INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR
Caracterizacin molecular de la poli (A) polimerasa (EhPAP) en
Entamoeba histolytica
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
P R E S E N T A
JESSICA MARIA GARCIA VIVAS
MXICO, D.F., FEBRERO DEL 2006.
2
3
4
NDICE
LISTA DE ABREVIATURAS i
LISTA DE FIGURAS iv
LISTA DE TABLAS vi
RESUMEN vii
ABSTRACT viii
1. INTRODUCCIN 1
1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis 1
1.2 Taxonoma de E. histolytica 3
1.3 Ciclo de vida de E. histolytica 5
1.4 Epidemiologa de la amibiasis 7
2. ANTECEDENTES 9
2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en
eucariontes 9
2.2 Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes 10
2.2.1 Capping del pre-RNAm 11
2.2.2 Splicing del pre-RNAm 12
2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm 14
2.3 Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y
poliadenilacin 16
2.4 Maquinaria de corte y poliadenilacin 20
2.4.1 Factor de especificidad del corte poliadenilacin (CPSF) 20
5
2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF) 21
2.4.3 Factores de Corte (CFlm y CFllm) 21
2.4.4 oli (A) polimerasa (PAP) 22
2.4.5 rotena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II) 22
2.4.6 Protenas adicionales 22
2.5 Mecanismo de corte y poliadenilacin 23
2.5.1 Corte del pre-RNAm 24
2.5.2 Poliadenilacin 26
2.6 Readenilacin citoplsmica 28
2.7 Importancia de la cola de poli (A) del RNAm 30
2.8 Poli(A) polimerasa en eucariontes 31
2.8.1 Generalidades 31
2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del RNAm 35
2.9 Poli (A) polimerasa en el ciclo celular 36
2.9.1 Generalidades del ciclo celular 36
2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular 38
2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular 39
2.10 Identificacin de las posibles secuencias en cis y
el procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 41
2.10.1 Identificacin de protenas involucradas en el
procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 44
2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de
resistencia a mltiples frmacos 46
3 JUSTIFICACION 48
6
4 OBJETIVOS 49
4.1 Objetivo general 49
4.2 Objetivos especficos 49
5 MATERIALES Y METODOS 50
5.1 Estrategia Experimental 50
5.2 Anlisis in silico de la secuencia del gen EhPap 50
5.3 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A 52
5.3.1 Restriccin enzimtica 53
5.3.2 Ligacin 56
5.3.3 Preparacin de bacterias competentes 56
5.3.4 Transformacin de bacterias por choque trmico 57
5.3.5 Mini-preparacin de DNA plasmdico 58
5.4 Expresin de la protena EhPAP recombinante 59
5.5 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 61
5.6 Purificacin de la protena EhPAP recombinante 62
5.7 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante 63
5.8 Inmunizacin de ratones para obtener anticuerpos 64
5.9 Cultivo de trofozotos 66
5.10 Obtencin de extractos nucleares y citoplsmicos de la clona A 66
5.11 Ensayos de Western blot 67
5.12 Sicronizacin de trofozoitos de la clona L-6 69
5.13 Obtencin del RNA total de los trofozoitos sincronizados 69
5.14 Ensayo de RT-PCR semi-cuantitativa 70
6 RESULTADOS 73
7
6.1 Anlisis in silico: La EhPAP es una protena evolutivamente
conservada 73
6.2 Subclonacin del gen EhPap en el vector pRSET-A 81
6.2.1 Restriccin enzimtica 81
6.2.2 Ligacin 84
6.2.3 Anlisis de clonas y mini-preparaciones de DNA 87
6.3 Expresin de la protena EhPAP recombinante 90
6.4 Purificacin de la protena EhPAP recombinante 92
6.5 Electroelucin de la protena EhPAP recombinante 95
6.6 Inmunizacin de ratones para la obtencin de anticuerpos 95
6.7 Localizacin subcelular de la EhPAP 96
6.8 La expresin de EhPAP aument en la fase G1 y S
del ciclo celular 97
7 DISCUSION 101
8 CONCLUSIONES 106
9 BIBLIOGRAFIA 108
8
LISTA DE ABREVIATURAS
3 UTR regin 3 no traducida
5 UTR regin 5 no traducida
aa aminocidos
ATP trifosfato de adenosina
cdk cinasa dependiente de ciclina
cDNA cido desoxirribonucleico complementario
CTD Dominio carboxi terminal de la RNA polimerasa II
CF I m Factor de corte I de mamfero
CF II m Factor de corte II de mamfero
CPSF Factor de especificidad de corte y poliadenilacin
CstF Factor estimulante del corte
DEPC dietilpirocarbonato
DNA cido desoxirribonucleico
DSE Elemento o secuencia ro abajo
DTT ditiotreitol
dNTPs didesoxinucletidos trifosfatados
dT didesoxitimidina
EhPap gen codificante de la protena EhPAP
EhPgp5 gen codificante de la protena EhPGP5
EDTA cido etilen diamino tetra-actico
EC extractos citoplsmicos
EN extractos nucleares
9
FIP 1 factor de interaccin con la protena PAP
G1 fase de la mitosis, intervalo 1
G2 fase de la mitosis, intervalo 2
GT enzima guanililtransferasa
kb kilobases
kDa kiloDaltones
LB medio de cultivo para bacterias Luria-Bertani
M fase de la mitosis, mitosis
MDR resistencia a mltiples drogas
g microgramos
l microlitros
M micromolar
ml mililitros
mM milimolar
MT enzima metiltransferasa
nt nucletidos
OMS Organizacin Mundial de la Salud
PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida
PAP poli (A) polimerasa
PAPB protena de unin al tracto de poli (A)
pb pares de bases
PBS solucin salina amortiguadora de fosfatos (NaCl, KCl, Na2PO4,
KH2PO4)
PCR reaccin en cadena de la polimerasa
10
pre-RNAm cido ribonucleico mensajero precursor
rpm revoluciones por minuto
RNA cido ribonucleico
RNAm cido ribonucleico mensajero
RNA poli (A+) cido ribonucleico mensajero poliadenilado
RNA poli (A-) cido ribonucleico mensajero no poliadenilado
RNApol II RNA polimerasa II
RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea
RT transcripcin reversa
RTP enzima RNA 5 trifosfatasa
S fase de la mitosis, sntesis
TAE solucin amortiguadora (Tris, cido actico glacial y EDTA)
TBE solucin amortiguadora (Tris, cido brico y EDTA)
U1 RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 1
U2 RNPsn ribonucleoprotena nuclear pequea rica en uridina 2
U2AF factor auxiliar de U2 RNPsn
USE secuencia localizada ro arriba
xg gravedades
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica 8
Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias
conservadas en los intrones 13
Figura 3. Proceso de eliminacin de intrones o splicing 15
Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que
participan en el corte y poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos
y levaduras 19
Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores
involucrados en la reaccin de corte del pre-RNAm en mamferos 25
Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas
que participan en la reaccin de poliadenilacin 27
Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de
humano (PAP II) 32
Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina
de la poli(A) polimerasa de bovino 33
Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin 40
Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8
secuencias genmicas (gDNA) y de cDNA de diferentes genes
de E. histolytica 42
Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del
procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica 43
Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del
12
extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica 47
Figura 13. Estrategia experimental 51
Figura 14. Esquema del vector pRSET 54
Figura 15. Secuencia de la EhPAP obtenida del banco de datos 74
Figura 16. Blast realizado tomando como referencia la
secuencia de EhPAP 76
Figura 17. Alineamiento mltiple de EhPAP con PAP de H. sapiens y PAP1 de S. cerevisiae 79
Figura 18. Representacin esquemtica de la estructura molecular
de PAPs de diferentes organismos incluyendo la EhPAP de
E. histolytica 80
Figura 19. rbol filogentico sin raz de las PAPs de diferentes
organismos 82
Figura 20. Comparacin de la estructura tridimensional de la
EhPAP y la PAP de bovino 83
Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los
productos de la restriccin enzimtica del vector pRSET-A y
TA-EhPap 85
Figura 22. Purificacin del vector pRSET y el gen EhPap 86
Figura 23. Restriccin enzimtica de minipreps de 9 clonas
correspondientes a la ligacin de pRSET-EhPap 88
Figura 24. Electroferograma de la secuencia del gen
EhPap clonado en el vector pRSET 89
13
Figura 25. Expresin de la protena recombinante EhPAP 91
Figura 26. Purificacin de la protena recombinante EhPAP 93
Figura 27. Inmunodeteccin de la protena recombinante
EhPAPr purificada 94
Figura 28. Ensayo de Western blot con el anticuerpo especfico
anti-EhPAP 98
Figura 29. Anlisis de la expresin del RNAm del gen EhPap en
trofozotos de la clona L6 sincronizados en el ciclo celular 100
14
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica 4
Tabla 2. Tabla comparativa de los factores que participan en
el procesamiento del extremo 3 de E. histolytica, H. sapiens
y S. cerevisiae 45
Tabla 3. Comparacin de EhPAP con otras PAPs de eucariontes 77
15
RESUMEN
En eucariontes, la poliadenilacin del extremo terminal 3 del pre-RNAm es esencial
para el transporte, estabilidad y traduccin del RNAm. Se identific y se clon el gen
que codifica para la protena poli(A) polimerasa nuclear (EhPAP) en Entamoeba
histolytica. Mediante un alineamiento de secuencias de distintas PAPs de otros
eucariontes se demostr que EhPAP contiene una regin de unin al RNA y un dominio
cataltico central descritos en otras PAPs nucleares pertenecientes a la familia de las
nucleotidil transferasas. La EhPAP recombinante expresada en bacterias se us para
generar anticuerpos especficos, los cuales reconocieron dos isoformas de la EhPAP de
60 y 63 kDa en extractos nucleares y citoplsmicos en ensayos de Western blot. Por
ensayos de RT-PCR de la expresin el RNAm gen EhPap en las fases del ciclo celular
se observ un incremento en las fases G1 y S.
16
ABSTRACT
In eukaryotes, polyadenylation of pre-mRNA 3 end is essential for mRNA export,
stability and translation. Here we identified and cloned a gene codifying for putative
nuclear poly(A) polymerase (EhPAP) in Entamoeba histolytica. Protein sequence
alignments with eukaryotic PAPs showed that EhPAP has the RNA-binding region and
the PAP central domain with the catalytic nucleotidyl transferase domain described for
the other nuclear PAPs. Recombinant EhPAP expressed in bacteria was used to
generate specific antibodies, which recognized two EhPAP isoforms of 60 and 63 kDa in
nuclear and cytoplasmic extracts by Western blot assay. RT-PCR assay showed that
EhPap mRNA expression is about 10- and 7-fold increased in G1 and S phase,
respectively, through cell cycle progression.
17
1. INTRODUCCIN
1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis
El trmino amiba proviene del griego amoibe que significa cambio (morfologa y
gran movilidad), de ah el nombre de la enfermedad conocida como amibiasis. La
amibiasis humana es una infeccin del tracto gastrointestinal producida por el parsito
protozoario Entamoeba histolytica al ser ingerido en agua o alimentos contaminados por
heces fecales (Schaudinn, 1903). Desde el siglo XVIII se consider una enfermedad
tropical, sin embargo, actualmente se sabe que es una enfermedad distribuida
mundialmente con predominio en las ciudades con grandes concentraciones humanas y
que ataca fundamentalmente a grupos con desnutricin y deficientes prcticas de
higiene.
El descubrimiento y la descripcin inicial de la amibiasis la dio el mdico ruso
Fedor Lsch en 1873 (Kean, 1978), quien sugiri que exista una relacin entre la
presencia de E. histolytica y la amibiasis al tratar a un paciente en San Petersburgo. Sin
embargo, al infectar a un perro con el parsito obtenido del paciente, no logr
reproducir la enfermedad en el animal y no pudo demostrar la relacin entre el parsito
y la patologa. No es hasta 1891, cuando Councilman y La Fleur, describieron la
evidencia clnica y patolgica de la asociacin de E. histolytica con la disentera y el
absceso heptico en humanos (Councilman, 1891). En 1893, Quincke y Roos
describieron al parsito en su forma de quiste (Kean, 1978). Posteriormente Walter y
Sellards (1913) determinaron que: 1) la transmisin de la enfermedad se da por los
quistes no por los trofozotos, 2) los portadores asintomticos son los reservorios y
18
probablemente los responsables de la transmisin, 3) existe un grupo de individuos de
riesgo, y 4) existen diferencias de virulencia en los parsitos.
En Mxico, existen registros de la enfermedad desde 1611 cuando fue relatada
por Fernndez del Castillo al efectuar la autopsia de Fray Garca Guerra, arzobispo y
virrey, quien falleci a dos aos de su llegada a la Nueva Espaa de una enfermedad
descrita como flaqueza de nimo, congoja y calores y en la cual, se encontr un
absceso heptico (Fournier, 1956).
En 1925 Emile Brumpt sugiri que haba dos especies: una capaz de causar
enfermedad invasora, E. histolytica, y otra que nunca causa enfermedad, a la que l
llam Entamoeba dispar. La hiptesis de Brumpt no fue reconocida por otros
investigadores en su momento. En la dcada de los 70s se empezaron a acumular
observaciones que apoyaban a la hiptesis de Brumpt de la existencia de dos
organismos distintos en lo que se conoca como E. histolytica. Se continuaron
acumulando datos bioqumicos, inmunolgicos y genticos y en 1993 se public una
redescripcin formal de E. histolytica, separndola de E. dispar (Diamond-Clark, 1993).
Adems, con base a la informacin gentica obtenida de los bancos de datos, se ha
confirmado que son especies diferentes (Britten y col., 1997; Nunez y col., 2001;
Blessmann y col., 2001).
19
1.2 Taxonoma de E. histolytica
E. histolytica es un parsito protozoario, el cual pertenece a los Rhizopodos que
son organismos que tienen como caracterstica formar pseudpodos en alguna etapa
de su vida y a los Entamoebidae, cuyos miembros son parsitos (Tabla 1). Es una de
las seis diferentes especies de Entamoeba conocidas que infectan al hombre las cuales
son: E. coli, E. gingivalis, E moshkovskii, E. hartmanni, E. polecki y E. histolytica
(Bruckner, 1992).
E. histolytica es un parsito protista del intestino humano, caracterizado por su
estructura celular simple y metabolismo primitivo. Estudios basados en la estructura, el
metabolismo, la organizacin del DNA y RNA, as como la carencia de mitocondria,
aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso y citoesqueleto microtubular (Martnez-
Palomo, 1986), sugieren que es uno de los eucariontes ms primitivos, o
protoeucariontes (Bakker-Grunwald y Wostman, 1993). Presenta cromosomas que no
estn condensados, con variaciones en tamaos que dificultan el poder determinar el
nmero exacto de stos (Loftus 2005). Es considerada como una reliquia viviente de la
fase temprana de la evolucin de los eucariontes, la cual ocurri antes de que la
simbiosis promitocondrial surgiera, aunque la existencia o ausencia de mitocondrias en
E. histolytica sigue siendo un tema de debate, ya que no contiene una mitocondria con
estructura y forma caracterstica o enzimas tpicas del metabolismo energtico.
20
Reino:
Subreino:
Phylum:
Superclase:
Clase:
Subclase:
Orden:
Suborden:
Familia:
Gnero:
Especie:
Protista
Protozoo
Sarcomastigophora
Rhizopoda
Lobosea
Gymnamoebida
Amoebida
Tubulina
Entamoebidae
Entamoeba
histolytica
Tabla 1. Clasificacin taxonmica de E. histolytica
Fuente: Levine et al., 1980
21
Se han descrito tres genes en el genoma nuclear de E. histolytica que codifican
para tres protenas asociadas tpicamente a la mitocondria en otros eucariontes,
aunque estructuralmente parece carecer de ella. La chaperonina 60 (cpn 60 Hsp 60),
es exclusiva de mitocondria, hidrogenosomas y cloroplastos (Clark y Rogers, 1995); la
nucletido piridina (NAD/NADP) transhidrogenasa (PNT: pyridine nucleotde
transhydrogenase, por sus siglas en ingls), que es una protena de tipo mitocondrial,
junto con la enzima metablica, piruvato: ferrodoxin-oxidoreuctasa (POR) (Huber y
col.,,1988); y la alcohol dehidrogenasas ADH1, ADHE, ADH3 (Yang, 1994). Adems,
diferentes grupos de investigacin, han identificado una serie de pequeos organelos a
los cuales han llamado mitosoma, crypton (Tovar y col., 1999, Mai y col., 1999, Ghosh y
col., 2000) o Ehko (Orozco y col., 1997, Marchat y col., 2002), los cuales contienen DNA
y/o protenas especficas que comparten con algunas caractersticas biolgicas de la
mitocondria. La razn por la que se considera a este organelo una mitocondria
remanente, se ha predicho por la deteccin de los genes de las protenas
mencionadas que tienen como blanco la mitocondria en otros eucariontes (Ghosh y col.,
2000).
1.3 Ciclo de vida de la amiba
E. histolytica presenta diferentes fases o estados en su ciclo de vida: trofozoto,
prequiste, quiste, metaquiste y trofozoto metaqustico (Dobell, 1928), entre los cuales
los ms importantes en la transmisin de la infeccin son el quiste y el trofozoto. La
infeccin se adquiere por la ingestin de comida o agua contaminada con quistes de E.
histolytica provenientes de las heces fecales de humano y por contacto directo oral-
22
fecal. La transmisin de E. histolytica u otros parsitos por agua contaminada es muy
comn en pases de tercer mundo, donde la mayor parte del agua potable no es
tratada. El uso de heces fecales como abono o fertilizantes tambin es una fuente
importante de infeccin (Markell, 1986).
El quiste maduro tiene cuatro ncleos (tetranucleado) (Gathiram, 1990), es
inmvil, esfrico (8.5-19 m de dimetro) y resistente a cambios ambientales y a los jugos gstricos, puede permanecer viable durante tres meses en el agua o alimentos.
Sin embargo, puede ser eliminado por hipercloracin o iodinacin (Kahn, 1975). Al
entrar en el tracto digestivo, se desenquista en el intestino delgado transformndose en
metaquiste, el cual duplica sus ncleos (ocho ncleos) formando as los trofozotos
metaqusticos que miden 8 m de dimetro (Martnez-Palomo, 1982). Estos se alimentan y crecen hasta transformarse en trofozotos maduros (12-60 m) que se establecen en el colon, donde se adhieren a la mucosa intestinal y se alimentan de
bacterias y restos celulares (Walsh, 1986). Los trofozotos presentan gran motilidad, son
hialinos, forman pseudpodos y son muy sensibles a cambios ambientales.
Los trofozotos, una vez en el intestino delgado, pueden tener diferentes destinos
los cuales podran estar relacionados por malos hbitos alimenticios, el alcoholismo, el
uso de esteroides y problemas del sistema inmune. Por lo tanto: 1) pueden habitar el
intestino grueso como comensal, dividirse y alimentarse de desechos orgnicos,
azcares y bacterias; 2) pueden invadir la mucosa intestinal produciendo disentera
amibiana aguda (con una duracin de 14 das) o crnica (ms de 15 das); 3) tambin
23
pueden causar colitis amibiana fulminante o amibiasis extraintestinal caracterizada por
la invasin del hgado y la formacin de abscesos hepticos principalmente, o bien la
invasin de otros rganos como son: piel, pulmn y el corazn; 4) o bien, los trofozotos
pueden enquistarse, en un proceso aparente estimulado por condiciones luminales no
ideales para los trofozotos, aqu el trofozoto reduce su tamao y compacta su DNA en
un solo ncleo (uninuclear) formando al prequiste, el cual realiza una divisin nuclear
hasta formar nuevamente los cuatro ncleos del quiste que ser eliminado con las
heces. La infeccin de un nuevo individuo puede producirse con tan slo un quiste en
el agua o alimentos contaminados (Fig. 1). Con inculos ms grandes el periodo de
incubacin puede acortarse en unos pocos das en vez de 1-2 semanas. Los trofozotos
que son excretados durante los perodos de colitis aguda no transmiten la infeccin, ya
que se desintegran rpidamente en el medio ambiente (Dobell, 1928; Lushbaugh y
Millar, 1988).
1.4 Epidemiologa de la amibiasis
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), la amibiasis es la 4 causa de
muerte a nivel mundial producida por un parsito, despus de la malaria, la enfermedad
de Chagas y la leishmaniasis; y es la 3 causa de morbilidad por un parsito despus
de la malaria y tricomoniasis (Espinosa-Cantellano y col., 2000)
La amibiasis es considerada un problema de salud pblica ya que entre el 10-12
% de la poblacin mundial (500 millones) es portadora de trofozotos de E. histolytica y
24
Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica. El proceso inicia cuando E. histolytica es
eliminada en forma de quistes en las heces fecales (1), que contaminan agua o
alimentos y son ingeridos por va oral por otro husped (2). Se desenquistan en el
intestino delgado (3) formando los trofozotos, que migran al intestino grueso (4), los
cuales se alojan en ste. (A) El individuo puede permanecer asintomtico, y se pueden
producir desde sntomas leves hasta disentera grave, o invadir otros rganos, tales
como el hgado, pulmn o cerebro (C).
25
Etapa infectiva
Etapa diagnstica
Ingesta de quistes maduros
Excrecin en heces fecales
Colonizacin no invasiva
Enfermedad intestinal
Enfermedad extraintestinal
Multiplicacin
Trofozotos
TrofozotosDesenquistamiento
Quiste
Salida del husped
26
el 10% de sta (50 millones) sufre la enfermedad, la letalidad por complicaciones se
estima entre el 0.1 y 0.25% (70-100,000 muertes) al ao (OMS, 1998). En Mxico, el
8.4% de la poblacin es seropositivo para la deteccin de antgenos de E. histolytica y
un 1.1 % de stos present abscesos hepticos entre 1999-2000
(http://www.ssa.gob.mx).
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en eucariontes
En todos los seres vivos, la regulacin de la expresin gnica es de gran
importancia ya que de esta depende el buen funcionamiento del organismo. Con los
recientes anlisis de genomas de diferentes organismos, principalmente en eucariontes,
se ha observado que slo una pequea fraccin del material gentico,
aproximadamente el 1.5%, codifica para protenas, mientras que la mayor parte del
DNA genmico participa en la regulacin de la expresin gentica (Mignone, 2002). La
informacin gentica se encuentra contenida en el DNA nuclear y mitocondrial, la cual
se traduce a protenas por medio del RNAm, que es el encargado de llevar la
informacin contenida en el DNA, hacia afuera del ncleo. Es en este proceso en donde
se encuentran diversos niveles o puntos de control que regulan la expresin gentica.
En eucariontes, los principales puntos de control se dan a nivel de: i) la transcripcin,
que permite la sntesis del pre-RNAm (transcrito primario) a partir del DNA por medio de
la RNA polimerasa II (RNA pol II) y otros factores de transcripcin; ii) el procesamiento
del pre-RNAm, por medio del cual se genera un RNAm maduro funcional que pueda ser
traducido a protena; en este procesamiento se incluye principalmente el capping, el
27
splicing y la reaccin de corte/poliadenilacin del extremo 3; y iii) la traduccin, que
consiste en la sntesis de una protena funcional a partir del RNAm, incluyendo posibles
modificaciones post-traduccionales (Day y Tuite, 1998). En este trabajo nos
enfocaremos en los mecanismos moleculares del procesamiento del pre-RNAm.
2.2 Procesamiento del pre-RNAm en eucariontes
En eucariontes, el hecho de obtener una copia de la informacin gentica del
DNA para generar un transcrito no significa que se ha completado la sntesis del RNA
mensajero maduro, sino que se obtiene un pre-RNAm el cual requiere de un
procesamiento nuclear para poder ser funcional.
El pre-RNAm, presenta una estructura tripartita que consiste en una regin 5 no
traducida (5 untranslated region: 5UTR por sus siglas en ingls) la cual tiene un rango
de longitud de 100 a 200 nucletidos (nt) y es rica en G y U; una regin codificante que
est constituida por exones que codifican para aminocidos e intrones no codificantes
que son eliminados en el proceso de splicing; y una regin 3 no traducida (3UTR),
cuya longitud es muy variable ya que puede ser de 200 nt en plantas y hongos, a 800 nt
en humanos y otros vertebrados (Mignone, 2002). El procesamiento del pre-RNAm se
lleva a cabo en el ncleo (Dreyfus, 2002) y requiere de varios eventos moleculares, los
cuales estn ligados entre s y pueden influenciarse uno a otro en especificidad y
eficiencia, adems de estar intimamente ligadas a la transcripcin, es por eso que
actualmente se conoce que la mayora de las reacciones de este procesamiento
ocurren co-transcripcionalmente (Proudfoot 2002).
28
2.2.1 Capping del pre-RNAm
La formacin de un capuchn, o estructura cap (capping en ingls), en el
extremo 5 protege el RNAm de la degradacin exonucletica en direccin 5 3 (Furuichi, 1997) y desempea un papel importante en el inicio de la traduccin (Shatkin,
1976). Este capuchn consiste en una guanosina metilada en la posicin 7 localizada
en el primer ribonucletido de la cadena de RNA en el extremo 5 del RNAm por medio
de una unin 5-5 trifosfato, y se conoce como m7G(5)ppp(5)N (donde N representa el
primer nucletido) o simplemente m7G (Day y Tuiter, 1998). La reaccin se lleva a cabo
por la enzima formadora del capuchn o guanililtransferasa (GT) asociada al dominio
carboxi-terminal (CTD) fosforilado de la RNA pol II. Este proceso se inicia en el extremo
5 del pre-RNAm el cual posee un trifosfato derivado del primer trifosfato del nucleido
incorporado en el sitio de inicio de la sntesis del transcrito. La enzima RNA 5
trifosfatasa (RTP: RNA 5 triphosphatase por su siglas en ingls) elimina el ltimo
fosfato (fosfato ), dejando un difosfato en el extremo 5, mientras que la GT transfiere un GMP del GTP al difosfato, dejando el extremo 5 de la guanosina frente al extremo 5
de la cadena de RNA, formando as el puente 5-5 trifosfato de guanosina. El extremo
terminal de la guanosina se metila en la posicin 7 de la guanina por medio de la
enzima metiltransferasa (MT), mientras que el segundo nucletido del lado interno del
puente de trifosfato se metila en la posicin 2 de la ribosa (Cho y col., 1988; Proudfoot
2002). La estructura cap inicial es reconocida por el complejo de unin al cap o CBC
(cap binding complex, por sus siglas en ingls), el cual est formado por las protenas:
CBP20 y CBP80, que estimulan el paso del RNAm a travs del poro nuclear para ser
exportado al citoplasma. Ya en el citosol, CBP20 y CBP80 son remplazadas por el
29
factor citoplsmico de inicio de la traduccin eIF-4E (Shatkin y Manley, 2000). La
estructura cap es importante en la regulacin de la expresin gnica, debido a que los
RNAm sin esta estructura presentan una traduccin deficiente adems de que el RNA
es menos estable (Horikami y col., 1984).
2.2.2 Splicing del pre RNAm
El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son removidos del pre-
RNAm para dejar slo la regin codificante (exones). En eucariontes, este proceso se
inicia con el reconocimiento de tres secuencias en el intrn, las cuales son altamente
conservadas en los pre-RNAm de los eucariontes: el dinucletido GU en el extremo 5;
el dinucletido AG en el extremo 3 del intrn y el sitio de ramificacin interno cercano al
extermo 3, el cual est prximo a un sitio rico en pirimidinas (Fig. 2). La protena U1
RNPsn (ribonucleoprotena pequea nuclear, rica en Uridina) se une a la secuencia GU
en el 5 del intrn, mientras que la protena U2 RNPsn, reconoce el sitio de ramificacin
que se encuentra previo a una secuencia rica en pirimidinas, ro arriba de la secuencia
AG del extremo 3 del intrn, a la cual se une dejando una adenina invariable libre que
posteriormente participa en el proceso de eliminacin del intrn. Se reclutan otras tres
protenas RNPsn: U4, U6 y U5, que interactan con U1 y U2. U6 es una ribozima y es la
encargada de realizar el corte en el extremo 5 del intrn, el cual al ser liberado, se une
a la adenina que qued libre en el sitio de ramificacin, formando una estructura en
forma de lazo del intrn. U5 acerca los extremos de los dos exones para unirlos,
mientras que U6 corta el extremo 3 del intrn el cual es liberado junto con los dems
componentes. U4 no interacciona directamente con el pre-RNAm pero su funcin
30
Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra las secuencias conservadas de los
intrones. Se observan los dinucletidos conservados en los extremos 5 y 3 del intrn,
GU y AG respectivamente, adems del sitio de ramificacin, as como la frecuencia de
cada nucletido en una posicin especfica y la distancia aproximada entre los sitios de
ramificacin y de splicing 3.
31
pre-RNAm
Frecuencia (%)
Sitio de ramificacinSitio de splicing 5 Sitio de splicing 3
Regin rica en Py(~15b)
32
principal es reclutar a U5 y U6 para llevarlos al sitio de accin. En eucariontes
superiores, se identific tambin la protena U2AF (U2 snRNP auxiliary factor por sus
siglas en ingls) que reconoce a una secuencia rica en pirimidinas en el intrn y se une
a esta, facilitando la unin de U2 al pre-RNAm (Fig. 3). En conjunto las snRNPs y otras
protenas accesorias forman el spliceosoma que constituye la maquinaria de splicing
nuclear.
En el splicing, se ha demostrado que no slo participan las protenas RNPsn,
sino tambin otras protenas como RNA helicasas y protenas involucradas en el
procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm como veremos ms adelante (Li, 2001;
Vagner, 2000; Evans, 2001, Garca- Blanco, 2003)
2.2.3 Corte y poliadenilacin del pre-RNAm
El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm incluye el corte y la adicin de un
tracto de 100-250 residuos de adeninas (tracto o cola de poli (A)), en el lugar donde se
realiz el corte endonucleoltico del transcrito primario. Una vez que el RNAm est
poliadenilado, es maduro o funcional y est listo para ser transportado al citoplasma
para ser traducido por los ribosomas, los cuales son los encargados de sintetizar la
protena codificada por el RNAm (Wahle, 1995; Colgan, 1997; Mignone, 2002)
Las UTRs tienen un papel muy importante en la regulacin post-transcripcional
de la expresin gentica. Ambas (5 y 3 UTR) tienen funciones importantes ya que
participan en el transporte del RNAm maduro del ncleo al citoplasma, La 5 UTR
33
Figura 3. Proceso de eliminacin de intrnes o splicing. Las ribonucleoprotenas U1 y
U2 reconocen al dinucletido GU y a la adenina presente en el sitio de ramificacin,
respectivamente. Posteriormente se reclutan U4, U5 y U6. U6 realiza el corte del
extremo 5 del intrn y se forma un lazo. Esta misma ribonucleoprotena corta el
extremo 3 del intrn mientras que U5 que funciona como ligasa uniendo los dos
exones.
34
Producto ligado RNAm
35
participa en el inicio de la traduccin, mientras que la 3 UTR participa el control de la
localizacin subcelular, en la estabilidad, as como en la eficiencia de la traduccin del
RNAm (Mignone, 2002). Esto se debe a la interaccin de la 3 UTR con protenas
especficas de unin al RNA, tanto en ncleo como en citoplasma (Kataoka y col.,
2000). A continuacin se describen las secuencias, factores y eventos moleculares del
procesamiento de la 3 UTR en eucariontes.
2.3 Secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y poliadenilacin
del pre-RNAm
El procesamiento de la 3UTR del pre-RNAm, requiere de secuencias cis-
reguladoras, las cuales se han estudiado ampliamente en eucariontes superiores (Zhao,
1999; Colgan, 1997; Wahle, 1995; Wahle 1999) y estas incluyen:
1. La seal de poliadenilacin, formada por el hexanucletido AAUAAA, la cual se
localiza de 10-30 nt ro arriba al sitio de corte/poliadenilacin. Es una secuencia
consenso y uno de los elementos ms conservados en mamferos, la cual se
encontr en un 90% de todos los pre-RNAm. En el 10% restante, cambia esta
secuencia en una sola base A U, dando la variante ms comn: AUUAAA, la
cual tambin acta como seal de poliadenilacin. Estudios realizados con
mutaciones en esta seal y sus variantes, concluyen que esta secuencia es
esencial tanto para el proceso de corte como para la adicin de la cola de poli
(A), ya que al mutarla se inhibe el proceso de poliadenilacin (Zhao, 1999).
36
2. El sitio de poliadenilacin o de corte que se encuentra de 10 a 30 nt ro abajo de
la seal de poliadenilacin. La secuencia que rodea al sitio de corte no es
conservada aunque en un 70% de los mRNA de vertebrados, se encuentra una
adenosina al extremo final del sitio de corte nucleoltico. El penltimo nucletido
ms frecuente antes del corte es normalmente una C, por lo que el dinucletido
CA define el sitio de poliadenilacin en la mayora de los genes (Zhao y col.,
1999).
3. El elemento ro abajo (DSE: down stream element por sus siglas en ingls), rico
en GU/U, est localizado de 20-40 nt ro abajo del sitio de corte. Esta secuencia
slo est presente en un 70% de los pre-RNAm de mamferos. Este elemento no
es tan conservado y puede ser de dos tipos: un elemento rico en U y un
elemento rico en GU. El elemento rico en U es una cadena corta de residuos de
U, mientras que el elemento rico en GU tiene el consenso YGUGUUYY (Y =
pirimidina). Esta secuencia DSE puede tener slo uno de estos elementos, o
ambos, que en este caso trabajan juntos sinrgicamente. Sin embargo, algunos
elementos ro abajo no contienen ninguno de estos dos motivos. Mutaciones
puntuales en cualquiera de estos elementos no alteran su funcin, sin embargo,
si se pierden grandes fragmentos de esta secuencia, se puede inhibir su funcin
al no ser identificada por los factores de procesamiento del 3 terminal. La
proximidad de estas secuencias ro abajo del sitio de poliadenilacin pueden
afectar la posicin del sitio de corte y la eficiencia del mismo.
37
4. El elemento ro arriba (USE: upstream element, por sus siglas en ingls) de la
seal de poliadenilacin es una secuencia rica en U que participa en el corte del
extremo 3 del pre-RNAm en el ncleo, y tambin puede ser identificada como
CPE (cytoplasmic polyadenylation element), la cual participa en la readenilacin
citoplsmica del RNAm como veremos ms adelante (Fig. 4A).
En levadura se han descrito secuencias homlogas a las secuencias
identificadas en eucariontes superiores, con algunas diferencias que radican tanto en la
organizacin molecular como en la secuencia propiamente dicha. Las secuencias cis-
reguladoras de los pre-RNAm de levaduras son menos conservadas que en eucariontes
superiores (Fig. 4B). Al menos tres seales son necesarias para realizar el
procesamiento en el extremo 3 en S. cerevisiae (Zhao y col., 1999):
1. Un elemento posicionador (PE: Position element, por sus siglas en ingls) rico
en A que funciona como la seal de poliadenilacin representada por la
secuencia AAUAAA, la cual puede ser no conservada y presentar una
variante que es AAAAAA y se localiza de 10 a 30 nt ro arriba del sitio de
corte. Slo un 50% de todos los RNAm la presentan (Wahle y Seller, 1992)
2. El sitio de corte o poliadenilacin, que generalmente corresponde al
dinucletido AA.
3. El elemento de eficiencia (EE) el cual se encuentra ro arriba del elemento
posicionador, es rico en UA y su funcin es activar al elemento posicionador.
4. No se ha identificado el dominio DSE rico en GU.
38
Figura 4. Comparacin de las secuencias cis-reguladoras que participan en el corte y
poliadenilacin del pre-RNAm de mamferos y levaduras. USE: Elemento ro arriba por
sus siglas en ingles: Upstream element; SP: Seal de poliadenilacin, DSE: Elemento
ro abajo, por sus siglas en ingls: Downstream element. EE: Elemento eficiente, PE:
Elemento Posicionador.
39
S. cerevisiae
Mamferos
USE SP Sitio Poli(A) DSE
U-rica AAUAAA CA U/GU-rica
30 nt10-30 nt
STOP
Sitio Poli(A)PEEE
UAUAUA AAUAAA Py(A)n
AAAAAA
10-30 nt
STOP
3 UTR
3 UTR
40
2.4 Maquinaria de corte y poliadenilacin
El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm se puede dividir en dos eventos
principales que son el corte y la poliadenilacin, en donde participan diversas protenas
las cuales pueden intervenir simultneamente en uno o ambos eventos. El corte y la
poliadenilacin son dos procesos que se llevan a cabo con espacios de separacin de
tiempo muy cortos in vivo, pero pueden dividirse ampliamente para su estudio in vitro. A
continuacin, se describen las protenas involucradas en este procesamiento en
eucariontes superiores.
2.4.1 Factor de especificidad del cortepoliadenilacin (CPSF)
El complejo CPSF, (Cleavage/polyadenylation specificity factor CPSF, por sus
siglas en ingls), pesa 360 kDa y est constituido por cuatro subunidades de 30, 73,
100 y 160 kDa. Participa tanto en el corte como en la poliadenilacin, reconoce la seal
de poliadenilacin en el RNA y se une a sta por la subunidad de 160 kDa (Jenny y col.,
1994; Colgan y col., 1997; Wahle y col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y
col., 2004). Se ha reportado que la protena Fip1 de humano (o factor interacting with
PAP, en ingls), es otra subunidad del complejo CPSF. Se une al elemento USE rico en
U (que se encuentra ro arriba de la seal de poliadenilacin) y acta junto con el
CPSF-160, en reconocer la seal de poliadenilacin y reclutar a la poli (A) polimerasa
(Poly (A) polymerase o PAP por sus siglas en ingls) hacia el sustrato de RNA
(Kaufman y col., 2004)
41
2.4.2 Factor de estimulacin de corte (CstF)
El complejo CstF (Cleavage stimulation factor CstF por sus siglas en ingls), es
una protena heterotrimrica formada por tres subunidades de 77, 64 y 50 kDa. La
subunidad de 64 kDa reconoce e interacta con la secuencia DSE rica en GU/U que se
encuentra ro abajo del sitio de corte y la subunidad 77 kDa interacta con el complejo
CPSF estabilizando el complejo ternario CPSF-CstF-RNA (Colgan y col., 1997; Wahle y
col., 1999; Zhao y col., 1999; Li y col., 2001; Ryan y col., 2004). Existen reportes que
demuestran que CstF-64 tambin participa en el proceso de splicing en Caenorhabditis
elegans (Evans y col., 2001)
2.4.3 Factores de Corte (CFIm y CFIIm)
Existen dos complejos de corte (Cleavage Factor o CF, por sus siglas en ingls),
los cuales son los principales responsables de la reaccin de corte. El CFIm est
formado por cuatro subunidades de 25, 59, 68 y 72 kDa, de las cuales se sabe que los
polipptidos 25 kDa y 68 kDa participan en la reaccin de corte. La subunidad de 25
kDa se une al RNA cerca del sitio de corte e interacta con la subunidad CFIm-68, PAP
y la protena de unin a la Poli (A) (PABP II: poly(A) binding protein II, por sus siglas en
ingls) (Dettwiler 2004). La funcin exacta del CFIIm no se reconoce, pero se sabe que
est formado por dos protenas denominadas CIP 1 y Pcf II, que se reclutan y participan
en el corte del extremo 3 (Wahle y col., 1999). CIP 1 interacta con CFIm-25 y CPSF-
100 (Vries y col., 2000). Los factores CFIm y CFIIm tienen una actividad de
endonucleasa, al igual que el factor CPSF-73 (Ryan y col., 2004)
42
2.4.4 Poli (A) polimerasa (PAP)
La Poli (A) polimerasa es la enzima que sintetiza del tracto de poli (A), pero
tambin participa en la reaccin de corte mediante su interaccin con el complejo
CPSF. Es probablemente la protena mejor estudiada y conocida de la maquinaria del
procesamiento del extremo 3. Es un polipptido monomrico que presenta diferentes
isoformas debido a un splicing diferencial. La forma activa en mamferos tiene un peso
molecular alrededor de 80 kDa (Wahle y col., 1999). De las isoformas enzimticamente
activas se encuentran la PAP I, PAP II y PAP IV (Zhao y Manley, 1996), de las cuales la
ms predominante es la PAP II. Sobre esta protena se hablar ampliamente ms
adelante.
2.4.5 Protena de unin al tracto de poli (A) II (PABP II)
La PABP II es monomrica con un peso molecular de 33 kDa (Wahle, 1995) y
presenta una alta afinidad por el tracto de poli (A). Cuando el tracto de poli (A)
comienza a ser sintetizado, la PABP II se une a l formando un multicomplejo con
CPSF y PAP, estabilizando as a la PAP en extremo 3 del RNA, lo que facilita la
agregacin de adeninas permitiendo que el proceso sea ms rpido (Bienroth y col.,
1993). La PABP II tambin participa estimulando la traduccin de los RNAm, mediante
la interaccin con algunos factores de la traduccin tales como el eIF4.
2.4.6 Protenas adicionales
Recientemente se han identificado otras protenas que tambin participan en
este procesamiento las cuales incluyen la Symplekina, Rrbp6, PNAS-120 y PC4, de las
43
cuales se sabe que tambin participan como coactivadores del la RNA polimerasa II en
humano.
En S. cerevisiae, se han identificado protenas homlogas a estos factores. El
complejo CPSF (160, 100, 73 y 30kDa) de mamferos, se encuentra representado en
levadura por las protenas Cft1p/Yhh1p, Cft2p/Ydh1p, Brr5/Ysh1p y Yth1p,
respectivamente (Zhao y col., 1999). Existe un homlogo de PAP y FIP 1 denominados
pap1 y fip 1 respectivamente, adems de otra protena identificada como Ptalp que en
humano se le conoce como Symplekina, las cuales no se han caracterizado en la
levadura. En levadura slo se identifican dos protenas homlogas al complejo CstF 77
y 64 de humano, conocidos como RNA14 y RNA15; mientras que la subunidad 50 kDa
del CstF de mamfero no tiene una protena homloga en S. cerevisiae. No se han
encontrado protenas homlogas al complejo CF Im (25, 59, 68 y 72 kDa) pero s al CF
IIm, las cuales son Clp1 y Pcf II, adems de otras protenas adicionales como son Hrp
1, Mpe I, Ssu 72 y Sub1, de las cuales no se sabe exactamente su funcin en la
reaccin de corte y poliadenilacin. Las protenas Mpe I, Ssu 72 y Sub1 son homlogas
a las protenas de mamfero Rrb6, PNAS-120 y PC4 respectivamente.
2. 5 Mecanismo de corte y poliadenilacin
La poliadenilacin es una reaccin en la que participan mltiples secuencias en
cis y protenas, las cuales son requeridas para la reaccin de corte de pre-RNAm y la
adicin de adeninas en eucariontes. A continuacin se descibe el mecanismo de corte y
poliadenilacin del pre-RNAm.
44
2.5.1 Corte del pre-RNAm
La subunidad de 160 kDa del CPSF se une a la seal de poliadenilacin
AAUAAA del 3 UTR del pre-RNAm. Por otro lado el factor CstF-64 identifica la
secuencia DSE rica en GU, que se encuentra ro abajo de la seal de poliadenilacin.
El CstF interacta con el CPSF-160 por medio de la subunidad de 77 kDa del CstF,
provocando un cambio conformacional del extremo 3 del pre-RNAm, formndose un
complejo ternario estable (CPSF-CstF-RNA), al cual se une la PAP, interactuando con
el CPSF y FIP 1. PAP interacta tambin con el CFIm-25 que se une al sitio de
poliadenilacin. El factor CF I m recluta al CF II m en donde CIP 1 interacta con CFIm-
25 y CPSF-100. CPSF interacta con el CTD (dominio carboxi- terminal carboxy
terminal domain, por sus siglas en ingls) de la RNA pol II estableciendo una relacin
funcional entre el procesamiento del 3 y la terminacin de la transcripcin (Steinmetz,
1997). Una vez reclutada toda la maquinaria, se realiza el corte del RNAm. El CstF y los
factores de corte CF I m y CF II m, junto con el fragmento de RNA donde se encuentra
la secuencia rica en GU se liberan, dejando una molcula de RNA con un extremo 3
OH libre en donde se inicia la sntesis de la cola de poli (A) (Fig. 5). El fragmento de
RNA liberado es degradado con rapidez.
El procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm est estrechamente relacionado
al inicio y terminacin de la transcripcin. Se ha demostrado que el complejo CPSF-160
es reclutado por el factor de transcripcin TFIID formando un complejo estable con ste
al inicio de la transcripcin. Posteriormente, durante la elongacin se transfiere al CTD
de la RNA po II, que se encuentra hiperfosforilado, y permanece unido a ste durante la
transcripcin (Dantonel y col., 1997). Existen reportes de que CstF tambin se asocia al
45
Figura 5. Esquema del reclutamiento de los factores involucrados en la reaccin de
corte del pre-RNAm en mamferos. CPSF reconoce a la seal de poliadenilacin por la
subunidad de 160 kDa, CstF reconoce la regin rica en G y U ro abajo del sitio de corte
por su subunidad de 64 kDa, e interactan ambas por la subunidad de 77 kDa del CstF,
reclutando a los factores de corte I y II (CFI y CFII), a PAP, a FIP entre otras.
46
CTD
RNA
Pol I
I
5
3
STOP
100 K
73K
CPSF
160
30 K AAUAAA
CstF
77K
50 K
64 K
rica G/U72
59
68
25
CF I
CIP1
FIP1Sitio decorte
PcfII
CF II
CA
PAP
47
CTD (McCracken y col., 1997). Cuando la RNA pol II identifica la seal poliadenilacin
AAUAAA en el pre-RNAm que se est sintetizando, existen dos posibles mecanismos
de cmo participa este factor en el procesamiento del extremo 3 (Li y col., 2001):
1) CPSF y CstF se disocian del CTD y se unen a las secuencias AAUAA y DSE
rica en GU del RNAm, respectivamente, para iniciar el corte del extremo 3
(Dantonel y col., 1997; McCracken y col., 1997) bien
2) CPSF y CstF permanecen asociados con el CTD, ya que ste tambin
participa en el corte del extremo 3 (Hirose y Manley, 1998)
2.5.2 Poliadenilacin
Inmediatamente despus del corte se inicia la poliadenilacin, donde la protena
PAP que contina unida al CPSF, comienza a agregar adeninas en el extremo 3. La
adicin de los primeros 10 residuos de adeninas se lleva a cabo con lentitud, a partir de
la cual le sigue una polimerizacin rpida de hasta 250 residuos de adenosina extras.
(Zhao y col., 1999). Tambin es necesaria la PABP II que se une a la cola de adeninas,
formando un complejo cuaternario junto con las protenas CPSF, PAP y el sustrato de
RNA. Esta protena estabiliza la unin de PAP al RNA en el extremo 3 y da soporte a
la sntesis de la cola de poli(A), al unirse a 10 adeninas del tracto recin sintetizado.
Adems de que facilita la agregacin de adeninas, permitiendo que sea ms rpida
(Bienroth y col., 1993) (Fig. 6). El RNAm maduro sale del ncleo ayudado por las
protenas que interactan con el cap del extremo 5 y la cola de poli (A) que son las
48
Figura 6. Diagrama esquemtico que muestra las protenas que participan en la
reaccin de poliadenilacin. La PAP sintetiza el tracto de poli (A) y su actividad es
estimulada por interacciones con las protenas CSPF, CFIIm25 y PABP II. La protena
PAPB II forma un complejo cuaternario con CPSF, PAP y el RNA para estabilizar a la
PAP, adems de que protege el tracto de poli (A) recin sintetizado.
49
STOP
73K
CPSF
16030 K
100 K
AAUAAAPcf
II
CIP1
CF II
PAPPAB II AAAAAAAAAAAAA
AAAA
AAAA
AAAA
A
AAAAAAAA
AAAAA
AAAAAAAAAAAAA
160
PAPPAB II
50
encargadas del transporte del RNAm y guiarlo hacia el citoplasma para ser identificado
por los ribosomas y ser traducido a protenas. Una vez que el RNAm se encuentra en
citoplasma y es traducido, comienza a ser degradado progresivamente por medio de
ribonucleasas especficas. Este proceso lo podemos dividir en tres fases principales:
1) El tracto de poli(A) se corta progresivamente por deadenilasas especficas como
Caf 1, POP2 y PAN, las cuales van eliminando las adeninas del tracto hasta
dejarlo aproximadamente en 10 adeninas, que es el mnimo necesario para que
se una la molcula de PABP II.
2) El decapping del extremo 5, que es un proceso en donde es removida la
estructura cap (m7GpppG) del extremo 5 por medio de la hidrlisis de la unin
del trifosfato mediante la enzima , y
3) Finalmente el RNAm es degradado por actividades de exonucleasa en direccin
53 y 35.
2.6 Readenilacin citoplsmica
La regulacin de la estabilidad, traduccin y localizacin del RNAm es esencial
en el desarrollo, crecimiento celular, homeostasis y plasticidad neuronal. La cola de
poli(A) en el extremo 3 del RNAm es clave para el control de la estabilidad y traduccin
del RNAm. Cuando la cola de poli(A) se acorta en el citoplasma, la traduccin se
detiene y el RNAm se degrada, con lo que se puede afirmar que la estabilidad del
RNAm y la activacin de la traduccin dependen de la longitud del tracto de poli(A)
(Kwan 2004). Todos los RNAm salen del ncleo con un tracto de poli(A) aproximado de
51
150-200 adeninas, el cual se va perdiendo por la accin de ribonucleasas, las cuales
eliminan las adeninas en una direccin 35. Es en este momento, en que algunos RNAm pueden alargar su tracto de poli(A) estando en el citoplasma, proceso conocido
como readenilacin citoplsmica (Dreyfus y Regnier, 2002). Se ha reportado la
existencia de diversas Poli(A) polimerasas citoplsmicas (PAPc) diferentes en
secuencia a la PAP nuclear, que catalizan la readenilacin de los mRNAs para que su
eficiencia de traduccin sea mayor. Las PAPc comparten la misma funcin, aunque
requieren de otras seales en el extremo 3 del RNAm.
Las PAPc son una familia reciente de polimerasas que se descubri
primeramente en Schizosaccharomyces pombe y en Caenorhabditis elegans. Difieren
de las PAPs principalmente en su secuencia y en su estructura, sin embargo tienen la
misma funcin. Fueron identificadas y llamadas GLD-2 ya que estaban involucradas en
el desarrollo y en embriognesis, de ah se deriva el nombre de GLD (Germline
development, por sus siglas en ingls). Se ha reportado que GLD-2 posee una baja
actividad de poli (A) polimerasa, y que necesita de otra protena que es GLD-3, que
pertenece a la familia de protenas de unin a RNA (Wang 2002). Mientras que la PAP
nuclear es monomrica, GLD-2 requiere de una protena de unin a RNA para realizar
su funcin. Recientemente, se han descrito una poli (A) polimerasa citoplsmica
homloga en humano conocida como Hs1 o hGLD-2, que se estudi en ovocitos de X.
laevis la cual no contiene el extremo C-terminal y que funciona como una poli (A)
polimerasa citoplsmica, aunque se cree que tambin participe como un estimulador de
52
la traduccin. Adems se han encontrado transcriptos de esta protena en la mayora de
los tejidos (Kwak y col., 2004).
Se ha demostrado que puede tambin existir readenilacin del RNAm en el
citoplasma en X. laevis y en Drosophila melanogaster (Dickson y col., 2001, Wickens,
1990; Richter, 1999; Juge 2002). Las enzimas involucradas se conocen como GLD-2 y
GLD-3 (Kwak y col., 2004; Keller y Martin, 2002), en donde participa la seal AAUAAA y
una seal cercana a est, rica en U y que se encuentra ro arriba, llamada elemento de
poliadenilacin citoplsmica; CPE (ver pag. 18); adems de los factores CPSF, PAP y
CPEB o protena de unin al CPE (cytoplasmic polyadenylation element binding, por
sus siglas en ingls). Al ser reunidas las secuencias AAUAAA y CPE por CPSF y CPEB
respectivamente, reclutan a la PAPc para iniciar la readenilacin del RNAm.
2.7 Importancia de la cola de poli(A) del RNAm
En las clulas animales, todos los RNA mensajeros excepto los de las histonas
poseen una cola de poli (A) en el extremo 3. Las funciones propuestas de esta cola
incluyen: promover la eficiencia de la transcripcin del RNA, en el transporte del mRNA
del ncleo al citoplasma y conferir estabilidad al mRNA. Los defectos en la formacin de
la cola de poli (A) pueden alterar profundamente la viabilidad, el crecimiento y el
desarrollo de la clula alterada. (Zhao y col., 1999). La vida media del RNAm depende
de su estabilidad, dada por el tracto o cola de poli(A) en el extremo 3 y por la estructura
cap en el extremo 5. La formacin del extremo 3 del RNAm es la clave en la expresin
de muchos genes y en algunos casos, una poliadenilacin aberrante lleva a una
enfermedad.
53
2.8 Poli(A) polimerasa
2.8.1 Generalidades
La PAP es un regulador postranscripcional de la expresin gentica, ya que al
sintetizar el tracto de poli(A) le da estabilidad el RNAm y permite que la traduccin del
RNAm sea ms eficiente. El peso molecular de la PAP en diferentes especies va desde
70 hasta106 kDa. La PAP de humano es un polipptido con una masa molecular de 84
kDa (Raabe y Manely, 1991; Wahle y col., 1991), la cual presenta mltiples sitios de
fosforilacin en su extremo amino (Raabe y Manley, 1994). En eucariontes, 2/3 partes
del extremo amino es altamente conservado y contiene un dominio cataltico homlogo
al de la familia de las nucleotidiltransferasas, el cual se caracteriza por presentar tres
residuos de aspartato (D) conservados en las posiciones 113, 115 y 167 en la PAP de
bovino. Un dominio de unin al RNA, est localizado entre los nucletidos 488 y 508, en
el extremo carboxi-terminal, el cual se traslapa a la seal de localizacin nuclear (NSL1)
que se localiza entre los nucletidos 493 y 538. A 140 nucletidos ro debajo de esta
NLS1, se encuentra la segunda seal NSL2. A partir de la seal NLS1, hasta el extremo
carboxil, es un segmento rico en serina y treonina, los cuales permiten mltiples
fosforilaciones las cuales regulan la actividad de la PAP (Fig. 7 y 8).
La PAP ha sido identificada en diversos eucariontes como levadura, humano,
ratn, bovino, rana y gallina y se han observado mltiples isoformas. Los mecanismos
moleculares que generan estas isoformas an no son completamente entendidos, sin
embargo, se sabe que la fosforilacin y el splicing alternativo contribuyen a que existan
PAPs con diversos pesos moleculares (Kyriakopoulou y col., 2001). La generacin de
diferentes isoformas, se lleva a cabo al menos, por tres mecanismos distintos:
54
Figura 7. Estructura molecular de la poli (A) polimerasa II de humano. PAP II est
formada por 689 aa, con un dominio central cataltico conservado donde se realiza la
transferencia de nucletidos e interaccin con el ATP y un dominio de unin a RNA, que
presenta 2 seales de localizacin nuclear (por sus siglas en ingls NLS). Adems
presenta varios posibles sitios de fosforilacin por las cinasas CK2 y cAMP.
55
HsPAP689 aa
Dominio central cataltico
Dominio de unin al RNA
F/YGS DD D NLS1CK2CK2 cAMP NLS2
56
Figura 8. Diagrama tridimensional de la estructura cristalina de la poli(A) polimerasa de
bovino. En naranja se localiza el dominio cataltico (aa 60-173); en azul el dominio
central y en morado el dominio terminal de unin al RNA. En magenta se seala la
molcula de ATP interactuando con el sitio cataltico.
57
58
duplicacin gnica, procesamiento alternativo de RNA y modificaciones
postranscripcionales. Con esto, podra parecer razonable la hiptesis de que diferentes
PAPs son responsables de diferentes funciones in vivo, ya que la PAP participa en el
corte de pre-RNAm, dependiente o independiente de la seal de poliadenilacin
AAUAAA y en la sntesis de la cola de poli(A). De estas isoformas, la ms abundante en
mamferos es la PAP II o , sin embargo existen otras como la PAP que presenta las mismas caractersticas que la PAP II nuclear de 90 kDa, incluyendo la interaccin que
tiene con la protena U1A (Kyriakopoulou 2001).
Se ha reportado que existe una expresin diferencial de la PAP II durante el
desarrollo y de manera tejido especfica, as como en diferentes lneas celulares, por
ejemplo en extractos nucleares (EN) de clulas HeLa se han encontrado tres isoformas
con aparentes masas moleculares de 90, 100 y 106 kDa (Thuresson y col., 1993;
Kyriakopoulou 2001). Otro ejemplo es una nueva isoforma de la poli (A) polimerasa
conocida como TPAP (Testis-specific poly(A) polymerase, por sus siglas en ingls), la
cual se presenta especficamente en el citoplasma de clulas espermatognicas.
Presenta un peso molecular de 70 kDa y una identidad del 86% con respecto a la PAP
II (Kashiwabara 2000). Adems, se ha identificado otra PAP, la Neo-Poli(A) polimerasa
la cual presenta una masa molecular de 82.8 kDa y 71% de homologa con la PAPII de
humano, y que es sobreexpresada en tumores humanos (la Neo Poli(A) polimerasa). La
Neo PAP es una enzima importante en el procesamiento del RNA, pero que es
regulada de una manera distinta a la utilizada por la PAP (Topalian y col., 2001), lo que
sugiere que algunas isoformas de PAP son restringidas o caractersticas con ciertas
59
etapas de desarrollo o tejidos. Recientemente se identific una PAP mitocondrial, con
un peso de 65-68 kDa y que participa en la sntesis del tracto de poli(A) de los RNAm
mitocondriales, aunque se observ que este tracto no participa en la estabilidad de los
RNAm mitocondriales (Tomecki 2004). En S. cerevisiae tambin se ha identificado una
PAP nuclear (Zhelkovsky 1995; Bard 2000), la cual presenta una masa molecular de
63 kDa (Linger 1991). Al ser comparada con la PAP de mamferos se observ que la
regin carboxi-terminal no es conservada mientras que los primeros 400 aa son
idnticos en un 47%. Se ha demostrado que la Pap1 no es requerida en el proceso del
corte del pre-RNAm, sin embargo es reclutada aparentemente para reconocer el sitio de
poliadenilacin (Zhao 1999)
2.8.2 Participacin de la PAP en el splicing del pre-RNAm
La PAP no slo participa en la poliadenilacin, sino tambin en otros eventos del
procesamiento del pre-RNAm, como lo es el splicing. La maquinaria basal de
poliadenilacin no contiene snRNPs, sin embargo, existen evidencias en las que se
sugiere que el splicing y la poliadenilacin estn ligados, estableciendo un enlace
funcional entre ellos. Por ejemplo, una seal funcional de poliadenilacin, puede facilitar
el splicing del extremo 5 terminal del intrn in vivo. Adems, en estudios recientes se
sugiere que los factores de splicing pueden actuar como auxiliares en la seleccin del
sitio de poli(A) (Colgan, 1997)
El mejor ejemplo estudiado de cmo una protena del spliceosoma influye en la
poliadenilacin es la protena U1 snRNP A (U1A). El pre-RNAm de la protena U1A
contiene una secuencia ro arriba del sitio de poliadenilacin, la cual es un sitio de unin
60
a U1A, de esta forma, el RNAm de U1A es autorregulado negativamente cuando dos
molculas de U1A se unen al pre-RNAm de U1A, dando como resultado una inhibicin
de la poliadenilacin (Boelens 1993). Al examinar esta reaccin por separado, se
determin que la unin de U1A no afecta al proceso de corte, sin embargo la
poliadenilacin se inhibe, sugiriendo que existe una relacin directa entre U1A y PAP,
algo que se haba propuesto anteriormente en un estudio realizado en EN de hepatoma
(Raju y Jacob, 1988). Existen estudios en donde se demostr que el extremo carboxi-
terminal de la PAP, incrementa la eficiencia de la protena U2AF 65, que participa en el
proceso de splicing, estimulando y facilitando su unin al intrn, ya que en el extremo
carboxi-terminal de PAP interacta con los residuos 17-47 de U2AF 65 (Vagner 2000).
Otro estudio reporta que la protena U2AF participa en el control de la longitud del tracto
de poli (A) (Gu y Schoenberg, 2003)
2.9 Poli (A) polimerasa en el ciclo celular
2.9.1 Generalidades del ciclo celular
El concepto de ciclo celular naci con el estudio de cultivos in vitro de clulas que
se dividen a intervalos regulares, en donde una clula madre da origen a dos clulas
hijas, cada clula hija se desarrolla y sufre posteriormente un nuevo proceso de divisin
para originar dos clulas idnticas dando con esto un fenmeno, llamado ciclo celular,
ya que estos procesos se repiten en cada generacin (Murray y col, 1993).
Originalmente se crea que el ciclo celular estaba compuesto por dos fases, las cuales
son la interfase y la divisin celular propiamente dicha o mitosis; sin embargo, se
observ que en algn momento en la interfase se duplicaba el DNA nuclear, para que
se divida en forma equitativa entre las clulas hijas. Actualmente sabemos que la
61
interfase se ha dividido en 3 fases denominadas: G1, S, y G2 (Fig. 9) (Murray y col,
1993; Lodish y col, 2002, Karp, 1996)
G1: (Intervalo 1 o Gap 1 en ingls) es el intervalo que va de la etapa final de la
mitosis hasta el inicio de la fase S. En este periodo, las clulas pueden permanecer
estacionadas, o prepararse para entrar en la fase S para iniciar el proceso de divisin.
S: (Sntesis) es la etapa en donde el DNA se duplica para poder obtener dos
ncleos con la misma informacin gentica que el ncleo de la clula madre.
G2: (Intervalo 2 o Gap 2 en ingls) es el tiempo que transcurre entre el final de la
sntesis del DNA y el inicio de la mitosis. Durante esta etapa la clula contiene el doble
de la cantidad de DNA presente en la clula original. Le provee a la clula un lapso
durante el cual actan mecanismos de seguridad para controlar si las molculas de
DNA se replicaron correctamente. A esta fase, tambin se le conoce como etapa de
crecimiento (Growing) ya que aumenta su tamao para dividirse.
M: (mitosis) es la etapa del ciclo celular donde se realiza la divisin celular y
tanto el citoplasma, como el material gentico se dividen equitativamente. En el
citoplasma, se forma el huso mittico, que est compuesto por microtbulos y es un
sistema generador de fuerzas que controla la posicin de los cromosomas y su
distribucin en las clulas hijas. Los microtbulos se implantan en los centrmeros. La
divisin del citoplasma de manera equitativa se conoce como citocinesis. En esta etapa,
la sntesis de DNA y RNA se interrumpen casi totalmente. Esta fase, a su vez se divide
62
en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La profase es el primer estadio
de la mitosis, en donde la cromatina se condensa, la membrana nuclear se disuelve, los
centrolos (si se encuentran presentes) se dividen y los pares migran a los polos, se
forma el cinetocoro y las fibras de ste, adems se forma el huso mittico. En la
metafase, los cromosomas migran al ecuador de la clula donde las fibras del huso se
"pegan" a las fibras del cinetocoro. En la anafase se inicia la separacin de los
centrmeros y el arrastre de los cromosomas a los polos opuestos y por ltimo, la
telofase en la cual los cromosomas llegan a los polos de sus respectivos husos
mitticos, la membrana nuclear se reconstituye, los cromosomas se desenrollan para
formar la cromatina y el nucleolo, que desapareci en la profase se vuelve a constituir.
Donde antes haba una clula ahora existen dos pequeas con exactamente la misma
informacin gentica. Estas clulas pueden luego diferenciarse durante el desarrollo
(Lodish y col, 2002, Earnsshaw y col, 1994).
2.9.2 Mecanismos de regulacin del ciclo celular
Hay mecanismos especializados para coordinar los procesos de divisin en el
ncleo y en el citoplasma y determinar el inicio y el fin de las fases del ciclo celular. En
esta regulacin participan varias protenas: las ciclinas y las cinasas dependientes de
ciclinas (cdc o cdk por sus siglas en ingls de cyclin dependent of kinases). En
mamferos, la regulacin de este ciclo se inicia con una protena conocida como Rb, la
cual se encuentra unida al factor de transcripcin E2F. Las cdk 4 y 6, se unen a la
ciclina D para activarla. Cuando se activa la ciclina D en la fase G1, fosforila a Rb la
cual libera el factor de transcripcin E2F, que activa la expresin gentica como de los
genes que codifican para la cdk2 y las ciclinas A y E, en la fase G1 del ciclo celular. Al
63
expresarse esta la cdk2, se une a la ciclina E y la activa, y contina fosforilando a Rb,
durante la fase G1 y al inicio de la fase S. En la fase S, la cdk2 se une a la ciclina A,
inactivando a la ciclina E, la cual desfosforila a Rb que se une nuevamente al factor
E2F; la ciclina A/cdk2 se mantiene activa toda la fase de S y parte de la fase G2. Al
finalizar la fase G2, la ciclina A/cdk 2 disminuye mientras que al inicio de la fase M
aumenta la ciclina B/cdk2 y se mantiene activa durante toda la fase (Downes y col,
1994; Morgan, 1997; Lodish, 2002)(Fig. 9).
2.9.3 Papel de la PAP en el ciclo celular
En X. laevis se ha observado que la poli (A) polimerasa se hiperfosforila por la
ciclina B durante la fase M del ciclo celular, lo que causa una inactivacin de la misma
(Colgan et al., 1996). Por otra parte se sabe, que durante la fase M en el ciclo celular, la
sntesis de protenas disminuye y que la longitud de los tractos de poli (A) del RNAm
tambin disminuyen. Por lo anterior, se propone que la poli (A) polimerasa inhibe la
expresin gentica durante la mitosis, es decir cuando la p34cdc2/ciclina B, que es el
regulador de la fase M, hiperfosforila a la poli (A) polimerasa, sta se inactiva en esa
misma fase, lo que va a generar RNAm poli (A-) y esto a su vez lleva a una traduccin
ineficiente y por lo tanto a un silenciamiento en la expresin gentica (Colgan et al.,
1998).
De acuerdo con estos trabajos se puede hacer la interrogante de que en otros
organismos suceda algo similar; al inactivarse la poli (A) polimerasa, se inhibe la
expresin gentica en la fase M y que probablemente cambios en la expresin del
64
Figura 9. Etapas del ciclo celular en eucariontes y su regulacin. La ciclina D/cdk4 o 6,
fosforila a Rb que se encuentra unido al factor de transcripcin E2F y lo libera. La
transcripcin de la ciclina E y de cdk 2, permite que Rb contine fosforilada. En la fase
S, se activa la ciclina A/cdk2 e inactiva a la ciclina E/cdk2, que desfosforila a Rb y se
une nuevamente a E2F. Al entrar en la fase M, se activa la ciclina B/cdk2 y se inactiva
la ciclina A/cdk2.
65
Ciclina D
Cdk 4, 6
Ciclina A
Cdk 2
Ciclina E
Cdk 2
Rb
E2F
Ciclina B
Cdk 2
RbE2F
66
RNAm del gen de la PAP durante la fase M del ciclo celular puedan tambin generar
este fenmeno.
2.10 Identificacin de las posibles secuencias en cis que participan en el
procesamiento del pre-RNAm en E. histolytica
El procesamiento del extremo 3 terminal en E. histolytica, es poco conocido. La
informacin obtenida del proyecto del genoma de E. histolytica (Loftus 2005), ofrece
nuevas aproximaciones experimentales en el estudio de la expresin gentica y facilita
la determinacin completa de los genes involucrados en el metabolismo del RNA. En un
anlisis in silico Lpez-Camarillo y col (2005) alinearon 320 nt (donde 240 nt
corresponden a la 3 UTR) de 50 diferentes secuencias genmicas, y se observ que
las 3UTR estn constituidas por una alta cantidad de los nucletidos AT (80%) y hay
una alta frecuencia de Ts en los primeros 10-50 nt de las 3UTR. Se identific la seal
de poliadenilacin, UA(A/U)UU, en un 65% de los genes y en 8% de ellos, esta
secuencia incluye el codon de paro (Fig. 10). Tambin se identificaron dos regiones
ricas en U, una localizada de 1-30 nt ro abajo del sitio de poliadenilacin y la otra a 3-
30 nt ro arriba de sitio de poliadenilacin; se sugiere que el 35% de los genes del
parsito que no presentan esta secuencia puedan usar otras secuencias regulatorias
diferentes para este procesamiento.
Todo lo anterior demuestra que existen cuatro secuencias cis-reguladoras del
procesamiento del 3UTR del pre-RNAm en E. histolytica (Fig. 11), las cuales son:
67
Figura 10. Representacin del alineamiento mltiple de 8 secuencias genmicas
(gDNA) y de cDNA de genes de E. histolytica. Se muestran las seales de
poliadenilacin (cajas amarillas), asterisco indica los nucleotidos que no coinciden con
la secuencia consenso de poliadenilacin, en negrita se muestran el sitio de corte y
poliadenilacin y subrayadas las regiones ricas en U.
68
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
69
Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del procesamiento del pre-
RNAm en E. histolytica. La seal de poliadenilacin se localiza de 10-30 nt ro arriba del
sitio de corte y poliadenilacin. Se localizan 2 secuencias ricas en U, una est
localizada ro arriba del sitio de corte y la otra se encuentra de 3-30 nt ro abajo del sitio
de corte. El codn de paro (TAA) est remarcado (lnea superior roja)
70
UAAUU UA(A/U)UU N Rica en URica en
Upre-RNAm
Seal de poliadenilacin
Sitio de poliadenilacin
Codnde paro
variable 10-30 nt 3-30 nt
71
1) Una seal del sitio de poliadenilacin (UA(A/U)UU) o con alguna
variante, localizada de 10-30 nt ro arriba del sitio de poliadenilacin
2) Una regin rica en U localizada de 1-30 nt ro arriba del sitio de
poliadenilacin
3) El sitio de poliadenilacin, sin una secuencia consenso conocida
4) Un elemento rico en U localizado 3-30 nt ro abajo al sitio de
poliadenilacin
Estas secuencias difieren de las descritas en mamferos y levaduras, por lo que
podra ser un modelo adecuado de estudio de los cambios evolutivos en las secuencias
de reconocimiento en el procesamiento del 3 UTR del pre-RNAm
2. 10. 1 Identificacin de protenas involucradas en el procesamiento del
extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica
En una bsqueda de la maquinaria que participa en el procesamiento del
extremo 3 del pre-RNAm en diferentes organismos y al compararlas entre ellos, se
observ que en E. histolytica existen protenas homlogas a la mayora de los factores
identificados en humano y en levadura. Se encontraron homlogos al CPSF-160,
CPSF-100, CPSF-73, CPSF-30, PAP, FIP 1, CstF 77, CstF 64, CstF 50, CstF 25, Cip 1,
Pcf II; adems de Rrbp6, PNAS-120 y PC4 que han sido identificadas recientemente
en humano. No se identificaron homlogos a las protenas de humano symplekina,
CFIm 59, CFIm 68 ni CFIm 72; pero se identific la protena Pfs2, homloga a Pfsp de
S. cerevisiae (Tabla 2) (Lpez-Camarillo y col., 2005). Adems, se propone que el
72
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73
procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm en E. histolytica, sea semejante al de
mamferos, ya que presenta una gran homologa con las protenas requeridas por stos
(Fig.12).
2.10.2 Papel de la poliadenilacin en el fenotipo de resistencia a mltiples
frmacos en E. histolytica
En un estudio a nivel postranscripcional realizado en E. histolytica (Lpez
Camarillo y col., 2003), en los trofozoitos de la clona C2 mutante que presenta el
fenotipo de resistencia a mltiples frmacos (MDR), se observ que la vida media del
RNAm del gen EhPgp5 es mayor en los trofozotos de la clona C2 mutante crecidos en
altas concentraciones de emetina, donde la vida media del RNAm del gen EhPgp5
obtenido de la clona C2 es 2.1 horas, en la clona C2 crecida a una concentracin de 90
M de emetina fue de 3.1 horas, mientras que en la clona C2 crecida a 225 M de
emetina fue de 7.8 horas (Lpez-Camarillo y col., 2003). Tambin se demostr que la
longitud del tracto de poli (A) del RNAm del gen EhPgp5 aument en los trofozotos de
la clona C2 (225), sugiriendo que la actividad de la PAP es la responsable del aumento
de la longitud del tracto de poli (A) y la estabilidad del RNAm del gen EhPgp5. Estos
datos muestran que la PAP es un regulador importante de la estabilidad del los RNAm,
por lo que su estudio ayudara en el entendimiento de los mecanismos moleculares que
regulan la expresin gnica a nivel postranscripcional.
74
Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm E.
histolytica. (A) Reconocimento de la seal de poliadenilacin por medio del CPSF, PAP
y Fip1. (B) EhCstF se une a la secuencia rica en U, localizada ro abajo del sitio de
poliadenilacin y se une a la subunidad 160 del CPSF. Los factores de corte CFIm y
CFIIm reconocen el sitio de poliadenilacin y realizan el corte. (C) Despus del corte,
PAP se une al CPSF para sintetizar la cola de poli (A). Las interacciones entre estas
protenas y el RNA son hipotticas.
75
Seal de poliadenilacin Sitio de poli (A)
Sitio decorte
Degradacin
rica U
rica U
rica U
rica U
rica U rica U
Lpez-Camarillo et al., 2005
76
3 JUSTIFICACION
En eucariontes se sabe que el procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm es un
evento importante dentro de la regulacin de la expresin de diferentes genes,
incluyendo genes involucrados en virulencia y resistencia a drogas de diversos
patgenos, ya que de esto depende la estabilidad del RNAm en el citoplasma y la
eficiencia de la traduccin. La formacin de la cola de poli (A) en el extremo 3 del
RNAm se ha estudiado en diferentes organismos eucariontes y se han identificado las
diferentes protenas que participan en este proceso. Entre ellos se encuentra la poli (A)
polimerasa (PAP) que es directamente responsable de la adicin de adeninas. Sin
embargo, la informacin que se tiene acerca del procesamiento y la estabilidad del
RNAm de los genes de E. histolytica es casi nula y aunque se sabe que se presenta un
control de la longitud del tracto de poli(A) en el extremo 3 del RNAm del gen EhPgp5,
se desconocen los mecanismos que lo regulan. El anlisis funcional y estructural de la
EhPAP nos permitir entender la reaccin de procesamiento y poliadenilacin del
mRNA en este parsito, as como analizar su importancia en el recambio del RNAm y
su papel en la regulacin de la expresin gentica durante el ciclo celular.
77
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Caracterizar estructural y funcionalmente la poli(A) polimerasa EhPAP de
Entamoeba histolytica.
4.2 Objetivos especficos
1. Realizar un anlisis in silico de la secuencia de la EhPAP.
9 Bsqueda de secuencias similares a la EhPAP en las bases de
datos de protenas.
9 Relacin filogentica de la EhPAP con otras PAPs.
9 Determinacin de patrones y motivos conservados.
9 Prediccin de la estructura terciaria de la EhPAP.
2. Determinar el perfil de la expresin del mRNA del gen EhPap durante el
ciclo celular.
3. Subclonar el gen EhPap en un vector de expresin.
4. Expresar y purificar la protena EhPAP recombinante.
5. Generar anticuerpos policlonales especficos contra la EhPAP.
6. Determinar la localizacin subcelular de la EhPAP en trofozotos de E.
histolytica.
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5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Estrategia Experimental
Para cumplir con los objetivos de este proyecto, seguimos la estrategia
experimental presentada en la Fig. 13
5.2 Anlisis in silico de la secuencia de aminocidos de la EhPAP
Tomando como referencia primaria la secuencia de la EhPAP (tesis Doctorado
Dr. Lpez-Camarillo), se hizo una bsqueda de secuencias similares en los bancos de
datos de la secuencia de PAPs de diferentes especies por medio del programa BLAST
2.0 (por sus siglas en ingls Basic Local Alignament Search Tool), que se encuentra en
el servidor en lnea de ExPASy Proteomics Server (por sus siglas en ingls Expert
Protein Analysis System) (http://www.expasy.org), el cual se especializa en el anlisis
protemico y que detecta regiones con similitudes presentes en otras protenas
reportadas en la base de datos.
Posteriormente se realiz un alineamiento mltiple de EhPAP con otras PAPs de
diferentes especies que presentaban mayor homologa entre ellas, las cuales fueron
obtenidas del BLAST usando el programa CLUSTALW. Para establecer los dominios
conservados entre las diferentes protenas se usaron los programas Prosite
(http://www.expasy.org) y Pfam (http://www.sanger.ac.uk) con los cuales se predijeron
los dominios funcionales y estructurales. Para realizar el rbol filogentico se us el
programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis: MEGA
(http://www.megasoftware.net). Primeramente se realiz un alineamiento mltiple con
las secuencias de las especies ms representativas de cada grupo: Vertebrados: H.
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Figura 13. Estrategia experimental. La cual consiste en el anlisis in slico de la
secuencia obtenida de gen EhPap clonado en el vector TA. Subclonacin del gen
EhPap en un vector de expresin (pRSET-A), con el cual se transformaron bacterias
E.coli BL21 (DE3) pLysS para obtener la protena EhPAPr, que se purific para generar
anticuerpos especficos en ratones. Se obtuvieron extractos nucleares y citoplsmicos
de trofozotos de la clona A, que se analizaron por ensayos de Western blot con el
anticuerpo especfico para determinar su localizacin subcelular. Trofozoitos de la clona
L-6 fueron tratados con colchicina para obtener el RNA de cada fase, con el cual se
realizaron ensayos de RT-PCR para analizar la expresin del gen de EhPap.
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Trofozotos de la clona L6 sincronizados en el
ciclo celular
ExtraccinRNA total
RT-PCR
Secuenciacin de la EhPAP
Purificacin de laEhPAP recombinante
Generacin de anticuerpos en ratones
Westernblot
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