azitromicina (Kirkcaldy, 2016). A medida que
las MICs aumentan, los gonococos pueden crecer en presencia de concentraciones altas del
antibiótico en cuestión (Kirkcaldy, 2016). Esto es una señal de resistencia potencial inminente,
dado que, si las concentraciones del antibiótico necesario para controlar la infección aumentan
hasta un nivel crítico, la dosis necesaria sobrepasaría niveles terapéuticos, implicando que la
cantidad de antibiótico necesaria para controlar la infección pasaría a ser citotóxica para el
individuo con gonococia (Kirkcaldy, 2016).
El aumento de la prevalencia de cepas de N. gonorrhoeae que presentan una reducción en la
susceptibilidad a la azitromicina, 5 años después que los MICs de cefalosporinas (como la
ceftriaxona) aumentaran, resalta el posible desarrollo de resistencia al único tratamiento
recomendado para la gonococia (Kirkcaldy, 2016). En el reporte de Kirkcaldy, 2016, de los 125
aislamientos de cepas de gonococos con susceptibilidad reducida a la azitromicina 48.8% eran
resistentes a tetraciclina, 22.4% a penicilina, y 8.8% a ciprofloxacina. Esta información
2
demuestra la situación crítica del tratamiento para la gonococia, dado que si hay un desarrollo de
resistencia contra la azitromicina y ceftriaxona no habrá forma de curar quienes porten esta
infección.
La reducción de la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a la azitromicina ha sido asociada a la
actividad de la bomba de expulsión codificada por los genes mtrCDE, que impide la entrada del
antibiótico al citoplasma, cuando esta se encuentra sobreexpresada (Zarantonelli, Borthagaray,
Lee, & Shafer, 1999). Estos genes constituyen una unidad transcripcional y sufren regulación
negativa por MtrR, una proteína codificada por mtrR; gen adyacente pero divergente al operón
mtrCDE (Zarantonelli et al., 1999). La sobreexpresión de MtrCDE, y subsecuente reducción de
la susceptibilidad a azitromicina, está asociada a tres mutaciones. La primera, y más frecuente (5
de 6 aislamientos resistentes a azitromicina), es una deleción de un par de bases en la región
espaciadora entre la caja -35 y -10 del promotor de mtrR. La segunda, presente en 4 de 6
aislamientos resistentes a azitromicina, es una mutación con pérdida de sentido en el codón 45 de
mtrR, cambiando de glicina a ácido aspártico. La tercera, y menos frecuente (1 de 6 aislamientos
resistentes a azitromicina), es una inserción de un dinucleótido TT en la misma región que la
primera mutación (Zarantonelli et al., 1999). La primera mutación aumenta por un factor de 10 la
reducción de susceptibilidad a la azitromicina de N. gonorrhoeae, y se conoce que abroga la
transcripción de mtrR y aumenta la transcripción del operón mtrCDE. La segunda mutación
disminuye la afinidad de MtrR por la región promotora de mtrCDE, reduciendo su capacidad de
regulación negativa del operón. La tercera mutación aumenta la región espaciadora de 17
nucleótidos a 19 nucleótidos, que resulta desfavorable para el reconocimiento por la RNA
polimerasa de las cajas -35 y -10 de la región promotora de mtrR. El efecto de estas tres
mutaciones culmina en la sobreexpresión de la bomba de expulsión MtrCDE. La presencia de un
mayor número de estas bombas en la membrana de N. gonorrhoeae incrementa su capacidad de
exportar la azitromicina al exterior de la célula, lo que explica la reducción en susceptibilidad y
resistencia a este antibiótico.
La bomba de expulsión MtrCDE está compuesta por una proteína de membrana interna (MtrD),
que transduce energía electroquímica y está encargada del reconocimiento de sustratos, y una
proteína de membrana externa formadora del conducto (MtrE), que están conectadas por una
proteína periplásmica de fusión de membrana (MtrC), que se encuentra anclada a la membrana
interna (Janganan et al., 2011). MtrCDE se ensambla con una estequiometria de
MtrD:MtrC:MtrE de 3:6:3 (Janganan, Bavro, Zhang, Borges-Walmsley, & Walmsley, 2013),
siendo MtrC quien estabiliza la interacción entre MtrE y MtrD al unirse sobre sus superficies. El
funcionamiento de esta proteína se da en cuatro etapas (Janganan et al., 2013) y estas se pueden
ver en la Figura 1. En la primera MtrC y MtrD se encuentran acomplejadas, y al reconocer un
antibiótico en el periplasma se ensamblan con MtrE. En la segunda, al estar MtrCDE
ensamblada, las puertas primaria y secundaria del canal de MtrE se abren. En la tercera, protones
se unen a MtrD, ocasionando cambios conformacionales que llevan a la transferencia del
antibiótico al canal interno de la proteína, a través del cual es expulsado. En la cuarta, ocurre otro
evento de translocación de protones que resulta en el desensamblaje de MtrCD-E y la proteína
vuelve a la primera etapa (Janganan et al., 2013). A medida que MtrD pasa por estas cuatro
etapas adopta tres conformaciones diferentes: acceso, unión y expulsión (Janganan et al., 2013).
La conformación de acceso hace referencia al estado de la proteína antes de reconocer un
sustrato, la conformación de unión es aquella que MtrD adopta al unirse al sustrato y la
3
conformación de expulsión ocurre cuando se forma el complejo MtrCDE y ocurre la expulsión
del sustrato.
Figura 1. Los cuatro estados de expulsión por MtrCDE, adaptada de Janganan et al., 2013.
En otros experimentos se ha demostrado que la inactivación o deleción de alguna de las proteínas
que forman estas bombas de expulsión tripartitas (compuesta por tres partes, por ejemplo las tres
proteínas MtrC, MtrD y MtrE) atenúan la bacteria (Piddock, 2014). Esta atenuación ocurre
independientemente de la especie bacteriana e impide a la bacteria de que infecte a su hospedero,
sea este una planta, pájaro o mamífero (Piddock, 2014). La inhibición de la expulsión, llevada a
cabo por las bombas tripartitas, también reduce la habilidad de la bacteria de formar biopeliculas
(Piddock, 2014) y de adquirir resistencia a antibióticos que sean sustratos de estas bombas (Ricci
& Piddock, 2009). Esto último ocurre porque estas bombas de expulsión no son específicas y su
rango de sustratos es amplio, incluyendo una variedad de antibióticos con diferentes mecanismos
de acción, antisépticos y desinfectantes, detergentes (entre ellas sales biliares), ácidos grasos,
metales pesados, solventes, y factores de virulencia (Venter, Mowla, Ohene-Agyei, & Ma,
2015). Por esto estas bombas de expulsión son parte importante de la patogenicidad bacteriana,
virulencia, y formación de biopeliculas (Venter et al., 2015). Para el caso de los antibióticos, las
bombas de expulsión son capaces de remover la mayoría de estos compuestos hasta que la
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bacteria haya tenido tiempo de adquirir resistencia a un antibiótico por mecanismos más
específicos (Venter et al., 2015).
Actualmente no hay inhibidores de bombas de expulsión (EPIs, Efflux Pumps Inhibitors) siendo
utilizados en tratamientos clínicos (Venter et al., 2015), pero si existen EPIs que han sido
probados experimentalmente (Vargiu, Ruggerone, Opperman, Nguyen, & Nikaido, 2014). Para
que una molécula se considere como un EPI, en teoría, debería (i) tener sinergia con antibióticos
empleados en la actualidad, (ii) restaurar la eficacia de los antibióticos para los cuales ha surgido
resistencia, (iii) reducir la incidencia de la emergencia de patógenos resistentes a antibióticos,
(iv) reducir la habilidad de los patógenos de infectar al hospedero dada la atenuación causada por
la inhibición de la expulsión, (v) prevenir el desarrollo de biopeliculas con una alta resistencia a
antibióticos (Venter et al., 2015). La similitud estructural entre las diferentes bombas de
expulsión tripartitas de diferentes bacterias Gram negativas sugiere que EPIs desarrollados para
cualquier una de ellas, podrían llegar a ser efectivas en otros patógenos (Venter et al., 2015).
Existen varias formas de potencialmente inhibir el funcionamiento de una bomba de expulsión.
Brevemente estas serían, explicadas por Venter et al. (2015), (i) controlar la red regulatoria
responsable por la transcripción de las proteínas que las conforman, (ii) alterar la estructura
molecular de los antibióticos para reducir su afinidad con la bomba de expulsión, (iii) prevenir el
ensamblaje de la bomba tripartita interrumpiendo la interacción entre MtrD y MtrC, (iv)
bloqueando el sitio de unión de MtrD con un sustrato competitivo de alta afinidad, (v)
manteniendo MtrD en una conformación inactiva que no permite el reconocimiento de
antibióticos, (vi) bloqueando el canal de MtrE, y (vii) impedir la translocación de protones que
MtrD requiere para el ensamblaje/desensamblaje de la bomba de expulsión. Estos mecanismos
de inhibición tienen ventajas y desventajas, pero dado que el propósito es llevar los EPIs a un
tratamiento clínico algunos de estos mecanismos pueden ser descartados. El mecanismo (ii) tiene
la desventaja de que al alterar la estructura química del antibiótico posiblemente este también
estará perdiendo afinidad por su blanco, haciendo que pierda eficiencia como tratamiento. El
mecanismo (vi) posee una desventaja, y es que por similitud entre las estructuras tipo poro de las
células sería un desafío lograr que el EPI fuera selectivo para poros bacterianos. Un EPI con el
mecanismo (vii) seguramente también afectaría translocación de protones en células humanas,
haciéndolo citotóxico e inutilizable. Por otro lado, el mecanismo (iv) parece ser una buena
estrategia para lograr la inhibición de MtrCDE por dos razones. La primera siendo que como sus
sustratos incluyen moléculas como antibióticos hay una mayor probabilidad de encontrar un
inhibidor con una farmacocinética similar a la de estos compuestos (no sería citotóxico y podría
ser distribuido hasta los sitios de infección). La segunda siendo que ya existen inhibidores
comprobados experimentalmente, que funcionan de acuerdo a este mecanismo, para AcrB
(proteína de membrana interna de AcrAB-TolC); una bomba de expulsión tripartita homologa a
MtrCDE. Además, buscar una molécula con potencial inhibitorio basado en similitud estructural
y química a inhibidores conocidos es una estrategia comúnmente utilizada.
MtrCDE hace parte de la familia RND (Resistance Nodulation Division) de bombas de expulsión
(Li, Plésiat, & Nikaido, 2015). Las bombas de esta familia son tripartitas y usan la fuerza protón-
motriz como fuente de energía (Li et al., 2015). AcrAB – TolC es una bomba de expulsión de la
familia RND constitutivamente expresada en Escherichia coli, y esta ha sido estudiada
extensivamente como el prototipo de las bombas tripartitas de esta familia. Una propiedad
5
común de los sustratos de AcrB, y otras bombas de la familia RND, es la presencia de un
dominio hidrofóbico (Li et al., 2015), siendo esta amplia especificidad algo sorprendente, pero
sin embargo puede ser explicada. Cuando una enzima captura su sustrato hidrofílico del medio
acuoso es necesario romper los puentes de hidrogeno entre el sustrato y las moléculas de agua
que lo rodean. De forma que la unión estable a la enzima va a depender de interacciones fuertes
y precisas con los residuos que componen el sitio activo, para poder superar la barrera energética
de la separación del solvente. En otras palabras, el sitio de unión debe ser pequeño y
cuidadosamente diseñado para lograr unirse astringentemente al sustrato. Por otro lado, los
sustratos de las bombas de expulsión que capturan compuestos con dominios hidrofóbicos no
estarán estabilizados por el medio acuoso, y su presencia representa un alto costo entrópico que
acompaña el ordenamiento de las moléculas de agua alrededor del sustrato. Por esto, el sitio de
unión de estas bombas es amplio y puede acomodar un amplio rango de diversidad de moléculas
con pequeñas disminuciones en la energía libre de unión (Li et al., 2015). Tanto en MtrD como
en AcrB, se han descrito dos bolsillos dentro de la cavidad de reconocimiento de sustrato:
bolsillo próximo y bolsillo distal (Li et al., 2015). Estos difieren cuanto a su localización dentro
de la cavidad, siendo el bolsillo distal el que se encuentra en la parte más profunda del sitio de
reconocimiento.
Existen otras similitudes entre AcrB y MtrD, y una de las más importantes para este estudio es la
presencia del loop rico en glicina. En AcrB está compuesto por los residuos 614 a 621 (Vargiu et
al., 2014) y en MtrD por los residuos 610 a 618 (Bolla et al., 2014). Este loop ayuda en el
transporte de los sustratos de la bomba al canal interno de expulsión, y está asociado al
mecanismo de inhibición de inhibidores de AcrB cuando se impide su movimiento (Vargiu et al.,
2014). Otra similitud importante es la presencia de una trampa hidrofóbica, que en AcrB está
compuesta por los residuos PHE-136, PHE-178, PHE-610 y PHE-628 (Vargiu et al., 2014) y en
MtrD está compuesta por PHE-136, TYR-325, PHE-568 y PHE-623 (determinada
computacionalmente en este trabajo). A pesar de no estar completamente conservada en MtrD,
con respecto a AcrB, la sustitución de fenilalanina por tirosina no ocasiona perdida de función
dado que ambos son amino ácidos hidrofóbicos. Esta trampa ha sido asociada a un mayor índice
de inhibición de los inhibidores de AcrB que interactúan con ella (Sjuts et al., 2016).
Un ejemplo de EPIs es MBX2319, una molécula con un núcleo piranopiridina, que fue
determinada computacionalmente (Vargiu et al., 2014) y luego probada con éxito
experimentalmente (Sjuts et al., 2016). Este inhibidor, y sus derivados, actúan sobre la bomba de
expulsión AcrAB-TolC (Vargiu et al., 2014), homologa de MtrCDE (Janganan et al., 2013).
MBX2319 disminuye el MIC de la eritromicina, el antibiótico del cual se deriva la azitromicina,
en un factor de 8 (Vargiu et al., 2014). Este inhibidor sirvió como base para luego desarrollar
nuevos inhibidores a través de substituciones sistemáticas en los sustituyentes del núcleo
piranopiridina (Sjuts et al., 2016). Estos nuevos inhibidores (MBX2931, MBX3132, MBX3135)
presentan una ligera mejora, en el caso de MBX2931, hasta una mejora considerable con
MBX3132 y MBX3135. Estos últimos en concentraciones 10 veces menores que las de
MBX2319 son 10-20 veces más potentes, respectivamente (Sjuts et al., 2016). MBX2319, y sus
derivados, inhiben AcrB al impedir el movimiento de un loop rico en glicinas, cuya función
radica en arrastrar los sustratos desde la cavidad de reconocimiento hacia el canal interno de la
bomba (Vargiu et al., 2014). También encontraron en varios cristales y simulaciones de docking
que estos inhibidores se unen cerca de una trampa hidrofóbica, que estabiliza la interacción y
6
mejora su capacidad de inhibición (Sjuts et al., 2016). Estos estudios de EPIs para AcrB
mostraron que las bombas de expulsión tripartitas tienen dos bolsillos de unión de ligandos
(Vargiu et al., 2014). El primero se denomina bolsillo distal, donde se han cocristalizado
sustratos de la bomba; y el segundo se denomina bolsillo próximo, donde se han cocristalizado
inhibidores, como los de la familia MBX.
Existen otros inhibidores de AcrB con mecanismos de inhibición similares. Por ejemplo, D13-
9001 inhibe competitivamente AcrB al unirse al sitio de unión de sustratos fuertemente, de forma
que impide que ocurran los cambios conformacionales en la proteína que llevan a la expulsión.
De esta forma, impide la unión de sustratos típicos y su subsecuente expulsión (Vargiu et al.,
2014). El compuesto D13-9001 se une principalmente a través de interacciones con la trampa
hidrofóbica, que lo ancla eficazmente en el sitio de unión. Los inhibidores NMP y PAβN
impiden el movimiento del loop rico en glicina, atascando AcrB en una conformación, lo que
impide la expulsión de los inhibidores y la unión de otros sustratos (Vargiu et al., 2014). Estos
dos últimos inhibidores no están dentro de la trampa hidrofóbica, pero están unidos en su
periferia (Vargiu et al., 2014).
La búsqueda de EPIs para MtrD puede realizarse a través de tamizaje in silico, un método que ha
demostrado tener capacidades predictivas cuanto a actividad potencial de moléculas como EPIs.
Ohene-Agyei, Mowla, Rahman, & Venter (2014) utilizaron esta metodología para buscar
posibles inhibidores de AcrB desde una librería de 50 fitoquímicos. A partir de docking
molecular de estos compuestos llegaron a 6 potenciales EPIs, que luego llevaron a experimentos
in vitro. Otro ejemplo del éxito de estos métodos computacionales es la investigación de
Sandhaus, Chapagain, & Tse-Dinh, 2018, donde utilizaron estructuras generadas por dinámicas
moleculares de la proteína TopI de Mycobacterium tuberculosis para realizar tamizaje in silico.
En este estudio encontraron compuestos activos con IC50 de 2 µM, que es suficientemente bajo
para ser considerado como potencialmente terapéutico. En ambos ejemplos encontraron una
fuerte correlación entre los resultados in silico e in vitro, demostrando que el tamizaje virtual es
una herramienta poderosa para preseleccionar compuestos con potencial actividad como
inhibidores.
Descubrir EPIs para la bomba de expulsión MtrCDE es importante, puesto que su uso, en teoría,
restauraría la eficacia de antibióticos para los cuales N. gonorrhoeae es resistente. Esto es de
especial importancia para la azitromicina, uno de los dos únicos antibióticos para los cuales este
patógeno aún es susceptible, pero que ya está empezando a perder eficacia. La pérdida de la
azitromicina como tratamiento para la gonococia tiene graves consecuencias, como infecciones
intratables que resultan en la muerte del hospedero. Encontrar un EPI para MtrD sería un primer
paso para prolongar la vida útil de los tratamientos actuales, y comprando tiempo para el
desarrollo de una nueva generación de tratamientos antibacterianos.
Por todas estas razones, se desarrolló un estudio computacional, realizando una campaña de
tamizaje in silico sobre diferentes conformaciones de MtrD generadas por dinámicas
moleculares, buscando compuestos potencialmente afines al bolsillo próximo y al bolsillo distal.
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2. Métodos
2.1 Simulación de docking
El proceso de docking involucra la predicción de la conformación y orientación de un ligando en
un sitio de unión determinado (Kitchen, Decornez, Furr, & Bajorath, 2004), y esto se puede
realizar con un solo ligando o una biblioteca de compuestos. Además este software hace un
ranking de los ligandos, dando puntajes independientes para cada conformación y cada posición
(o pose) favorable de estas (Kitchen et al., 2004).
El software Glide, utilizado en este trabajo, determina el sitio de unión a través del grid. Este
ultimo es una representación estructural de los residuos y todos sus átomos, que se encuentran
dentro de una caja de volumen determinado, y tiene en cuenta las potenciales interacciones que
pueden tener los amino ácidos que componen el sitio de unión. Esta caja determina el espacio
donde el software intentará localizar el ligando, y dentro de ella hay otra caja más pequeña que
determina donde debe ir el centro de masa del ligando al cual se le está haciendo el docking.
Los ligandos son preparados con el software LigPrep, que calcula diferente posibles
conformaciones de cada ligando. De esta forma se tiene en cuenta la variabilidad conformacional
de cada molécula que será utilizada en el proceso de docking.
De acuerdo a lo anterior, Glide posicionará cada una de las conformaciones generadas de los
ligandos dentro del grid, y además le permite tener cierta flexibilidad a los ligandos. De esta
forma las moléculas pueden acomodarse a la cavidad, mostrando una interacción más cercana a
la que se esperaría observar en el sistema biológico. Luego de obtener las diferentes poses utiliza
una función de scoring que le otorga un puntaje a cada una de ellas en 𝑘𝑐𝑎𝑙
𝑚𝑜𝑙.
La función de scoring es un acercamiento a la energía libre de unión de estos compuestos, y la
que utiliza Glide está basada en información experimental (Friesner et al., 2004). Las
limitaciones de esta función es que no tiene en cuenta la solvatación del sistema ni la energía del
receptor y ligando aislados; por esto es un acercamiento a la energía libre de unión (Friesner
et al., 2004). Siendo así, aquellos compuestos que presentan un puntaje más grande y más
negativo, serán los que el software predice que tendrán una mayor afinidad por el receptor.
2.2 Tamizaje in silico
El tamizaje in silico hace referencia al uso de diferentes funciones de scoring para evaluar una
librería de compuestos. Esta evaluación se relaciona con la potencial afinidad de los compuestos
con relación a un receptor, y aquellas moléculas que lleguen al final del tamizaje in silico tendrán
una mayor probabilidad de ser afines a la proteína siendo evaluada; en este caso el componente
MtrD de la bomba de expulsión MtrCDE de N. gonorrhoeae. Pero como se trata de miles de
compuestos es necesario llevar a cabo el tamizaje in silico por etapas, de otra forma el costo
computacional sería demasiado alto.
8
Primero, se utiliza una función de scoring de baja precisión para evaluar las poses de docking de
miles de compuestos en poco tiempo, y con sus resultados se eliminan de consideraciones los
compuestos con menor afinidad al receptor. Segundo, se utiliza una función de scoring más
exigente para evaluar cientos de compuestos y nuevamente filtrarlos para que permanezcan
aquellos con mayor afinidad al receptor siendo estudiado. Finalmente, se utiliza una función de
scoring de alta precisión para ordenar los mejores 100 compuestos provenientes de la librería.
En este trabajo se utilizaron las siguientes funciones de scoring, de menor a mayor precisión:
High-Throughput Virtual Screening (HTVS), Standard Precision (SP) y Extra Precision (XP).
El docking a través de HTVS tiene como propósito evaluar grandes librerías de compuestos, ya
que su muestreo conformacional está mucho más limitado que en el docking SP. En otras
palabras, HTVS limita el numero de conformaciones del complejo ligando – receptor a ser
evaluadas y limita el muestreo torsional del ligando dentro del receptor (Manual de Glide). La
función de scoring SP tiene en cuenta interacciones lipófilas, puentes de hidrogeno entre átomos
neutros, puentes de hidrogeno entre un átomo neutro y un átomo cargado, puentes de hidrogeno
entre átomos cargado, interacciones entre metales y átomos aceptores aniónicos, incorpora las
contribuciones energéticas Coulombianas y de van der Waals de la interacción ligando –
receptor, y finalmente introduce un modelo de solvatación al medir la exposición del ligando a
posibles moléculas de agua en el sitio de unión (Friesner et al., 2004). La función de scoring XP
se diferencia de SP en varios factores (Friesner et al., 2006). El primero siendo que realiza un
muestreo conformacional más exhaustivo, de forma que evalúa un mayor numero de posiciones
del ligando dentro del sitio de unión (Friesner et al., 2006). También tiene categorías más
especificas de las interacciones con diferentes puntajes de docking; por ejemplo, en vez de
agrupar todos los puentes de hidrogeno entre átomos cargados tiene cinco categorías diferentes
para darle un puntaje a este tipo de interacción (Friesner et al., 2006).
Por esto, al final del tamizaje in silico se tienen dos puntuaciones por cada ligando, XP docking
score y SP docking score. La diferencia es la precisión de la función de puntuación para la
afinidad, siendo XP la más precisa de acuerdo a lo mencionado previamente.
Luego de pasar por estos tres cálculos el tamizaje in silico provee una lista de compuestos
enriquecida, en otras palabras con una alta proporción de compuestos potencialmente activos.
2.3 Dinámica molecular
Las dinámicas moleculares son simulaciones cuyo propósito es estudiar el comportamiento
dependiente de tiempo de sistemas microscópicos (De Vivo, Masetti, Bottegoni, & Cavalli,
2016). Esto se logra solucionando las ecuaciones diferenciales de segundo orden representadas
por la segunda ley de Newton para cada átomo en el sistema, teniendo en cuenta las
interacciones con los demás átomos (De Vivo et al., 2016). Esta aproximación sirve para
partículas masivas, como el núcleo, mientras que el movimiento de los electrones se toma como
un promedio (De Vivo et al., 2016). Para lograr esto, se introduce una función de energía
potencial empírica y el modelo que surge de esta representación simplificada es el force field
(FF).
9
El FF es una ecuación que contiene términos que representan las interacciones intramoleculares
de los átomos. Estos términos describen variaciones en la energía potencial como función del
estiramiento de enlaces, flexión y torsión entre átomos involucrados en enlaces (De Vivo et al.,
2016). El estiramiento y flexión de enlaces comparte la misma forma funcional, siendo esta su
descripción como potenciales harmónicos con valores de referencia asignados. Por otro lado, los
términos torsionales, por su periodicidad intrínseca son definidos como una serie de cosenos de
M términos para cada ángulo diedro (De Vivo et al., 2016). Estos tres grupos de contribuciones
energéticas son los términos de enlace del FF. Además de estos están los términos de no enlace,
siendo estas las interacciones de van de Waals y electrostáticas. Estas contribuciones actúan
sobre todos los pares de átomos del sistema que no se tuvieron en cuenta en los términos de
enlace. Las interacciones de van der Waals son tratadas con un potencial 12 – 6 de Lennard-
Jones y las interacciones electrostáticas tienen en cuenta las cargas parciales de cada par de
átomos y la permisividad relativa del sistema (De Vivo et al., 2016).
Con esta información es posible calcular el comportamiento del sistema a través del tiempo, y en
este trabajo se utilizó esta herramienta para encontrar diferentes conformaciones de la proteína
MtrD.
3. Metodología y Resultados
3.1 Preparación de la estructura de MtrD
Actualmente solo hay una estructura cristalográfica de MtrD (PDB 4MT1), representada en la
Figura 2, con una resolución de 3.54 Å y hecha con difracción de rayos X (Bolla et al., 2014).
Este cristal representa la conformación de acceso de la proteína, ya que el cristal obtenido se
asemeja más a la conformación de acceso de AcrB, que a las conformaciones de unión y
expulsión de AcrB (Bolla et al., 2014). Al realizar la cristalografía encontraron que en este cristal
el loop rico en glicinas, asociado a los inhibidores de AcrB, está conservado en MtrD (Bolla et
al., 2014). Esta estructura presentaba tres mutaciones: L626F, A839E y R861S (esta
nomenclatura significa que en el cristal la LEU-626 presente en MtrD se mutó a fenilalanina).
Todas las mutaciones se deshicieron in silico usando Maestro, la interfaz gráfica de la suite de
Schrödinger. Se utilizó la herramienta de minimización de estructuras de Maestro para
reacomodar las cadenas laterales de estos residuos dentro de la cavidad. Esta herramienta busca
mínimos energéticos locales, y es necesaria en este paso ya que al agregar los átomos de los
residuos nuevos estos pueden quedar en posiciones no favorables (por ejemplo, demasiado cerca
de átomos de residuos aledaños).
10
Figura 2. Representación gráfica del trímero MtrD (PDB 4MT1) en el software Maestro. Se pueden ver los
protómeros de colores diferentes: verde, blanco y rojo.
Dadas las limitaciones de este método de cristalografía la estructura está incompleta, ya que no
posee ningún hidrogeno. Para agregar los hidrógenos se utiliza el software Protein Preparation
Wizard (Madhavi Sastry, Adzhigirey, Day, Annabhimoju, & Sherman, 2013). Con este programa
también se revisó que no hubieran átomos faltantes en los residuos y se borraron las moléculas
de aguas residuales del cristal. Eliminar las moléculas de agua del cristal es estándar del método,
excepto cuando se trate de un sitio catalítico donde se conozca que el agua participe de la
catálisis, o cuando se conoce que las moléculas de agua son esenciales para la unión entre el
ligando y el receptor. Se removió el dominio transmembranal de MtrD, marcado con colores en
un protómero de MtrD en la Figura 3, puesto que por limitaciones de recursos computacionales
no es posible hacer simulaciones incluyendo la membrana. Además, los sitios de unión están
suficientemente lejanos a este dominio para inferir que no hay interacciones, de forma que
incluir el dominio transmembranal doblaría el costo computacional sin ofrecer información
adicional. La estructura de la proteína preparada y cortada, representada en la Figura 4, fue
utilizada en los procedimientos siguientes.
11
Figura 3. Protómero de MtrD con dominio periplásmico en blanco y dominio transmembranal marcado con
colores. Las hélices en verde, azul, naranja y rosado fueron las que se eliminaron de la estructura.
12
Figura 4. Estructura final de MtrD a ser utilizada en los pasos siguientes.
3.2 Obtención de conformaciones de MtrD para el tamizaje virtual.
Para hacer el tamizaje in silico sobre MtrD se utilizaron ocho conformaciones de esta proteína.
Dos conformaciones A0 (i y ii) provendrían de una dinámica molecular (MD) de MtrD sin
ligandos, enfocando el tamizaje en el bolsillo distal, donde la proteína estaría en un estado
relajado, como se encontraría previamente al reconocimiento de un sustrato. Dos conformaciones
I0 (i y ii) tendrían el mismo origen de la conformación A0, pero el tamizaje se enfocaría en el
bolsillo próximo. Las conformaciones A1 (i y ii) provendrían de una MD de MtrD con
azitromicina en el bolsillo distal, donde se enfocaría el tamizaje. De la estructura sacada de la
MD se remueve el antibiótico, de forma que el bolsillo distal estaría en la conformación que
adopta cuando tiene un sustrato unido; lo que permitiría el docking de ligandos que podrían no
acomodarse en A0 por impedimentos estéricos. Las conformaciones I1 (i y ii) provendrían de
una MD de MtrD con MTX3135 en el bolsillo próximo, donde se enfocaría el tamizaje. Se retira
MTX3135 de la estructura, y el bolsillo próximo quedaría en la conformación que adopta al tener
un ligando unido; permitiendo el docking de ligandos que podrían no acomodarse en I0. La
extracción de las conformaciones de cada cavidad está resumida en el Diagrama 1. Se
escogieron solamente dos conformaciones de cada cavidad por el costo computacional inherente
de cada tamizaje in silico. Se decidió evaluar ambos bolsillos para abarcar una mayor diversidad
de compuestos, de forma que los potenciales EPIs encontrados en este estudio puedan inhibir
desde el bolsillo próximo o el bolsillo distal.
13
Diagrama 1. Representación gráfica de la extracción de las diferentes conformaciones de las cavidades A1/A0
e I1/I0 de sus respectivas dinámicas moleculares. “Conf. Cav.” quiere decir conformaciones de la cavidad.
3.2.1 Generación de complejos MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135
Dado que MtrD no ha sido cocristalizada con ningún ligando se realizaron dos docking
moleculares con el software Glide (Halgren et al., 2004) para obtener los complejos de MtrD con
azitromicina y el inhibidor de AcrB MBX3135.
3.2.1.1 Preparación de azitromicina y MBX3135
La estructura de la azitromicina, Figura 5, se descargó de la base de datos DrugBank (Wishart et
al., 2018). La estructura de MBX3135, Figura 6, se obtuvo del PDB 5ENR, del cual se eliminó
la proteína, aguas y sales, dejando solamente la información estructural del inhibidor. Ambas
estructuras fueron preparadas para el docking utilizando el software LigPrep (Schrodinger,
2017a), cuya función principal es generar estructuras 3D de los ligandos a partir de estructuras
2D, como la descargada del DrugBank. Además en la preparación se generaron diferentes
conformaciones, estados de ionización a un pH de 7.0 2.0, al cual se encuentra N. gonorrhoeae
(Morse & Hebeler, 1978), tautomeros, y variaciones de los centros quirales. También, cuando
necesario, se agregaron los hidrógenos que no estaban en la estructura inicial.
1 1
14
Figura 6. Estructura de MBX3135.
Se obtuvieron 4 conformaciones de MBX3135 y 5 conformaciones de la azitromicina.
3.2.1.2 Preparación de grids de cavidades A e I
El grid es un archivo donde la forma y las propiedades del sitio de unión del receptor están
representados, y este determina el lugar de la proteína donde se hará la exploración de la
posición de los ligandos. Estos fueron preparados utilizando las coordenadas del centro de la
cavidad A y la cavidad I con el software Glide (Halgren et al., 2004), específicamente el
componente Receptor Grid Generation. Las coordenadas del centro de las cavidades se
determinaron por comparación visual, teniendo en cuenta la posición de los ligandos de los
cristales de AcrB cocristalizados con eritromicina (PDB 4ZJL) y MBX3135 (PDB 5ENR).
Se obtuvieron dos archivos de grid, uno para la cavidad A (donde se haría el docking de la
azitromicina) y otro para la cavidad I (donde se haría el docking de MBX3135).
3.2.1.3 Docking de azitromicina y MBX3135 en MtrD
Se realizaron dos ensayos de docking con Glide (Halgren et al., 2004) utilizando la función de
puntuación XP (Extra Precision). El primero utilizando el grid sobre la cavidad A y las
conformaciones preparadas de azitromicina, y el segundo utilizando el grid sobre la cavidad I y
las conformaciones preparadas de MBX3135.
Se escogieron las poses con el mejor puntaje de cada uno de los ligandos. De forma que se
obtuvieron tres archivos estructurales de MtrD: la proteína sola, el complejo MtrD-azitromicina
y el complejo MtrD-MBX3135.
Figura 5. Estructura de la azitromicina.
15
Como referencia, el mejor puntaje XP de docking de la azitromicina fue -8.584 𝑘𝑐𝑎𝑙
𝑚𝑜𝑙 y el mejor
puntaje de docking de MBX3135 fue -6.581 𝑘𝑐𝑎𝑙
𝑚𝑜𝑙. La azitromicina quedó anclada a MtrD por
cinco interacciones: 1 puente de hidrogeno aromático con la cadena lateral de TYR-77, un
puente de hidrogeno y un puente salino con la cadena lateral de GLU-669, y dos puentes de
hidrogeno con el backbone de PHE-612 y SER-613. La azitromicina interactúa con la punta del
loop rico en glicina, que es una interacción esperada ya que este loop está encargado de
movilizar este sustrato al canal interno de expulsión. El inhibidor de AcrB, MBX3135, solo
quedó anclado a MtrD por un puente de hidrogeno con la cadena lateral de TYR-325, uno de los
componentes de la trampa hidrofóbica.
3.2.2 Dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135
Se realizaron tres simulaciones de MD, una para cada complejo y una para la proteína sin
ligandos, de 150ns utilizando Desmond (Desmond, 2017). Las MD calculan la posición de los
átomos dentro del sistema a través del tiempo (Franco, 2016), solucionando iterativamente las
ecuaciones de Newton de movimiento para cada átomo (Franco, 2016).
Estas MD se realizan para obtener conformaciones que tengan una alta probabilidad de ser
adoptadas por la proteína en un sistema biológico, con el propósito de evitar utilizar la estructura
cristalográfica de MtrD. La razón de esto es que aunque la estructura en el PDB es verosímil,
tiene la desventaja de haber sido obtenida bajo condiciones no biológicas. Para realizar este
cristal MtrD se encontraba a temperatura ambiente, menor a la temperatura a la que se
encontraría en la membrana de N. gonorrhoeae, y en solución con buffer Na-HEPES (20mM) y
Cymal-6 (0.05%) (Bolla et al., 2014). Además al formar un cristal la proteína se encuentra
deshidratada, cuando generalmente esta se encontraría en solución acuosa; en otras palabras la
conformación determinada por el cristal proviene de un ambiente químico ajeno al ambiente
biológico. Otra razón para no utilizar la estructura cristalográfica de MtrD es que las proteínas
son dinámicas, y el cristal representa solamente una de las posibles estructuras que puede adoptar
MtrD, que no necesariamente es una conformación común al sistema biológico por las razones
previamente mencionadas. Dado esto, realizar MD para obtener conformaciones más cercanas a
las presentes en la bacteria es una buena estrategia, puesto que MtrD estaría en solución acuosa y
podría relajar su estructura hasta llegar a un mínimo energético conformacional a través del
tiempo de MD. Idealmente, este mínimo energético conformacional sería más cercano a la
estructura adoptada por MtrD en N. gonorrhoeae.
Otro motivo para realizar las MD es el cambio conformacional de las cavidades a través del
tiempo, con y sin ligando, ya que con diferentes formas de las cavidades se podría explorar una
mayor parte del espacio químico ocupado por la librería de moléculas a ser utilizada en el
tamizaje virtual. Si se fuera a utilizar solamente una conformación de la cavidad se estarían
sesgando los resultados del tamizaje in silico a esa superficie específica, disminuyendo
considerablemente la diversidad química de los potenciales EPIs que obtendríamos. Se esperaría
obtener, preferiblemente, una alta diversidad química, puesto que este estudio es un primer
acercamiento para encontrar inhibidores para MtrD, y entre más candidatos existan mayor la
probabilidad que alguno de ellos sea activo.
16
Para realizar la MD se utilizó el force field OPLS_2005. Se usó un time step de 2.0fs. Se
emplearon condiciones de frontera periódica. El radio cutoff de interacciones coulombianas fue
de 9.0Å. Las simulaciones se realizaron en el ensemble NPT y la temperatura se mantuvo a 310K
con el termostato Noose-Hoover chain, con un tiempo de relajación de 1.0ps. La presión se
mantuvo a 1.01325 bar usando el baróstato Martyna-Tobias-Klein, con un tiempo de relajación
de 2.0ps, y estilo de acoplamiento isotrópico. Se utilizó el modelo de solvente explicito TIP3P y
se neutralizó la carga de la proteína con iones de sodio. Información estructural de la proteína a
través de la dinámica fue guardada cada 75ps, resultando en una trayectoria compuesta por 2000
frames (o 2000 archivos estructurales provenientes de la dinámica) y 150ns de simulación.
3.2.2.1 Justificación de las restricciones aplicadas a la proteína durante las dinámicas moleculares
Para las tres simulaciones se aplicaron restricciones en dos regiones de la proteína durante los
150ns de simulación. La primera región a la que se le restringió el movimiento de los átomos del
backbone fue la frontera con el dominio transmembranal que fue previamente removido,
ilustrada en la Figura 7 en la parte inferior del protómero de MtrD. Esta restricción es necesaria
ya que el dominio transmembranal en un sistema biológico le otorga una estabilidad intrínseca a
la proteína por anclarla a la membrana, sin ella la restricción de los átomos del backbone en la
frontera simularía dicha estabilidad sin comprometer la integridad estructural de la proteína. La
segunda región a la que se le restringió el movimiento de los átomos del backbone está
compuesta por tres hélices cortas de la parte superior del dominio periplásmico de MtrD,
ilustrada en la Figura 7 en la parte superior del protómero de MtrD. Esta restricción fue
necesaria puesto que en dinámicas moleculares anteriores, restringiendo solamente la primera
región, la proteína colapsaba, perdiendo la estructura que estaba cristalizada. Este colapso puede
ser explicado por el hecho que en el sistema biológico MtrD se encuentra acomplejada a MtrC,
siendo la región de contacto los surcos entre los protómeros del dominio periplásmico de MtrD
(Janganan et al., 2013), interacción que preserva la integridad estructural de MtrD. Esta
restricción estaría simulando la presencia y acción estabilizadora de MtrC en las dinámica
moleculares. No se consideró simular el complejo MtrCD, en vez de aplicar restricciones en la
región superior de MtrD, ya que actualmente no existen estructuras cristalográficas del complejo
ni de MtrC sola.
17
Figura 7. Protómero cortado de MtrD. Marcado en rojo donde se aplicaron las restricciones de movimiento.
3.2.2.2 Análisis de las dinámicas moleculares de MtrD, MtrD-azitromicina y MtrD-MBX3135
La calidad de las dinámicas moleculares se evalúa de acuerdo a la convergencia del RMSD
(Root Mean Squared Deviation) de la proteína a través del tiempo de cálculo. El RMSD evalúa
la distancia de los átomos en cada frame con relación a la estructura original sobre la cual se
realiza la MD, dando información sobre cambios conformacionales de la proteína. De forma que
si el RMSD es de 3Å significa que en promedio los átomos del sistema están a 3Å de su posición
original. El RMSD se puede calcular en relación a la proteína completa, al backbone, a las
cadenas laterales o exclusivamente algunos residuos. También se puede considerar, o
comúnmente, desconsiderar los hidrógenos, puesto que estos están constantemente en
movimiento y no aportan información cuanto a la conformación estructural de la proteína.
La convergencia a un valor de RMSD sugiere que la proteína llegó a un equilibrio
conformacional, de forma que puede ser tomado como una representación del sistema biológico.
Este análisis se realizó utilizando el componente Simulation Interactions Diagram del software
Desmond (Desmond, 2017), que toma la trayectoria del sistema para calcular el RMSD sobre los
C del backbone de la proteína.
3.2.2.2.1 Análisis dinámica molecular MtrD
18
En la Figura 8 se puede observar que la MD de MtrD sin ligandos se estabiliza y el RMSD
converge a 4.0Å a partir de los 40ns de simulación. Esto significa que las estructuras de la
proteína con relevancia biológica aparecen a partir de este punto y todos los análisis siguientes se
realizaran excluyendo conformaciones de MtrD anteriores a los 40ns.
Figura 8. Análisis de RMSD de C de MtrD por 150ns.
3.2.2.2.2 Análisis dinámica molecular MtrD – azitromicina
En la Figura 9 se puede observar en que la MD de MtrD acomplejada a la azitromicina la
proteína se estabiliza y converge a 4.2Å a partir de los 20ns de simulación. Hay una fluctuación
de 0.6Å a los 115ns que se mantiene constante hasta el final de la MD. Esta fluctuación puede
ser explicada por la rotación de algunos residuos o la reacomodación de alguno de los loops
presentes en la proteína. Como a partir de los 115ns el RMSD se mantiene estable, la relevancia
biológica de las conformaciones de la proteína a través de la simulación se mantiene desde los
20ns hasta el final. Esto significa que las estructuras de la proteína con relevancia biológica
aparecen a partir de este punto y todos los análisis siguientes se realizaran excluyendo
conformaciones de MtrD anteriores a los 20ns.
En la Figura 9 también se puede observar el RMSD del ajuste de la azitromicina en el sitio de
unión. Este indica que la azitromicina no converge a una posición dentro de la cavidad A, pero
esto es de esperar dado que de acuerdo al funcionamiento de la bomba de expulsión la
azitromicina debería migrar hacia el canal interior de la proteína. Dadas las limitaciones de este
sistema (solamente MtrD, sin MtrCE) y de las MD, que no pueden simular cambios estructurales
causados por movimiento de protones, es de esperar que la azitromicina esté inquieta en la
19
cavidad. Además, como la azitromicina fue introducida en la proteína por un proceso de docking
es normal que a esta le cueste acomodarse.
Figura 9. Análisis de RMSD de C del backbone de MtrD y del ajuste de la azitromicina a la proteína por
150ns.
3.2.2.2.3 Análisis dinámica molecular MtrD – MBX3135
En la Figura 10 se puede observar en que la MD de MtrD acomplejada a MBX3135 la proteína
se estabiliza y converge a 4.2Å a partir de los 20ns de simulación. Esto significa que las
estructuras de la proteína con relevancia biológica aparecen a partir de este punto y todos los
análisis siguientes se realizaran excluyendo conformaciones de MtrD anteriores a los 20ns.
En la Figura 10 también se puede observar el RMSD del ajuste de MBX3135 en el sitio de
unión. Este indica que MBX3135 converge a una posición dentro de la cavidad I. Hay una
fluctuación entre los 30ns y 50ns, y esto se puede explicar porque la amida-sustituida de
MBX3135 es flexible y cambia de posición en la cavidad. Después de este movimiento la
posición de la amida-sustituida se mantiene estable hasta el final de la simulación. Hay una gran
diferencia entre el ajuste de la azitromicina en la cavidad A y el ajuste de MBX3135 en la
cavidad I, pero esto se puede interpretar como que esta última cavidad no hace parte de la ruta
hacia el canal interno de expulsión. Al no hacer parte de la vía hacia el canal de expulsión
permite una unión más estable de sustratos que en la cavidad A, ya que una de las funciones de la
cavidad A, al hacer parte de la vía hacia el canal de expulsión, es movilizar sus sustratos.
20
Figura 10. Análisis de RMSD de C del backbone de MtrD y del ajuste de MBX3135 a la proteína por 150ns.
3.2.2.3 Determinación de amino ácidos de las cavidades A e I
La determinación de los amino ácidos que interactúan con la azitromicina y MBX3135, a través
del tiempo, se realizó en dos partes. Primero, a través del análisis realizado por el componente
Simulation Interactions Diagram del software Desmond (Desmond, 2017), que también
determina el tipo y duración de las interacciones del ligando con amino ácidos específicos de la
proteína. Este análisis caracteriza las interacciones como puentes de hidrogeno, contactos
hidrofóbicos, interacciones iónicas y puentes de agua. Este paso se realizó con el propósito de
definir los amino ácidos que se tendrían en cuenta en el análisis de clustering de las cavidades
A1/A0 e I1/I0 de las dinámicas moleculares.
El software determina que una interacción es un puente de hidrogeno por criterios geométricos.
Estos son que la distancia entre un átomo del residuo y uno del ligando es de 2.5 Å, y entre estos
átomos uno es donador y el otro es receptor. También tiene en cuenta si el ángulo Donador –
Hidrogeno – Receptor es 120º, y si el ángulo Hidrogeno – Receptor – ‘Átomos enlazados al
receptor’ es 90º.
Generalmente los contactos hidrofóbicos involucran interacciones entre un amino acido
hidrofóbico y un grupo aromático o alifático en el ligando, pero el software también incluye las
interacciones π – catión en esta categoría. Entre los contactos hidrofóbicos (esta categoría),
además, están las interacciones π – π stacking y otras interacciones no específicas. Los criterios
geométricos que usa el software para determinar si la interacción es un contacto hidrofóbico son:
para π – catión, una distancia de 4.5 Å entre el aromático y el grupo cargado; para π – π stacking,
21
dos grupos aromáticos cara-a-cara o cara-a-borde; para no específicas, una distancia >3.6 Å entre
una cadena lateral hidrofóbica y de un carbono aromático o alifático del ligando.
Las interacciones iónicas, o interacciones polares, son determinadas por el software si hay dos
átomos con cargas opuestas a una distancia >3.7Å y no hay un enlace de hidrogeno involucrado
en la interacción.
Los puentes de agua son interacciones de puentes de hidrogeno entre la proteína y el ligando
mediados por una molécula de agua. Los criterios geométricos para los enlaces de hidrogeno de
este tipo de interacción son relajados en comparación a los criterios estándares de enlaces de
hidrogeno. Estos criterios son: una distancia de 2.7Å entre el átomo donador y el átomo receptor,
un ángulo Donador – Hidrogeno – Receptor es 110º, y si un ángulo Hidrogeno – Receptor –
‘Átomos enlazados al receptor’ es 80º.
El segundo método usado para evaluar los amino ácidos de las cavidades fue inspección visual
de la dinámica molecular. El objetivo de este análisis es escoger amino ácidos que no interactúen
con el ligando de acuerdo al software, pero que cierren la cavidad alrededor del ligando.
Además, a través de la inspección visual, se determinó si algunos de los amino ácidos que
interactuaban con el ligando de acuerdo al software no pertenecían a la cavidad. El criterio
utilizado fue si la interacción ocurría exclusivamente por un movimiento del backbone que
posicionaba temporalmente el residuo dentro de la cavidad, de forma que en el resto de la
dinámica el amino acido en cuestión no pertenezca al sitio de unión. También para eliminar
amino ácidos que interactúan con el ligando, de acuerdo al software, pero que la interacción
ocurre por movimientos del backbone, cambiando la orientación del residuo hacia el ligando
solamente durante la interacción y que en el resto de la dinámica esté orientada hacia fuera de la
cavidad.
3.2.2.3.1 Determinación amino ácidos de la cavidad A
Esta determinación se realizó con la MD del complejo MtrD – azitromicina, y se analizaron las
interacciones de los residuos de MtrD y de la azitromicina en la cavidad A.
22
Figura 11. Contactos entre la azitromicina y residuos de la cavidad A de MtrD y la fracción de la dinámica en
que ocurrieron.
En la Figura 11 podemos observar en el eje X los residuos con los que la azitromicina interactuó
a través de la MD, y en el eje Y podemos ver la fracción de la MD sobre la que ocurrieron. Un
valor de 1 significa que la interacción ocurrió durante toda la MD, pero como algunos residuos
pueden tener más de una interacción simultánea pueden haber valores superiores a 1.
Esto último solo ocurrió para la SER-81, que interactuó principalmente con la azitromicina por
puentes de hidrogeno y por poco tiempo por puentes de agua. Los residuos SER-89, SER-91, y
THR-93 tuvieron principalmente interacciones del tipo puentes de agua y ocurrieron entre 60% y
70% de la MD. El residuo PHE-816 tuvo exclusivamente interacciones hidrofóbicas con la
azitromicina y estas ocurrieron durante el 60% de la MD. El residuo GLU-863 tuvo interacciones
de puentes de hidrogeno, puentes de hidrogeno a través de moléculas de agua, y brevemente
interacciones iónicas con la azitromicina.
23
Figura 12. Número de contactos de la azitromicina con los residuos de la cavidad A.
En la Figura 12 se puede observar el número de contactos de la azitromicina con cada residuo de
la cavidad A a través del tiempo de simulación. Es importante resaltar que la MD se estabilizó a
los 20ns, de forma que las interacciones que ocurren antes de este momento no son de interés, y
los residuos que exclusivamente tengan contacto con el antibiótico en la franja de tiempo 0 –
20ns no hacen parte de la cavidad A; al menos en lo que concierne a este análisis. De acuerdo a
esto se eliminan de consideración 6 residuos, que aparecen en amarillo oscuro en la Tabla 1.
Luego se procedió a la visualización de la MD analizando cada uno de los amino ácidos que de
acuerdo al software estaban interactuando con la azitromicina. El propósito de esta visualización
es determinar si la cadena lateral del residuo en cuestión está orientada hacia la cavidad, o si las
interacciones con la azitromicina se dan por rotaciones infrecuentes del backbone durante la MD,
de forma que la cadena lateral se orienta hacia la azitromicina en el instante de la interacción. En
otras palabras, este análisis se realiza con el propósito de separar los residuos que están
orientados hacia la cavidad, pero que interactúan con poca frecuencia con el ligando (y que
hacen parte del sitio de unión), de los residuos que no están orientados hacia la cavidad y solo
24
interactúan instantáneamente con el ligando cuando ocurre una rotación del backbone (y que no
hacen parte del sitio de unión). De acuerdo a esto se eliminaron de consideración 11 residuos,
que aparecen en rojo en la Tabla 1.
Finalmente, se realizó una visualización de la cavidad A con los residuos que no fueron
eliminados de consideración marcados. El objetivo era determinar si la cavidad A estaba
totalmente rodeada, en otras palabas si se formaba una esfera de amino ácidos alrededor de la
posición de la azitromicina. Se encontró que hacía falta completar una faceta de esta esfera, y el
residuo más cercano que la completaba era la GLY-717, que aparece en azul en la Tabla 1. A
pesar de que este residuo no interactuara con la azitromicina se agregó a la lista de amino ácidos
que componen la cavidad A, ya que se supone que en esta cavidad va a haber interacción con una
gran variedad molecular química; por lo que la ausencia de interacción con la azitromicina no es
importante.
Tabla 1. Residuos que interactúan con la azitromicina en la MD (rojo y negro), residuos que fueron eliminados
de consideración para la composición de la cavidad A (rojo), y residuos que fueron agregados a la composición
de la cavidad A (azul). CL – cadenas laterales.
Polar, CL sin
carga
No polar, CL
alifáticas
No polar, CL
aromáticas CL carga - CL carga +
Asparagina 135 Alanina 39 Fenilalanina 136 Glutamato 669 Lisina 823
Glutamina 812 Alanina 40 Fenilalanina 612 Glutamato 863
Glutamina 859 Glicina 614 Fenilalanina 816
Prolina 664 Glicina 717 Tirosina 77
Prolina 665 Glicina 858
Serina 134 Isoleucina 43
Serina 611 Leucina 668
Serina 613 Leucina 92
Serina 79 Metionina 570
Serina 81 Valina 38
Serina 860 Valina 814
Serina 89 Valina 90
Serina 91
Treonina 42
Treonina 44
Treonina 80
Treonina 93
25
En la Tabla 1 podemos observar los 19 residuos que componen la cavidad A de MtrD, siendo
estos los que están en negro y en azul. En la Figura 13 se puede ver la cavidad formada por estos
19 residuos (en rojo). Esta información se podrá utilizar para el análisis de clustering de la
cavidad A.
Figura 13. Cavidad A (en rojo), formada por los 19 residuos mostrados en la Tabla 1.
3.2.2.3.2 Determinación amino ácidos de la cavidad I
Esta determinación se realizó con la MD del complejo MtrD – MBX3135, y se analizaron las
interacciones de los residuos de MtrD y de MBX3135 en la cavidad I.
26
Figura 14. Contactos entre MBX3135 y residuos de la cavidad I de MtrD y la fracción de la dinámica en que
ocurrieron.
En la Figura 14 podemos observar en el eje X los residuos con los que MBX3135 interactuó a
través de la MD, y en el eje Y podemos ver la fracción de la MD sobre la que ocurrieron. Un
valor de 1 significa que la interacción ocurrió durante toda la dinámica, pero como algunos
residuos pueden tener más de una interacción simultánea pueden haber valores superiores a 1.
Se puede observar en la Figura 14 que los residuos GLN-34 y GLN-566 interactuaron
principalmente a través de puentes de agua con MBX3135, durante el 70% y 30% de la MD,
respectivamente. La PRO-665 interactuó con el inhibidor de AcrB durante casi toda la MD,
principalmente por puentes de hidrogeno, durante 85% de la MD, por puentes de agua, durante
más o menos 10% de la MD, y brevemente por interacciones hidrofóbicas. La PHE-612
interactuó con MBX3135 principalmente por interacciones hidrofóbicas, durante 35% de la MD,
y por puentes de agua, durante 10% de la MD. Los residuos PRO-664, ILE-667 y LEU-670
tuvieron interacciones exclusivamente hidrofóbicas, durante 20%, 30% y 25% de la MD,
respectivamente. La ASN-135 tuvo interacciones de puentes de agua y puentes de hidrogeno con
MBX3135.
27
Figura 15. Número de contactos de MBX3135 con los residuos de la cavidad I.
En la Figura 15 se puede observar el número de contactos de MBX3135 con cada residuo de la
cavidad I a través del tiempo de simulación. Es importante resaltar que la MD se estabilizó a los
20ns, de forma que las interacciones que ocurren antes de este momento no son de interés, y los
residuos que exclusivamente tengan contacto con el antibiótico en la franja de tiempo 0 – 20ns
no hacen parte de la cavidad I; al menos en lo que concierne a este análisis. De acuerdo a esto se
eliminan de consideración 6 residuos, que aparecen en amarillo oscuro en la Tabla 2.
Luego se procedió a la visualización de la MD analizando cada uno de los amino ácidos que de
acuerdo al software estaban interactuando con MBX3135. El propósito de esta visualización es
determinar si la cadena lateral del residuo en cuestión está orientada hacia la cavidad, o si las
interacciones con MBX3135 se dan por rotaciones infrecuentes del backbone durante la MD, de
forma que la cadena lateral se orienta hacia MBX3135 en el instante de la interacción. De
acuerdo a esto se eliminaron de consideración 17 residuos, que aparecen en rojo en la Tabla 2.
28
Finalmente, se realizó una visualización de la cavidad I con los residuos que no fueron
eliminados de consideración marcados. El objetivo era determinar si la cavidad I estaba
totalmente rodeada, en otras palabas si se formaba una esfera de amino ácidos alrededor de la
posición de MBX3135. Se encontró que no hacía falta completar ninguna faceta de esta esfera.
Tabla 2. Residuos que interactúan con MBX3135 en la MD (rojo y negro), residuos que fueron eliminados de
consideración para la composición de la cavidad A (rojo). CL – cadenas laterales.
Polar, CL sin
carga
No polar, CL
alifáticas
No polar, CL
aromáticas CL carga - CL carga +
Asparagina 135 Alanina 132 Fenilalanina 136 Glutamato 669 Arginina 133
Glutamina 34 Glicina 567 Fenilalanina 330 Arginina 174
Glutamina 566 Glicina 614 Fenilalanina 568 Arginina 861
Glutamina 859 Glicina 673 Fenilalanina 610 Lisina 823
Prolina 562 Glicina 675 Fenilalanina 612
Prolina 664 Glicina 857 Fenilalanina 623
Prolina 665 Glicina 858 Tirosina 325
Prolina 666 Isoleucina 667 Tirosina 35
Serina 134 Leucina 670 Tirosina 77
Serina 33 Metionina 290
Serina 611 Metionina 570
Serina 613 Metionina 621
Serina 674 Valina 662
Serina 677
Serina 79
Serina 91
Treonina 42
Treonina 93
En la Tabla 2 podemos observar los 22 residuos que componen la cavidad I de MtrD, siendo
estos los que están en negro. En la Figura 16 se puede ver la cavidad formada por estos 22
residuos (en azul) Esta información se podrá utilizar para el análisis de clustering de la cavidad I.
29
Figura 16. Cavidad I (en azul), formada por los 22 residuos mostrados en la Tabla 2.
3.2.3 Análisis de clustering de las cavidades A e I en las dinámicas moleculares
El clustering conformacional es una herramienta que nos permite encontrar conformaciones de
las cavidades que ocurran con frecuencia, lo que indica que en un sistema biológico estas
conformaciones tendrán una mayor probabilidad de que puedan ser encontradas. La forma de
determinar esto es la población de los clusters; por ejemplo, un cluster con 500 frames de un total
de 2000, tendría un frame representativo que mostraría la conformación que adopta la cavidad el
25% del tiempo. Además, nos permite encontrar conformaciones diferentes de las cavidades,
información estructural importante para realizar el proceso de tamizaje in silico sobre diferentes
estados de los sitios de unión para aumentar el espacio químico que se podría explorar para
encontrar potenciales inhibidores. En síntesis, el clustering permite la extracción de
conformaciones de las cavidades A e I que sean frecuentes y diferentes entre ellas.
El análisis de clustering se realiza con el componente RMSD Based Clustering of Frames from
Desmond Trajectory del software Desmond (Desmond, 2017). Este utiliza la trayectoria de las
MD, escogiendo frames a un intervalo especificado, y luego los superpone antes de calcular el
RMSD. El intervalo escogido fue de 1 frame, de forma que se analizaron los 2000 frames de las
3 trayectorias. Luego, se calcula una matriz de RMSD de pares de átomos especificados, en este
30
caso siendo aquellos pertenecientes a los residuos que componen las cavidades A o I. Esta matriz
de RMSD se utiliza en el clustering jerárquico aglomerante, con un numero especificado de
clusters para terminar el análisis. Se determinó que el resultado fueran 10 y 15 clusters, ya que
estos valores eran los que mejor mostraban la variabilidad conformacional de las cavidades A e I.
En otras palabras, este cálculo agrupa los frames de la trayectoria de acuerdo a la similitud
conformacional de las cavidades A e I de acuerdo al RMSD de los pares de átomos de los
residuos que componen los sitios de unión. Además, nos provee con el frame representativo de
cada cluster, siendo este el que representa la conformación de la cavidad a la que las demás del
mismo cluster menos difieren.
3.2.3.1 Clustering de la cavidad A0
Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD sin ligandos sobre los átomos que componen la
cavidad A, y se obtuvieron 10 (Figura 17) y 15 clusters (Figura 18). La cavidad A0 tiene la
misma composición que A1, pero en una conformación relajada. Cabe resaltar que esta MD se
estabilizó a los 40ns, que corresponde al frame 533, de forma que los clusters formados por
frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que
resulta en 10C (10 clusters) (Figura 17), de C5 a C10 (cluster 5 a cluster 10); en el clustering
que resulta en 15C (Figura 18), se eliminan de consideración C7 y de C9 a C15.
31
Figura 17. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD,
especificando un resultado de 10 clusters.
En la Figura 17 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad A0
cuando estas se dividen en 10C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1 a C4. El cluster más poblado es C3, con 411 frames, seguido de
C2, con 291 frames, y luego de C1, con 205 frames. Algo interesante de este clustering es que
muestra como la cavidad A0 de MtrD visita dos veces la conformación que representa C1.
32
Figura 18. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD,
especificando un resultado de 15 clusters.
En la Figura 18 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad A0
cuando estas se dividen en 15C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1 a C6 y C8. El cluster más poblado es C4, con 294 frames,
seguido de C8, con 278 frames, y luego de C1, con 205 frames.
Comparando la Figura 17 y la Figura 18 podemos ver que C1 está conservado en ambos
clustering, lo que indica que son conformaciones con un RMSD muy cercano entre ellas. Si lo
contrario fuera cierto este cluster se dividiría en clusters menos poblados, como ocurrió con C2 –
10C (C2 de 10C). La división de C2 – 10C en C2 y C3 – 15C sugiere que este cluster contiene
conformaciones de A0 que difieren entre ellas, de forma que tiene una alta variabilidad
conformacional, resultado que no conviene para el propósito de este análisis. C3 – 10C se dividió
en C4 – 15C y C5 – 15C, siendo este último compuesto también por 100 frames de C5 – 10C,
que comparte similitudes estructurales con la proteína antes de la convergencia de la MD.
Dado esto, se escogerán las estructuras representativas de C1 y C4 – 15C para realizar el
tamizaje in silico sobre la cavidad A0. C1 – 15C porque está conservado en ambos clustering y
C4 – 15C porque es el más poblado compuesto por frames posteriores a la convergencia de MD.
No se escogió C3 – 10C, aunque fuera el más poblado, por contener frames que se agrupan en
15C con estructuras de la proteína antes de la convergencia.
33
3.2.3.2 Clustering de la cavidad I0
Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD sin ligandos sobre los átomos que componen la
cavidad I, y se obtuvieron 10 (Figura 19) y 15 clusters (Figura 20). La cavidad I0 tiene la
misma composición que I1, pero en una conformación relajada. Cabe resaltar que esta MD se
estabilizó a los 40ns, que corresponde al frame 533, de forma que los clusters formados por
frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que
resulta en 10C (Figura 19), C3 y de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 20),
se eliminan de consideración de C4, C5 y de C8 a C15.
Figura 19. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD,
especificando un resultado de 10 clusters.
En la Figura 19 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad I0
cuando estas se dividen en 10C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1, C2 y C4. El cluster más poblado es C1, con 802 frames, seguido
de C4, con 292 frames, y luego de C2, con 198 frames.
34
Figura 20. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD,
especificando un resultado de 15 clusters.
En la Figura 20 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad I0
cuando estas se dividen en 15C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1 a C3 y C7. El cluster más poblado es C1, con 491 frames,
seguido de C2, con 311 frames, luego de C7, con 209 frames, y finalmente por C3, con 198
frames.
Comparando la Figura 19 y la Figura 20 podemos ver que C1 – 10C se divide en C1 y C2 –
15C, sugiriendo que los dos últimos comparten características estructurales. C2 – 10C está
conservado en ambos clustering, pero cambia de nomenclatura a C3 – 15C. C4 – 10C se divide
en C6 y C7 – 15C.
Dado esto, se escogerán las estructuras representativas de C1 y C3 – 15C para realizar el
tamizaje in silico sobre la cavidad I0. C1 – 15C se escogió sobre C2 – 15C, siendo que ambos
provienen del mismo cluster de 10C, porque entre los dos es el más poblado y porque la
orientación de los residuos que componen la cavidad I cambian en las estructuras representativas
de C1 y C2 – 15C. C3 – 15C en vez de C7 – 15C, aunque este último esté más poblado, porque
está conservado en ambos clustering.
3.2.3.3 Clustering de la cavidad A1
35
Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD – azitromicina sobre los átomos que componen
la cavidad A, y se obtuvieron 10 (Figura 21) y 15 clusters (Figura 22). Cabe resaltar que esta
MD se estabilizó a los 20ns, que corresponde al frame 266, de forma que los clusters formados
por frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que
resulta en 10C (Figura 21), de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 22), se
eliminan de consideración C7 y C9 a C15.
Figura 21. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD –
azitromicina , especificando un resultado de 10 clusters.
En la Figura 21 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad A1
cuando estas se dividen en 10C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son de C1 a C4. El cluster más poblado es C4, con 574 frames, seguido
de C3, con 472 frames, luego de C2, con 342 frames, y finalmente C1, con 136 frames.
36
Figura 22. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad A en la trayectoria de MtrD –
azitromicina, especificando un resultado de 15 clusters.
En la Figura 22 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad A1
cuando estas se dividen en 15C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1 a C6 y C8. El cluster más poblado es C2, con 342 frames,
seguido de C5, con 302 frames, luego de C6, con 272 frames, y finalmente C3, con 258 frames.
Comparando la Figura 21 y la Figura 22 podemos ver que C2 está conservado en ambos
clustering. C3 – 10C se divide en C3 y C4 – 15C. C4 – 10C, el cluster más poblado de este
clustering, se divide en C5 y C6 – 15C, siendo C5 – 15C el más poblado de estos dos.
Dado esto, se escogerán las estructuras representativas de C2 y C5 – 15C para realizar el
tamizaje in silico sobre la cavidad A1. C2 – 15C se escogió porque está conservado en ambos
clustering y porque es el cluster más poblado de 15C. C5 – 15C se escogió por ser el segundo
cluster más poblado de 15C.
3.2.3.4 Clustering de la cavidad I1
37
Este cálculo se realizó con la trayectoria de MtrD – MBX3135 sobre los átomos que componen
la cavidad I, y se obtuvieron 10 (Figura 23) y 15 clusters (Figura 24). Cabe resaltar que esta
MD se estabilizó a los 20ns, que corresponde al frame 266, de forma que los clusters formados
por frames anteriores a este no son de interés. Esto elimina de consideración, en el clustering que
resulta en 10C (Figura 23), de C5 a C10; en el clustering que resulta en 15C (Figura 24), se
eliminan de consideración de C7 a C15.
Figura 23. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD –
MXB3135, especificando un resultado de 10 clusters.
En la Figura 23 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad I1
cuando estas se dividen en 10C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son de C1 a C4. El cluster más poblado es C1, con 519 frames, seguido
de C3, con 450 frames, luego de C2, con 386 frames, y finalmente C4, con 217 frames.
38
Figura 24. Análisis de clustering por RMSD de los residuos de la cavidad I en la trayectoria de MtrD –
MXB3135, especificando un resultado de 15 clusters.
En la Figura 24 se pueden observar las diferentes conformaciones que adopta la cavidad I1
cuando estas se dividen en 15C, de los cuales los únicos que están en la etapa posterior a la
estabilización de la MD son C1 a C6. El cluster más poblado es C1, con 519 frames, seguido de
C4, con 391 frames, luego de C6, con 219 frames, y finalmente C2, con 209 frames.
Comparando la Figura 23 y la Figura 24 podemos ver que C1 está conservado en ambos
clustering y tiene una población muy alta. C3 – 10C se divide en C4 y C5 – 15C, pero C5 – 15C
tiene una población de solamente 59 frames. En esta división también se puede apreciar como la
cavidad I1 visita una misma conformación, representada por más de una vez a través de la MD.
C2 – 10C se divide en C2 y C3 – 15C.
Dado esto, se escogerán las estructuras representativas de C1 y C4 – 15C para realizar el
tamizaje in silico sobre la cavidad I1. C1 – 15C se escogió porque está conservado en ambos
clustering y porque es el cluster más poblado de 15C. C4 – 15C se escogió por ser el segundo
cluster más poblado de 15C.
3.3 Tamizaje in silico para encontrar potenciales inhibidores de MtrD
El tamizaje in silico es un proceso que permite encontrar moléculas potencialmente afines a un
sitio de unión a partir de una librería de miles de compuestos. Se realiza utilizando cálculos de
docking sucesivos, y con funciones de scoring cada vez más exigentes a medida que se va
filtrando la librería. El propósito de este paso es encontrar potenciales inhibidores de MtrD, o
39
moléculas que sean afines a la cavidad A o I, y que interrumpan su funcionalidad al mantenerse
unidos a las cavidades impidiendo que MtrD reconozca la azitromicina.
Este proceso se realizó con el componente Virtual Screening Workflow (VSW) de Glide
(Halgren et al., 2004), al cual se le provee un archivo con la librería de compuestos cuya afinidad
va a ser determinada, los receptores sobre los cuales se medirá la afinidad, y las características de
los docking a realizar. La librería utilizada fue Asinex Elite Library, con 103175 compuestos. Se
utilizaron en total 8 conformaciones de MtrD, 4 de la cavidad A (2 de A1 y 2 de A0) y 4 de la
cavidad I (2 de I1 y 2 de I0). Se realizó un tamizaje in silico por cada receptor, todos utilizando
la misma librería.
VSW realiza un primer docking con todos los compuestos de la librería con el algoritmo High
Throughput Virtual Screening (HTVS), y después del docking se le pidió que mantuviera 5% de
los mejores compuestos. Luego hace un segundo docking con los mejores compuestos de HTVS
con el algoritmo Standard Precision (SP), y después del docking se le pidió que mantuviera los
mejores 200 compuestos. Finalmente, realiza un tercer docking con el algoritmo Extra Precision
(XP), que utiliza una versión distinta de Glide (Friesner et al., 2006), sobre los mejores 200
compuestos de SP, y se le pidió que reportara solamente los mejores 100 compuestos. Esta
metodología está ilustrada en el Diagrama 2.
Diagrama 2. Ilustración de la metodología empleada para el tamizaje in silico.
3.3.1 Preparación de la librería Asinex Elite Library para el tamizaje in silico
La preparación de los ligandos se realizó solamente para el primer tamizaje in silico, y para los
demás se utilizó el archivo de los ligandos preparados. La preparación tuvo la misma
metodología a aquella en la sección 3.2.1.1, y luego de la preparación se realizó un proceso de
filtraje. El filtraje se realizó con el software QikProp (Schrodinger, 2018), que calcula
40
propiedades farmacéuticamente relevantes de los compuestos a partir de su estructura 3D. Entre
estas propiedades están las que menciona la regla de cinco de Lipinski (Lipinski, Lombardo,
Dominy, & Feeney, 2001), que luego utiliza para eliminar las moléculas que no la cumplan.
Además se eliminan compuestos con grupos reactivos.
El resultado de la preparación y filtraje de la librería Asinex Elite Library fue un archivo con
95422 compuestos y 326365 conformaciones.
3.3.2 Preparación de grids para las cavidades A e I
La preparación de los grids se realizó antes del VSW, de forma que a este se le proveyeron los 8
grids preparados. Se utilizó el componente Receptor Grid Generation de Glide (Halgren et al.,
2004) para este proceso.
3.3.2.1 Preparación grids de la cavidad A0 y A1
Se prepararon 2 grids para la cavidad A0 a partir de las estructuras representativas de C1 y C4 –
15C, y 2 grids para la cavidad A1 a partir de las estructuras representativas de C2 y C5 – 15C. El
centro del grid se determinó utilizando los 19 residuos que componen la cavidad A, mostrados en
la Tabla 1.
Se obtuvieron 4 grids: A0 – C1, A0 – C4, A1 – C2 y A1 – C5.
3.3.2.2 Preparación grids de la cavidad I0 e I
Se prepararon 2 grids para la cavidad I0 a partir de las estructuras representativas de C1 y C3 –
15C, y 2 grids para la cavidad I1 a partir de las estructuras representativas de C1 y C4 – 15C. El
centro del grid se determinó utilizando los 22 residuos que componen la cavidad I, mostrados en
la Tabla 2.
Se obtuvieron 4 grids: I0 – C1, I0 – C3, I1 – C1 y I1 – C4.
3.3.3 Resultados tamizaje in silico
Se realizaron 8 tamizajes in silico con los compuestos preparados en la sección 3.3.1, y los 8
grids preparados en la sección 3.3.2. Cada tamizaje resultó en 100 compuestos, resultando en un
total de 800 compuestos; de los cuales 400 estaban asociados a la cavidad A y los otros 400
asociados a la cavidad I.
Los resultados para cada cavidad se agruparon, independientemente de si venían de la estructura
relajada (A0/I0) o de la estructura con un ligando (A1/I1), puesto que son la misma cavidad en
conformaciones diferentes. El propósito de este estudio es encontrar los ligandos que presenten
la mejor afinidad para la cavidad A e I, en cualquier conformación que sea frecuente en la
proteína.
41
3.3.3.1 Resultados del tamizaje in silico de la cavidad A0 y A1
Los 20 compuestos más afines a la cavidad A (incluye A0 y A1) están presentados en la Tabla 3.
Se puede observar que todos los puntajes de docking XP son mayores al puntaje de docking XP
de la azitromicina. Este se obtuvo en la sección 3.2.1.3, y el valor fue de -8.584 𝑘𝑐𝑎𝑙
𝑚𝑜𝑙. Esta
comparación es meramente de referencia, ya que la azitromicina es un sustrato de la proteína, y
no un inhibidor. De forma que la información que se puede inferir de esta comparación es que de
acuerdo al software estas 20 moléculas son más afines a la cavidad A de MtrD que la
azitromicina. Siendo así, existe la posibilidad que estos compuestos, o algunos de ellos, sean
capaces de unirse a la proteína con mayor afinidad y disrumpir su funcionamiento. En otras
palabras, los resultados encontrados para la Cavidad A son lo esperado de moléculas con
potencial inhibitorio: presentar una mayor afinidad por la proteína que un sustrato común.
Es importante resaltar que el compuesto AEM 17368541 aparece en la lista en las posiciones 1 y
19 (Tabla 3). Se decidió mantener la lista de esta manera ya que este compuesto tuvo excelentes
puntajes de docking en dos grids diferentes (CavA1-Clu2, posición 1, y CavA0-Clu4, posición
19), siendo uno de ellos el mejor puntaje para la cavidad A. Además, en cada grid interactuó con
residuos diferentes: en CavA1-Clu2 tuvo interacciones con los residuos PHE-623, GLU-669,
SER-134, TYR-325 y VAL-38, principalmente a través de puentes de hidrogeno y enlaces π –
catión; en CavA0-Clu4 tuvo interacciones con ASP-83, PHE-610, GLY-614, GLU-669 y SER-
611, principalmente a través de puentes de hidrogeno, enlaces π – catión y puentes salinos.
Tabla 3. Resultados del tamizaje in silico de la cavidad A de MtrD.
A-Rank Compound
code
XP score
(kcal/mol)
SP score
(kcal/mol) Grid
1 AEM 17368541 -11.366 -11.272 CavA1-Clu2
2 SYN 15662120 -11.125 -10.522 CavA1-Clu2
3 ADM 12232132 -11.030 -11.030 CavA0-Clu1
4 LMG 15227407 -10.983 -9.318 CavA0-Clu1
5 SYN 15662268 -10.871 -10.768 CavA1-Clu2
6 LEG 14688228 -10.681 -10.283 CavA0-Clu1
7 LMK 17710488 -10.497 -10.334 CavA0-Clu1
8 ADM 13809111 -10.308 -9.751 CavA0-Clu1
9 LEG 17710735 -10.307 -10.116 CavA0-Clu1
10 SYN 20067946 -10.184 -9.825 CavA0-Clu1
11 LEG 15407554 -10.114 -9.094 CavA1-Clu2
12 SYN 15543837 -10.099 -10.016 CavA1-Clu2
13 AOP 18546356 -10.093 -9.870 CavA1-Clu2
42
14 ADM 13302999 -10.075 -9.898 CavA1-Clu2
15 AEM 14468192 -10.063 -9.832 CavA1-Clu2
16 LEG 17217288 -10.026 -10.017 CavA0-Clu1
17 AEM 10821016 -10.025 -9.962 CavA0-Clu1
18 AEM 17368395 -10.018 -9.963 CavA0-Clu4
19 AEM 17368541 -10.013 -9.919 CavA0-Clu4
20 SYN 15410027 -9.978 -9.318 CavA1-Clu2
Los compuestos 2, 3, 5, 6, 8, 10, 14, 15, 16, 18, y 19 (diez compuestos) tienen interacciones con
uno o más residuos del loop rico en glicina, que está asociado a la inhibición de AcrB. Los
residuos del loop involucrados en estas interacciones son PHE-610, SER-611, PHE-612, SER-
613 y GLY-614. Las interacciones con estos residuos varían entre π – π stacking, con los
residuos aromáticos, puentes de hidrogeno con el backbone y con cadenas laterales, puentes de
hidrogeno aromáticos, e interacciones π – catión.
Todos los compuestos, excepto el 12 y 13, están entre 1.75 – 3.28 Å del loop rico en glicina. Las
dos excepciones están a 4.98 y 5.35 Å, respectivamente. Esto sugiere que, aunque la posición de
algunos de estos compuestos no cumpla los criterios geométricos de interacción, en el sistema
biológico pueden haber interacciones directamente con loop, o que estos compuestos sean
capaces de impedir su movimiento dada su cercanía.
En la cavidad A hay cuatro residuos aromáticos que forman una trampa hidrofóbica (Figura 25),
que parece ser aquella previamente descrita en AcrB (Sjuts et al., 2016). Los residuos son PHE-
136, TYR-325, PHE-568 y PHE-623, y estos tienen interacciones del tipo π – π stacking con los
compuestos 1, 2, 5, 11, 12, 13, 15 y 20 (ocho compuestos). Esta trampa parece estabilizar los
compuestos con anillos aromáticos, aumentando su afinidad por la cavidad A. En la Figura 25 se
puede apreciar, en líneas azules discontinuas, las diferentes formas en que puede ocurrir esta
interacción con el compuesto 2, dependiendo de la orientación del ligando y de las cadenas
laterales. Estos compuestos interactúan con uno hasta cuatro residuos que componen la trampa.
Figura 25. Compuesto 2 dentro de la trampa hidrofóbica de MtrD. Líneas
discontinuas en azul son representaciones de las posibles interacciones de
π – π stacking que hay entre la trampa y el ligando.
TYR-325
PHE-623
PHE-568
PHE-136
43
El residuo GLU-669 interactúa con todos los compuestos excepto el 14. Las interacciones con
este residuo incluyen hasta: dos puentes de hidrogeno, con la cadena lateral y/o el backbone; dos
puentes salinos, con la cadena lateral; dos puentes de hidrogeno aromáticos, con la cadena lateral
y/o el backbone. El compuesto 13 tiene hasta cinco interacciones con este residuo (Figura 26),
uno o dos puentes de hidrogeno con la cadena lateral, o un puente salino en vez de un puente de
hidrogeno, y dos puentes de hidrogeno aromáticos, uno con la cadena lateral y el otro con el
backbone. Estos resultados sugieren que GLU-669 es de alta importancia para el reconocimiento
de sustratos, puesto que tuvo interacciones con 95% de los mejores 20 potenciales inhibidores
para la cavidad A.
Figura 26. Interacción entre el compuesto 13 y el residuo GLU669. Líneas discontinuas en azul claro, amarillo
y rosado son, respectivamente, representaciones de interacciones de puentes de hidrogeno aromáticos, puentes
de hidrogeno y puente salino.
Las demás interacciones de estos compuestos se pueden ver en detalle en la Tabla A1, en
anexos.
En la Figura 27 se puede apreciar la estructura de los mejores 10 potenciales inhibidores para la
cavidad A (la estructura de los compuestos 11 a 20 está en la Figura A1, en anexos). Los
compuestos 2 y 10 son derivados del benzimidazole funcionalizados en diferentes posiciones.
Los compuestos 1 y 5 son derivados del indol funcionalizados en diferentes posiciones. Los
compuestos 7, 8 y 9 comparten el mismo núcleo pyrazolo[1,5-a]pyrimidina-7(4H)-one
funcionalizados en diferentes posiciones. El compuesto 3 es un derivado de la indolina,
funcionalizado en las posiciones 2 y 7. El compuesto 4 es un derivado de (3-2H)-4H-Chromen-4-
one, funcionalizado en la posición 2. El compuesto 6 es un derivado del imidazol, funcionalizado
en la posición 2.
GLU-669
44
Figura 27. Los 10 compuestos más afines a la cavidad A de MtrD.
Los compuestos encontrados para la cavidad A se encuentran anclados a la proteína
principalmente por puentes de hidrogeno y secundariamente por interacciones del tipo π – π
stacking. La mayoría de estos compuestos presenta entre 4 y 6 puentes de hidrogeno y entre 1 a 4
interacciones π – π stacking, lo que explica porque los puntajes de docking son tan altos. Los
puentes de hidrogeno son la interacción que más estabiliza una interacción proteína – ligando,
seguida de las interacciones π – π stacking (Kitchen et al., 2004). Además, 18 de los mejores 20
compuestos están a una distancia menor a 3.28Å del loop rico en glicina, y 10 de estos 18
presentan interacciones directas con el loop. Esto sugiere que los compuestos encontrados
pueden bloquear el movimiento del loop rico en glicina, sea por impedimento estérico o por
interacciones directas, emulando el mecanismo de inhibición de MBX3135 en AcrB. Otra
característica común de 8 de los mejores 20 compuestos es estar dentro de una trampa
hidrofóbica compuesta por 4 residuos, cuya presencia no había sido confirmada en MtrD, pero si
en AcrB, y cuyas interacciones están asociadas a una mejora en el índice de inhibición de los
mejores inhibidores de AcrB (Sjuts et al., 2016). Los altos puntajes de docking y las
características previamente mencionadas aportan confianza a que algunos de los compuestos
encontrados sean inhibidores de MtrD.
45
3.3.3.2 Resultados tamizaje in silico de la cavidad I0 e I1
Los 20 compuestos más afines a la cavidad I (incluye I0 e I1) están presentados en la Tabla 4. Se
puede observar que todos los puntajes de docking XP son mayores al puntaje de docking XP de
MBX3135. Este se obtuvo en la sección 3.2.1.3, y el valor fue de -6.581 𝑘𝑐𝑎𝑙
𝑚𝑜𝑙. Esta comparación
es meramente de referencia, ya que MBX3135 es un inhibidor de AcrB, y no de MtrD. De forma
que la información que se puede inferir de esta comparación es que de acuerdo al software estas
20 moléculas son más afines a la cavidad I de MtrD que MBX3135. Es importante resaltar que
dada la similitud estructural entre AcrB y MtrD estos resultados sugieren que las moléculas
encontradas, al tener un mejor puntaje de docking que MBX3135, tienen una muy buena
probabilidad de unirse a la Cavidad I con suficiente afinidad para ocasionar inhibición.
Tabla 4. Resultados del tamizaje in silico de la cavidad I de MtrD.
I-Rank Compound Code XP score
(kcal/mol)
SP score
(kcal/mol) Grid
1 SYN 20121713 -12.249 -12.249 CavI1-Clu1
2 LEG 20112752 -11.981 -11.981 CavI1-Clu1
3 SYN 20111262 -11.748 -11.748 CavI1-Clu1
4 SYN 20011339 -11.643 -11.643 CavI1-Clu1
5 AEM 17457717 -11.619 -11.528 CavI1-Clu1
6 ART 17731821 -11.576 -11.161 CavI1-Clu1
7 LMK 20989244 -11.421 -11.421 CavI1-Clu1
8 AEM 17457954 -11.362 -11.267 CavI1-Clu1
9 SYN 20045816 -11.357 -11.357 CavI1-Clu1
10 SYN 20119221 -11.309 -11.309 CavI1-Clu1
11 SYN 22338318 -11.217 -11.185 CavI1-Clu1
12 ART 20458851 -11.189 -11.152 CavI1-Clu1
13 AEM 17458517 -11.029 -10.936 CavI1-Clu1
14 SYN 24376253 -10.985 -9.651 CavI0-Clu3
15 SYN 22873506 -10.975 -10.234 CavI0-Clu3
16 SYN 26081504 -10.901 -10.490 CavI1-Clu1
17 AEM 17457261 -10.649 -10.554 CavI1-Clu1
18 SYN 15653212 -10.608 -10.119 CavI1-Clu1
19 SYN 26081481 -10.578 -10.168 CavI1-Clu1
20 AOP 22313704 -10.544 -10.522 CavI1-Clu1
46
En la cavidad I solamente cinco compuestos mostraron interacciones con el loop rico en glicina.
Estos fueron el 5, 8, 13, 16 y 19 y todos interactuaron exclusivamente con el residuo PHE-610,
principalmente por π – π stacking, y en una ocasión por puentes de hidrogeno aromáticos con la
cadena lateral. A pesar de esta falta de interacciones directas con el loop en comparación a los
compuestos encontrados para la cavidad A, todos excepto los compuestos 6, 12, 15 y 17 están
entre 2.01 – 3.61 Å. Las excepciones están entre 4.33 – 7.70 Å. Nuevamente, esto sugiere que a
pesar de que los compuestos encontrado por el tamizaje no aparenten interactuar directamente
con el loop, están suficientemente cerca para ser un impedimento estérico, de forma que podrían
inhibir MtrD por un mecanismo similar al de MBX3135 en AcrB.
Los compuestos 1, 2, 3, 9, 10, 11 y 12 interactúan con dos residuos de la trampa hidrofóbica,
PHE-568 y TYR-325, exclusivamente por puentes de hidrogeno, y puentes de hidrogeno
aromáticos para el compuesto 1. Estos compuestos están sobre la trampa (Figura 28), no dentro
de ella como los compuestos encontrados para la cavidad A.
Figura 28. Compuesto 1 sobre la trampa hidrofóbica. Líneas descontinuas en azul claro y en amarillo son,
respectivamente, representaciones de interacciones de puentes de hidrogeno aromáticos y puentes de
hidrogeno.
No se encontró ningún patrón discernible en las interacciones de los mejores 20 compuestos con
la cavidad I, a diferencia de la cavidad A. Las demás interacciones de estos compuestos se
pueden ver en detalle en la Tabla A2, en anexos.
En la Figura 29 se puede apreciar la estructura de los mejores 10 potenciales inhibidores para la
cavidad I (la estructura de los compuestos 11 a 20 está en la Figura A2, en anexos). Los
PHE-136
PHE-623 PHE-568
TYR-325
47
compuestos 1, 2, 3, 4, 9 y 10 son derivados del glycoluril sustituidos en la misma posición, pero
con diferente estereoquímica. Los compuestos 5, 7 y 8 son compuestos derivados del
fluorobenceno sustituidos en diferentes posiciones. El compuesto 6 es un derivado del 1,7-
Diazaindene sustituido en las posiciones 2 y 3.
Figura 29. Los 10 compuestos más afines a la cavidad I de MtrD.
Los compuestos encontrados para la cavidad I se encuentran anclados a la proteína
principalmente por puentes de hidrogeno. La mayoría de estos compuestos presenta entre 5 y 7
puentes de hidrogeno, lo que explica porque los puntajes de docking son tan altos. Los 7 mejores
compuestos para la cavidad I presentan puntajes de docking superiores al de los mejores 20
compuestos encontrados para la cavidad A. Estos mejores 7 compuestos para la cavidad I tienen
entre 6 y 7 puentes de hidrogeno, lo que explica los valores más altos que aquellos encontrados
para la cavidad A.
Además, 18 de los mejores 20 compuestos están a una distancia menor a 3.61Å del loop rico en
glicina, pero solo 5 de estos 18 presentan interacciones directas con el loop. Esto sugiere que los
48
compuestos encontrados pueden bloquear el movimiento del loop rico en glicina, sea por
impedimento estérico o por interacciones directas, emulando el mecanismo de inhibición de
MBX3135 en AcrB. Los altos puntajes de docking y las características previamente mencionadas
aportan confianza a que algunos de los compuestos encontrados sean inhibidores de MtrD.
4. Discusión
4.1 Estructura de MtrD y conformaciones obtenidas por MD
La estructura de MtrD que fue utilizada en todos los experimentos estaba truncada, ya que se
eliminó por completo el dominio transmembranal. Para las simulaciones de docking este cambio
no presenta pérdidas de fidelidad al sistema biológico, dado que estas se realizan sobre un grid,
que no incluye toda la proteína. Ninguno de los grids que se utilizaron incluían el dominio
transmembranal, de forma que la ausencia del dominio transmembranal no afectaría los
resultados obtenidos.
El truncamiento de MtrD sí resulta en pérdidas de información en las dinámicas moleculares,
puesto a que el comportamiento de esta proteína es influenciado por estar anclada a una
membrana lipídica. El anclaje implica una limitación del movimiento predominantemente en la
región inferior de MtrD, disminuyendo gradualmente hacia las partes superiores de la proteína;
lo que implica que en la región media de la proteína también habría rigidez estructural. Las
restricciones de movimiento a los átomos de la frontera entre el dominio transmembranal y el
dominio periplásmico, en las dinámicas moleculares, no representarían bien la limitación de
movimiento otorgada por el anclaje. Estas restricciones no reducirían el movimiento de la región
media de la proteína, ni simularían la reducción gradual de esta limitación de movimiento.
Además, en el sistema biológico MtrD se encuentra en complejo con MtrC, que se une a los
surcos interprotomericos en la parte superior de la proteína (Janganan et al., 2013), y en
consecuencia tiene su movimiento restringido por esta interacción. Se intentó simular esta
limitación restringiendo algunos átomos de la parte superior, pero esto ignora la influencia
electrostática de los residuos de MtrC sobre MtrD. Dadas ambas dificultades para simular
verídicamente el movimiento de MtrD en el espacio periplásmico, es posible que las
conformaciones que se obtuvieron en las dinámicas moleculares no sean conformaciones que
ocurran en el sistema biológico. A pesar de esta posibilidad, se debe tener en cuenta que la
metodología empleada ya había sido validada, de forma que los resultados encontrados en este
estudio son muy prometedores (Vargiu et al., 2014).
A pesar de esto, se mantuvieron las restricciones previamente explicadas ya que en estudios
anteriores, que resultaron exitosos, realizaron dinámicas con AcrB truncada y aplicaron
restricciones de movimiento sobre los átomos de la frontera entre el dominio transmembranal y
periplásmico (Vargiu et al., 2014). En este estudio lograron simular apropiadamente el
comportamiento de AcrB y elucidar el mecanismo de inhibición de MBX3135, lo que respalda la
aplicación de este modelo truncado para MtrD.
4.2 Tamizaje in silico
49
El propósito de utilizar 4 grids en el tamizaje es poder explorar una mayor parte del espacio
químico de moléculas potencialmente afines a la cavidad A de MtrD. Por esto, se espera que en
los 400 compuestos que llegaron a la última etapa del tamizaje no aparezcan muchos duplicados.
A pesar de esto, la presencia de duplicados no es un resultado negativo, puesto que esto sugiere
que los compuestos repetidos son afines a la cavidad A en diferentes conformaciones. No hubo
ningún compuesto que mostrará afinidad por los 4 grids utilizados para explorar la cavidad A,
pero si se encontraron 2 compuestos comunes entre CavA – Clu2, CavA0 – Clu1 y CavA0 –
Clu4 y 1 compuesto en común entre CavA – Clu5, CavA0 – Clu1 y CavA0 – Clu4. El mayor
número de compuestos compartidos fue de 12, entre CavA0 – Clu1 y CavA0 – Clu4. El hecho
que en el tamizaje in silico solo se encontraron 12 compuestos en común de ~104.000, muestra
que las conformaciones extraídas de las dinámicas moleculares eran suficientemente diferentes, y
se logró explorar una mayor parte del espacio químico. La variedad molecular de los mejores
compuestos obtenidos hubiera sido distinguidamente menor si se hubiera usado solo un grid.
Para la cavidad I se encontraron muy pocos resultados en común. Entre CavI – 1 y CavI – 4 se
encontraron 7 compuestos comunes, y no hubo ningún resultado que apareciera para tres de los
grids. Nuevamente, mostrando que el análisis de clustering fue efectivo determinando
conformaciones diferentes de las cavidades a partir de las dinámicas moleculares.
Los resultados del tamizaje in silico para la cavidad A son muy prometedores, puesto que se
logró determinar que muchos de los compuestos más afines están dentro de la trampa hidrofóbica
e interactúan con, o están cercanos a, el loop rico en glicina. Ambas interacciones han sido
caracterizadas para los inhibidores conocidos de AcrB, y sugieren que los potenciales inhibidores
encontrados podrían tener un mecanismo de acción similar. Además, la mayoría de los
compuestos encontrados tienen un carbonilo cercano a un grupo polar; que parece estar anclando
los compuestos al residuo GLU-669. La azitromicina también está anclada a MtrD a través de un
puente de hidrogeno y un puente salino con GLU-669, lo que soporta la hipótesis de que este es
un residuo importante en el reconocimiento de sustratos de MtrD.
Ninguno de los compuestos en la cavidad I estaba dentro de la trampa hidrofóbica, aunque
muchos sí interactuaban con, o estaban cercanos a, el loop rico en glicina. Pero, los mejores
puntajes de docking fueron los de los compuestos afines a esta cavidad [I]. Estos resultados
sugieren que los mejores compuestos de esta cavidad, aunque no compartan el mecanismo de
inhibición de MBX3135 en AcrB, presenten un modo de acción completamente diferente que de
igual manera resulte en la inhibición de MtrD. A pesar de esto, los compuestos encontrados para
la cavidad A son más alentadores, ya que sus posiciones parecen reflejar el mismo
comportamiento inhibitorio de MBX3135 en AcrB y presentan excelentes puntajes de docking.
Indudablemente, el siguiente paso es realizar ensayos experimentales con estos potenciales
inhibidores para determinar su eficacia in vivo. El hecho de que los compuestos encontrados para
la cavidad I tuvieron mejores puntajes de docking que los compuestos encontrados para la
cavidad A puede ser explicado por el numero de puentes de hidrogeno. Los compuestos de la
cavidad I con un mayor puntaje de docking (los mejores 7) presentaban, en promedio, más
puentes de hidrogeno que los mejores 20 de la cavidad A.
Otro factor que soporta la plausibilidad de haber encontrado moléculas potencialmente
inhibitorias para MtrD es la diferencia entre las interacciones de los compuestos encontrados con
50
la proteína y de la azitromicina con la proteína. No solo los puntajes de docking de los
compuestos encontrados fueron mejores que el puntaje de la azitromicina, si no que la mayoría
de estos compuestos presentaban un mayor numero de interacciones con MtrD, lo que
aumentaría la energía necesaria para deshacer estas interacciones.
Al comparar las poses de los mejores compuestos de la cavidad A con la pose de la azitromicina,
es claro que el antibiótico no interactúa con la trampa hidrofóbica, a diferencia de los mejores
compuestos determinados por el tamizaje in silico. La mayoría de estos compuestos se encuentra
dentro de la trampa, de forma que se podría explicar a través de esta interacción diferencial la
posible inhibición de MtrD por los compuestos encontrados, y la no inhibición de esta bomba de
expulsión por su sustrato. Además, la azitromicina se encuentra anclada a MtrD por dos puentes
de hidrogeno y un puente salino (desconsiderando los puentes de hidrogeno con dos residuos
pertenecientes al loop rico en glicina, ya que estas interacciones están asociadas a la expulsión
del sustrato y no su permanencia en la cavidad A). Mientras que los compuestos encontrados en
el tamizaje in silico para la cavidad A muestran, por lo general, un mayor numero de
interacciones y otros tipos de interacciones (por ejemplo, la presencia de interacciones
Una vez se haya determinado cuales compuestos presentan la mayor actividad se puede realizar
un análisis exhaustivo de su mecanismo de acción. Se deberían realizar dinámicas moleculares, y
determinar las contribuciones atómicas del inhibidor a la energía libre de unión con respecto a la
proteína a lo largo de la dinámica. De esta forma, se podría encontrar cuales grupos funcionales
del inhibidores son los que menos contribuyen a la formación del complejo MtrD – inhibidor,
para que estos sean modificados de forma que la afinidad del inhibidor aumente; disminuyendo
la concentración necesaria de este compuesto para ocasionar inhibición.
Cuando se haya desarrollado un inhibidor de MtrD comprobado experimentalmente y
optimizado computacionalmente, este podría ser aplicado en conjunto con la terapia dual
actualmente utilizada. La ventaja de esta terapia trial sería una mayor disminución en la
probabilidad del desarrollo de la resistencia al tratamiento, ya que se ha demostrado que la
inhibición de las bombas de expulsión impide la generación de resistencia a través de otros
mecanismos por parte de la bacteria (Piddock, 2014), y además haría con que la terapia evada
exitosamente la resistencia actual de N. gonorrhoeae a la azitromicina.
5. Conclusiones
▪ Se lograron obtener diferentes conformaciones de la cavidad de reconocimiento de
sustratos de MtrD a partir de dinámicas moleculares, utilizando la herramienta de
clustering.
▪ Se encontró que los compuestos que se anclaron a la cavidad A se posicionan dentro de
una trampa hidrofóbica y que estaban cercanos a, o interactúan con, un loop rico en
glicina, ambas características encontradas en los inhibidores de AcrB.
▪ Se encontró que los compuestos que se anclaron a la cavidad I se posicionan cerca de la
trampa, pero no interactuaban con ella. Sí interactuaban con, o estaban cercanos a, el loop
rico en glicina.
51
▪ Se encontraron potenciales inhibidores de MtrD muy prometedores, que podrían restaurar
la eficacia de la azitromicina como tratamiento de la gonococia.
▪ Para lograr un mayor acercamiento al sistema biológico, se puede utilizar MtrD sin
truncar, anclada a una membrana y en complejo con MtrC. De esta forma, las
conformaciones obtenidas por dinámicas moleculares serían más confiables.
▪ Se puede expandir el tamizaje in silico para que tenga en cuenta moléculas presentes en
otras bases de datos, por ejemplo ZINC15.
▪ Se debe probar experimentalmente si los compuestos encontrados en este trabajo
ocasionan la inhibición de MtrD.
52
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54
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55
7. Anexos
7.1 Tablas
Tabla A1. Interacciones de los mejores 20 compuestos encontrados en el tamizaje in silico de la
cavidad A. Residuos del loop rico en glicina en verde.
Rank Compound Code Residuo Interacciones
Distancia
GLY-rich loop
(Å)
Grid
Fenilalanina 623 Pi-cation CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 134 H-bond CL
Tirosina 325 Pi-cation CL
Valina 38 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking / Aromatic H-bond CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 611 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 612 Aromatic H-bond BB
Glutamato 669 2 H-bond / Aromatic H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Serina 89 H-bond CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Serina 79 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 611 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Alanina 40 H-bond BB
Fenilalanina 612 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Glutamato 863 SaltBridge CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Serina 79 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 612 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Lisina 823 H-bond CL
Serina 613 H-bond BB
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 610 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 2 H-bond CL
Serina 134 H-bond BB
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB
Leucina 668 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond BB / 2 SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Valina 38 H-bond BB
Asparagina 135 H-bond CL
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB
Serina 134 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Glicina 717 2 H-bond CL
Lisina 823 Pi-cation / Aromatic H-bond CL
Fenilalanina 612 H-bond BB / Pi-pi stacking CL
Serina 89 H-bond CL
Serina 91 H-bond CL
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 612 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Glutamina 859 H-bond CL
Leucina 668 H-bond BB
Serina 134 H-bond CL
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Alanina 40 H-bond BB
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL
Serina 611 H-bond CL
Tirosina 77 H-bond CL
Glicina 858 H-bond BB
Glutamato 669 Aromatic H-bond CL
Glutamina 859 2 H-bond CL
Serina 134 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond BB/CL
Aspartato 83 H-bond / SaltBridge CL
Fenilalanina 610 Pi-cation CL
Glicina 614 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Aspartato 83 H-bond / SaltBridge CL
Fenilalanina 610 Pi-cation CL
Glicina 614 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Serina 611 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-cation CL / H-bond BB
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / Aromatic H-bond BB
Serina 134 H-bond BB
LMG 15227407 2.80
1
2
3
4
AEM 17368541
SYN 15662120
ADM 12232132
2.14
1.81
2.10
7 LMK 17710488 1.97
2.08ADM 138091118 CavA0-Clu1
5 SYN 15662268 2.23
2.526 LEG 14688228
2.34LEG 1540755411
5.35SYN 1554383712
3.009 LEG 17710735
2.34SYN 2006794610
2.45AEM 1446819215
2.13LEG 1721728816
4.98AOP 1854635613
2.06ADM 1330299914
2.08AEM 1736854119
2.48SYN 1541002720
17 3.28AEM 10821016
1.75AEM 1736839518
CavA0-Clu4
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA0-Clu4
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
56
Rank Compound Code Residuo Interacciones
Distancia
GLY-rich loop
(Å)
Grid
Fenilalanina 623 Pi-cation CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 134 H-bond CL
Tirosina 325 Pi-cation CL
Valina 38 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking / Aromatic H-bond CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 611 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 612 Aromatic H-bond BB
Glutamato 669 2 H-bond / Aromatic H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Serina 89 H-bond CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Serina 79 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Serina 611 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Alanina 40 H-bond BB
Fenilalanina 612 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Glutamato 863 SaltBridge CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Serina 79 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 612 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Lisina 823 H-bond CL
Serina 613 H-bond BB
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 610 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 SaltBridge CL
Glutamina 859 2 H-bond CL
Serina 134 H-bond BB
Serina 860 2 H-bond CL/BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB
Leucina 668 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond BB / 2 SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Valina 38 H-bond BB
Asparagina 135 H-bond CL
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL / 2 Aromatic H-bond CL/BB
Serina 134 H-bond BB
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Glicina 717 2 H-bond CL
Lisina 823 Pi-cation / Aromatic H-bond CL
Fenilalanina 612 H-bond BB / Pi-pi stacking CL
Serina 89 H-bond CL
Serina 91 H-bond CL
Fenilalanina 136 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 568 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 612 Pi-pi stacking CL
Fenilalanina 623 Pi-pi stacking CL
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge / Aromatic H-bond CL
Glutamina 859 H-bond CL
Leucina 668 H-bond BB
Serina 134 H-bond CL
Tirosina 325 Pi-pi stacking CL
Alanina 40 H-bond BB
Glutamato 669 2 H-bond / SaltBridge CL
Serina 611 H-bond CL
Tirosina 77 H-bond CL
Glicina 858 H-bond BB
Glutamato 669 Aromatic H-bond CL
Glutamina 859 2 H-bond CL
Serina 134 H-bond CL
Serina 860 2 H-bond BB/CL
Aspartato 83 H-bond / SaltBridge CL
Fenilalanina 610 Pi-cation CL
Glicina 614 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Aspartato 83 H-bond / SaltBridge CL
Fenilalanina 610 Pi-cation CL
Glicina 614 H-bond BB
Glutamato 669 SaltBridge CL
Serina 611 H-bond BB
Fenilalanina 136 Pi-cation CL / H-bond BB
Glutamato 669 H-bond / SaltBridge CL / Aromatic H-bond BB
Serina 134 H-bond BB
LMG 15227407 2.80
1
2
3
4
AEM 17368541
SYN 15662120
ADM 12232132
2.14
1.81
2.10
7 LMK 17710488 1.97
2.08ADM 138091118 CavA0-Clu1
5 SYN 15662268 2.23
2.526 LEG 14688228
2.34LEG 1540755411
5.35SYN 1554383712
3.009 LEG 17710735
2.34SYN 2006794610
2.45AEM 1446819215
2.13LEG 1721728816
4.98AOP 1854635613
2.06ADM 1330299914
2.08AEM 1736854119
2.48SYN 1541002720
17 3.28AEM 10821016
1.75AEM 1736839518
CavA0-Clu4
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA0-Clu4
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA-Clu2
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
CavA0-Clu1
57
Tabla A2. Interacciones de los mejores 20 compuestos encontrados en el tamizaje in silico de la
cavidad I. Residuos del loop rico en glicina en verde.
Rank Compound Code Residuo InteraccionesDistancia GLY-
rich loop (Å)Grid
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond CL/BB
PHE610 Pi-pi stacking CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
GLN34 H-bond CL
GLN566 H-bond CL
PHE136 2 H-bond CL/BB
ASN135 Aromatic H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
GLN566 H-bond CL
PHE136 2 H-bond BB
PRO665 H-bond BB
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond BB
PHE610 Aromatic H-bond CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 H-bond CL
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
SER134 Aromatic H-bond BB
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
GLN34 3 H-Bond 2CL/BB
PHE136 Aromatic H-bond BB
TYR325 Aromatic H-bond CL
TYR35 Pi-pi stacking CL
GLN34 2 H-bond CL
GLN566 Aromatic H-bond CL
PHE136 H-bond BB
PHE568 Pi-pi stacking CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond BB
PHE610 2 Pi-pi stacking CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
GLN566 H-bond CL
PRO562 Aromatic H-bond BB
SER674 H-bond CL
VAL663 2 H-bond BB
PRO562 H- Bond / Aromatic H-bond BB
SER674 2 H-bond CL/BB
SER860 H- bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 H- bond CL
PHE610 Pi-pi stacking CL
GLN34 H-bond BB
PHE136 Aromatic H-bond BB
PRO665 H-bond BB
TYR35 Pi-pi stacking CL
ALA132 Aromatic H-bond BB
GLN34 2 Aromatic H-bond CL/BB
PHE136 2 H-bond BB
SER91 Aromatic H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 H-bond BB
PHE610 Pi-pi stacking CL
GLN34 H-bond BB
PHE136 H-bond BB
PRO665 H-bond / Aromatic H-bond BB
CavI-Clu1SYN 200458169
CavI-Clu12.09AEM 174579548
CavI-Clu12.67LMK 209892447
CavI-Clu14.86ART 177318216
5
CavI-Clu12.09SYN 200113394
CavI-Clu12.91AOP 2231370420
CavI-Clu1
CavI-Clu12.84SYN 201217131
2.24
CavI-Clu12.85SYN 201112623
CavI-Clu12.57LEG 201127522
CavI-Clu12.01AEM 17457717
2.57SYN 2608148119
CavI-Clu12.13SYN 1565321218
CavI-Clu15.32AEM 1745726117
CavI-Clu12.01SYN 2608150416
CavI0-Clu34.33SYN 2287350615
CavI0-Clu33.61SYN 2437625314
CavI-Clu12.13AEM 1745851713
CavI-Clu17.70ART 2045885112
CavI-Clu13.29SYN 2233831811
CavI-Clu12.14SYN 2011922110
58
.
7.2 Figuras
Rank Compound Code Residuo InteraccionesDistancia GLY-
rich loop (Å)Grid
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond CL/BB
PHE610 Pi-pi stacking CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
GLN34 H-bond CL
GLN566 H-bond CL
PHE136 2 H-bond CL/BB
ASN135 Aromatic H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
GLN566 H-bond CL
PHE136 2 H-bond BB
PRO665 H-bond BB
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond BB
PHE610 Aromatic H-bond CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
ARG133 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 2 H-bond CL/BB
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
TYR325 H-bond CL
ASN135 H-bond CL
GLN34 H-bond CL
PHE136 H-bond BB
PHE568 Aromatic H-bond CL
SER134 Aromatic H-bond BB
TYR325 H-bond CL
ARG133 H-bond CL
GLN34 3 H-Bond 2CL/BB
PHE136 Aromatic H-bond BB
TYR325 Aromatic H-bond CL
TYR35 Pi-pi stacking CL
GLN34 2 H-bond CL
GLN566 Aromatic H-bond CL
PHE136 H-bond BB
PHE568 Pi-pi stacking CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 2 H-bond BB
PHE610 2 Pi-pi stacking CL
PRO665 Aromatic H-bond BB
GLN566 H-bond CL
PRO562 Aromatic H-bond BB
SER674 H-bond CL
VAL663 2 H-bond BB
PRO562 H- Bond / Aromatic H-bond BB
SER674 2 H-bond CL/BB
SER860 H- bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 H- bond CL
PHE610 Pi-pi stacking CL
GLN34 H-bond BB
PHE136 Aromatic H-bond BB
PRO665 H-bond BB
TYR35 Pi-pi stacking CL
ALA132 Aromatic H-bond BB
GLN34 2 Aromatic H-bond CL/BB
PHE136 2 H-bond BB
SER91 Aromatic H-bond CL
GLN34 Aromatic H-bond BB
PHE136 H-bond BB
PHE610 Pi-pi stacking CL
GLN34 H-bond BB
PHE136 H-bond BB
PRO665 H-bond / Aromatic H-bond BB
CavI-Clu1SYN 200458169
CavI-Clu12.09AEM 174579548
CavI-Clu12.67LMK 209892447
CavI-Clu14.86ART 177318216
5
CavI-Clu12.09SYN 200113394
CavI-Clu12.91AOP 2231370420
CavI-Clu1
CavI-Clu12.84SYN 201217131
2.24
CavI-Clu12.85SYN 201112623
CavI-Clu12.57LEG 201127522
CavI-Clu12.01AEM 17457717
2.57SYN 2608148119
CavI-Clu12.13SYN 1565321218
CavI-Clu15.32AEM 1745726117
CavI-Clu12.01SYN 2608150416
CavI0-Clu34.33SYN 2287350615
CavI0-Clu33.61SYN 2437625314
CavI-Clu12.13AEM 1745851713
CavI-Clu17.70ART 2045885112
CavI-Clu13.29SYN 2233831811
CavI-Clu12.14SYN 2011922110
59
Figura A1. Compuestos 11 a 20 de la cavidad A.
11 13
12
15
17
14
16
18
19
20
60
Figura A2. Compuestos 11 a 20 de la cavidad I.
11
13
12
15
17
14
16
18
19
20