Download - Trabajo de grado andres Vela · Figura 4. Comparación de los esquemas de conteo de la técnica para una mayor precisión por Kirchman y colaboradores (1982), 1) dos filtros de la

1

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS SOBRE LA

DENSIDAD DE LOS MICROORGANISMOS EDÁFICOS EN SUELOS

DEL EJE CAFETERO EN LAS CUENCAS DEL LOS RÍOS

LA VIEJA Y EL OTÚN

Andrés Felipe Vela Rojas

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

Microbiólogo Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C.

(Julio de 2007)

2




LA VIEJA Y EL OTÚN

Andrés Felipe Vela Rojas

APROBADO:

----------------------------

Fabio Roldán, PhD

Director del trabajo de grado

--------------------------- ----------------------------------

Amanda Varela, PhD Angela Umaññaa,, BBiiooll .. MMPPhhii ll

Jurado Decana Académica

-------------------------- ------------------------------

Eduardo Mora, PhD David Gómez Mendez

Jurado Director de carrera de

microbiología industrial

3

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No. 13 de Julio de 1946:

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus tesis de grado”

4

Agradecimientos

Al Centro de Investigación en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG) y a la Pontificia

Universidad Javeriana por el apoyo logístico y económico para el desarrollo de la investigación

Al Doctor Fabio Roldán por su paciencia y su colaboración.

A Mónica Berdugo por su colaboración

A Fernando Torres por su colaboración

A Nelcy Latorre por ser más que una compañera de trabajo, un ejemplo, un abrazo, un beso, un

anhelo y todo lo que una persona busca para su vida

A mi familia y en especial a mis padres por ser el motor de mis acciones.

A la persona más importante de mi vida, mi hija Simona por ser el cielo más hermoso que Dios

puso en mi camino

A toda la gente que acompaño este proceso en el laboratorio, por una risa, un consejo un algo que

construye una mejor persona cada día.

Y a Dios porque gracias a el todo este sueño se realizó.

5

TABLA DE CONTENIDO

Pág

RESUMEN .................................................................................................................................... 15

ABSTRACT .................................................................................................................................. 16

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 17

2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 18

2.1. El suelo ............................................................................................................................... 18

2.2. Técnicas directas e indirectas para conteo microbiano ...................................................... 19

2.2.1. Técnicas de conteo...................................................................................................... 21

2.2.2. Conteo directo por microscopia de epifluorescencia ................................................... 23

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN .................................................... 31

3.1. Formulación del problema. ................................................................................................ 31

3.2. Justificación ........................................................................................................................ 32

4. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 33

4.1. Objetivo general. ................................................................................................................ 33

4.2. Objetivos específicos. ......................................................................................................... 33

5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 34

5.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo utilizando DAPI:................. 34

5.1.1. Cultivo de E. coli o control de procedimiento: ............................................................ 34

5.1.2. Estandarización de la tinción utilizando suelo: ........................................................... 34

5.1.3. Descripción del protocolo de tinción: .......................................................................... 35

5.1.4. Modificaciones al protocolo de tinción ....................................................................... 37

5.1.4.1. Evaluación de un pretratamiento para eliminar interferencia de la matriz de

6

suelo……………………………………………………………………………………....35

5.1.4.2. Evaluación de la concentración de DAPI para la tinción………………………..35

5.1.4.3. Esquema de conteo………………………………………………………………35

5.1.5. Tratamientos y análisis visual de los filtros para la estandarización del protocolo de

tinción .................................................................................................................................... 40

5.1.6. Control de calidad del conteo: ..................................................................................... 40

5.1.7. Análisis estadístico para la estandarización................................................................. 40

5.2. Estimación de la densidad microbiana en suelos de la ecorregión cafetera utilizando DAPI

................................................................................................................................................... 41

5.2.1. Muestreo ...................................................................................................................... 41

5.2.2 Unidades de muestreo ................................................................................................... 41

5.2.3. Eventos de muestreo: .................................................................................................. 43

5.2.4. Parámetros fisicoquímicos:......................................................................................... 43

5.3. Análisis estadístico para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los conteos de

microorganismos totales. ............................................................................................................... 44

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................... 45

6.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo con DAPI: ........................... 45

6.1.1. Control de procedimiento con E. coli para el conteo directo con DAPI ..................... 45

6.1.2. Evaluación de los tratamientos utilizando E. coli como control de procedimiento .... 46

6.2. Evaluación de los tratamientos seleccionados para la estandarización utilizando muestras

de suelo ...................................................................................................................................... 48

6.3. Conteo de microorganismos de suelo de la ecorregión cafetera utilizando DAPI ............. 51

7

6.3.1. Comparación de los conteos de microorganismos edáficos totales de las fincas

seleccionadas para cada cobertura. ........................................................................................ 51


seleccionadas para cada sistema productivo .......................................................................... 68

6.3.3. Efecto en los conteos del evento de muestreo ............................................................. 72

6.3.4. Efecto en los conteos del evento de muestreo entre ventanas ..................................... 76

7. CONCLUSIONES .................................................................................................................... 79

8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 80

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 81

10. ANEXOS................................................................................................................................. 92

8

LISTA DE TABLAS

Pág

Tabla 1. Parámetros de comparación entre los conteos directos e indirectos. .............................. 20

Tabla 2. Ventajas y desventajas del conteo en placa y número más probable. ............................. 22

Tabla 3: Comparación de los métodos para el conteo en placa y directo por epifluorescencia .... 23

Tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por

epifluorescencia ............................................................................................................................. 26

Tabla 5. Tratamientos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI utilizando un

cultivo de E. coli y las muestras de suelo. ..................................................................................... 40

Tabla 6. Sistemas productivos, coberturas y fincas seleccionadas en la cuenca del río La Vieja y

El Otún. .......................................................................................................................................... 43

Tabla 7. Descripción general de la cuenca del río La Vieja. ......................................................... 42

Tabla 8. Descripción general de la cuenca del río El Otún. .......................................................... 44

Tabla 9. Recuentos en placa y absorbancia de E. coli en el tiempo ............................................. 45

Tabla 10. Conteos obtenidos durante la estandarización del proceso de tinción utilizando E. coli.

....................................................................................................................................................... 47

Tabla 11. Conteos obtenidos de los distintos tratamientos evaluados durante el proceso de

estandarización utilizando una muestra de suelo ........................................................................... 49

Tabla 12: Conteos de los microorganismos edáficos obtenidos durante el estudio en la CEAN.. 52

Tabla 13. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas de las fincas

seleccionadas para cada cobertura en la cuenca de río La Vieja .................................................. 54

Tabla 14. Diferencias entre coberturas para la cuenca del río La Vieja. ...................................... 58

9

Tabla 15. Intervalo de confianza al que se presentaban deferencias significativas en el tiempo por

cada cobertura en la cuenca del río La Vieja ................................................................................. 60

Tabla 16. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en

la cuenca del río La Vieja en el tiempo ......................................................................................... 61

Tabla 17. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre las fincas

seleccionadas para cada cobertura en la cuenca de río El Otún ................................................... 61

Tabla 18. Diferencias entre coberturas para la cuenca del río El Otún. ....................................... 66

Tabla 19. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo por

coberturas en la cuenca del río El Otún ......................................................................................... 68

Tabla 20. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en

la cuenca del río El Otún ............................................................................................................... 69

Tabla 21. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre las fincas

seleccionadas para cada sistema productivo. ................................................................................. 70

Tabla 22: Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en

la temperatura del suelo en cada finca. .......................................................................................... 75


la humedad del suelo en cada finca. .............................................................................................. 76


el pH del suelo en cada finca. ........................................................................................................ 77

Tabla 25. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre cuencas

para los dos eventos de muestreo .................................................................................................. 78

Tabla 26. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre los eventos

de muestreo. ................................................................................................................................... 78

10

LISTA DE FIGURAS

Pág

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo utilizado para el conteo con DAPI (Casamayor, 2006).

....................................................................................................................................................... 35

Figura 2. Células coloreadas con DAPI en una muestra de suelo. ................................................ 37

Figura 3. Diagrama de flujo del protocolo de tinción y las modificaciones evaluadas. A, B y C

hacen referencia a los pasos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI. ................ 38

Figura 4. Comparación de los esquemas de conteo de la técnica para una mayor precisión por

Kirchman y colaboradores (1982), 1) dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y

2) dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado de la dilución. ........... 39

Figura 5. Curva de calibración (absorbancia vs. recuento en placa) del cultivo de E. coli. Se

presenta el promedio de dos valores. ............................................................................................. 46

Figura 6. Conteos de microorganismos totales en los cafetales de la cuenca del río La Vieja. Se

presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ....................................................................... 53

Figura 7. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río La vieja. Se


Figura 8. Conteo de microorganismos totales en los pastizales de la cuenca del río la Vieja. Se


Figura 9. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río La Vieja. Se


Figura 10. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río La Vieja entre muestreos. Se

presenta el promedio y desviación estándar (n=12). ..................................................................... 59

11

Figura 11. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río El Otún. Se


Figura 12. Conteos de microorganismos totales en los cultivos de cebolla de la cuenca del río El

Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6). ........................................................ 63

Figura 13. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río El Otún. Se


Figura 14. Conteos de microorganismos totales en los forestales de la cuenca del río El Otún. Se


Figura 15. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río El Otún entre muestreos. Se

presenta el promedio y desviación estándar (n=12). ..................................................................... 67

Figura 16. Dispersión de los conteos de cada sistema productivo para la cuenca del río La Vieja

en el EM1. ..................................................................................................................................... 71

Figura 18. Dispersión de los conteos de cada sistema productivo para la cuenca del río El Otún

en el EM1. ..................................................................................................................................... 72

Figura 19. Dispersión de los conteos de cada sistema productivo para la cuenca del río El Otún

en el EM2. ..................................................................................................................................... 73

12

LISTA DE ANEXOS

Pág

Anexo A. Preparación de DAPI para el conteo directo ................................................................. 92

Anexo B. Cálculos de factor de corrección para conteos realizados en Microscopio de

epifluorescencia Nikon Eclipse 5.0i .............................................................................................. 93

Anexo C. Curva de calibración para el cultivo de Escherichia coli ATCC 25922 ....................... 94

Anexo D. Tabla de datos de la estandarización ............................................................................. 95

Anexo E. Distribución de los tratamientos para la estandarización con de E. coli. ..................... 96

Anexo F. Distribución de los tratamientos, ANOVA y comparación de medias utilizando Tukey-

Kramer para la estandarización con la muestra de suelo ............................................................... 97

Anexo G. t-student para los conteos entre las concentraciones de DAPI para la estandarización

en las muestras de suelo................................................................................................................. 98

Anexo H. t-student para los conteos entre los esquemas de conteo para la estandarización en las

muestras de suelo. .......................................................................................................................... 99

Anexo I. t-student para los conteos entre los pretratamientos para la estandarización con

muestras de suelo. ........................................................................................................................ 100

Anexo J. Datos del primer evento de muestreo .......................................................................... 101

Anexo K. Datos del segundo evento de muestreo ...................................................................... 103

Anexo L. Efecto de la cobertura sobre los conteos .................................................................... 105

Anexo M. Diferencias entre muestreos por coberturas .............................................................. 113

Anexo N. Efecto del sistema productivo sobre los conteos ....................................................... 117

Anexo O. Conteos del control de procedimiento Escherichia coli ATCC 25922 ...................... 122

13

Anexo N. Relación del conteo, porcentaje de humedad y temperatura entre ventanas del primer

evento de muestreo ...................................................................................................................... 123

Anexo Ñ. Relación del conteo, porcentaje de humedad y temperatura entre ventanas del segundo

evento de muestreo ...................................................................................................................... 125

Anexo O. Libreta de campo ......................................................................................................... 127

15

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue estimar la densidad microbiana en suelos de diferentes

sistemas productivos del Eje Cafetero Colombiano por microscopía de epiflurescencia. Por lo

cual se estandarizó la técnica y se evaluó el efecto de los sistemas productivos sobre los conteos

empleando DAPI. Para estandarizar la técnica se evaluaron tres variables: el uso de dos

pretratamientos, la evaluación de dos concentraciones de DAPI y dos esquemas de conteo.

Posteriormente en dos épocas de muestreo de diferentes características climáticas, se tomaron en

cada una 48 muestras compuestas de suelo. Se analizaron variables fisicoquímicas como pH,

porcentaje de humedad, temperatura del suelo y altura de la hojarasca y del cultivo.

Se determinó que dos lavados sucesivos en NaCl (0,85% p/v) a 13000 rpm por 5 minutos a una

concentración de 5 µg/ml de DAPI por 20 min y el uso de dos filtros, uno de la dilución

seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución generó los conteos mas altos, la CV

mas pequeña y la calidad del filtro mayor de todos los tratamientos evaluados.

Al analizar los datos en el sistema productivo se observó que presenta alta heterogeneidad, por lo

cual fue necesario analizar los datos por coberturas. La cobertura forestal presentó los mayores

conteos. Adicionalmente los cafetales sin sombrío, los guaduales y el cultivo de cebolla

mostraron ser las coberturas más variables mientras que los bosques y los pastizales fueron las

coberturas menos variables. Finalmente se observaron mayores conteos en el segundo evento de

muestreo.

Palabras claves: DAPI, sistemas productivos, conteos, densidad, suelo.

16

ABSTRACT

The purpose of the present study was to consider the soils microbial density of the different

productive systems from the Colombian coffee zone by epifluorescence microscopy. For this

reason this technique was standardized and the effect of the productive systems was evaluated on

the counts by using DAPI. To standardize the technique three variables were evaluated: the use of

two pre-treatments, two DAPI’s concentrations, and two count schemes. Sampling was

conducted at two different seasons (June and September) from 16 farms within 6 different

productive systems. Three random composite samples were collected from each farm for a 96

total samples. Physiochemical variables like pH, humidity, soil temperature and height of the

litter fall and cultivation were analyzed.

It was determined that the successive washings with NaCl (0.85% w/v) to 13,000 rpm by 5

minutes, staining with 5 µg/ml of DAPI by 20min and the use of two filters: one from the

selected dilution, and the second from the duplicate to the same dilution generated the highest

counts, the highest precision and in general the best quality of all the evaluated treatments.

The productive systems showed a high heterogeneity level indicating that the effect has to be

monitored at the covers level. The forest cover displayed greater microbial counts. Additionally,

the coffee plantations without shady, the bamboo an onion cultivations were the most variable

covers despite the fact that the forests and pastures were the less variable covers. Finally bigger

counts in the second event of sampling were observed.

Keywords: DAPI, productive systems, counts, density, soil.

.

.

.

17

1. INTRODUCCIÓN

El suelo es la matriz heterogénea y variable que soporta el mantenimiento de organismos de nivel

macro y microscópico. Los microorganismos son unidades biológicas, autónomas, de amplia

versatilidad metabólica capaces de utilizar compuestos, sintetizar biomasa y generar sustancias

útiles para otros organismos que necesitan sustratos en forma disponible y asimilable, y cumplen

funciones primordiales en la fijación de nitrógeno, la degradación de compuestos contaminantes

y el ciclaje de nutrientes y materia orgánica. Los microorganismos en el suelo se encuentran

definidos en fusión de la densidad. La densidad o abundancia total es definido como el total de

microorganismos por unidad de hábitat. Esta densidad conjugada con la riqueza y la abundancia

relativa ayudan a definir la diversidad de un ambiente. Para determinar la densidad microbiana

se pueden utilizar métodos de conteos directos e indirectos.

El presente trabajo se enmarca en el proyecto del centro de excelencia CIEBREG y

específicamente en caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad de paisajes naturales

asociados a sistemas productivos para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica. El trabajo

se desarrolló en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) y trabaja

específicamente en el programa de valoración de bienes y servicios ambientales de la

biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales en el complejo ecorregional Andes

del norte (CEAN) específicamente en las cuencas del río La Vieja y El Otún. Para evaluar

diversidad de microorganismos edáficos es necesario estimar al densidad microbiana en suelos

diferentes sistemas productivos de la cuenca del río La Vieja y El Otún para lo cual fue necesario

estandarizar el conteo directo de microorganismos por epifluorescencia utilizando 4'-6-

Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI), realizar el conteo directo de microorganismos del

suelo en diferentes sistemas productivos seleccionados del eje cafetero, evaluar el efecto de los

sistemas productivo sobre la densidad microbiana y comparar la densidad microbiana entre

sistemas productivos.

18

2. MARCO TEÓRICO

2.1. El suelo

El suelo es el material suelto de la superficie que suministra soporte físico y nutricional para el

crecimiento de plantas, animales y organismos (Eweis y Ergas, 1999). Geológicamente, “el suelo

se forma a partir de rocas mediante un proceso complejo en el que intervienen fuerzas físicas,

químicas y biológicas, que primero reducen la roca a regolíto (fragmento de roca) y después a

suelo. Los principales factores que participan en la formación y que afectan directamente la

composición del suelo son: el material original, el clima, la topografía, la actividad biológica y el

tiempo” (Atlas y Bartha, 2001). A nivel general, el suelo está compuesto por minerales, aire,

agua, materia orgánica y organismos vivos (Eweis y Ergas, 1999). Los materiales minerales

constituyen un 50% del volumen total del suelo y son los encargados de la regulación de los

procesos biogeoquímicos, siendo sustratos iniciales, aceptores de electrones o catalizadores para

reacciones bioquímicas en microorganismos (Eweis y Ergas, 1999, Maier et al., 2001). Por otro

lado, el aire y el agua constituyen del 25 al 50% del volumen total del suelo actuando como

reguladores del tamaño de los poros, aumentando la disponibilidad de aceptores de electrones y

reguladores de reacciones de oxido-reducción, entre otros (Eweis y Ergas, 1999).

El suelo generalmente es pobre en nutrientes y fuentes de energía (Nannipieri et al., 2003); su

materia orgánica está constituida por residuos vegetales o animales, microorganismos y

productos generados del metabolismo orgánico (Eweis y Ergas, 1999; Maier et al., 2001). La

porción húmica es una mezcla heterogénea compuesta de productos provenientes de los procesos

bioquímicos de los residuos orgánicos (Atlas y Bartha, 2001).

Microbiológicamente, el suelo es reconocido como uno de los sitios que presenta interacciones

biológicas más dinámicas en la naturaleza, contiene bacterias, hongos, algas y protozoarios que

intervienen en el ciclaje de nutrientes, y preservar la salud y la estructura del suelo. De igual

forma, estos organismos pueden aumentar la fertilidad, convirtiendo los sustratos en formas

asimilables o disponibles que contribuyen al sostenimiento del crecimiento vegetal (Alexander,

1987; Kennedy, 1999).

En el suelo se pueden encontrar diversos microambientes donde la actividad microbiana varía de

acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y a las condiciones fisicoquímicas. Estos

19

microambientes difieren como consecuencia del clima, materiales geológicos, topografía,

comunidades microbianas y el efecto del tiempo generando diferencias ambientales a pequeña

escala espacial afectando las comunidades microbianas (Meeting, 1993; Hartel, 2005).

En la distribución y diversidad microbiana del suelo influyen las características extrínsecas

relacionadas a las precipitaciones, el viento, la composición del suelo, humedad, pH, temperatura,

los organismos superiores como plantas o animales y las prácticas agrícolas (Toro, 2004). Las

características intrínsecas hacen referencia a los mecanismos de persistencia y resistencia

microbianas (esporas y cápsulas), el tamaño, la tasa de mortalidad y las cualidades bioquímicas

de los microorganismos (Coyne, 2000).

Las comunidades microbianas edáficas cumplen funciones fundamentales en el ciclaje de

nutrientes, descomposición de materia orgánica, efectos en la estructura y características

fisicoquímicas del suelo como humedad, pH y alcalinidad (Nannipieri et al., 2003; Singh et al.,

2006).

Diferentes estudios como Torsvik y colaboradores (1990) desarrollado en suelo de un forestal en

Noruega, utilizando microscopia de epifluorescencia con naranja de acridina, reportó 1.5 x 1010

bacterias por cada gramo de peso seco. Torsvik y Øvreås (2002) reportan 4.2 x 10 11 células por

gramo de peso seco con DAPI y Schmidt (2006), reporta una densidad de microorganismos

totales en 1 x 1010 organismos por gramo de suelo.

2.2. Técnicas directas e indirectas para conteo microbiano

Para entender las relaciones entre las poblaciones microbianas de un ecosistema, es necesario

poseer información del número, la actividad y desarrollo de los organismos en su hábitat (Atlas y

Bartha, 2001). Por esta razón, es necesario diseñar y desarrollar métodos que indiquen la

densidad y presencia o ausencia de organismos en una muestra. En estudios microbiológicos, es

importante reconocer cual es el objetivo principal para realizar el conteo microbiano, el tipo de

matriz, la composición y las posibles relaciones microbianas en la muestra manejando biomasa y

la actividad microbiana como datos independientes (Yu et al., 1995; Atlas y Bartha, 2001), por

tal razón, una metodología para todo tipo de muestras no se puede aplicar debido a su distinta

procedencia (Kirchman et al., 1982; Yu et al., 1995; Bhupathiraju et al., 1999; Atlas y Bartha,

2001; Proctor y Souza, 2001).

20

Se pueden considerar dos tipos de conteo de los microorganismos en distintos ecosistemas:

directo o indirecto. El conteo directo es una observación directa del microorganismo (Maier et

al., 2001) en el cual se reconocen por separado cada una de los individuos de una comunidad

existente en una muestra (Atlas y Bartha, 2001; Maier et al., 2001; Khan y Yadav, 2004; Wolffs

et al., 2005). Por otro lado, el conteo indirecto se define como la evidencia presuntiva de

microorganismos por medio de la búsqueda de productos metabólicos en ensayos cultivables

(Maier et al., 2001), evaluando la oxido-reducción de los metabolitos primarios o secundarios

utilizando reactivos que evidencian la presencia del microorganismo en la muestra.

El conteo directo es ampliamente usado en estudios que necesitan datos en cortos periodos de

tiempo, mientras que el conteo indirecto es usado para realizar análisis relacionados con la

actividad metabólica de los microorganismos, en ensayos que necesitan medios selectivos o

específicos para microorganismos (Tabla 1).

Existen organismos que debido a su sensibilidad, exigencia y metabolismo particular, necesitan

elementos, microelementos y condiciones de cultivo específicas para ser cultivados y así ser

manipulados en laboratorio. Los microorganismos que son poco exigentes o que necesitan

condiciones de cultivo similares a las que se le ofrecen en el laboratorio, son los considerados

cultivables, mientras los que tienen un mayor nivel de exigencia, se consideran no cultivables por

las dificultades de mantenerlos en condiciones de laboratorio.

Tabla 1. Parámetros de comparación entre los conteos directos e indirectos.

Conteo Directo Conteo Indirecto

Tiempo Corto Considerable por incubación

Sensibilidad Mayor Menor Precisión Mayor Menor

Alcance Viables, no viables y viables no cultivables

Solo viables.

Valores del conteo

Mayores Menores

Fuente: Pettipher y Rodrigues, 1982; Roszak y Colwell, 1987; Boulos et al., 1999.

21

2.2.1. Técnicas de conteo

Entre las técnicas mas utilizadas para cuantificar biomasa se han clasificado en tres grupos: 1) El

numero de bacterias cultivables determinado por un conteo en placa (CP) o por número mas

probable (NMP), 2) uso de marcadores específicos de moléculas biológicas por microscopia de

epifluorescencia y 3) métodos microautoradiograficos (Yu et al., 1995). Inicialmente, se utilizaba

el CP y NMP como métodos para estimar el número de microorganismos de una muestra sin

discriminar su origen. Sin embargo, estas técnicas no tienen en cuenta los microorganismos no

cultivables ni los que tienen un crecimiento lento, los tiempos de lectura se encuentran

estandarizados dependiendo del grupo de microorganismos que se desea contar y son sensibles a

las condiciones de cultivo como la temperatura y la composición del medio (Boulos et al., 1999)

(Tabla 2).

El uso de marcadores específicos de moléculas biológicas por microscopia, por ejemplo

competidores de los electrones en la cadena respiratoria, que al reducirse generan una

fluorescencia ó algún fenómeno físico como la sedimentación facilitando la enumeración de

microorganismos. El conteo directo por epifluorescencia genera un conteo más alto de

microorganismos con respecto al CP y NMP, debido a que se tienen en cuenta los organismos

viables no cultivables, viables cultivables y no viables, independientemente si los viables son

aerobios o anaerobios, psicrófilos, mesófilos o termófilos (Roslev y King, 1993, Yu et al., 1995,

Bhupathiraju et al., 1998, Boulos et al., 1999, Créach et al., 2003)(Tabla 3).

El método microautoradiográfico consiste en ligar un radioisótopo a la membrana celular del

microorganismo que se activa y se evidencia al tomar una placa radiográfica (Yu et al., 1995). El

uso de esta técnica depende del manejo de equipos específicos de alto valor económico lo que

dificulta su utilización.

.

.

22

Tabla 2. Ventajas y desventajas del conteo en placa y número más probable.

Técnica Característica

Conteo en placa

Ventajas

Practicidad • Fácil y práctica

Costos • Bajos costos

Conteo • Rango de conteo 30 a 300 UFC.

• Uso de diluciones

Desventajas

• Modificación del protocolo según el objetivo de trabajo

• Tendencia al error operativo y sistemático

• Tiempo de incubación dependiente del microorganismo

• Potencial de selectividad biológica.

• Selectividad nutricional.

NMP

Ventajas

Practicidad • Fácil

Costos • Bajos costos

Conteo • Basados en

estimación estadística.

Desventajas

• Modificación del protocolo según el objetivo de trabajo.

• Tendencia al error operativo y sistemático.

• Tiempos de incubación dependen de la técnica y del microorganismo.

• Poca precisión. Fuente: Noble y Ashton, 1991, Yu et al., 1995, Atlas y Bartha, 2001, Maier et al., 2001.

23

Tabla 3: Comparación de los métodos para el conteo en placa y directo por epifluorescencia

Conteo en Placa Conteo directo por epifluorescencia

Referencias

Tiempo de incubación Depende del

microorganismoa 1-12 horas Schallenberg et al.,

1989. Microorganismos no

cultivables No los cuenta Los cuenta

Lepeuple et al., 2004.

Variabilidad del conteo Variable No variable Rodríguez et al.,

1992. Manipulación de

muestra Alta Baja

Noble y Ashton 1991.

Uso de equipos específicos

No necesita Necesita

Toxicidad a microorganismos

Nula Considerable

Capacidad de recuperar microorganismos viables

Alta Nula

Anaerobios cultivables Los cuentab Los cuenta a Depende de la velocidad de duplicación del microorganismo que se desea.

b Por conteo en placa se pueden contar anaerobios cultivables al aumentar los costos por equipos específicos

2.2.2. Conteo directo por microscopia de epifluorescencia

La cuantificación del número bacteriano y la biomasa es de gran importancia para entender la

dinámica de las comunidades microbianas en el ambiente. Algunas modelos que se han utilizado

para el conteo celular y que han mostrado un amplio desarrollo, emplean el uso de radicales libres

de la respiración (p. e., sales de tetrasolium) y ligandos a membrana (p.e., primulina), que

generan un cambio molecular en el fluorocromo haciendo visible la presencia de un organismo.

Otras técnicas que se usan, son los fluorocromos (p.e. naranja de acrídina y DAPI (4'-6-

Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato), que al reaccionar con el material genético generan una

fluorescencia a una longitud de onda de excitación que puede ser observada y de esta forma ser

utilizada dependiendo del objetivo de la investigación (Tabla 4). Estas técnicas de conteo directo

por epifluorescencia, generan apreciaciones del número total de organismos, microorganismos

24

viables o no viables dependiendo del tipo de fluorocromo, generando una ventaja competitiva

frente al CP (Maki y Remsem 1981; Kepner y Pratt 1994; Yu et al. 1995; Minor et al., 2003).

El naranja de acridina o 3,6-bis (dimetilamino) clorhidrato de acrídina, es uno de los

fluorocromos más usados para el conteo directo por epifluorescencia (Kepner y Pratt, 1994). El

naranja de acridina se intercala fuertemente a la doble hélice del DNA por el grupo fosfato de los

ácidos nucleicos (Kepner y Pratt 1994, Rapposch et al. 2000). Sin embargo, por la interacción

DNA-Naranja de Acrídina se visualiza todo el DNA presente en la muestra, siendo imposible

distinguir entre los organismos metabolitamente inactivos, células viables y el material genético

ajeno al objetivo del ensayo (Tabla 4)(McFeters et al.1991; Kepner y Pratt 1994; Yu et al. 1995).

Tras la aparición del conteo directo como herramienta útil y de fácil aplicación, la gran mayoría

de los estudios empleaban el naranja de acridina como la mejor elección. Uno de las primeras

aproximaciones del uso de naranja de acridina en el conteo por epifluorescencia la realizó

Gwynfryn (1974) el cual aplico la técnica en aguas. Sin embargo, un estudio desarrollado por

Francisco y colaboradores (1975) estandarizó el proceso de conteo directo con naranja de

acridina en aguas. Otros estudios como Daley y Hobbie (1975) realizaron conteos de bacterias

del cuerpo de agua de un estuario y un lago, Ramsay (1978) realizó conteos de bacterias en

totales en aguas para compararlo con la actividad heterotrófica, Grivan y colaboradores (2003)

evaluaron el efecto del tipo de suelo en la composición, las comunidades microbianas cultivables

y totales en suelos de uso agrícola, entre otros.

Sin embargo, el desarrollo del DAPI presentó un avance importante en las técnicas de conteo

directo siendo muy superior al naranja de acridina debido al amplio especto de uso, mayor

especificidad y sensibilidad, no sobreestimación, no variación de los conteos y la coloración a

diferentes pH y porque el DAPI no reacciona con RNA (Porter y Feig, 1980; Kepner y Pratt,

1994; Yu et al., 1995). El DAPI es un tinte fluorescente que pertenece al grupo de los colorantes

del indol utilizado en la tinción del DNA, recomendado para teñir células de material botánico,

alimentos, agua, y suelos con microscopia y citometría de flujo (Diederichs y Beardsley, 2003;

Merck, 2004). El DAPI reacciona en el grupo fosfato del DNA específicamente cuando se

25

encuentra la porción nuclear rica en secuencias de A-T (Adenina - Timina), requiriendo mínimo

tres pares AT consecutivos para obtener una interacción fuerte (Kepner y Pratt, 1994) (Tabla 4).

Sin embargo DAPI colorea todo el DNA presente en la muestra sin discriminar si es bacteriano o

no y si es viable o no (Kepner y Pratt, 1994, Weinbauer et al., 1998). Algunos interferentes que

no tienen DNA desarrollan una coloración amarilla y otros como la clorofila una coloración roja

a 400 nm (Kirchman et al., 1982, Kuwae y Hosokawa, 1999).

El uso de DAPI en muestras de suelo, presenta algunos problemas relacionados con su

metodología. Un problema fundamental, es la presencia de coloides que pueden generar

autofluorescencia o unión no específica con el fluorocromo, presentándose enmascaramiento de

la unidad fluorescente y generando interferentes por perdida de capacidad de observación en los

campos de lectura (Maier et al., 2001, Schallenberg et al., 1989). A nivel práctico se entiende que

a diluciones altas, disminuye la interferencia coloidal, pero también decrece el número de

microorganismos lo que resulta en un conteo estadísticamente no representativo. Sin embargo,

en muestras de suelo, la concentración de microorganismos es suficientemente alta para realizar

diluciones seriadas hasta 10-5 o 10-6 revistiendo de menor importancia la interferencia coloidal

(Maier et al., 2001; Torsvik y Øvreås, 2002; Schmidt, 2006).

La interferencia coloidal se puede minimizar con una filtración eliminando las partículas de

tamaño superior a 20 µm (Maier et al., 2001). Además de lo anterior, se pueden realizar lavados

en soluciones isotónicas, con el fin de eliminar interferentes difundidos en solución de tamaño y

densidad menor que la población evaluada (Bae y Casida, 1972). Estos procesos también pueden

ser utilizados con el fin de eliminar material genético, población bacteriana muerta y clorofila que

puede generar un falso positivo para la prueba de conteo directo con DAPI como los minerales y

los detritos (Kuwae y Hosokawa, 1999).

26

Tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por epifluorescencia

Tipo muestra Limitaciones Ventajas Referencias

NARANJA DE ACRIDINA

• Aguas tratadas • Aguas residual • Lodos activados • Suelos • Alimentos • Uso clínico • Sedimentos

• Varía la coloración dependiendo del pH

• Colorea RNA/DNA • No discrimina entre viables y no

viables • Autofluorescencia por detritos • Reconoce todo el DNA • Genera falsos positivos

dependiendo del estado fisiológico del microorganismo

• Se reconoce la célula aparte de la fluorescencia por la forma y el tamaño

• Prueba rápida

• Duffy y Sheridan, 1998 • Girvan et al., 2003 • Hoff et al., 1995 • Kepner y Pratt, 1994 • McCarthy and Senne, 1980 • Mc Feters et al., 1991 • Rapposch et al., 2000 • Yu et al., 1995

DAPI

• Aguas tratadas • Aguas residuales • Lodos activados • Suelos • Alimentos • Inmunología • Sedimentos

• Fluorescencia de fondo • Poca definición dependiendo de

la muestra • No se puede almacenar la

muestra coloreada por mucho tiempo

• Autofluorescencia del suelo • Manchado de todo el DNA de la

muestra • Uso de sistema de extracción

celular en muestras sólidas o semisólidas

• Se reconoce el microorganismos aparte de la fluorescencia por la forma y el tamaño

• Conteo de células totales

• Creach et al., 2003 • Diederichs et al., 2003 • Duffy y Sheridan, 1998 • Kuwae y Hosokawa, 1999 • Porter y Feig, 1980 • Quéric et al., 2004 • Schallenberg et al., 1989 • Smith y McFeters, 1997 • Yu et al., 1995

PRIMULINA

• Aguas costeras • Aguas subterráneas • Uso clínico

• Uso de filtros de excitación y lectura por aparte.

• Reacción con detritos.

• No interfiere con la lectura de fluorescencia de la clorofila

• Minimiza enmascaramiento de clorofila

• Caron, 1979 • McKenzie et al., 1992

27

Continuación tabla 4: Comparación de los distintos colorantes usados en conteos directos por epifluorescencia

Sales de tetrazoleo Tipo muestra Limitaciones Ventajas Referencias

INT

• Aguas tratadas. • Aguas residuales • Lodos activados • Suelos. • Uso clínico.

• INT-formazan es insoluble. • Dificultad al leer INT-formazan

en células pequeñas. • Baja taza de reducción. • Soluble en aceite de inmersión. • Baja sensibilidad.

• Alto espectro de reducción. • Conteos de viables no

cultivables. • Depósitos de INT reducido

internos.

Bitton y Koopman, 1982 Duffy y Sheridan, 1998 Harvey y Young, 1980 Hatzinger et al., 2003 Maki, et al., 1981 Rodríguez et al., 1992 Roslev y King, 1993 Smith y McFeters, 1997

XTT

• Suelos • Lodos activados

• Utiliza isótopos radioactivos (opcional del fabricante)

• Muestra un potencial de retención en la célula del colorante reducido

• Alta citotoxicidad • Alta tasa de retención bacteriana

• Necesita el transportador de electrones

• Fácil reducción química • Algunas especies reducen

el XTT

Hatzinger et al., 2003 Kuhn et al., 2003 Mc Feters et al., 1991 Roslev y King, 1993 Shimamura et al., 2003 Smith y McFeters, 1997

CTC

• Alimentos • Suelos • Lodos • Aguas contaminadas • Aguas tratadas • Patología

• Es inhibido por transportadores de electrones.

• Disminuye el conteo con inhibidores de la cadena respiratoria.

• Es necesario aumentar la tasa metabólica para tener conteos altos.

• Conteo de viables y no viables.

• No deja coloración de fondo.

• Se observa CTC reducido en pequeñas concentraciones.

• Boulos et al., 1999 • Creach et al., 2003 • Duffy y Sheridan et al., 1998 • Hatzinger et al., 2003 • Jugnia, L. et al., 2000 • Lepeuple et al., 2004 • Proctor y Souza, 2001 • Rodríguez et al., 1992 • Yu et al., 1995

28

De acuerdo con Schallenberg y colaboradores (1989), la aplicación de concentraciones

erróneas de DAPI en muestras de suelo, causan una subestimación del conteo

bacteriano. En diferentes estudios han utilizado concentraciones de 0.01, 0.5, 5.0 y 10.0

µg/ml de DAPI para el conteo bacteriano obteniendo buenos resultados (Yu et al., 1995;

Schallenberg et al., 1989). Sin embargo, Schallenberg y colaboradores (1989) afirman

que la concentración óptima para el conteo directo por epifluorescencia con DAPI para

muestras ambientales, es de 5 µg/ml en muestras que tengan un contenido de agua de 50

al 99%.

El DAPI ha sido ampliamente utilizado. Un estudio realizados por Coleman (1980)

reportó el uso del DAPI para la detección de bacterias en aguas. Porter y Feig (1980)

identificaron y contaron microflora acuática con DAPI. Kirchman y colaboradores

(1982) realizaron un estudio enfocado en al análisis estadístico del método de conteo

directo para la enumeración bacteriana con DAPI. Hymel y Plante (1998) realizaron el

conteo bacteriano en suelos arenosos, fangos y otras matrices evaluando cualitativa y

cuantitativamente la tinción. Banks y colaboradores (2003), determinaron como afecta

la absorción y transporte bacteriano en columnas de suelos saturados. Diederichs y

colaboradores (2003) realizaron un estudio utilizando hibridación in situ fluorescente

(FISH) para determinar la microflora bacteriana que alimenta ciliados determinando la

población total con DAPI, Caraccioloa y colaboradores (2005) aplicaron FISH en suelos

y en acuíferos respectivamente aplicando DAPI para determinar los microorganismos

totales en la muestra.

Otro fluorocromo utilizado para conteos microbianos es la Primulina, un colorante que

se desarrolló para la diferenciación de microorganismos heterótrofos y fotótrofos en

columnas de agua (Caron 1983; McKenzie et al. 1992). Esta técnica se desarrollo

debido a la interferencia y dificultad que presentaban colorantes como el naranja de

acridina al contar microorganismos en muestras ambientales al presentar interferencia

con la clorofila debido a que el máximo de excitación del naranja de acridina (580 nm) y

la clorofila (660 nm) es muy cercano haciendo necesaria la preparación de dos filtros

(Caron 1983). De esta forma la primulina que tiene una longitud de onda de excitación

29

máxima de 425 nm no interfería con la clorofila y se podían leer en la misma

preparación (Caron 1983) (Tabla 4).

Por otro lado, las sales de tetrazoleo son ampliamente utilizadas en los ensayos

biológicos, incluyendo localización y medición de la actividad de las oxidoreductasas, la

detección de radicales superóxido, pruebas de viabilidad y crecimiento bacteriano

(Bernas y Dobrucki 2000). Las sales de tetrazoleo sirven como fuertes aceptores de

electrones que al tener contacto con el sistema transportador (STE) se oxidan, generando

una molécula fluorescente a una longitud de onda particular (McCluskey et al. 2005;

Roslev y King 1993).

Una de las sales de tetrazolium más utilizadas es el (2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5

Fenil Clorhidrato de Tetrazolio (INT) que se emplea para la cuantificación del potencial

de respiración, generando una precipitación o una reacción calorimétrica que determina

la producción de INT reducido o como se le llama comúnmente, INT-formazán (Harvey

y Young, 1980; Maki et al., 1981; Bitton y Koopman, 1982) (Tabla 4).

Harvey y Young (1980) enumeraron bacterias en un pantano salado por medio de INT.

Maki y Remsen (1981) realizaron la comparación del INT con el cultivo en placa para

determinar el metabolismo bacteriano en aguas. Trevors y colaboradores (1983)

utilizaron INT para determinar un efecto tóxico de sustancias ambientales en algas.

Dufour y Colon (1992) aplicaron una metodología con INT y DAPI para realizar conteos

de microorganismos viables y totales en ambientes acuáticos. Mosherr y colaboradores

(2003) utilizaron INT para demostrar la actividad de la deshidrogenasa en sedimentos

contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos.

Otra sal de tetrazolium, 2.3-Bis (2-Metoxi-4-Nitro-5-Sulfofenil) -5- [(fenil-amino)

Carbonil] -2H-Hidróxido de Tetrazolio (XTT), es un potente indicador de viabilidad en

células tanto procariotas como eucariotas (Ahmed et al., 2004; Kuhn et al., 2003). El

XTT es una sal soluble en agua que presenta un potencial de reducción químico alto, es

30

de rápida reducción, fácil visualización y preparación frente a otros colorantes como el

INT (Kuhn et al., 2003; Vallejo et al., 2006).

Paull y colaboradores (1988) fueron los primeros en sintetizar el XTT. Roslev y King

(1993) utilizaron el XTT como indicador de viabilidad bacteriana en cultivos de

Methylosinus trichosporium, Pseudomonas putida, Escherichia coli y Bacillus subtillis.

Guyard y colaboradores (1999) enumeraron y caracterizaron bacterias un nacimiento de

agua. Bensaid y colaboradores (2000) usaron XTT para la estimación de la actividad

biológica en lodos activados. Vallejo y colaboradores (2006) compararon XTT con INT

utilizando NMP para estimar la densidad de microorganismo degradadores de

hidrocarburos.

El 5-ciano-2,3-ditolil cloruro de Tetrazolio (CTC), es una sal de tetrazolium que se

reduce en CTC-formazan el cual es acumulado intracelularmente, generando una alta

fluorescencia (Roslev y King, 1993; Yu et al., 1995; Smith y McFeters, 1997;

Bhupathiraju et al., 1999; Sieracki et al., 1999) (Tabla 4). El CTC a diferencia de INT,

en forma reducida no produce fluorescencia de fondo, a pesar de ser insoluble. Por lo

anterior, el conteo directo con CTC es notablemente superior al conteo con INT

(Rodríguez et al., 1992; Yu et al., 1995).

Rodríguez y colaboradores (1992) utilizaron por primera vez el CTC para determinar el

número de bacterias activas en muestras de agua. Sieracki y colaboradores (1999)

utilizaron citometría de flujo con CTC para evaluar el bacterioplanton marino activo.

Bhupathiraju y colaboradores (1999) evaluaron la actividad metabólica de bacterias

anaeróbicas. Proctor y Souza (2000) determinaron la cantidad de células activas

especificas al CTC en sedimentos de río, costa y esturarios. Créach y colaboradores

(2002) determinaron el uso y las limitaciones del CTC en la estimación de las bacterias

activas con E. coli. Lepeuple y colaboradores (2004) compararon el uso del CTC, el

conteo de viables totales por escaneo láser y viables cultivables en muestras de aguas de

distintas plantas de tratamiento.

31

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1. Formulación del problema

En Colombia se han desarrollado un limitado número de investigaciones sobre

diversidad microbiana edáfica debido a la complejidad nutricional, condiciones de

cultivo y la dificultad de la recuperación de los microorganismos no cultivables. El

Centro de Investigaciones y Estudios en Biodiversidad y Recursos Geneticos

(CIEBREG) está enfocado a la valoración y monitoreo de la diversidad en paisajes

naturales asociados a sistemas productivos a todos los niveles tróficos en el complejo

ecorregional de los andes del norte (CEAN). Reconociendo la real importancia de los

microorganismos en los procesos ambientales y servicios ecosistémicos, en la Unidad de

Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), se estudia la diversidad microbiana

edáfica. Para desarrollar este estudio, es necesario determinar la abundancia total de

microorganismos edáficos, que es el objetivo general de este trabajo de grado.

Adicionalmente, en USBA no se contaba con un protocolo estandarizado para el conteo

de microorganismos totales en suelos.

.

32

3.2. Justificación

Una de las regiones más densamente pobladas y sobreexplotada de Colombia es el

CEAN. Según algunos trabajos realizados por las Corporaciones Autónomas

Regionales, la densidad poblacional es de 378 h/km2, con un 39.4% de la población

nacional en 0.26% del territorio colombiano (CRQ et al., 2005). Sin embargo, a pesar

de esta problemática, se ha logrado mantener algunos focos ecológicos inexplorados o

poco intervenidos entre suelos dedicados al uso agrícola en la cuenca del río La Vieja y

El Otún. Estos territorios han sido sujeto de algunos estudios e investigaciones en pro

de su conservación biológica, la preservación y/o la forestación (CRQ et al., 2005).

Uno de estos estudios está siendo desarrollado por el Centro de Excelencia CIEBREG

con apoyo de Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología

(COLCIENCIAS) al cual pertenece la Pontificia Universidad Javeriana y la Unidad de

Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA). Este proyecto busca valorar los

bienes y servicios ambientales en las cuencas del río La Vieja y Otún para lo cual se

hace necesario a nivel microbiológico estimar las densidades microbianas, para

determinar los índices de diversidad de algunos grupos funcionales estudiados en

USBA.

33

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Evaluar el efecto de los sistemas productivos sobre la densidad de

microorganismos edáficos en suelos del eje cafetero en las cuencas de los ríos La

Vieja y El Otún.

4.2. Objetivos específicos.

• Estandarizar el conteo de microorganismos por epifluorescencia utilizando

DAPI.

• Estimar la densidad microbiana en los sistemas productivos predominantes en

la ecorregión cafetera.

• Evaluar el efecto de los sistemas productivos sobre la densidad microbiana.

34

5. MATERIALES Y MÉTODOS

El conteo directo de los microorganismos del suelo se realizó utilizando microscopio de

epifluorescencia con 4'-6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). Inicialmente, se

realizó la estandarización de la técnica para conteo de microorganismos en el laboratorio

de USBA con un cultivo de E. coli a una concentración conocida y con una muestra de

suelo. Para la estandarización del protocolo de tinción se modificaron algunos de los

pasos reportados en la literatura para disminuir la variabilidad y la presencia de

interferentes e incrementar la exactitud. Con base con los resultados obtenidos durante

la estandarización, se estableció el protocolo de tinción para realizar los conteos durante

la fase de campo del estudio.

5.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo utilizando DAPI:

5.1.1. Cultivo de E. coli o control de procedimiento: con el fin de obtener una

solución con una concentración conocida de bacterias, se realizaron curvas de

crecimiento por absorbancia y UFC en el tiempo, y se estableció una curva de

calibración de Unidades Formadores de colonia (UFC)/ml vs. absorbancia (600 nm).

Para la realización de estas curvas, se empleó un cultivo de E. coli ATCC 25922 (PUJ-

M-Bio-USBA-107), al cual se le realizaron dos preinóculos consecutivos en caldo

nutritivo (Pronadisa, 1216) a 1/5 del volumen del recipiente a 25ºC por 24 h a 160 rpm.

Del segundo preinóculo, se hizo un cultivo en caldo nutritivo a 25ºC a 160 rpm, del cual

se tomaron muestras para realizar recuentos en agar nutritivo (Dibico, 1022-E) y

mediciones de absorbancia en el tiempo para poder obtener la línea mejor ajuste. La

curva de calibración se utilizó para conocer una abundancia específica a una absorbancia

definida y utilizar esa concentración para la estandarización del conteo con DAPI.

5.1.2. Estandarización de la tinción utilizando suelo: se utilizaron muestras de suelo

de jardín por duplicado. Las muestras se transportaron y mantuvieron a 4-6 ºC hasta su

análisis.

35

5.1.3. Descripción del protocolo de tinción: Se utilizó el protocolo usado por

Casamayor (2006) en el Centro de estudios avanzados de Blanes (CEAB), el cual está

basado en el protocolo propuesto por Porter y Feig (1980), para la identificación y

conteo de microbiota acuática utilizando DAPI, y en el estudio realizado por Kirchman y

colaboradores (1982) en un estudio enfocado en al análisis estadístico del método de

conteo directo para la enumeración bacteriana con DAPI (Figura 1).

Extracción de microorganismos

Filtración

Tinción

Acondicionamiento del filtro

Conteo

Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo utilizado para el conteo con DAPI

(Casamayor, 2006).

36

5.1.3.1. Extracción de microorganismos: El paso inicial para el conteo directo es la

extracción de los microorganismos presentes en el suelo. La estandarización de la

extracción fue realizada por Latorre (2007) donde 10 g de suelo fueron colocados en 90

ml de solución salina al 0,85% p/v (grado reactivo; J.T.Baker). La mezcla fue

homogenizada en un agitador orbital (I2100; New Science) a 160 rpm por 15 min y se

dejó sedimentar por 5 min. Se realizaron diluciones seriadas del sobrenadante en base

10 hasta 10-6 en solución salina (0.85% p/v) previamente filtrada (GSWP04700;

millipore) y esterilizada a 121oC, 15 lb de presión por 15 min.

5.1.3.2. Filtración: se colocó 1 ml de la dilución seleccionada en 9 ml de solución salina

(0.85% p/v). La muestra fue mezclada por vortex y filtrada utilizando un filtro de 0,22

µm de policarbonato negro de 25 mm de diámetro (GTBP02500, Millipore) con ayuda

de una bomba de vació a 25 psi (ROA-P164-AA:GAST). Finalmente el filtro se dejó

secar por 20 min a temperatura ambiente antes de la tinción.

5.1.3.3. Tinción: se agregaron 100 µl de DAPI (D9542; Sigma) sobre toda la superficie

del filtro de manera homogénea con una micropipeta (la concentración y el tiempo de

contacto se evaluaron en 5.1.4.2). Posteriormente, el filtro se lavó con agua MilliQ por 1

min y se enjuagó en etanol (70% v/v) por 2 s, para finalmente dejarse secar a

temperatura ambiente en oscuridad por 20 min.

5.1.3.4. Acondicionamiento del filtro: El filtro seco se colocó en una lámina porta

objetos y se le agregó en el centro una gota de aceite Citifluor AF1 (No. 17970-25;

Electrón Microscopy). Luego se le colocó una laminilla presionando fuertemente para

evitar la formación de burbujas. Al montar la lámina en el microscopio de

epifluorescencia (Eclipse 5.0i, Nikon) se utilizó un filtro de doble acción, excitación de

400 a 418 nm y lectura de 450 a 465 nm, y aceite de inmersión de baja luminiscencia (50

tipo NF, Nikon).

37

5.1.3.5. Conteo: Se consideró como células los óvalos, círculos y puntos definidos que

mostraron una coloración azul fluorescente durante la observación. En caso de

observarse un número de células por rejilla de lectura menor a 30, se leyeron 50 campos

aleatorios por filtro y en caso de presentarse un número mayor de cel/campo, se leyó 20

campos aleatorios por filtro (Casamayor, 2006) (Figura 2).

Figura 2. Células coloreadas con DAPI en una muestra de suelo.

5.1.4. Modificaciones al protocolo de tinción: El incremento de la variabilidad en los

conteos de microorganismos es favorecida por: la interferencia de la matriz de suelo

(Schallenberg et al., 1989, Maier et al., 2001), la concentración del colorante y tiempo

de reacción (Schallenberg et al., 1989), uso de submuestras, diferentes tipos de filtros y

38

el número de campos de lectura (Kirchman et al., 1982). Por esa razón en el presente

estudio se evaluaron como variables: a) el efecto de un pretratamiento realizando un

prefiltrado (Maier et al., 2001) y un lavado de células, b) uso de la concentración

adecuada de DAPI, 5 µg/ml por 20 min (Schallenberg et al., 1989) y 10 µg/ml por 40

min (Yu et al., 1995) y c) dos esquemas de conteo que se explicarán en 5.1.5.3.

(Figura 3).

Extracción de microorganismo

Filtración

Tinción

Acondicionamiento del filtro

Conteo

Figura 3. Diagrama de flujo del protocolo de tinción y las modificaciones evaluadas.

A, B y C hacen referencia a los pasos evaluados para la estandarización del conteo

con DAPI.

2

1

10 µg/ml x 40 min

5 µg/ml x 20 min

Lavado

Prefiltrado

B

Prefiltrado y

lavado de

células como

Esquemas

de conteo

A

C

Uso de la

concentración

39

5.1.4.1. Evaluación de un pretratamiento para eliminar interferencia de la matriz

de suelo: Se evaluaron dos pretratamientos para reducir la interferencia causada por la

fluorescencia de la matriz en las muestras (Figura 3):

1. Un prefiltrado de la dilución del extracto de células utilizando un filtro de

fibra de vidrio de 42 mm de diámetro (2.0-8.0 µm) (AP2502500; Millipore)

(Maier et al., 2001).

2. Dos lavados sucesivos de la dilución del extracto de células utilizando

solución salina (0.85% p/v) por centrifugación a 13,000 rpm por 5 min.

5.1.4.2. Evaluación de la concentración de DAPI para la tinción: Se evaluaron dos

concentraciones de DAPI a 5 µg/ml por 20 min (Schallenberg et al., 1989) y 10 µg/ml

por 40 min (Yu et al., 1995) para determinar la concentración óptima del colorante en

muestras de suelo.

5.1.4.3. Esquema de conteo: Se evaluaron dos esquemas de conteo para aumentar la

precisión y evitar la variabilidad en cada muestra. El primer esquema consistió en

obtener dos filtros de la dilución seleccionada de cada muestra, mientras que el segundo,

consistió en obtener 2 filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo de un

duplicado a la misma dilución (Figura 4).

Figura 4. Comparación de los esquemas de conteo de la técnica para una mayor

precisión por Kirchman y colaboradores (1982), 1) dos filtros de la dilución

seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el

segundo del duplicado de la dilución.

20 ó 50 campos de lectura

2

1

Dilución

10-5

40

5.1.5. Tratamientos y análisis visual de los filtros para la estandarización del

protocolo de tinción: Inicialmente se utilizó el cultivo de E. coli de concentración

conocida para seleccionar los tratamientos que presentaran los mayores conteos y una

muestra de suelo para seleccionar el mejor tratamiento con base en los recuentos y en el

análisis visual. Cada tratamiento correspondió al conjunto de modificaciones que fueron

evaluadas (Tabla 5). Para el análisis visual de los filtros se observó la disminución de

los interferentes de lectura, la eliminación de la fluorescencia de fondo, la fluorescencia

de las células y del borde, la nitidez del filtro y la distribución homogénea de las células

en el filtro.

5.1.6. Control de calidad del conteo: Como control de calidad durante el proceso de

tinción, se utilizaron 3 parámetros: la distribución homogénea de las células en el filtro

de lectura, la baja fluorescencia de fondo y la definición de la tinción del borde del

microorganismo. Estas características se aplicaron estrictamente a cada filtro de lectura

y en caso de cumplirse, los filtros se desechaban y se repetía el proceso.

Tabla 5. Tratamientos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI utilizando un cultivo de E. coli y las muestras de suelo.

Tratamiento Pretratamiento [DAPI] µg/ml Esquema Conteoa

1 Prefiltrado 5 1 2 Prefiltrado 5 2 3 Lavado 5 1 4 Lavado 5 2 5 Prefiltrado 10 1 6 Prefiltrado 10 2 7 Lavado 10 1 8 Lavado 10 2

a 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la

dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución.

5.1.7. Análisis estadístico para la estandarización: Inicialmente, se observó si los

datos presentaban una distribución normal y la homogeneidad de varianza con la prueba

de Bartlett (p<0.05). Para su análisis estadístico los datos fueron transformados con el

logaritmo base diez y analizados con pruebas paramétricas. Se valuó la precisión

41

utilizando el porcentaje del coeficiente de variación (% CV) y la exactitud comparando

la concentración del control (cultivo de E. coli) con el valor obtenido durante el conteo.

Para las muestras de suelo se observaron diferencias entre los tratamientos con la prueba

de Tukey-kramer (p<0.05) para escoger el que tenga los mayores conteos.

5.2. Estimación de la densidad microbiana en suelos de la ecorregión cafetera

utilizando DAPI

5.2.1. Muestreo: En cada una de las coberturas seleccionadas (Tabla 6), se ubicaron

aleatoriamente tres cuadrantes (2.5m x 2.5m) representativos, a por lo menos 30 m del

borde, para evitar el efecto borde. Se tomó una muestra en cada vértice y del centro de

los cuadrantes con un barreno de 15 cm de largo por 5 cm de diámetro en la cabeza de

toma de muestras. Se obtuvo una muestra compuesta por cuadrante después de mezclar

vigorosamente en un plástico de alta densidad las muestras obtenidas de todos los puntos

del cuadrante. De esta mezcla, se tomaron 2 kg de suelo en una bolsa de cierre

hermético la cual fue refrigerada (4-6 ºC) durante su transporte hasta el laboratorio de

USBA y su posterior análisis.

5.2.2 Unidades de muestreo

En el marco de la investigación del CIEBREG, se tomaron como unidad macro del

muestreo las dos ventanas correspondientes a la cuenca del río La Vieja y Otún en la

ecorregión cafetera. Estas ventanas fueron seleccionadas con criterios de

heterogeneidad espacial, gradiente altitudinal y estructuras de paisaje por medio de un

análisis de correspondencias canónicas de características bióticas y abióticas (Camargo,

2006). Una vez definidas las ventanas, se tomaron como siguiente nivel de muestreo

los sistemas productivos que correspondían a conjuntos de propiedades que reflejan un

tipo particular de aprovechamiento y uso de la tierra (Camargo, 2006). Se seleccionaron

dentro de los sistemas productivos las coberturas, que son el uso determinado del suelo

en función de sus productos y finalmente, la unidad de muestreo más pequeña fueron las

las fincas y en las cuales se tomaron tres cuadrantes escogidos aleatoriamente (Tabla 6).

42

5.2.2.1. Ventana La Vieja

La cuenca hidrográfica del río La Vieja sostiene una intensa actividad agropecuaria y

una alta densidad poblacional, convirtiéndose en una zona importante para la

preservación de los ecosistemas de la ecorregión cafetera. La cuenca está ubicada entre

los departamentos de Quindío, Risaralda y Valle del Cauca con una área de ~2,925 km2.

Geográficamente la cuenca está ubicada entre 4° 04´ y 4° 49´ de latitud norte y 75° 24´ y

75° 57´ de longitud oeste (CRQ et al., 2005). La cuenca del río La Vieja presenta una

gran heterogeneidad ambiental evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas

(Tabla 7) (Díaz et al., 1996).

5.2.2.2. Ventana El Otún

La cuenca hidrográfica del río El Otún esta ubicada el departamento de Risaralda, con

un área de ~67 km2, nace en el nevado de Santa Isabel y desemboca en el río Cauca. Se

han encontrado bosques premontanos de alta humedad con vegetación arbórea,

pastizales naturales y mejorados, y cultivos mixtos (cebolla y aromáticas) (Beltrán et al.,

1988) (Tabla 8).

Tabla 7. Descripción general de la cuenca del río La Vieja.

Característica Descripción

clima Medio húmedo transaccional a medio seco

disposición Superficial o moderadamente profundo

composición Texturas finas o moderadamente finas

pH Moderadamente ácido

erosión Moderada a severa

Fuente: Díaz et al., (1996).

43

Tabla 6. Sistemas productivos, coberturas y fincas seleccionadas en la cuenca del río La Vieja y El Otún.

Ventana Sistema productivo Cobertura Finca

La Vieja

Ganadería de carne

Bosque La Ilusión

Pastizal La Ramada

Guadual La Ramada

Cultivos mixtos

Guadual La Comarca

Cafetal sin sombrío El Bolsillo

Cafetal sin sombrío La Alegría

Ganadería de leche Bosque Bremen

Pastizal Villa Ximena

El Otún

Cultivos mixtos

Cebolla Macarena

Bosque Santa Helena

Cebolla Bella Vista

Guadual Mandalay

Guadual La Playa

Cultivos forestales Forestales Playa Rica

Forestales Lisbrán

Áreas protegidas Bosque La Pastora

5.2.3. Eventos de muestreo: el primer muestreo se realizó del 10 al 24 de junio de

2006 y el muestreo segundo del 14 al 21 de octubre de 2006.

5.2.4. Parámetros fisicoquímicos: se evaluó la temperatura, pH y humedad del suelo.

La temperatura in situ se tomó con un termómetro de campo a 20 cm de profundidad, el

pH se determino de acuerdo al protocolo de la Agencia Ambiental de Estados Unidos

(EPA, 9045c) y el porcentaje de humedad se tomó de acuerdo al protocolo del Instituto

Geográfico Agustín Codazzi (1979). pH y humedad fueron evaluados en las muestras

compuestas de suelo en el laboratorio.

44

Tabla 8. Descripción general de la cuenca del río El Otún.

Característica Descripción

clima Medio húmedo y frío

disposición Drenados, profundos y moderadamente profundos

composición Texturas finas con alto contenido orgánico, y suelos pobres en fósforo y de poca fertilidad

pH De moderadamente ácido a extremadamente ácido.

erosión Susceptibles a procesos de erosión

Se tienen dos descripciones IVe y VIIesc2 según el IGAC para la cuenca del río La Vieja.

Fuente: Beltrán et, al. 1988.

5.3. Análisis estadístico para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los

conteos de microorganismos totales. Para evaluar el efecto del sistema productivo

sobre los conteos, se utilizó una t-studen (p<0.05 o p<0.02) ó un análisis de varianza

(ANOVA) (p<0.05 o p<0.02) y una prueba de Tukey-Kramer (p<0.05) según el caso.

.

.

45

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo con DAPI:

6.1.1. Control de procedimiento con E. coli para el conteo directo con DAPI

Para obtener la curva de crecimiento con recuentos mayores a 1 x 1010 UFC/ml fue

necesario llevar la absorbancia a rangos mayores a 1 unidad de absorbancia (UA). Para

realizar la curva de las absorbancias en el tiempo, se empleó una dilución 1/40 y los

valores fueron correlacionados con los recuentos para obtener la curva de calibración

de absorbancia vs. recuento en placa (Figura 5) (Tabla 9).

Utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste

absmlufcmlufcabsabs XY 1909,0109 1/12 +×= −×

− se estableció que un cultivo a una dilución

1/40 con una absorbancia de 0.460 tendría un recuento de 1.2 x 1012.

Tabla 9. Recuentos en placa y absorbancia de E. coli en el tiempo

Tiempo (min) Recuento Abs* 0 4,45E+09 0,101 30 4,1E+09 0,138 50 4,35E+09 0,163 70 5,35E+09 0,173 90 6,5E+09 0,204 110 1,35E+10 0,307 130 2,85E+10 0,451 150 4,55E+10 0,6125 170 6,3E+10 0,792 190 8,1E+10 0,9145

*Absorbancia después de la dilución 1:40

46

6.1.2. Evaluación de los tratamientos utilizando E. coli como control de

procedimiento

Durante la evaluación de los diferentes tratamientos para la estandarización de la

tinción se utilizó un cultivo de E. coli a una concentración de 1.2 x 1012 UFC/ml. Se

escogieron los 4 tratamientos que tuvieron los conteos mayores, independiente de su

precisión, y buscando el metodo que favoreciera la mayor recuperacion de

microorganismos. De esta forma, los tratamientos 1, 3, 7 y 8 (anexos D y E) mostraron

los mayores conteos indicando que la combinación de un lavado como pretratamiento y

el uso de un esquema de conteo de dos filtros de la misma dilución presentaban los

mayores conteos.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1E+10 2E+10 3E+10 4E+10 5E+10 6E+10 7E+10 8E+10 9E+10

Conteo en placa (UFC/ml)

Abs

orba

ncia

(60

0 nm

)

Figura 5. Curva de calibración (absorbancia vs. recuento en placa) del cultivo de E.

coli. Se presenta el promedio de dos valores.

En todos los tratamientos se observó que los conteos obtenidos con DAPI fueron

mayores a los recuentos en placa de la curva de calibración (Tabla 10). Los principales

factores que pudieron afectar los recuentos en placa pueden ser atribuidos a los errores

durante la toma y homogenización de volúmenes con micropipetas y rastrillos, y de

igual forma a factores fisiológicos como la concentración de nutrientes (fuente de C y


−

47

N) y condiciones de incubación como temperatura y concentración de oxígeno

(McCaing et al., 2001; Merck, 2005).

Se observó que de los tratamientos seleccionados que presentaron mayores recuentos

tenían en primer esquema de conteo (dos filtros de la misma dilución seleccionada),

presentó la mayor precisión expresada como el porcentaje del coeficiente de variación

(%CV) (Tabla 10). El alto recuento y la alta precisión de este esquema de conteo,

permite seleccionarle como método a utilizar durante el estudio.

Tabla 10. Conteos obtenidos durante la estandarización del proceso de tinción utilizando E. coli.

Tratamientos Pretratamiento [DAPI] aµµµµg/ml Esquema conteob Cel/ml %CV c

1 Prefiltrado 5 1 3,45 x 1012 10,75 2 Prefiltrado 5 2 1,85 x 1012 6,37 3 Lavado 5 1 1,89 x 1012 11,90 4 Lavado 5 2 1,50 x 1012 22,22 5 Prefiltrado 10 1 1,64 x 1012 8,12 6 Prefiltrado 10 2 1,72 x 1012 14,45 7 Lavado 10 1 6,05 x 1012 17,24 8 Lavado 10 2 3,61 x 1012 66,73

a El tiempo de reacción para la concentración de 5 µg/ml de DAPI corresponde a 20 min y

para la concentración de 10 µg/ml es de 40 min. b Esquemas de conteo, 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos

filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución. c %CV = coeficiente de variación = (ds/media)

Se presenta el promedio de dos valores obtenidos.

De acuerdo a un estudio realizado por Kirchman y colaboradores (1982), en el análisis

estadístico de un método de conteo directo de enumeración bacteriana, la varianza es

menor cuando se usan dos filtros de una misma submuestra y no un filtro por cada

submuestra. Al analizar el %CV, el menor pertenece a un prefiltrado a una

concentración de 5 µg/ml y el segundo esquema de conteo. Sin embargo, el mayor

%CV pertenece a un lavado a una concentración de 10 µg/ml y el segundo esquema de

conteo, lo que puede significar un efecto externo del lavado o de la concentración del

colorante. Un estudio realizado por Schallenberg y colaboradores (1989), enfocado en

la solución de problemas en la enumeración de bacterias del sedimento por conteo

48

directo, afirma que el uso de DAPI a concentraciones diferentes a 5 µg/ml genera la

subestimación en los conteos. Si se tiene en cuenta que los conteos para ese

tratamiento fueron altos, se pudo presentar este efecto en alguno de los filtros de las

submuestras.

Con base en los resultados obtenidos del recuento con DAPI en el control de

procedimiento en el presente estudio se seleccionó: 1) el prefiltrado a una

concentración de 5 µg/ml por 20 minutos con el primer esquema de conteo, 2) el

lavado a una concentración de 5 µg/ml por 20 minutos con el primer esquema de

conteo, 3) el lavado a una concentración 10 µg/ml por 40 minutos con el primer

esquema de conteo y 4) el lavado a una concentración de 10 µg/ml por 40 minutos con

el segundo esquema de conteo porque presentan los mayores conteos en primera

instancia y %CV menor como segunda medida.

6.2. Evaluación de los tratamientos seleccionados para la estandarización

utilizando muestras de suelo

Con base en los resultados obtenidos con el control de procedimiento con E. coli de

concentración conocida, se analizaron las muestras de suelo con los tratamientos con

mayores conteos.

No se observaron diferencias significativas con los diferentes tratamientos en los

conteos de las muestras de suelo (ANOVA; p < 0.05; n=16). Sin embargo, se

presentaron conteos mayores cuando se realizó un lavado como pretratamiento a una

concentración de 5 µg/ml por 20 min y realizando un esquema de conteo de dos filtros

de la misma dilución (Tabla 11).

El orden de los tratamientos que presentaron mayores recuentos en la muestra de suelo

fue inverso al orden de los tratamientos que presentaron mayores recuentos con el

cultivo de concentración conocida de E. coli. Los mayores conteos con E. coli se

presentaron en el tratamiento 7 mientras que el mayor conteo en la muestra de suelo fue

49

en el tratamiento 3. Las modificaciones realizadas a estos dos tratamientos sólo

difieren en la concentración de DAPI a la cual se hace la tinción, esto demuestra que la

concentración varía de acuerdo a las diferentes matrices (suelo, lodos, aguas, etc).

Resultados similares fueron obtenidos por Schallenberg y colaboradores (1989) quienes

afirman que la concentración óptima para muestras de sedimentos es de 5 µg/ml por 20

min de DAPI y el uso de otras concentraciones puede producir la subestimación del

conteo de células totales.

Tabla 11. Conteos obtenidos de los distintos tratamientos evaluados durante el proceso de estandarización utilizando una muestra de suelo

Tratamiento Pretratamiento [DAPI] a µµµµg/ml E. conteob Conteo % CVc

1 Prefiltrado 5 1

7,94 x 1011

36.02 8,05 x 1011 5,42 x 1011 3,39 x 1011

3 Lavado 5 1

5,75 x 1011 24.74 9,71 x 1011

6,11 x 1011 7,41 x 1011

7 Lavado 10 1

2,86 x 1011 47.44 7,02 x 1011

2,59 x 1011 5,15 x 1011

8 Lavado 10 2

7,20 x 1011 18.81 7,02 x 1011

5,09 x 1011 5,15 x 1011

a El tiempo de reacción para la concentración de 5 µg/ml de DAPI corresponde a 20 min y

para la concentración de 10 µg/ml es de 40 min. b Esquemas de conteo, 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos

filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución. c %CV = coeficiente de variación = (ds/media)

Durante la estandarización del protocolo de tinción utilizando las muestras de suelo, se

observó que el pretratamiento que disminuía los interferentes de lectura más

eficientemente era el lavado con una solución NaCl (0,85% p/v) a 13.000 rpm por 5

minutos. Se pueden considerar como interferentes de lectura los coloides de tamaño

50

mayor al celular, la fluorescencia de fondo generada por la matriz del suelo y la

fluorescencia de los residuos del DAPI. El prefiltro tiene un tamaño de poro variable de

2.0 a 8.0 µm permitiendo el paso de coloides que se pueden ver en la mayoría de los

campos del microscopio; además, tiene una gran capacidad absorbente de líquidos lo

que podría suponer una pérdida en la concentración celular de la muestra filtrada. Por

otro lado, la fluorescencia de fondo de la matriz de la muestra se eliminó con los

lavados porque las partículas permanecieron en el sobrenadante y eran descartadas en

el proceso. Un estudio realizado por Bakken (1985) basado en la separación y

purificación de bacterias del suelo, afirma que las partículas del suelo y material

orgánico no celular luego de un proceso de centrifugación se encuentran en el

sobrenadante y que el proceso es óptimo como pretratamiento en microscopía de

fluorescencia, comprobando lo realizado en este estudio. Finalmente, la fluorescencia

de fondo debida al uso del DAPI se eliminó eficientemente por medio de un enjuague

con una solución de etanol al 70% (Casamayor, 2006).

El efecto del esquema de conteo entre los tratamientos seleccionados se observa

claramente. Tres de los cuatro tratamientos correspondieron al esquema de conteo de

dos filtros de la dilución seleccionada confirmando lo dicho por Kirchman y

colaboradores (1982); este esquema utiliza dos filtros de la misma muestra y tiene una

mayor precisión y un porcentaje de error menor al esquema de conteo dos que

corresponde a dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado de

la misma dilución. Como se puede observar en la tabla 11, se utilizó el coeficiente de

varianza (CV) como variable de selección; se puede observar en la muestra 1, que el

tratamiento que tiene menor CV y los dos tratamientos con mayor CV corresponden al

primer esquema de conteo. Esta variación en los conteos era de esperarse con las

muestras de suelo debido la interferencia, la dificultad para recuperar los

microorganismos y la variabilidad de las poblaciones a pequeña escala (Bakken, 1985;

Torsvik and Øvreås, 2002). En la muestra 2, el esquema que tuvo el menor CV es el de

dos filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado de la misma

dilución. Sin embargo, los conteos no fueron los mas altos y el análisis visual del filtro

51

en el que se observó definición de la fluorescencia, y disminución de interferentes y

fluorescencia de fondo no fue el mejor.

Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con el cultivo de E. coli de

concentración conocida y las muestras de suelo, se seleccionó el uso del lavado a una

concentración de DAPI de 5 µg/ml por 20 min y el primer esquema de conteo que

utiliza dos filtros de lectura de la misma dilución para realizar el análisis. Esta

selección se basó en los mayores recuentos, la observación al microscopio y la

precisión (%CV).

6.3. Conteo de microorganismos de suelo de la ecorregión cafetera utilizando DAPI

Se procesaron un total de 96 muestras de suelo utilizando el protocolo seleccionado

Casamayor (2006) y estandarizado con las siguientes modificaciones: un pretratamiento

correspondiente a dos lavados sucesivos en solución salina (0.85% p/v) a 13,000 rpm

por 5 min, tinción utilizando una concentración de 5 µg/ml por 20 min de DAPI y un

esquema de conteo correspondiente a dos filtros de dilución seleccionada, de cada una

de las muestras (Tabla 12) (Anexo J y K).

Se utilizaron los conteos para evaluar si las dos fincas seleccionadas por cobertura

presentaban recuentos significativamente iguales. Después se analizó el efecto de las

distintas coberturas, sistemas productivos, ventanas y eventos de muestreo sobre los

conteos de los microorganismos edáficos.


seleccionadas para cada cobertura.

Inicialmente se evaluaron si existían diferencias significativas entre las dos fincas

seleccionadas para cada una de las coberturas.

52

Tabla 12: Conteos de los microorganismos edáficos obtenidos durante el estudio en la CEAN.

Muestreoa Ventana Sistema productivo Cobertura Finca Conteo cel/gps %CV c

1 La Vieja Cultivos mixtos CFSSb El Bolsillo 1,53 x 1011 28,65 1 La Vieja Cultivos mixtos CFSS Alegría 3,19 x 1011 53,84 1 La Vieja Cultivos mixtos Guadual La Comarca 1,96 x 1011 18,50 1 La Vieja Ganadería de carne Guadual La Ramada 1,65 x 1011 18,23 1 La Vieja Ganadería de carne Bosque Bremen 1,71 x 1011 18,11 1 La Vieja Ganadería de carne Bosque La ilusión 1,72 x 1011 43,42 1 La Vieja Ganadería de leche Pastizal La Ramada 1,29 x 1011 30,37 1 La Vieja Ganadería de leche Pastizal Villa Ximena 1,76 x 1011 17,56 1 El Otún Áreas protegidas Bosque La Pastora 1,61 x 1011 13,15 1 El Otún Cultivos mixtos Bosque Santa Helena 1,05 x 1011 12,26 1 El Otún Cultivos mixtos Cebolla Macarena 1,41 x 1011 22,16 1 El Otún Cultivos mixtos Cebolla Bella Vista 1,41 x 1011 17,76 1 El Otún Cultivos mixtos Guadual Mandalay 7,64 x 1010 11,82 1 El Otún Cultivos mixtos Guadual La Playa 1,59 x 1011 52,54 1 El Otún Plantaciones forestales Forestales Playa Rica 2,69 x 1011 28,62 1 El Otún Plantaciones forestales Forestales Lisbran 3,12 x 1011 15,85 2 La Vieja Cultivos mixtos CF SS El Bolsillo 1,95 x 1011 18,93 2 La Vieja Cultivos mixtos CF SS Alegría 1,36 x 1011 17,75 2 La Vieja Cultivos mixtos Guadual La Comarca 2,58 x 1011 22,53 2 La Vieja Ganadería de carne Guadual La Ramada 2,28 x 1011 36,81 2 La Vieja Ganadería de carne Bosque Bremen 3,17 x 1011 40,99 2 La Vieja Ganadería de carne Bosque La ilusión 3,32 x 1011 35,05 2 La Vieja Ganadería de leche Pastizal La Ramada 2,09 x 1011 21,32 2 La Vieja Ganadería de leche Pastizal Villa Ximena 1,86 x 1011 12,02 2 El Otún Áreas protegidas Bosque La Pastora 3,13 x 1011 11,76 2 El Otún Cultivos mixtos Bosque Santa Helena 4,23 x 1011 33,14 2 El Otún Cultivos mixtos Cebolla Macarena 1,73 x 1011 29,41 2 El Otún Cultivos mixtos Cebolla Bella Vista 3,21 x 1011 21,00 2 El Otún Cultivos mixtos Guadual Mandalay 2,90 x 1011 20,95 2 El Otún Cultivos mixtos Guadual La Playa 4,60 x 1011 13,93 2 El Otún Plantaciones forestales Forestales Playa Rica 4,40 x 1011 34,44 2 El Otún Plantaciones forestales Forestales Lisbran 3,23 x 1011 27,08

a EM1 realizado del 10 -24 de junio y 2 del 14 – 21 de Octubre de 2006. b CFSS = cafetal sin sombrío c CV = coeficiente de variación = (ds/media)

Se presenta el promedio y porcentaje del coeficiente de varianza (%CV) (n=6).

gps = gramo de peso seco

53

6.3.1.1. Cuenca del río La Vieja: en términos generales las fincas seleccionadas para

las coberturas fueron significativamente diferentes con un intervalo de confianza del

80% (Anexo L) en alguno de los dos eventos de muestreo.

Se observó que el cafetal de La Alegría presentó conteos significativamente superiores

al cafetal de El Bolsillo (t-student: p < 0.05; n=12) en el Evento de Muestreo 1 (EM1)

(Tabla 12) (Figura 6) sin presentar diferencias significativas en los parámetros

fisicoquímicos de pH, porcentaje de humedad y temperatura del suelo. Los mayores

conteos en el cafetal La Alegría se pudieron presentar debido a la densa y gruesa capa de

hojarasca presente (8,96 ± 11,2 cm) (n=15) (anexo O), constituida principalmente de

plantas de plátano mientras que El Bolsillo presentó una menor capa de hojarasca (2,86

± 0,80cm) (n=15), presentándose una diferencia del 68,4%. Una densa y gruesa capa de

hojarasca, como la observada en La Alegría, puede llegar a influir en la densidad

microbiana, debido que proporciona un ambiente rico en calidad y cantidad de materia

orgánica con alto potencial de mineralización (Kennedy, 1999; Nusslein y Tiedje, 1999;

Escobar, 2003).

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2

Evento de muestreo

Con

teo

(cél

ulas

/gps

)

El Bolsillo

La Alegría

Figura 6. Conteos de microorganismos totales en los cafetales de la cuenca del río La

Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

Un estudio realizado por Mantilla y colaboradores (2000), describe la hojarasca del

cafetal con sombrío en la zona cafetera, como la reunión de tallos, hojas y ramas en un

54

estado medio de descomposición, con una alta presencia de invertebrados e insectos, lo

que puede aumentar la carga orgánica del suelo.

No se pudo establecer si la aplicación de agroquímicos podría tener un efecto

significativo sobre la densidad microbiana. Sin embargo, un estudio realizado por Burke

y colaboradores (2006) en el cual se evaluó la influencia de las ectomicorizas y la

fertilización en la diversidad del suelo en un cultivo de pino, demostró que no existiría

un efecto significativo de uso de fertilizantes en las bacterias del suelo.

Durante el segundo evento de muestreo (EM2) se observaron conteos significativamente

mayores en El Bolsillo (t-student; p < 0.05; n=24). De acuerdo a información

recolectada en el evento de muestreo, días antes de la toma de muestras se había

presentado una fuerte precipitación con presencia de granizo en la zona y una menor

producción de cafe (anexo O), lo que pudo disminuir la densidad microbiana del suelo

por choque térmico o disminuyendo el metabolismo celular (Madigan et al., 2001).

Tabla 13. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas de las fincas seleccionadas para cada cobertura en la cuenca de río La Vieja

Cobertura Fincas EM1a Fincas EM2a

CFSSb El bolsillo-La Alegría 95% El bolsillo-La Alegría 95%

Bosque La Ilusión-Bremen - La ilusión-Bremen -

Pastizal La Ramada-Villa Ximena 95% La Ramada-Villa Ximena -

Guadual La Ramada- La Comarca 80% La Ramada- La Comarca -

a Evento de muestreo

(-) No hay diferencias significativas al 80% y al 95% b CFSS = Cobertura cafetal sin sombrío

No se observaron diferencias significativas en los valores de pH obtenidos entre La

Alegría (5,4±0,4) y El Bolsillo (5.3±0.1) en el EM1 y al igual que La Alegría (6.2±0.5) y

El Bolsillo (5.8±0.2) en el EM2 (t-student; p < 0.05; n=12). De similar forma, los

55

valores observados son similares a los valores reportados (5.4) para esta región por

Murgueitio (2003).

Algunas de las diferencias observadas en los conteos microbianos podrían ser atribuidas

al efecto alelopático de cafeína sobre la población de microorganismos totales generando

una inhibición del crecimiento (Escobar, 2003). Sin embargo este efecto no se pudo

evidenciar debido que en el EM2 se presentó una fuerte precipitación con presencia de

granizo, lo que pudo generar un choque térmico y disminuir la densidad de

microorganismos totales en el suelo (Madigan et al., 2001).

Las fincas con bosques utilizados para este estudio en la cuenca del río La Vieja, no

mostraron diferencias significativas en ninguno de los dos eventos de muestreo

(t-student; p < 0.05; n=24) (Figura 7).

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2

Evento de muestreo

Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

Bremen

La Ilusión

Figura 7. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río La

vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

En los pastizales de la cuenca del río La Vieja para el EM1, se observaron conteos

significativamente mayores en Villa Ximena que en La Ramada

(t-student; p < 0.05; n=12) y para el EM2 no presentaron diferencias significativas en

esta cobertura (t-student; p < 0.05; n=12) (figura 8).

56

Los datos de porcentaje de humedad del pastizal Villa Ximena fueron significativamente

mayores (44.9 ± 4.5%) a los datos de La Ramada (23.0 ± 2.7%)

(t-student; p < 0.05; n=6) y los datos de temperatura de suelo muestran registros

significativamente mayores (t-student; p < 0.05; n=30) en La Ramada (26.8 ± 1.9ºC) que

en Villa Ximena (22.7 ± 0.2ºC). Teniendo en cuenta que no existen diferencias en los

datos de pH (t-student; p < 0.05; n=6) y de acuerdo con Varela (2004) la humedad del

suelo puede llegar a tener un mayor efecto sobre la actividad microbiana que la

temperatura del suelo.

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2

Evento de muestreo

Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

La Ramada

Villa Ximena

Figura 8. Conteo de microorganismos totales en los pastizales de la cuenca del río la

Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

En los guaduales de la cuenca del río La Vieja para el EM1, se observaron conteos

significativamente mayores en La Comarca que en La Ramada

(t-student; p < 0.2; n=12) y para el EM2 no se presentaron diferencias significativas en

los conteos (t-student; p < 0.05; n=12) (figura 9). Los datos de campo mostraron que el

guadual La Comarca tiene una cobertura densa mientras que La Ramada es un pequeño

fragmento de guadua al que corresponden grupos de pocas guaduas a la orilla de la

quebrada (anexo O). Un estudio realizado por Carney y colaboradores (2004) determinó

que existe un efecto antropogénico sobre las comunidades microbianas del suelo

57

generando la disminución de la biomasa y la diversidad. Este efecto se puede llegar a

observar en el guadual La Ramada debido a que el fragmento de guadua puede estar

desapareciendo por uso de la madera, cambios en el uso del suelo o cualquier otro efecto

antropogénico generando una disminución en la densidad de microorganismos edáficos.

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2

Evento de muestreo

Con

teo

(cél

ulas

/gps

)

La Comarca

La Ramada

Figura 9. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río

La Vieja. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

Al observar en conjunto del EM1 en la cuenca del río La Vieja, no se observaron

diferencias significativas entre las coberturas (Tukey-Kramer, ANOVA; p < 0.05; n=48)

(Tabla 14). Los cafetales sin sombrío asociados a plátano (CFSS) presentaron los

mayores conteos sin diferencias significativas y con alta dispersión (desviación estándar)

(Figura 10). Un estudio reportado por Murgueitio (2003) reportó una mayor actividad

microbiana-CO2 en los guaduales, seguido por cafetal con sombrío y finalmente

pastizales dedicados a ganadería extensiva. Al comparar esos resultados con los

obtenidos en este estudio, se observa cierta similitud al encontrar en la cuenca del río La

Vieja en el EM1 conteos superiores en la cobertura guadual y los menores conteos en la

cobertura pastizal.

Por otro lado, un estudio realizado por Carney y colaboradores (2004) en el que se

estudió la diversidad y la composición de los nitrificantes del suelo a través del gradiente

de diversidad de las plantas y el tipo de uso del suelo, determinó que los cambios

58

antropogénicos a los ecosistemas puede alterar las comunidades microbianas y que los

forestales de Brosimum alicastrum, Bursera simaruba, Cordilla alliodora, Alchornea

costaricensis, Bravaisia intergerrima, Casearia corymbosa y Simira maxonii, tienen

más biomasa que los pastizales. Este efecto se puede observar claramente en los

resultados de este estudio. Los bosques La Ilusión y Bremen mostraron conteos

superiores a los pastizales para el EM1 y para el EM2, se observa el efecto más

claramente (Figura 10).

Tabla 14. Diferencias entre coberturas para la cuenca del río La Vieja.

EM1a EM2b EM1-EM2

CFSS G B P B G P CFSS B G CFSS P

a a a a

a a a a a

b b

c c b a 10 al 24 de junio de 2006 b 14 al 21 de octubre de 2006 G = Guadual CFSS = Cafetal sin sombrío asociado a cultivos de plátano P = Pastizal B = Bosque Diferente letra en minúscula (a,b y c) indican diferencias significativas (p<0.05) Los conteos más bajos se presentan a la izquierda

En el EM2, los bosques presentaron conteos significativamente mayores a las coberturas

pastizal y cafetal sin sombrío asociado a cultivo de plátano (Tukey-Kramer; p < 0.05;

n=48). Por otro lado en los guaduales se observaron conteos significativamente

superiores a los cafetales y los pastizales no presentaron diferencias significativas con

los cafetales sin sombrío (Tukey-Kramer; p < 0.05; n=48) (Tabla 14).

Al observar EM1-EM2 los bosques, guaduales y CFSS presentaron diferencias

significativas con los pastizales (Tukey-Kramer; p < 0.05; n=96). Un estudio reportado

por Murgueitio (2003), muestra mayor actividad microbiana-CO2 en los guaduales

59

seguido por cafetal, y pastizal con ganadería de leche y de ceba. Lo reportado por

Murgueitio (2003) ratifican los resultados de este estudio (Figura 10). Sin embargo, esta

diferencia se pudo presentar debido que en el cafetal La Alegría días antes del evento de

muestreo se presentó una fuerte precipitación con presencia de granizo (anexo O), lo

cual pudo generar la muerte por choque térmico de los microorganismos o una

disminución de la taza metabólica.

2,00E+107,00E+101,20E+111,70E+112,20E+112,70E+113,20E+113,70E+114,20E+114,70E+115,20E+11

Bosque Pastizal Guadual CFSS

Coberturas

Con

teo

(cel

ulas

/gps

)

EM1

EM2

Figura 10. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río La Vieja entre

muestreos. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=12).

Los conteos en la cuenca del río La Vieja en los dos eventos de muestreo, muestran un

posible efecto antropogénico debido que en la cobertura menos intervenida se

observaron los mayores conteos y la más intervenida los menores. Un estudio realizado

por Carney y colaboradores (2004), afirma que los cambios antropogénicos pueden

disminuir las comunidades microbianas, y otro desarrollado por Pereira y colaboradores

(2006), los cuales determinaron mayor cantidad de comunidades edáficas en un forestal

que en un suelo cultivado por mas de 10 años de manera sucesiva con tomate, habas,

maíz y soya, ratifican los resultados del presente estudio.

Al observar los conteos en el tiempo, los cafetales sin sombrío, mostraron conteos

significativamente mayores en el EM1 (2,35 x 1011cel/gps) a comparación con el EM2

60

(1,65 x 1011cel/gps) (t-student; p < 0.2; n=24) (Tabla 15). Esto se pudo presentar por

debido a la fuerte precipitación antes mencionada. Las otras coberturas, presentaron

conteos significativamente mayores en el EM2 (ANOVA; p < 0.05; n=72) (Tabla 15)

(Figura 10) afectando los conteos de toda la cuenca del río La Vieja en el tiempo (Tabla

16). Los datos de campo muestran una media de temperatura del suelo para la cuenca del

río La Vieja en el EM1 (22.4 ± 2.4ºC) sin diferencias significativas con los datos del

EM2 (22.0 ± 2.3ºC) (t-student; p < 0.05; n=240). Por otro lado los datos de humedad del

EM1 (30.3 ± 11.2) fueron significativamente superiores a los datos del EM2 (25.8 ± 9.5)

(t-student; p < 0.2; n=48). Los datos de pH del EM2 (5.9 ± 0.6) fueron

significativamente superiores a los del EM1 (5.3 ± 0.7) (t-student; p < 0.05; n=48). El

aumento en los valores de pH puede tener un efecto en los conteos de microorganismos

edáficos del suelo (Hartel, 2005).

Tabla 15. Intervalo de confianza al que se presentaban deferencias significativas en el tiempo por cada cobertura en la cuenca del río La Vieja

Cobertura Evento de muestreo

1a(cel/gps) 2b(cel/gps) 1-2 CFSSc 2,35 x 1011 ± 1.48 x 1011 1,65 x 1011 ± 4.28 x 1010 80%

Guadual 1,80 x 1011 ± 3.55 x 1010 2,43 x 1011 ± 7.07 x 10 10 95% Bosque 1,71 x 1011 ± 5.45 x 1010 3,25 x 1011 ± 1.18 x 1011 95% Pastizal 1,52 x 1011 ± 4.16 x 1010 1,98 x 1011 ± 2.2 x 1010 95%

a 10 al 24 de junio de 2006 b 14 al 21 de octubre de 2006 c CFSS = cobertura cafetal sin sombrío


6.3.1.2. Cuenca del río El Otún: En términos generales las distintas fincas

seleccionadas para las coberturas fueron significativamente diferentes con un intervalo

de confianza del 80% y del 95% (Anexo L) (Tabla 17).

61

Tabla 16. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en la cuenca del río La Vieja en el tiempo

Cuenca del río

Evento de muestreo 1a 2b 1-2

La Vieja (cel/gps) 1,85 x 1011 ± 8.64 x 1010 2,32 x 1011 ± 9.40 x 1010 95%

a 10 al 24 de junio de 2006 b 14 al 21 de octubre de 2006

Se presenta el promedio y desviación estándar (n=48)

El guadual La Playa presentó conteos significativamente mayores que los observados en

el guadual Mandalay (t-student; p < 0.05; n=24) en los dos eventos de muestreo (Figura

11).

Tabla 17. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre las fincas seleccionadas para cada cobertura en la cuenca de río El Otún

Cobertura Fincas EM1a Fincas EM2a

Guadual Mandalay-La Playa 95% Mandalay-La Playa 95%

Cebolla Macarena-Bella Vista - Macarena-Bella Vista 95%

Bosque Sta Helena-La Pastora 95% Sta Helena-La Pastora 80%

Forestal Playa Rica-Lisbran - Playa Rica-Lisbran 80% a Evento de muestreo

(-) No hay diferencias significativas al 80% y al 95%

No se encontraron diferencias significativas en los datos de pH, temperatura del suelo y

profundidad de la hojarasca (t-student; p< 0,05; n=6, 30 y 15 respectivamente). Sin

embargo, se observó que para el primer evento de muestreo la humedad en La Playa

(38.6±7.6) fue significativamente superior a la observada en Mandalay (31.6±0.3). Para

el segundo evento de muestreo, la humedad en La Playa (29.7±1.5) fue

significativamente superior a la observada en Mandalay (25.0±2.1). De acuerdo a lo

anterior, puede existir un efecto de la humedad en los conteos de microorganismos

edáficos. Sin embargo, durante el segundo evento de muestreo en el guadual de

Mandalay se pudo observar la presencia de gran cantidad de bolsas de basura lo que

62

pudo afectar los recuentos observados (anexo O). Esto se pudo presentar debido que en

un microambiente en el cual se reduce el flujo de nutrientes, la densidad microbiana

disminuye. Cuando el límite del microambiente es una matriz de difícil degradación,

como una bolsa de basura, este fenómeno se agudiza de tal forma que los nutrientes

disponibles en el suelo sólo pueden provenir del área de influencia directa con el

microambiente sin recibir carbono o nitrógeno de la cobertura vegetal. De acuerdo a

Aguilera y Vélez (2001), a medida que haya diferentes sustratos disponibles habrá

mayor número de microorganismos.

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2Evento de muestreo

Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

Mandalay

La Playa

Figura 11. Conteos de microorganismos totales en los guaduales de la cuenca del río

El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

En las fincas evaluadas para la cobertura de cebolla (Macarena y Bella Vista) no se

observaron diferencias significativas en los conteos en el primer evento de muestreo

(t-student; p < 0.05; n=12). En contraste, en el EM2 se observaron conteos

significativamente superiores en Bella Vista (t-student; p < 0.05; n=12) (Figura 12). No

se encontraron diferencias significativas en los datos de temperatura y humedad del

suelo (ANOVA; p < 0.05; n=6). Estas diferencias solo pudieron relacionarse con una

altura significativamente mayor de la cebolla para Bella Vista (53.8 ± 2.7 cm) en

comparación con La Macarena (40.1 ± 4.5 cm). Sin embargo, la altura de la cebolla

puede ser respuesta al estado fisiológico del cultivo, es decir, al estar el cultivo más

63

crecido puede significar que esta cerca el periodo de recolección, lo que implica que la

planta ha crecido durante un periodo de tiempo necesario para obtener un cultivo

maduro y óptimo para el consumo.

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11


Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

La Macarena

Bella Vista

Figura 12. Conteos de microorganismos totales en los cultivos de cebolla de la

cuenca del río El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

En los bosques de la cuenca del río El Otún para el EM1, se observaron conteos

significativamente mayores en la reserva La Pastora mientras que para el EM2 se

presentaron conteos significativamente mayores en el bosque Santa Helena

(t-student; p < 0.2; n=12) (Figura 13). Para el EM1, Los datos de campo mostraron

temperaturas del suelo significativamente superiores (ANOVA; p < 0.05; n=30) en el

bosque Santa Helena (18.8 ± 0.1ºC) que en la reserva La Pastora (16.0 ± 0,3ºC) (anexo

O). Por otro lado, los valores de porcentaje de humedad del bosque Santa Helena (44.6 ±

5.7) fueron significativamente superiores (t-student; p < 0.05; n=6) a los datos de la

reserva La Pastora (37.8 ± 2.0). Sin embargo, los valores de pH reportados para la

reserva La Pastora (5.9 ± 0.1) son significativamente superiores

(t-student; p < 0.05; n=6) a los valores reportados para el bosque Santa Helena (4.8 ±

0.1). Si se tiene en cuenta que a pH neutro existe más densidad microbiana (Hartel,

2005), la humedad tiene mayor efecto que la temperatura en la actividad microbiana

(Varela y Feria, 2004) y que el porcentaje de humedad del bosque Santa Helena está

64

cerca del 50% lo cual puede favorecer la anaerobiosis descomponiendo la materia

orgánica a menor velocidad debido a la disminución de la biomasa microbiana

(Alexander, 1987; Madigan et al., 2001; Varela y Feria, 2004), puede existir un efecto el

pH y la humedad sobre los conteos en los bosques de la cuenca del río El Otún para el

EM1.

Para el EM2 no se observaron diferencias significativas entre los datos de pH

(t-student; p < 0.05; n=6). Se observaron datos de temperatura significativamente

mayores en el bosque Santa Helena (16.6 ± 1.7ºC) que en la reserva La Pastora (11.8 ±

0.2ºC) (t-student; p < 0.05; n=6). Los datos de porcentaje de humedad del suelo fueron

significativamente mayores en la reserva La Pastora (34.2 ± 2.3) que en el bosque Santa

Helena (21.41 ± 0.86). De acuerdo a Varela y Feria (2004), las reacciones biológicas

aumentan de dos a tres veces al incrementarse la temperatura 10 ºC. Teniendo en cuenta

que no hay diferencias en los datos de pH, la baja temperatura del suelo pudo afectar los

conteos de microorganismos totales edáficos en la reserva La Pastora.

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11


Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

La Pastora

Sta Helena

Figura 13. Conteos de microorganismos totales en los bosques de la cuenca del río El

Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

Los cultivos forestales para el EM1 no presentaron diferencias significativas

(t-student; p < 0.05; n=12). Sin embargo, para el EM2 el ciprés Playa Rica presentó

conteos superiores a los del pinar Lisbran (t-student; p < 0.2; n=12) (figura 14).

65

La temperatura del suelo de Lisbrán (18.8 ± 0.9ºC) no fue significativamente diferente

(t-student; p < 0.05; n=30) que la temperatura de Playa Rica (18.5 ± 1.9 ºC). Los datos

de porcentaje de humedad de Lisbran (29.25 ± 5,7) no fueron diferentes con los datos

de Playa Rica (34.6 ± 4.9) (t-student; p < 0.05; n=6). Sin embargo, los datos de pH de

Playa Rica (5.64 ± 0.17) fueron significativamente mayores que los datos de Lisbrán

(5.2 ± 0.3) (t-student; p < 0.05; n=6). Teniendo en cuenta que Playa Rica presenta

mayores conteos y datos superiores de pH, puede existir un efecto del pH sobre los

conteos puesto que cuando el pH tiende a la neutralidad aumenta el la densidad

microbiana (Hartel, 2005).

1,00E+10

1,10E+11

2,10E+11

3,10E+11

4,10E+11

5,10E+11

6,10E+11

1 2

Evento de muestreo

Con

teos

(cél

ulas

/gps

)

Playa Rica

Lisbran

Figura 14. Conteos de microorganismos totales en los forestales de la cuenca del río

El Otún. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=6).

En la cuenca del río El Otún en el EM1 y EM1-EM2, los conteos en la cobertura

forestales fueron significativamente mayores a los conteos obtenidos en las otras

coberturas (ANOVA; p < 0.05; n=96) (Figura 15) (Tabla 18). Sin embargo, es

importante tener en cuenta que las diferencias existentes entre las fincas de los guaduales

y los bosques, puede afectar la media y la desviación estándar de los datos.

Un estudio realizado por Nüsslein y Tiedje (1999) enfocado en determinar el efecto del

cambio de cultivos forestales en pastos de suelos tropicales, estableció que el cambio de

66

cobertura vegetal a pastizales resulta en un 49% de las modificaciones de la composición

microbiana del suelo mostrando mayores concentraciones de microorganismos en los

pastizales. Sin embargo, en un estudio de Pereira y colaboradores (2006) donde se

caracterizó molecularmente las poblaciones bacterianas de diferentes suelos en Brasil,

comparó suelos dedicados al cultivo intensivo de tomate, habas y maíz con un forestal

libre de intervención humana, determinó que existe mayor cantidad de phyla y por ende

diversidad en el área forestal que en los cultivos intensivos. Es importante tener en

cuenta que no se puede generalizar la densidad de microorganismos edáficos totales

como un concepto equivalente a la diversidad, debido que esta se define en función de la

riqueza, la abundancia relativa y la densidad. Sin embargo, la mayor diversidad del

forestal del estudio en Brasil, puede llegar a confirmar el resultado de este estudio,

debido que los forestales de pino y ciprés muestran conteos significativamente

superiores a comparación con las coberturas de pastizal, guadual y cultivos de cebolla.

Tabla 18. Diferencias entre coberturas para la cuenca del río El Otún.

EM1a EM2b EM1-EM2

F C B G F G B C F B G C

a a a a a

b b b b b b b a 10 al 24 de junio de 2006 b 14 al 21 de octubre de 2006 F = Forestal C = Cebolla B = Bosque G = Guadual Diferente letra en minúscula (a,b y c) indican diferencias significativas (p<0.05) Los conteos más bajos se presentan a la izquierda

Para el EM2, los bosques, guaduales y forestales presentaron conteos significativamente

mayores que los cultivos de cebolla (ANOVA; p < 0.05; n=48) (Figura 15) (Tabla 18).

De acuerdo al estudio realizado por Carney y colaboradores (2004), los cambios

antropogénicos pueden disminuir las comunidades microbianas. Lo anterior ratifica los

67

resultados de la cuenca del río El Otún en el EM2, en donde la cobertura más intervenida

(cultivo de cebolla) presentó los menores conteos en relación a las otras coberturas. Por

otro lado, la cobertura menos intervenida debería ser la que tuviera los mayores conteos.

Sin embargo, en la cobertura bosque se encuentra la reserva La Pastora que presenta

conteos estadísticamente mayores con el bosque Santa Helena (t-student; p < 0.2;

n=12) que fue asociado al sistema productivo cultivos mixtos y es un bosque pobre e

intervenido, lo cual pudo afectar los conteos generales de la cobertura.

2,00E+10

7,00E+10

1,20E+11

1,70E+11

2,20E+11

2,70E+11

3,20E+11

3,70E+11

4,20E+11

4,70E+11

5,20E+11

Cebolla Bosque Guadual Forestal

Coberturas

Con

teos

(cé

lula

s/gp

s)

EM1

EM2

Figura 15. Diferencias de las coberturas de la cuenca del río El Otún entre

muestreos. Se presenta el promedio y desviación estándar (n=12).

En términos generales, se obtuvieron conteos más altos durante el EM2 en la cuenca del

río El Otún (ANOVA; p < 0.05; n=96) (Tabla 16). Por otro lado, todas las coberturas

tuvieron conteos significativamente mayores en el segundo evento de muestreo

(ANOVA; p < 0.05; n=96) (Tabla 19 y 20).

Se observó en la cuenca del río El Otún una temperatura del suelo en el EM1 (20.1 ±

2.3ºC) significativamente mayor a la determinada en el EM2 (17.7 ± 3.3ºC)

(t-student; p < 0.05; n=48). Los datos de humedad de suelo en el EM1 (36.8 ± 5.8)

fueron significativamente mayores a los del EM2 (28.5 ± 6.7)

68

(t-student; p < 0.05; n=48). Finalmente los datos de pH para el EM1 (5.4 ± 0.60) fueron

significativamente menores a los del EM2 (5.7 ± 0.3) (t-student; p < 0.05; n=48). En el

EM2, la temperatura y el porcentaje de humedad del suelo fueron menores al EM1. Sin

embargo, el pH fue mayor en el segundo evento de muestreo lo que pudo afectar más

directamente los conteos que la disminución de temperatura y humedad del suelo,

debido a que tiende a la neutralidad aumentando en rango de microorganismos que

pueden estar en el suelo (Hartel, 2005).

Tabla 19. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo por coberturas en la cuenca del río El Otún

Cobertura Evento de muestreo

1a(cel/gps) 2b(cel/gps) 1-2 Bosque 1.33 x 1011 ± 3.34 x 1011 3.68 x 1011 ± 2.98 x 1010 80%

Guadual 1.17 x 1011 ± 7.13 x 1011 3.75 x 1011 ± 5.12 x 10 10 95% Cebolla 1.40 x 1011 ± 2.70 x 1010 2.47 x 1011 ± 5.60 x 1011 95% Forestal 2,90 x 1011 ± 6.57x 1010 3.82 x 1011 ± 5.87 x 1010 95%



Es importante resaltar que existen algunas peculiaridades, como la fuerte precipitación

en el cafetal La Alegría y la presencia de bolsas de basura en el guadual Mandalay, que

puede llegar a afectar en el porcentaje de humedad, pH y temperatura del suelo

generando efectos en ciertos los conteos. Por tal razón, no se puede generalizar los

efectos de los parámetros fisicoquímicos sobre los conteos.


seleccionadas para cada sistema productivo

Inicialmente se evaluó si existían diferencias significativas entre las fincas asociadas a

cada uno de los sistemas productivos. Se observaron diferencias significativas en las

fincas asociadas a los cultivos mixtos en la cuenca del río La Vieja y El Otún

69

(ANOVA; p < 0.2; n=108). De igual forma se observó que en ganadería de carne en el

EM2 y cultivos forestales en el EM2 presentaron diferencias significativas

(ANOVA, t-student; p < 0.2; n=18, n=12 respectivamente). Finalmente, ganadería de

carne, ganadería de leche y cultivos forestales del EM1 no presentaron diferencias

significativas (ANOVA, t-student; p < 0.2; n=18, n=18, n=12) (Tabla 18) (anexo N).

Tabla 20. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en la cuenca del río El Otún

Cuenca del río

Evento de muestreo 1a 2b 1-2

El Otún (cel/gps) 1,70 x 1011 ± 8.73 x 1010 3,43 x 1011 ± 1.23 x 1011 95%


Se presenta promedio y desviación estándar (n=48)

Para observar el efecto de los sistemas productivos en los conteos de microorganismos

edáficos, fue necesario observar detalladamente que fincas se asociaron a cada una de

los sistemas productivos. En la cuenca del río La Vieja, se encuentran los sistemas

productivos cultivos mixtos (37.8%), ganadería de carne (37.8%) y ganadería de leche

(25%). Se pude observar 1) que la distribución del número de fincas para cada sistema

productivo no es homogénea (Tabla 21) y 2) se puede llegar a desconocer el efecto de

las coberturas en cada uno de los sistemas productivos. La heterogeneidad de las fincas

y la cobertura de las muestras afecta los conteos de microorganismos totales edáficos y

mostrando entre cada uno de los sistemas productivos diferencias que no permite

realizar la comparación entre sistemas productivos y mucho menos en cada uno de los

eventos de muestreo (Figura 16 y 17). Es importante mencionar que el ancho de los

diamantes, en estas figuras, refleja la dispersión de los datos asociados a cada sistema

productivo. El diamante de ganadería de leche es menos ancho que el diamante de

cultivos mixtos y de ganadería de carne indicando que existe menor dispersión de los

datos.

70

Tabla 21. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre las fincas seleccionadas para cada sistema productivo.

Fincas Coberturas Sistema productivo Evento de muestreo

1a 2b

Ventaja La Vieja Bremen Bosque

Ganadería de leche - 95% Villa Ximena

Pastizal La Ramada

Ganadería de carne - 80% La Ilusión Bosque La Ramada

Guadual La Comarca

Cultivos mixtos 95% 95% La Alegría CFSSc

Al Bolsillo Ventana El Otún

Macarena Cebolla

Cultivos mixtos 95% 95% Bella Vista

Santa Helena Bosque Mandalay

Guadual La Playa

Playa Rica Forestal Cultivos forestales - 80%

Lisbran a 10 al 24 de junio de 2006 b 14 al 21 de octubre de 2006 c CFSS = Cobertura cafetal sin sombrío


En la cuenca del río El Otún se encuentran los sistemas productivos cultivos mixtos

(62.5%), cultivos forestales (25%) y áreas protegidas (12.5%) En esta cuenca, cinco de

las ocho fincas corresponden a cultivos mixtos (Tabla 21) comprendiendo las coberturas

de cebolla, bosque y guadual. Al sistema productivo cultivos forestales, se le asociaron

dos fincas que corresponden a la misma cobertura facilitando su análisis. Por otro lado,

para el sistema productivo áreas protegidas solo se encuentran una finca, la reserva La

Pastora, lo que hace imposible analizar si es un efecto particular de la reserva La pastora

o un efecto del sistema productivo sobre el conteo de microorganismos edáficos (Figura

18 y 19).

71

Figura 16. Dispersión de los conteos de cada sistema productivo para la cuenca del

río La Vieja en el EM1.

Figura

17. Dispersión de los conteos en cada sistema productivo para la cuenca del río La

Vieja en el EM2.

10,9

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

11,9

Cultivos mixtos Ganadería de carne Ganadería de leche

Sistema productivo

10,9

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

11,9

Cultivos

mixtos

Ganadería de

carne

Ganadería de

leche Sistema productivo

Log cel/gps

Log cel/gps

72

6.3.3. Efecto en los conteos del evento de muestreo

En términos generales se pudo observar conteos significativamente mayores durante en

el 2 EM (t-student; p < 0.05; n=192).


río El Otún en el EM1.

Históricamente, las épocas en las cuales se realizaron los eventos de muestreos tienen

una identidad en el régimen de precipitaciones de la región. En las cuencas se presenta

un patrón típico de distribución bimodal debido a que entre los meses de abril-junio y

septiembre-noviembre se presentan lluvias cenitales y calmas calorosofocantes,

respectivamente (Echeverri et al., 2005; IDEAM, 2007). De esta forma, se tiene una

época de lluvias superior en el primer evento de muestreo mientras que se observan

menores precipitaciones y temperaturas superiores en el segundo evento de muestreo

(Octubre). Sin embargo, durante el estudio se encontraron condiciones ambientales

distintas el la toma de muestras.

Según el Centro Nacional de Investaión de Café (CENICAFE) la distribución promedio

mensual de lluvias para la cuenca del río La Vieja del mes de junio fue de 180 mm y 280

10,9

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

11,9

Áreas protegidas Cultivos forestales Cultivos mixtos

Sistema productivo

Log cel/gps

73

mm para el mes de octubre, mientras que para la cuenca del río El Otún fue 190 mm en

junio y 277 en Octubre (http://www.cenicafe.org). No obstante, las precipitaciones

reportadas no se pudieron relacionar con el porcentaje de humedad observado en el

primer EM (33.52%) ni en el segundo EM (27.17%). Sin embargo, con base en los

datos ambientales mensuales (temperatura y precipitación) ambas épocas, en que se

realizaron los muestreos, corresponden a periodos transicionales entre temporada

húmeda y seca para el primer muestreo y de seca a húmeda para el segundo muestreo.

La humedad tiene una influencia en la actividad microbiana y se puede convertir en un

factor limitante para las comunidades edáficas. En suelos con baja humedad se

disminuye la actividad microbiana permitiendo el crecimiento de algunos

microorganismos adaptados a estas condiciones. Adicionalmente una alta humedad

inhibe el intercambio gaseoso y trasporte de oxígeno favoreciendo la presencia de

microorganismos anaerobios facultativos (Alexander, 1987; Madigan et al., 2001).


río El Otún en el EM2.

10,9

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

11,9

Áreas protegidas Cultivos forestales Cultivos mixtos

Sistema productivo

Log cel/gps

74

De acuerdo a estudios realizados por entes gubernamentales (IGAC, CRQ, CRVC,

CRR), los suelos de las dos cuencas son superficiales y susceptibles a procesos de

erosión (Beltran et, al. 1988, Díaz, et, al 1996), lo que genera que en temporada de

lluvias se saturen, facilitándose la anaerobiosis. Por otro lado, si se tiene en cuenta que

el calor se difunde mas rápidamente en ambientes donde el agua se encuentra en

cualquier estado (Tipler, 1977), una disminución en la cantidad de agua en el suelo,

generaría una baja en la temperatura lo que explicaría la disminución de la temperatura

del suelo para el segundo evento de muestreo.

Sin embargo, en las temperaturas del suelo entre los dos eventos de muestreo (Tabla 22),

se observan diferencias significativas en las fincas La Pastora y Mandalay (t-student; p <

0.05; n=30) y en las fincas La Ramada (pastizal), El bolsillo, Macarena, Santa Helena,

Playa Rica, La Playa y Lisbrán (t-student; p < 0.2; n=30) mostrando una disminución

significativa en la temperatura (Tabla 20).

Adicionalmente, las temperaturas observadas en las fincas Bremen, La Ramada guadual,

La Comarca y la Alegría mostraron una tendencia de aumento entre los muestreos. Un

estudio realizado por Comerma y Sánchez (1980) en las consideraciones sobre el

régimen de temperatura del suelo en Venezuela, determinaron que a mayor altura sobre

el nivel del mar se presenta menor temperatura del suelo. El aumento en las temperatura

se observó más marcadamente en la cuenca del río La Vieja que en El Otún, debido a la

altura (1200 y 2600 msnm respectivamente) puesto que cuando entre más cerca al nivel

del mar se mantiene más calor en el suelo.

En los porcentajes de humedad (Tabla 23) La Alegría, La Ilusión y Bremen no presentan

diferencias significativas (ANOVA: p < 0.05; n=18). Por otra parte la Playa Rica, La

Ilusión y el Bolsillo mostraron un incremento en los porcentajes de humedad. Un

estudio realizado por el IDEAM (2000), del medio ambiente en Colombia y

específicamente en la estabilidad, productividad y degradación en suelos, afirma que a

temperaturas moderadas de media y alta montaña se retarda la biodegradación de la

75

materia orgánica, dando lugar a contenidos importantes de esta en el suelo y

favoreciendo la humedad. Lo anterior se puede observar en algunas fincas en las cuales

se disminuye la temperatura del suelo y aumenta el porcentaje de humedad.

Tabla 22: Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en la temperatura del suelo en cada finca.

Finca Evento de muestreo

1a (ºC) 2b (ºC) 1-2 El Bolsillo 23.0 ± 0.8 21,9 ± 0.1 80% La Alegría 22,8 ± 0.6 23,1 ± 0.2 -

La Comarca 22,2 ± 0.2 22,7 ± 0.2 95% La Ramada guadual 22,3 ± 0.2 23,1 ± 0.3 95%

Bremen 18.0 ± 0.2 18,0 ± 0.1 - La Ilusión 22.0 ± 0.2 20,5 ± 2.0 -

La Ramada pastizal 26,8 ± 1.9 26,8 ± 0.1 - Villa Ximena 22,7 ± 0.2 20,9 ± 0.6 95% La Pastora 16,1 ± 0.3 11,8 ± 0.2 95%

Santa Helena 18,8 ± 0.2 16,6 ± 1.7 80% Macarena 22,3 ± 0.3 20,7 ± 2.7 - Bella Vista 23,9 ± 0.6 21,8 ± 1.6 80% Mandalay 19,2 ± 0.1 16,6 ± 0.6 95% La Playa 18,6 ± 0.6 16 ± 0.0 95%

Playa Rica 21,5 ± 0.8 18,5 ± 1.9 80% Lisbran 20,1 ± 0.4 28,8 ± 0.9 80%




Se observaron datos de pH significativamente mayores (t-student; p < 0.05; n=54) en El

Bolsillo, La Comarca, el guadual La Ramada, Bremen, Santa Helena, Mandalay, La

Playa, Playa Rica y Lisbrán. Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas

en los datos de pH de Villa Ximena, pero si se observó una disminución en la media de

los datos (Tabla 24). Es importante tener en cuenta que no se puede generalizar el

efecto del porcentaje de la temperatura del suelo, el porcentaje de humedad y el pH en

los conteos de células totales. No se puede desconocer las peculiaridades de cada una de

76

las fincas como altura de la hojarasca, inclinación del terreno, la densidad en la capa

vegetal y la disponibilidad de nutrientes que son variables que pueden afectar los

conteos de células totales en suelos.

Tabla 23: Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en la humedad del suelo en cada finca.


1a (%H) 2b (%H) 1-2 El Bolsillo 21,9 ± 17.2 27,5 ± 4.3 -

La Alegría 26,9 ± 12.4 17,2 ± 1.8 - La Comarca 34,8 ± 1.1 26,2 ± 12.1 -

La Ramada guadual 27,2 ± 0.8 23,2 ± 4.1 80% Bremen 46.0 ± 2.0 44,9 ± 1.5 -

La Ilusión 20,1 ± 2.6 23,1 ± 2.6 - La Ramada pastizal 23.0 ± 2.7 16,9 ± 2.2 95%

Villa Ximena 41,9 ± 4.5 27,3 ± 5.7 95% La Pastora 37,8 ± 2.0 34,1 ± 3.0 80%

Santa Helena 44,6 ± 5.7 21,4 ± 0.9 95% Macarena 35,7 ± 2.5 33.0 ± 6.2 - Bella Vista 38,9 ± 4.9 21,4 ± 9.7 95% Mandalay 31,6 ± 0.3 24,9 ± 2.1 95% La Playa 38,9 ± 7.6 29,7 ± 1.5 80%





6.3.4. Efecto en los conteos del evento de muestreo entre ventanas

En EM1 se observaron conteos significativamente mayores (t-student; p < 0.2; n=96) en

la cuenca del río La Vieja. Para EM2 se observaron conteos significativamente mayores

(t-student; p < 0.05; n=96) en la cuenca del río El Otún (Tabla 25). Sin embargo, según

el análisis realizado a los parámetros fisicoquímicos (anexo M y N), en EM1 se

observaron datos del porcentaje de humedad significativamente mayores

(t-student; p < 0.05; n=48) en la cuenca del río El Otún, datos de temperatura del suelo

77

significativamente mayores (t-student: p < 0.05; n=240) en la cuenca del río La Vieja y

en los datos de pH no se observaron diferencias significativas

(t-student; p < 0.05; n=48) entre las dos cuencas. Para EM2, los datos de porcentaje de

humedad no se observaron diferencias significativas (t-student; p < 0.05; n=48), pero si

datos de porcentaje de humedad mas altos en la cuenca del río El Otún. En los datos de

temperatura del suelo, se observaron datos significativamente mayores

(t-student; p < 0.05; n=240), en la cuenca del río La Vieja y para los datos de pH, no se

observaron diferencias significativas (t-student; p < 0.05; n=48) entre los dos eventos de

muestreo.

Tabla 24: Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas en el tiempo en el pH del suelo en cada finca.


1a (pH) 2b (pH) 1-2 El Bolsillo 5,4 ± 0.2 6.0 ± 0.3 95% La Alegría 5,5 ± 0.4 5,7 ± 0.5 80%

La Comarca 5,5 ± 0.2 6,3 ± 0.0 95% La Ramada guadual 5,7 ± 0.0 6,4 ± 0.0 95%

Bremen 4,7 ± 0.5 5,3 ± 0.1 95% La Ilusión 5,8 ± 0.2 5,9 ± 0.5 -

La Ramada pastizal 5,5 ± 1.2 6,4 ± 0.1 80% Villa Ximena 5,5 ± 0.4 4,4 ± 0.6 - La Pastora 5,9 ± 0.1 5,9 ± 0.0 -

Santa Helena 4,8 ± 0.0 6,1 ± 0.3 95% Macarena 5,8 ± 0.2 5,9 ± 0.1 - Bella Vista 6,6 ± 0.3 5,6 ± 0.1 80% Mandalay 5,56 ± 0.1 6,03 ± 0.0 95% La Playa 5,16 ± 0.1 5,67 ± 0.1 95%





78

Dado que los parámetros fisicoquímicos no reflejan efecto alguno en los conteos de

microorganismos totales con DAPI, es necesario analizar los efectos en una escala más

pequeña como las coberturas o las mismas fincas en los muestreos. Además, la

heterogeneidad de las muestras y el efecto de la cobertura cafetal sin sombrío afectan en

gran medida los efectos de los eventos de muestreo en los conteos.

Tabla 25. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre cuencas para los dos eventos de muestreo

Evento de muestreo

Cuenca del río La Vieja (cel/gps) El Otún (cel/gps) La Vieja – El Otún

1 1,85 x 1011 ± 8.64 x 1010 1,70 x 1011 ± 8.73 x 1010 80% 2 2,32 x 1011 ± 9.40 x 1010 3,43 x 1011 ± 1.23 x 1011 95%



Se observaron conteos significativamente mayores (t-student; p < 0.05; n=192) en el

segundo evento de muestreo (Tabla 26). En los análisis fisicoquímicos, se observaron

datos significativamente mayores del porcentaje de humedad y temperatura del suelo

(t-student; p < 0.05; n=192, n=480, respectivamente) en el primer evento de muestreo.

Se observaron datos significativamente mayores de pH (t-student; p < 0.05; n=96) en el

segundo evento de muestreo. Puede existir un efecto del pH en los conteos, debido que

a pH cercanos a la neutralidad se encuentra más abundancia microbiana (Alexander,

1987; Hartel, 2005).

Tabla 26. Intervalo de confianza al que se presentaban diferencias significativas entre los eventos de muestreo.

Evento de muestreo 1a (celulas/gps) 2b (celulas/gps)

1-2 1,78 x 1011 ± 5.67 x 1010 2,88 x 1011 ± 1.22 x 10 11 95%



79

7. CONCLUSIONES

1. El uso de dos lavados en NaCl (0.85% p/v) a 13,000 rpm por 5 minutos, una

concentración de DAPI a 5 µg/ml por 30 minutos y el esquema de conteo de dos

filtros de la misma dilución, disminuye los interferentes de lectura del suelo,

genera células definidas, de alta fluorescencia y con altos conteos.

2. El análisis de las densidades de microorganismos totales edáficos, indicó que las

dos fincas de los cafetales y guaduales fueron significativamente diferentes entre

ellas, lo cual no permitió comparar estas coberturas en cada una de las cuencas

estudiadas para determinar el efecto de la cobertura en las densidades

microbianas.

3. Las diferencias observadas al interior de algunos sistemas productivos (p.e.,

cultivos mixtos y ganaderos) no permitieron la comparación entre ellos por lo

cual se realizó el análisis a una escala menor (coberturas).

.

.

.

80

8. RECOMENDACIONES

1. Para estudios posteriores se debe utilizar como escala de estudio la cobertura,

debido que para análisis microbiológicos no se puede evidenciar diferencias

entre sistemas productivos.

2. Es necesario muestrear cafetales sin sombrío y no asociados a cultivos de plátano

debido a que estos últimos pueden generar algún tipo de sombrío para el cultivo

de café.

3. Se pueden aplicar controles para el procedimiento (repeticiones de por finca)

para comparar la precisión de los conteos.

4. Sustituir la cobertura guadual por otra cobertura representativa que esté en las

dos ventanas y aumentar el número de fincas a 3 por cada cobertura para tener

muestras más representativas y menos variables de la zona, y aumentar la

confiabilidad del análisis estadístico.

81

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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.

92

10. ANEXOS

Anexo A. Preparación de DAPI para el conteo directo

Debido que el colorante muestra fotosensibilidad y pierde viabilidad cuando se

encuentra a temperatura ambiente, es necesario realizar todo el proceso en oscuridad y

con la mayor brevedad posible.

Inicialmente se preparó una solución stock de 50 µg/ml de DAPI (D9542, Sigma) en

agua MilliQ. Se homogenizo en vortex por 15 min y se filtro con un filtro de celulosa de

0.22 µm en frasco forrado con papel aluminio y cinta de enmascarar. Esta solución es

congelada a -20ºC hasta su uso.

Al momento de necesitarse el DAPI, se descongela completamente la solución stock y se

realiza una dilución 1/10 para ser alicuotada en viales protegidos de la luz de 1.5 ml. Si

sobra solución diluida, se puede congelar en las mismas condiciones que la solución

stock. Los viales son congelados a -20ºC hasta su procesamiento.

Es importante tener en cuenta, que entre menos veces se descongele cualquiera de las

soluciones con DAPI, mayor será su viabilidad en función del tiempo.

93

Anexo B. Cálculos de factor de corrección para conteos realizados en

Microscopio de epifluorescencia Nikon Eclipse 5.0i

Para expresar la concentración de la muestra en células por mililitro (cel/ml), se cuenta

las células en el área de la regilla que se observa por el ocular izquierdo del microscopio.

Al tener ese dato, se relaciona con el volumen de filtrado (ml) y el factor de corrección

(F) que relaciona el área examinada del filtro con respecto al área total.

Cada cuadricula tiene 100 cuadrados de un área de 2.5 x 10-3 mm2 y un área de 2.5 x

10-5 mm2 respectivamente. El área efectiva de lectura del filtro de policarbonato negro

de 25 mm de diámetro es de 346,360 mm2.

Para determinar el factor de corrección (F) se aplica la siguiente formula:

23.544,138105.2360,346

23

2

=

×=

= − mm

mm

cuadriculaladeárea

filtrodellecturadeefectivaáreaF

Usando el factor de corrección, se aplica la siguiente formula para convertir los conteos

a cel/ml:

Fmlfiltradaoriginalmuestradevolumen

celcuadriculaporcelulasdeconteo

ml

celulas ×=

)()(

94

Anexo C. Curva de calibración para el cultivo de Escherichia coli ATCC 25922

Se realizaró una curva de calibración de Escherichia coli ATCC 25922 (PUJ-M-Bio-

USBA-107) obtenida del cepario de USBA. Se relacionaron los datos obtenidos de las

absorbancias a 600 nm y los datos de conteo en placa.

Se realizaron dos preinoculos consecutivos en caldo nutritivo (Pronadisa, 1216.00) a 1/5

del volumen del recipiente a ~22ºC por 24 h a 160 rpm. Del segundo preinoculo, se hizo

un cultivo caldo nutritivo a ~22ºC por 160 rpm recuentos en agar nutritivo (Dibico,

1022-E). De igual forma se realizaron medicines de absorbancia para poder obtener la

línea mejor ajuste.

La curva se utilizó para conocer a una absorbancia definida un recuento específico y

utilizarlo para la estandarización del conteo con DAPI y poder evaluar los diferentes

tratamientos del protocolo de tinción.

95

Anexo D. Tabla de datos de la estandarización

Muestra Tratamientos Pretratamiento [DAPI] µµµµg/ml Esquema conteo Conteo E. coli 1 Prefiltrado 5 1 3,18 x 1012

E. coli 1 Prefiltrado 5 1 3,71 x 1012 E. coli 2 Prefiltrado 5 2 1,76 x 1012 E. coli 2 Prefiltrado 5 2 1,93 x 1012 E. coli 3 Lavado 5 1 2,05 x 1012 E. coli 3 Lavado 5 1 1,73 x 1012 E. coli 4 Lavado 5 2 1,26 x 1012 E. coli 4 Lavado 5 2 1,73 x 1012 E. coli 5 Prefiltrado 10 1 1,73 x 1012 E. coli 5 Prefiltrado 10 1 1,55 x 1012 E. coli 6 Prefiltrado 10 2 1,90 x 1012 E. coli 6 Prefiltrado 10 2 1,55 x 1012 E. coli 7 Lavado 10 1 6,79 x 1012 E. coli 7 Lavado 10 1 5,31 x 1012 E. coli 8 Lavado 10 2 1,91 x 1012 E. coli 8 Lavado 10 2 5,31 x 1012 Suelo 1 Prefiltrado 5 1 7,94 x 1011 Suelo 1 Prefiltrado 5 1 8,05 x 1011 Suelo 1 Prefiltrado 5 1 5,42 x 1011 Suelo 1 Prefiltrado 5 1 3,39 x 1011 Suelo 3 Lavado 5 1 5,75 x 1011 Suelo 3 Lavado 5 1 9,71 x 1011 Suelo 3 Lavado 5 1 6,11 x 1011 Suelo 3 Lavado 5 1 7,41 x 1011 Suelo 7 Lavado 10 1 2,86 x 1011 Suelo 7 Lavado 10 1 7,02 x 1011 Suelo 7 Lavado 10 1 2,59 x 1011 Suelo 7 Lavado 10 1 5,15 x 1011 Suelo 8 Lavado 10 2 7,20 x 1011 Suelo 8 Lavado 10 2 7,02 x 1011 Suelo 8 Lavado 10 2 5,09 x 1011 Suelo 8 Lavado 10 2 5,15 x 1011

96

Anexo E. Distribución de los tratamientos para la estandarización con de E.

coli.

12,2

12,3

12,4

12,5

12,6

12,7

12,8

12,9

Logc

onte

o

1 2 3 4 5 6 7 8

Tratamiento

97

Anexo F. Distribución de los tratamientos, ANOVA y comparación de medias

utilizando Tukey-Kramer para la estandarización con la muestra de suelo

12,4

12,5

12,6

12,7

12,8

12,9

13

Logc

onte

o

1 3 7 8

Tratamiento

Análisis de una vía Anova

Análisis de Varianza

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Tratamiento 3 0,12762331 0,042541 1,8562 0,1908 Error 12 0,27502747 0,022919 C. Total 15 0,40265078

Comparación de todas los pares de medias usando Tukey-Kramer HSD

q* 2,96883

Abs(Dif)-LSD 3 8 1 7 3 -0,31781 -0,24787 -0,23456 -0,07385 8 -0,24787 -0,31781 -0,30450 -0,14379 1 -0,23456 -0,30450 -0,31781 -0,15710 7 -0,07385 -0,14379 -0,15710 -0,31781

Positive values show pairs of means that are significantly different.

98

Anexo G. t-student para los conteos entre las concentraciones de DAPI para la

estandarización en las muestras de suelo.

12,4

12,5

12,6

12,7

12,8

12,9

13

Logc

onte

o

5 10

Concentracion

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 0,11533 1,460 14 0,1664 Std Error 0,07899

Lower 95% -0,05410 Upper 95% 0,28475

Assuming equal variances

99

Anexo H. t-student para los conteos entre los esquemas de conteo para la

estandarización en las muestras de suelo.

12,4

12,5

12,6

12,7

12,8

12,9

13

Logc

onte

o

1 2

Esq conteo

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,03913 -0,402 14 0,6938 Std Error 0,09735

Lower 95% -0,24793 Upper 95% 0,16968


100

Anexo I. t-student para los conteos entre los pretratamientos para la

estandarización con muestras de suelo.

12,4

12,5

12,6

12,7

12,8

12,9

13

Logc

onte

o

Lavado Prefiltrado

Pretratamiento

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,02139 -0,219 14 0,8300 Std Error 0,09775

Lower 95% -0,23103 Upper 95% 0,18826


101

Anexo J. Datos del primer evento de muestreo

Ventana Sistema productivo Fincas Cobertura Cel/gps 1a Ganadería de carne La ilusión Bosque 3,13 x 1011

1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 1,63 x 1011 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 1,22 x 1011 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 1,88 x 1011 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 1,30 x 1011 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 1,15 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,13 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,14 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,21 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,25 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 9,47 x 1010 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 2,06 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,35 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 2,12 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,48 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,43 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,63 x 1011 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,91 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,23 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 1,94 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 1,87 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,52 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 1,56 x 1011 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 1,64 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSSc 1,10 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,05 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,50 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,68 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 2,25 x 1011 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,59 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,68 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 3,52 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 2,85 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 2,25 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 2,38 x 1011 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 6,46 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,85 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 2,26 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,53 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,39 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,57 x 1011 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,66 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 2,30 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,52 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,83 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,88 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,51 x 1011 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,54 x 1011 2b Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,24 x 1011 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,14 x 1011 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,44 x 1011

102

2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,10 x 1011 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,62 x 1011 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,91 x 1011 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 9,45 x 1010 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 9,78 x 1010 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 9,93 x 1010 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 1,01 x 1011 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 1,09 x 1011 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 1,30 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,63 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,49 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,72 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,36 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,20 x 1011 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 1,07 x 1011 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 9,45 x 1010 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 7,43 x 1010 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 7,13 x 1010 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 7,54 x 1010 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 7,11 x 1010 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 7,19 x 1010 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 3,00 x 1011 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 2,25 x 1011 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 1,18 x 1011 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 1,09 x 1011 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 1,07 x 1011 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 9,69 x 1010 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,48 x 1011 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,54 x 1011 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 2,90 x 1011 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 2,64 x 1011 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 1,82 x 1011 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 1,78 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 2,48 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,35 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,85 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 2,65 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,23 x 1011 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,17 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 1,64 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 1,49 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 1,44 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 2,01 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 1,58 x 1011 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 1,47 x 1011

a Cuenca del río La vieja b Cuenca del río El Otún c CFSS = Cobertura cafetal sin sombrío

103

Anexo K. Datos del segundo evento de muestreo

Ventana Sistema productivo Fincas Cobertura Cel/gps 1a Ganadería de carne La ilusión Bosque 2,20 x 10 11

1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 2,92 x 10 11 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 2,03 x 10 11 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 4,27 x 10 11 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 4,97 x 10 11 1 Ganadería de carne La ilusión Bosque 3,55 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 2,89 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 2,28 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,76 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,66 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 2,05 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Pastizal 1,93 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,70 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,80 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 3,31 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 3,34 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 1,41 x 10 11 1 Ganadería de carne La Ramada Guadual 2,15 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,23 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 3,52 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 1,97 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,14 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,76 x 10 11 1 Cultivos mixtos La Comarca Guadual 2,88 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSSc 2,11 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,79 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 2,38 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 2,27 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,42 x 10 11 1 Cultivos mixtos El Bolsillo CFSS 1,71 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,64 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,02 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,38 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,16 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,35 x 10 11 1 Cultivos mixtos Alegría CFSS 1,59 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 5,21 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 4,05 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 2,71 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 3,29 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,80 x 10 11 1 Ganadería de leche Bremen Bosque 1,98 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,53 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,76 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 2,20 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,86 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,82 x 10 11 1 Ganadería de leche Villa Ximena Pastizal 1,97 x 10 11

104

2b Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,46 x 10 11 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,17 x 10 11 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 1,21 x 10 11 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 2,27 x 10 11 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 2,16 x 10 11 2 Cultivos mixtos Macarena Cebolla 2,14 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 6,64 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 4,51 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 2,43 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 4,40 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 3,96 x 10 11 2 Cultivos mixtos Santa Helena Bosque 3,46 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 3,19 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 4,45 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 2,62 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 3,20 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 2,60 x 10 11 2 Cultivos mixtos Bella Vista Cebolla 3,18 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 3,08 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 2,93 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 3,67 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 3,33 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 2,04 x 10 11 2 Cultivos mixtos Mandalay Guadual 2,36 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 5,62 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 4,01 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 4,99 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 4,73 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 4,15 x 10 11 2 Cultivos mixtos La Playa Guadual 4,08 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,25 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,92 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 5,51 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,58 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 6,97 x 10 11 2 Cultivos forestales Playa Rica Forestales 3,19 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,16 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 2,37 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 4,79 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 3,58 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 2,82 x 10 11 2 Cultivos forestales Lisbrán Forestales 2,64 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 2,68 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 2,84 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 3,00 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 3,17 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 3,67 x 10 11 2 Áreas protegidas La Pastora Bosque 3,42 x 10 11

a Cuenca del río La vieja b Cuenca del río El Otún c CFSS = Cobertura cafetal sin sombrío

105

Anexo L. Efecto de la cobertura sobre los conteos

Primer evento de muestreo

Cuenca del río La Vieja

t-student del log conteo en los bosques

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 0,02012 0,275 10 0,7890 Std Error 0,07319 Lower 95% -0,14296 Upper 95% 0,18319


t-student del log conteo en los pastizales

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,14289 -2,583 10 0,0273 Std Error 0,05532 Lower 95% -0,26615 Upper 95% -0,01963


11,05

11,1

11,15

11,2

11,25

11,3

11,35

11,4

11,45

11,5

Bremen La Ilusión

Finca

11

11,1

11,2

11,3

La Ramada P Villa Ximena

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

106

t-student del log conteo en los guaduales

t-Test



t-student del log conteo en los cafetales

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 0,290882 3,014 10 0,0130 Std Error 0,096523 Lower 95% 0,075814 Upper 95% 0,505949


Cuenca del río El Otún

Log cel/gps

11,15

11,2

11,25

11,3

11,35

11,4

La Comarca La Ramada G

Finca

Log cel/gps

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

Alegría El Bolsillo

Finca

107

t-student del log conteo en los cultivos de cebolla

t-Test




t-Test



Log cel/gps

11,05

11,1

11,15

11,2

11,25

11,3

Bella Vista Macarena Finca

Log cel/gps

10,95 11

11,05 11,1

11,15 11,2

11,25 11,3

La Pastora Santa Helena

Finca

108


t-Test



t-student del log conteo en los forestales

t-Test



Log cel/gps

10,9

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

La Playa Mandalay

Finca

Log cel/gps

11,25 11,3

11,35 11,4

11,45 11,5

11,55 11,6

Lisbran Playa Rica

Finca

109

Segundo evento de muestreo



t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,02700 -0,279 10 0,7860 Std Error 0,09684 Lower 95% -0,24277 Upper 95% 0,18877


t-student del log conteo en los pastizales

t-Test



11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

Bremen La Ilusión

Finca

11,2

11,25

11,3

11,35

11,4

11,45

La Ramada P Villa Ximena

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

110

t-student del log conteo en los Guaduales

t-Test



t-student del log conteo en los cafetales

t-Test



11,2

11,3

11,4

11,5

La Comarca La Ramada G

Finca

11

11,1

11,2

11,3

11,4

Alegría El Bolsillo

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

111


t-student del log conteo en los cultivos de cebolla

t-Test




t-Test



11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

Bella Vista Macarena

Finca

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

La Pastora Santa Helena

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

112


t-Test




t-Test



11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

La Playa Mandalay

Finca

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

Lisbran Playa Rica

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

113

Anexo M. Diferencias entre muestreos por coberturas


t-student del log conteo de los cafetales entre eventos de muestreo

t-Test



t-student del log conteo de los guaduales entre eventos de muestreo

t-Test



11

11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 11,9

1 2

Muestreo

11,15

11,2

11,25

11,3

11,35

11,4

11,45

11,5

11,55

1 2

Muestreo

Log cel/gps

Log cel/gps

114

t-student del log conteo de los bosques entre eventos de muestreo

t-Test



t-student del log conteo de los pastizales entre eventos de muestreo

t-Test



11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

1 2

Muestreo

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

1 2

Muestreo

Log cel/gps

Log cel/gps

115


t-student del log conteo de los bosques entre eventos de muestreo

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,43847 -9,462 22 <.0001 Std Error 0,04634 Lower 95% -0,53457 Upper 95% -0,34236


t-student del log conteo de los cultivos de cebolla entre eventos de muestreo

t-Test



10,9 11

11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 11,9

1 2

Muestreo

11

11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6

1 2

Muestreo

Log cel/gps

Log cel/gps

116

t-student del log conteo de los guaduales entre eventos de muestreo

t-Test



t-student del log conteo de los forestales entre eventos de muestreo

t-Test



10,8 10,9

11

11,1 11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8

1 2

Muestreo

11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8

1 2

Muestreo

Log cel/gps

Log cel/gps

117

Anexo N. Efecto del sistema productivo sobre los conteos



Análisis de varianza del Log conteo en ganadería de carne

ANOVA de una vía Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Finca 2 0,05062296 0,025311 1,6668 0,2220 Error 15 0,22778581 0,015186 C. Total 17 0,27840877

Análisis de varianza del Log conteo en cultivos mixtos

ANOVA de una vía Análisis de varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Finca 2 0,25731769 0,128659 6,2124 0,0108 Error 15 0,31065162 0,020710 C. Total 17 0,56796931

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

La Ilusión La Ramada G La Ramada P

Finca

11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

Alegria El Bolsillo La Comarca

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

118

t-student del log conteo en ganadería de leche

t-Test





ANOVA de una vía Análisis de varianza

Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Finca 4 0,33888237 0,084721 6,9051 0,0007 Error 25 0,30673185 0,012269 C. Total 29 0,64561422

11,15

11,2

11,25

11,3

11,35

Bremen Villa Ximena

Finca

10,9 11

11,1 11,2 11,3 11,4 11,5

Bella Vista La Playa Macarena Mandalay Santa Helena

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

119

t-student del log conteo de los forestales

t-Test





Análisis de varianza Log conteo en ganadería de carne



Log cel/gps

11,25 11,3

11,35 11,4

11,45 11,5

11,55 11,6

Lisbrán Playa Rica

Finca

Log cel/gps

11,2 11,3 11,4 11,5 11,6 11,7

La Ilusión La Ramada G La Ramada P

Finca

120

Análisis de varianza del Log conteo en los cultivos mixtos



t-student del log conteo en ganadería de leche

`

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 0,205072 2,697 10 0,0224 Std Error 0,076024 Lower 95% 0,035681 Upper 95% 0,374463


11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

Alegría El Bolsillo La Comarca

Finca

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

Bremen Villa Ximena

Finca

Log cel/gps

Log cel/gps

121




Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Finca 4 0,69104057 0,172760 14,8023 <.0001 Error 25 0,29177973 0,011671 C. Total 29 0,98282030

t-student del log conteo de los cultivos forestales

t-Test



11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

Bella Vista La Playa Macarena Mandalay Santa Helena

Finca

Log cel/gps

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

Lisbran Playa Rica

Finca

Log cel/gps

122

Anexo O. Conteos del control de procedimiento Escherichia coli ATCC 25922


1 3,73 x 1012

2 2,97 x 1012 3 2,95 x 1012 4 3,32 x 1012 5 2,89 x 1012 6 2,85 x 1012 7 3,17 x 1012 8 3,03 x 1012


1 3,61 x 1012 2 3,59 x 1012 3 3,04 x 1012 4 2,85 x 1012 5 2,84 x 1012 6 3,16 x 1012 7 3,61 x 1012 8 3,59 x 1012

123

Anexo N. Relación del conteo, porcentaje de humedad y temperatura entre

ventanas del primer evento de muestreo

t-student del log conteo entre ventanas del primer evento de muestreo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,05630 -1,516 94 0,1329 Std Error 0,03714 Lower 95% -0,13003 Upper 95% 0,01743


t-student del porcentaje de humedad del suelo entre ventanas del primer evento de muestreo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 6,5233 2,522 46 0,0152 Std Error 2,5869 Lower 95% 1,3161 Upper 95% 11,7306


10,810,9

11 11,111,2

11,311,4

11,511,611,7

11,811,9

El Otun La Vieja

Ventana

%H

0

10

20

30

40

50

El Otun La Vieja

Ventana

Log cel/gps

124

t-student del porcentaje de la temperatura del suelo entre ventanas del primer evento de muestreo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -2,3792 -3,474 46 0,0011 Std Error 0,6848 Lower 95% -3,7575 Upper 95% -1,0008


.

.

14

16

18

20

22

24

26

28

El Otun La Vieja

Ventana

Tem soil

125

Anexo Ñ. Relación del conteo, porcentaje de humedad y temperatura entre

ventanas del segundo evento de muestreo

t-student del log conteo entre ventanas del segundo evento de muestreo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 0,170044 5,189 94 <.0001 Std Error 0,032767 Lower 95% 0,104984 Upper 95% 0,235105

Assuming equal variantes

t-student del porcentaje de humedad del suelo entre ventanas del segundo evento de muestreo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate 2,7635 1,166 46 0,2495 Std Error 2,3693 Lower 95% -2,0056 Upper 95% 7,5326


11

11,1

11,2

11,3

11,4

11,5

11,6

11,7

11,8

11,9

El Otun La Vieja

Ventana

%H

10

15

20

25

30

35

40

45

50

El Otun La Vieja

Ventana

Log cel/gps

126

t-student de la temperatura del suelo entre ventanas del segundo evento de muestreo

t-Test



.

.

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

El Otun La Vieja

Ventana

Tem soil

127

Anexo O. Libreta de campo

Primer muestreo

Ventana No 1.

Finca La Ilusión (Bosque)

Presencia de grades árboles con raíces tubulares con un diámetro de altura del pecho

superior a los 2m. Los tres cuadrantes del muestreo se ubicaron en la falda occidental del

parche del bosque.

P1 P2 P3 Temperatura 21,8 22,1 21,8

Promedio de profundidad de la hojarasca

P1 P2 P3 cm 0,9 1 3,1

La Ramada (Pastizal)

El pastizal tiene una antigüedad cercana a los 20 años. Se esta aprovechando para

ganado Cebú de leche


Promedio de la altura del pasto:

P1 P2 P3 cm 20,4 23,4 8,6

La Ramada (Guadual)

Fragmento de guadual asociado al curso de agua cuyo cause esta en la parte baja de un

barranco empinado. La mayoría del guadual esta al costado occidental. La cobertura

corresponde a los grupos de pocas guaduas en la orilla de la quebrada


128


P1 P2 P3 cm 5,1 5,2 5,9

La Comarca (Guadual)

Finca con amplios jardines, sectores de guadual y un lago con lodos. El guadual del

muestreo estaba localizado a lado y lado de una quebrada grande de 10 m de ancho. La

extensión del guadual es de más de 50 m de ancho con una leve pendiente.

P1 P2 P3 Temperatura 22,3 22 22,2


P1 P2 P3 cm 4,8 10,3 5,7

El Bolsillo (Cafetal sin sombrío)

Esta finca tiene sectores de cafetal antiguo, donde se encuentra cafetal sin sombrío por lo

menos desde hace 25 años. Una parte de la finca fue cafetal con platano en un sector

con una pendiente considerable (30º) y en otro existen cultivos de platano y yuca.

Ademas tienen ganado lanar de subsistencia.

El cafetal con sombrío donde se tomaron las primeras muestras tubo predominio de

gusanos en el dosel laxo; el sotobosque presenta algunas moraceas y el piso estaba

tapizado con balsaminaceas, conmelinas, verbenaceas y gesneriaceas adhesivas. El

terreno era plano. Se le aplican agroquímicos y existe la presencia de broca.

P1 P2 P3 Temperatura 22,2 23,8 23


P1 P2 P3 cm 3 2 3,6

129

La Alegría (Cafetal sin sombrío)

Tiene un cafetal con plátano y una densa y gruesa capa de hojarasca con grandes aportes

de plátano. Tiene una antigüedad de 35 años. El terreno es más o menos pendiente cerca

del río. Se aplican agroquímicos de la variedad caturro.



P1 P2 P3 cm 22,2 4 0,7

Bremen (Bosque)

El sector del muestreo esta en la horilla del sendero didáctico en un terreno poco

inclinado (4º) con un sotobosque denso. El diámetro a la altura de pecho de la mayoría

de los individuos es menor a los 10 cm y los individuos mayores tienen un diámetro de

hasta 70 cm. Existe un reclutamiento importante de moráceas. Existen helechos con un

diámetro de 10 cm de una altura de 3,5 m. Helechos con vernación húmeda y viscosa de

50 a 70 cm de alto.



P1 P2 P3 cm 5,76 10,9 3

Villa Ximena (Pastizal)

Producción de leche tecnificada. En un terreno mas o menos plano con pasto alto.

Algunos árboles de sombra ubicados a la orilla del camino. Cuadrantes descubiertos.


130

Promedio de la altura del pasto

P1 P2 P3 cm 11,56 38,2 24,6

Ventana El Otún

Macarena (Cebolla)

P1 P2 P3 Temperatura 22.1 22,1 22,7

Promedio de la altura del la cebolla

P1 P2 P3 cm 11,56 38,2 24,6

Santa Helena (Bosque)

Relicto de bosque suscesional, reconocido localmente como un rastrojo. Ubicado en la

parte alta del valle en este sector de la cuenca, al borde de la carretera.


Promedio de la profundidad de la hojarasca

P1 P2 P3 cm 2,1 4,8 3,9

Bella Vista (Cebolla)

P1 P2 P3 Temperatura 24,6 23,5 23,56

Promedio de la altura de la cebolla

P1 P2 P3 cm 41,8 48,4 52,2

131

Mandalay (Guadual)

Guadual en la vega del río. Cobertura mas o menos uniforme en el suelo de hojas de

guadua. Yemas espinosas. Las cepas de los individuos conforman un dosel largo y

discontinuo de mas o menos 7 metros de altura. Los tres cuadrantes distan entre si por

100 m.



P1 P2 P3 cm 4,1 5 2,4

La Playa (Guadual)



P1 P2 P3 cm 0,6 2,4 1,2

Playa rica (Forestal)

Plantación forestal de ciprés a lo largo de varias colinas a 2106 msnm. Sotobosque

completamente despejado. Árboles jóvenes de ciprés con diámetro a la altura del pecho

de 20 a 50 cm. El piso tiene un tapete continuo de hojas de ciprés y varios montones de

ramas. El segundo cuadrante se tomó de un valle a un estado sucecional avanzado.



P1 P2 P3 cm 0,4 0,58 0,6

132

Lisbrán (Forestal)

Plantación de pinos de más o menos 15 m de alto con un diámetro a la altura al pecho de

20 a 60 cm

P1 P2 P3 Temperatura 20 20,54 19,7


P1 P2 P3 cm 9 5,6 5

La pastora (bosque)


Densidad de la cobertura vegetal:

P1 P2 P3 % de docel/punto 95,06 93,708 91,212


P1 P2 P3 cm 2,2 3,3 2,1

Segundo muestreo

Ventana La vieja

La Ilusión (Bosque)



P1 P2 P3 cm 1,4 3,1 1,9

133

La Ramada (Pastizal)

P1 P2 P3 Temperatura 26,2 26 26


P1 P2 P3 cm 26,8 21,8 30,8

La Ramada (Guadual)



P1 P2 P3 cm 5 6,2 4,6

La Comarca (Guadual)

P1 P2 P3 Temperatura 23 22,6 22,6


P1 P2 P3 cm 11 11,4 6

El Bolsillo (Cafetal sin sombrío)



P1 P2 P3 cm 3,2 3,7 2,2

134

La Alegría (Cafetal sin sombrío)

Fuertes precipitaciones con presencia de granizo días antes de la toma de muestras.



P1 P2 P3 cm 5,6 3,4 2,8

Bremen (Bosque)



P1 P2 P3 cm 5,6 7,2 4,5

Villa Ximena (Pastizal)



P1 P2 P3 cm 29 13,8 20

Ventana El Otún

Macarena (Cebolla)


135


P1 P2 P3 cm 43,28 34,8 42,3

Santa Helena (Bosque)



P1 P2 P3 cm 9,3 4,9 5,2

Bella Vista (Cebolla)



P1 P2 P3 cm 50,9 54,2 56,4

Mandalay

Al realizar la toma de muestras se observo gran cantidad de bolsas de basura

P1 P2 P3 Temperatura 16,2 17


P1 P2 P3 cm 4,8 7,8

La Playa (Guadual)

P1 P2 P3 Temperatura 16 16

136


P1 P2 P3 cm 5,3 8,2

Playa Rica (forestales)



P1 P2 P3 cm 6,2 0,8 0,7

Lisbran (forestales)



P1 P2 P3 cm 4 6,3 4,3

La Pastora (Bosque)



P1 P2 P3 cm 5,2 2,8 4,1

137




LA VIEJA Y EL OTÚN

Andrés Felipe Vela Rojas1 y Fabio Roldán1

Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología,

Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA)

Cra 7 No. 43-83. Edificio Jesús Emilo Ramírez S.J No. 53. Lab 314b

Correo electrónico: [email protected]

138

RESUMEN: El objetivo del presente estudio fue estimar la densidad microbiana en

suelos de diferentes sistemas productivos del Eje Cafetero Colombiano por microscopía

de epiflurescencia. Por lo cual se estandarizó la técnica y se evaluó el efecto de los

sistemas productivos sobre los conteos empleando DAPI. Para estandarizar la técnica se

evaluaron tres variables: el uso de dos pretratamientos, la evaluación de dos

concentraciones de DAPI y dos esquemas de conteo. Posteriormente en dos épocas de

muestreo de diferentes características climáticas, se tomaron en cada una 48 muestras

compuestas de suelo. Se analizaron variables fisicoquímicas como pH, porcentaje de

humedad, temperatura del suelo y altura de la hojarasca y del cultivo.

Se determinó que dos lavados sucesivos en NaCl (0,85% p/v) a 13000 rpm por 5

minutos a una concentración de 5 µg/ml de DAPI por 20 min y el uso de dos filtros, uno

de la dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución generó los

conteos mas altos, la CV mas pequeña y la calidad del filtro mayor de todos los

tratamientos evaluados.

Al analizar los datos en el sistema productivo se observó que presenta alta

heterogeneidad, por lo cual fue necesario analizar los datos por coberturas. La cobertura

forestal presentó los mayores conteos. Adicionalmente los cafetales sin sombrío, los

guaduales y el cultivo de cebolla mostraron ser las coberturas más variables mientras

que los bosques y los pastizales fueron las coberturas menos variables. Finalmente se

observaron mayores conteos en el segundo evento de muestreo.

Palabras claves: DAPI, sistemas productivos, conteos, densidad, suelo.

139

ABSTRACT: The purpose of the present study was to consider the soils microbial

density of the different productive systems from the Colombian coffee zone by

epifluorescence microscopy. For this reason this technique was standardized and the

effect of the productive systems was evaluated on the counts by using DAPI. To

standardize the technique three variables were evaluated: the use of two pre-treatments,

two DAPI’s concentrations, and two count schemes. Sampling was conducted at two

different seasons (June and September) from 16 farms within 6 different productive

systems. Three random composite samples were collected from each farm for a 96 total

samples. Physiochemical variables like pH, humidity, soil temperature and height of the

litter fall and cultivation were analyzed.

It was determined that the successive washings with NaCl (0.85% w/v) to 13,000 rpm by

5 minutes, staining with 5 µg/ml of DAPI by 20min and the use of two filters: one from

the selected dilution, and the second from the duplicate to the same dilution generated

the highest counts, the highest precision and in general the best quality of all the

evaluated treatments.

The productive systems showed a high heterogeneity level indicating that the effect has

to be monitored at the covers level. The forest cover displayed greater microbial counts.

Additionally, the coffee plantations without shady, the bamboo an onion cultivations

were the most variable covers despite the fact that the forests and pastures were the less

variable covers. Finally bigger counts in the second event of sampling were observed.

Keywords: DAPI, productive systems, counts, density, soil.

140




LA VIEJA Y EL OTÚN

A. Vela1 y F. Roldán1

Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología,

Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA)

Cra 7 No. 43-83. Edificio Jesús Emilo Ramírez S.J No. 53. Lab 314b

Correos electronicos: [email protected], [email protected]

1. INTRODUCCIÓN

El suelo es la matriz heterogénea y variable que soporta el mantenimiento de organismos

de nivel macro y microscópico. Los microorganismos son unidades biológicas,

autónomas, de amplia versatilidad metabólica capaces de utilizar compuestos, sintetizar

biomasa y generar sustancias útiles para otros organismos que necesitan sustratos en

forma disponible y asimilable, y cumplen funciones primordiales en la fijación de

nitrógeno, la degradación de compuestos contaminantes y el ciclaje de nutrientes y

materia orgánica. Los microorganismos en el suelo se encuentran definidos en fusión de

la densidad. La densidad o abundancia total es definido como el total de

microorganismos por unidad de hábitat. Esta densidad conjugada con la riqueza y la

abundancia relativa ayudan a definir la diversidad de un ambiente. Para determinar la

densidad microbiana se pueden utilizar métodos de conteos directos e indirectos.

El presente trabajo se enmarca en el proyecto del centro de investigaciones y estudios en

biodiversidad y recursos genéticos (CIEBREG) enfocado evaluar el efecto de los

sistemas productivos sobre la densidad de los microorganismos edáficos en suelos del

eje cafetero en las cuencas de los ríos La Vieja y El Otún

141

2. MATERIALES Y MÉTODOS

El conteo directo de los microorganismos del suelo se realizó utilizando microscopio de

epifluorescencia con 4'-6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). Inicialmente, se

realizó la estandarización de la técnica para conteo de microorganismos en el laboratorio

de USBA con un cultivo de E. coli a una concentración conocida y con una muestra de

suelo. Para la estandarización del protocolo de tinción se modificaron algunos de los

pasos reportados en la literatura para disminuir la variabilidad y la presencia de

interferentes e incrementar la exactitud. Con base con los resultados obtenidos durante

la estandarización, se estableció el protocolo de tinción para realizar los conteos durante

la fase de campo del estudio.

2.1. Estandarización de la tinción de microorganismos del suelo con DAPI:

2.1.1. Cultivo de E. coli o control de procedimiento: con el fin de obtener una

solución con una concentración conocida de bacterias, se realizaron curvas de

crecimiento por absorbancia y UFC en el tiempo, y se estableció una curva de

calibración de Unidades Formadores de colonia (UFC)/ml vs. absorbancia (600 nm).

Para la realización de estas curvas, se empleó un cultivo de E. coli ATCC 25922 (PUJ-

M-Bio-USBA-107), al cual se le realizaron dos preinóculos consecutivos en caldo

nutritivo (Pronadisa, 1216) a 1/5 del volumen del recipiente a 25ºC por 24 h a 160 rpm.

Del segundo preinóculo, se hizo un cultivo en caldo nutritivo a 25ºC a 160 rpm, del cual

se tomaron muestras para realizar recuentos en agar nutritivo (Dibico, 1022-E) y

mediciones de absorbancia en el tiempo para poder obtener la línea mejor ajuste. La

curva de calibración se utilizó para conocer una abundancia específica a una absorbancia

definida y utilizar esa concentración para la estandarización del conteo con DAPI.

2.1.2. Estandarización de la tinción utilizando suelo: se utilizaron muestras de suelo

de jardín por duplicado. Las muestras se transportaron y mantuvieron a 4-6 ºC hasta su

análisis.

2.1.3. Descripción del protocolo de tinción: Se utilizó el protocolo utilizado por

Casamayor (2006) del Centro de estudios avanzados de Blanes (CEAB) el cual esta

142

basado en el protocolo propuesto por Porter y Freig (1980) y Kirchman y colaboradores

(1982).

2.1.3.1. Extracción de microorganismos: El paso inicial para el conteo directo es la

extracción de los microorganismos presentes en el suelo. La estandarización de la

extracción fue realizada por Latorre (2007) donde 10 g de suelo fueron colocados en 90

ml de solución salina al 0,85% p/v (grado reactivo; J.T.Baker). La mezcla fue

homogenizada en un agitador orbital (I2100; New Science) a 160 rpm por 15 min y se

dejó sedimentar por 5 min. Se realizaron diluciones seriadas del sobrenadante en base

10 hasta 10-6 en solución salina (0.85% p/v) previamente filtrada (GSWP04700;

millipore) y esterilizada a 121oC, 15 lb de presión por 15 min.

.

2.1.3.2. Filtración: se colocó 1 ml de la dilución seleccionada en 9 ml de solución salina

(0.85% p/v). La muestra fue mezclada por vortex y filtrada utilizando un filtro de 0,22

µm de policarbonato negro de 25 mm de diámetro (GTBP02500, Millipore) con ayuda

de una bomba de vació a 25 psi (ROA-P164-AA:GAST). Finalmente el filtro se dejó

secar por 20 min a temperatura ambiente antes de la tinción.

2.1.3.3. Tinción: se agregaron 100 µl de DAPI (D9542; Sigma) sobre toda la superficie

del filtro de manera homogénea con una micropipeta (la concentración y el tiempo de

contacto se evaluaron en 5.1.4.2). Posteriormente, el filtro se lavó con agua MilliQ por 1

min y se enjuagó en etanol (70% v/v) por 2 s, para finalmente dejarse secar a

temperatura ambiente en oscuridad por 20 min.

2.1.3.4. Acondicionamiento del filtro: El filtro seco se colocó en una lámina porta

objetos y se le agregó en el centro una gota de aceite Citifluor AF1 (No. 17970-25;

Electrón Microscopy). Luego se le colocó una laminilla presionando fuertemente para

evitar la formación de burbujas. Al montar la lámina en el microscopio de

epifluorescencia (Eclipse 5.0i, Nikon) se utilizó un filtro de doble acción, excitación de

400 a 418 nm y lectura de 450 a 465 nm, y aceite de inmersión de baja luminiscencia (50

tipo NF, Nikon).

2.1.3.5. Conteo: Se consideró como células los óvalos, círculos y puntos definidos que

mostraron una coloración azul fluorescente durante la observación. En caso de

143

observarse un número de células por rejilla de lectura menor a 30, se leyeron 50 campos

aleatorios por filtro y en caso de presentarse un número mayor de cel/campo, se leyó 20

campos aleatorios por filtro (Casamayor, 2006).

2.1.4. Modificaciones al protocolo de tinción:

2.1.4.1. Evaluación de un pretratamiento para eliminar interferencia de la matriz

de suelo: Se evaluaron dos pretratamientos para reducir la interferencia causada por la

fluorescencia de la matriz en las muestras:

3.Un prefiltrado de la dilución del extracto de células utilizando un filtro de

fibra de vidrio de 42 mm de diámetro (2.0-8.0 µm) (AP2502500; Millipore)

(Maier et al., 2001).

4. Dos lavados sucesivos de la dilución del extracto de células utilizando

solución salina (0.85% p/v) por centrifugación a 13,000 rpm por 5 min.

2.1.4.2. Evaluación de la concentración de DAPI para la tinción: Se evaluaron dos

concentraciones de DAPI a 5 µg/ml por 20 min (Schallenberg et al., 1989) y 10 µg/ml

por 40 min (Yu et al., 1995) para determinar la concentración óptima del colorante en

muestras de suelo.

2.1.4.3. Esquema de conteo: Se evaluaron dos esquemas de conteo para aumentar la

precisión y evitar la variabilidad en cada muestra. El primer esquema consistió en

obtener dos filtros de la dilución seleccionada de cada muestra, mientras que el segundo,

consistió en obtener 2 filtros, uno de la dilución seleccionada y el segundo de un

duplicado a la misma dilución

2.1.5. Tratamientos evaluados durante la estandarización: Inicialmente se utilizó el

cultivo de E. coli para seleccionar los tratamientos que presentaron los mayores conteos

y una muestras de suelo para seleccionar el mejo tratamientos con base en los recuentos

y en el análisis visual (Tabla 1). Para el análisis visual de los filtros se observó la

disminución de los interferentes de lectura, la eliminación de la fluorescencia de fondo,

la fluorescencia de las células y del borde, la nitidez del filtro y la distribución

homogénea de las células en el filtro.

Tabla 1. Tratamientos evaluados para la estandarización del conteo con DAPI

utilizando un cultivo de E. coli y las muestras de suelo.

144

Tratamiento Pretratamiento [DAPI] µµµµg/ml Esquema Conteo a

1 Prefiltrado 5 1

2 Prefiltrado 5 2

3 Lavado 5 1

4 Lavado 5 2

5 Prefiltrado 10 1

6 Prefiltrado 10 2

7 Lavado 10 1

8 Lavado 10 2

a 1) Dos filtros de la dilución seleccionada para cada muestra y 2) dos filtros, uno de la

dilución seleccionada y el segundo del duplicado a la misma dilución.

2.1.6. Control de calidad del conteo: tres elementos que definen la calidad del proceso

de tinción la distribución homogénea de las células en el filtro de lectura, la baja

fluorescencia de fondo y la definición de la tinción del borde del microorganismo. Estas

características se aplicaron estrictamente a cada filtro de lectura y en caso de cumplirse,

los filtros se desechaban y se repetía el proceso.

2.1.7. Análisis estadístico: Inicialmente, se observó si los datos presentaban una

distribución normal y la homogeneidad de varianza con la prueba de Bartlett (p<0.05).

Para su análisis estadístico los datos fueron transformados con el logaritmo base diez y

analizados con pruebas paramétricas. Se valuó la precisión utilizando el porcentaje del

coeficiente de variación (% CV) y la exactitud comparando la concentración del control

(cultivo de E. coli) con el valor obtenido durante el conteo. Para las muestras de suelo

se observaron diferencias entre los tratamientos con la prueba de Tukey-kramer (p<0.05)

para escoger el que tenga los mayores conteos.

2.2. Estimación de la densidad microbiana en suelos de la ecorregión cafetera

utilizando DAPI

2.2.1. Muestreo: En cada una de las coberturas seleccionadas (Tabla 2), se ubicaron

aleatoriamente tres cuadrantes (2.5m x 2.5m) representativos, a por lo menos 30 m del

borde, para evitar el efecto borde. Se tomó una muestra en cada vértice y del centro de

145

los cuadrantes con un barreno de 15 cm de largo por 5 cm de diámetro en la cabeza de

toma de muestras. Se obtuvo una muestra compuesta por cuadrante después de mezclar

vigorosamente en un plástico de alta densidad las muestras obtenidas de todos los puntos

del cuadrante. De esta mezcla, se tomaron 2 kg de suelo en una bolsa de cierre

hermético la cual fue refrigerada (4-6 ºC) durante su transporte hasta el laboratorio de

USBA y su posterior análisis.

2.2.2 Unidades de muestreo

En el marco de la investigación del CIEBREG, se tomaron como unidad macro del

muestreo las dos ventanas correspondientes a la cuenca del río La Vieja y Otún en la

ecorregión cafetera. Estas ventanas fueron seleccionadas con criterios de

heterogeneidad espacial, gradiente altitudinal y estructuras de paisaje por medio de un

análisis de correspondencias canónicas de características bióticas y abióticas (Camargo,

2006). Una vez definidas las ventanas, se tomaron como siguiente nivel de muestreo

los sistemas productivos que correspondían a conjuntos de propiedades que reflejan un

tipo particular de aprovechamiento y uso de la tierra (Camargo, 2006). Se seleccionaron

dentro de los sistemas productivos las coberturas, que son el uso determinado del suelo

en función de sus productos y finalmente, la unidad de muestreo más pequeña fueron las

las fincas y en las cuales se tomaron tres cuadrantes escogidos aleatoriamente (Tabla 2).

2.2.3. Eventos de muestreo: el primer muestreo se realizó del 10 al 24 de junio de

2006 y el muestreo segundo del 14 al 21 de octubre de 2006.

2.3. Parámetros fisicoquímicos: se evaluó la temperatura, pH y humedad del suelo.

La temperatura in situ se tomó con un termómetro de campo a 20 cm de profundidad, el

pH se determino de acuerdo al protocolo de la Agencia Ambiental de Estados Unidos

(EPA, 9045c) y el porcentaje de humedad se tomó de acuerdo al protocolo del Instituto

Geográfico Agustín Codazzi (1979). pH y humedad fueron evaluados en las muestras

compuestas de suelo en el laboratorio.

2.4. Análisis estadístico para evaluar el efecto del sistema productivo sobre los

conteos de microorganismos totales: Para evaluar el efecto del sistema productivo

sobre los conteos, se utilizó una t-studen (p<0.05 o p<0.02) ó un análisis de varianza

(ANOVA) (p<0.05 o p<0.02) y una prueba de Tukey-Kramer (p<0.05) según el caso.

146

Tabla 2. Sistemas productivos, coberturas y fincas seleccionadas en la cuenca del

río La Vieja y El Otún.

Ventana Sistema productivo Cobertura Finca

La Vieja

Ganadería de carne

Bosque La Ilusión

Pastizal La Ramada

Guadual La Ramada

Cultivos mixtos

Guadual La Comarca

Cafetal sin sombrío El Bolsillo

Cafetal sin sombrío La Alegría

Ganadería de leche Bosque Bremen

Pastizal Villa Ximena

El Otún

Cultivos mixtos

Cebolla Macarena

Bosque Santa Helena

Cebolla Bella Vista

Guadual Mandalay

Guadual La Playa

Cultivos forestales Forestales Playa Rica

Forestales Lisbrán

Áreas protegidas Bosque La Pastora

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

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3.1. Estandarización de la tinción de microorganismos de suelos con DAPI

3.1.1. Control de procedimiento con E. coli para el conteo directo con DAPI: Para

obtener la curva de crecimiento con recuentos mayores a 1 x 1010 UFC/ml fue

necesario llevar la absorbancia a rangos mayores a 1 unidad de absorbancia (UA). Para

realizar la curva de las absorbancias en el tiempo, se empleó una dilución 1/40 y los

valores fueron correlacionados con los recuentos para obtener la curva de calibración

de absorbancia vs. recuento en placa. Utilizando la ecuación de la línea de mejor ajuste


− se estableció que un cultivo a una dilución

1/40 con una absorbancia de 0.460 tendría un recuento de 1.2 x 1012.

3.1.2. Evaluación de los tratamientos con el control de procedimiento con E. coli

Durante la evaluación de los diferentes tratamientos para la estandarización de la

tinción se utilizó un cultivo de E. coli a una concentración de 1.2 x 1012 UFC/ml. Se

escogieron los 4 tratamientos que tuvieron los conteos mayores, independiente de su

precisión, y buscando el metodo que favoreciera la mayor recuperacion de

microorganismos. De esta forma, los tratamientos 1, 3, 7 y 8 (anexos D y E) mostraron

los mayores conteos indicando que la combinación de un lavado como pretratamiento y

el uso de un esquema de conteo de dos filtros de la misma dilución presentaban los

mayores conteos.

En todos los tratamientos se observó que los conteos obtenidos con DAPI fueron

mayores a los recuentos en placa de la curva de calibración (Tabla 10). Los principales

factores que pudieron afectar los recuentos en placa pueden ser atribuidos a los errores

durante la toma y homogenización de volúmenes con micropipetas y rastrillos, y de

igual forma a factores fisiológicos como la concentración de nutrientes (fuente de C y

N) y condiciones de incubación como temperatura y concentración de oxígeno

(McCaing et al., 2001; Merck, 2005). Se observó que de los tratamientos

seleccionados que presentaron mayores recuentos tenían en primer esquema de conteo

(dos filtros de la misma dilución seleccionada), presentó la mayor precisión expresada

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como el porcentaje del coeficiente de variación (%CV) (Tabla 10). El alto recuento y

la alta precisión de este esquema de conteo, permite seleccionarle como método a

utilizar durante el estudio.

3.2. Evaluación de los tratamientos seleccionados para la estandarización

utilizando muestras de suelo: No se observaron diferencias significativas con los

diferentes tratamientos en los conteos de las muestras de suelo (ANOVA; p < 0.05;

n=16). Sin embargo, se presentaron conteos mayores cuando se realizó un lavado

como pretratamiento a una concentración de 5 µg/ml por 20 min y realizando un

esquema de conteo de dos filtros de la misma El orden de los tratamientos que

presentaron mayores recuentos en la muestra de suelo fue inverso al orden de los

tratamientos que presentaron mayores recuentos con el cultivo de concentración

conocida de E. coli. Los mayores conteos con E. coli se presentaron en el tratamiento 7

mientras que el mayor conteo en la muestra de suelo fue en el tratamiento 3. Las

modificaciones realizadas a estos dos tratamientos sólo difieren en la concentración de

DAPI a la cual se hace la tinción, esto demuestra que la concentración varía de acuerdo

a las diferentes matrices (suelo, lodos, aguas, etc). Resultados similares fueron

obtenidos por Schallenberg y colaboradores (1989) quienes afirman que la

concentración óptima para muestras de sedimentos es de 5 µg/ml por 20 min de DAPI

y el uso de otras concentraciones puede producir la subestimación del conteo de células

totales.

El lavado diminuye mas eficientemente los interferentes, debido que en el proceso de

centrifugación se encuentran en el sobrenadante descartándose posteriormente

comprobando lo realizado por Bakken (1985). El esquema de conteo para las muestras

de suelo mostró valores de coeficiente de varianza altos; esto era de esperarse debido a

la alta interferencia y la dificultad de la recuperación. Sin embargo, tres de los cuatro

tratamientos pertenecían a este esquema de conteo. De esta forma, se selecciono el uso

de lavado a una concentración de 5 µg/ml de DAPI y el uso de dos filtros a la misma

dilución para realizar el análisis en la ecorregión cafetera.

3.3. Efecto en los conteos de cada cobertura

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3.3.1. Cuenca del río La Vieja: El cafetal de La Alegría presentó conteos

significativamente superiores al cafetal de El Bolsillo (t-studen; p < 0.05; n=12) si

presentar diferencias con los parámetros de pH, porcentaje de humedad y temperatura

del suelo. Sin embargo, los datos de campo mostraron que el cafetal La Alegría presenta

una densa y gruesa capa de hojarasca de amplio aporte de plátano mientras que El

Bolsillo una capa menor. La cantidad de la hojarasca puede llegar a influir en la

densidad microbiana, debido que proporciona un ambiente rico en calidad y cantidad de

materia orgánica con alto potencial de mineralización (Kennedy, 1989; Nusslein y

Tiedje, 1999; Escobar, 2003). Se descartó un efecto alelopático de la cafeina en los

conteos (Escobar, 2003).

En los pastizales se observaron conteos significativamente mayores en Villa Ximena que

en La Ramada (t-studen; p < 0.05; n=12). Se presentaron datos de porcentaje de

humedad del suelo mayores en Villa Ximena, registros mayores de temperatura del suelo

en La Ramada y no se tuvieron diferencias en el pH. Los mayores conteos en Villa

Ximena muestran que la humedad puede llegar a tener un mayor efecto en la actividad

microbiana que la temperatura del suelo (Feria, 1998).

En los guaduales para el EM1, se observaron conteos significativamente mayores en La

Comarca que en La Ramada (t-student; p < 0.2; n=12) y para el EM2 no se presentaron

diferencias significativas en los conteos. Los datos de campo mostraron que La

Comarca tiene una cobertura mas densa mientras que La Ramada es un pequeño

fragmento de guadua. De acuerdo a estudios realizados por Carney y colaboradores

(2004) existe un efecto antropogénico sobre las comunidades microbianas disminuyendo

su abundancia. En los bosque no se observó diferencias significativas (t-student; p < 0.2;

n=12).

En toda la cuenca del río La Vieja para el EM1, se observaron conteos superiores en los

cafetales sin sombrío con alta desviación estándar, seguido por guaduales, bosque y

pastizal. Para el EM2 tuvieron mayores conteos los bosques, seguido de los guaduales,

pastizales y los conteos mas bajos se presentaron en los cafetales. Se puede observar un

efecto antropogénico mas marcado en el EM2, y un efecto significativo de las

diferencias entre las dos fincas por cada cobertura. Por otro lado, todos los conteos a

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excepción del cafetal La Alegría aumentaron en el segundo evento de muestreo. Es

importante tener en cuenta que en ese cafetal se presentó una fuerte precipitación con

presencia de granizo lo que pudo afectar la abundancia de microorganismos edáficos y

que afectó la producción de café.

3.3.2. Cuenca del río El Otún: El guadual La Playa presentó conteos significativamente

mayores que los observados en Mandalay (t-student; p < 0.05; n=24) en los dos eventos

de muestreo sin diferencias significativas en los datos de pH, temperatura del suelo y

profundidad de la hojarasca. Sin embargo, se observó que para los dos eventos de

muestreo la humedad en La Playa fue significativamente mayor a la observada en

Mandalay. De acuerdo a lo anterior, puede existir un efecto de la humedad en los

conteos de microorganismos edáficos. Sin embargo, durante el segundo evento de

muestreo en Mandalay se pudo observar la presencia de gran cantidad de bolsas de

basura lo que pudo afectar los recuentos observados. Esto se pudo presentar debido que

en un microambiente cerrado los nutrientes y la densidad microbiana tienden a escasear.

Cuando el límite del microambiente es una matriz de difícil degradación, como una

bolsa de basura, este fenómeno se agudiza de tal forma que los nutrientes disponibles en

el suelo solo pueden provenir del área de influencia directa con el microambiente sin

recibir carbono o nitrógeno de la cobertura vegetal.

En los cultivos de Cebolla, no se observaron diferencias significativas en el EM1 pero en

EM2 se observaron conteos significativamente superiores en La Macarena. No se

encontraron diferencias en pH, humedad y temperatura del suelo, pero si se registró una

altura mayor del cultivo de cebolla en La Macarena. La altura del cultivo puede influir

en los conteos de microorganismos totales debido que el estado fisiológico de la planta

es avanzado y se encuentra cerca de su recolección, lo implica que ha estado creciendo

por tiempo suficiente liberando exudados que promueven el crecimiento microbiano.

En los bosques en el EM1, se observaron conteos significativamente mayores en la

reserva La Pastora mientras que para el EM2 se presentaron conteos significativamente

mayores en el bosque Santa Helena (t-student; p < 0.2; n=12). Para el EM1 los datos de

temperatura y humedad del suelo fueron superiores en Santa Helena. Sin embargo, los

datos de pH fueron significativamente mayores en la reserva La Pastora lo que pudo

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afectar los conteos debido que aumenta la actividad microbiana, se descompone la

materia orgánica a mayor velocidad y la cantidad de microorganismos que pueden estar

en pH neutro (Feria, 1998). Para el EM2 el porcentaje de humedad del suelo fue

significativamente mayor en la reserva La pastora y la temperatura del suelo fue

significativamente mayor en Santa Helena sin presentar diferencias en pH. Por esta

razón una baja temperatura del suelo como la de la reserva La pastora tiene una menor

actividad microbiana lo que pudo afectar los conteos.

Los cultivos forestales para el EM1 no presentaron diferencias significativas y para el

EM2 el ciprés Playa Rica presentó conteos superiores a los del pinar Lisbran (t-student;

p < 0.2; n=12). En el EM2, no se observaron diferencias significativas en la temperatura

y la humedad del suelo. Mientras que se presentaron se presentaron pH estadísticamente

superiores en Playa Rica lo que pudo permitir que se presentara mas densidad

microbiana en el suelo (Alexander, 1987).

En toda la cuenca del río El Otún, para el EM1, los cultivos forestales fueron

significativamente mayores a los de las otras coberturas, seguido en los conteos por los

cultivos de cebolla, bosques y guaduales. Para el EM2 los forestales tuvieron los

conteos mas altos seguidos por los bosques, guaduales y con los conteos mas bajos los

cultivos de cebolla; sin embargo, las diferencias entre las fincas de cada cobertura afecta

la media y la desviación estándar de los datos. Un estudio realizado por Nüsslein y

Tiedje (1999), Murgueitio (2003) y Carney y colaboradores (2004) determinan que

existe un efecto antropogénico sobre la diversidad y específicamente sobre la

abundancia de microorganismos edáficos. Para el EM1 no es muy claro el efecto,

mientras que para el segundo el cultivo de cebolla tiene los conteos mas bajos.

Al analizar los conteos agrupados en sistemas productivos, se observó que la en la

mayoría se presentaba diferencias significativas debido a la alta heterogeneidad en el

origen de las muestras y a un efecto de la cobertura antes mencionado. Además los

cultivos mixtos, para la cuenca del río El Otún, tiene cerca del 62.5% de los datos de esa

cuenca y el efecto de tres coberturas, por lo cual son altamente heterogéneos. Por tal

razón, se tomó como unidad del análisis experimental la cobertura.

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Concluyendo, el uso de dos lavados en NaCl (0.85 % p/v) a 13,000 rpm por 5 minutos,

una concentración de DAPI a 5 µg/ml por 20 minutos y el esquema de conteo de dos

filtros de las misma dilución, disminuye los interferentes de lectura del suelo, genera

células definidas, de alta fluorescencia y con altos conteos. El análisis de las densidades

indico que las fincas cafetales seleccionadas en la cuenca del río La Vieja y las fincas de

los guaduales son significativamente diferentes. Los cultivos mixtos son altamente

heterogéneos y finalmente, para conteos de microorganismos totales el sistema

productivo es una escala muy general y haciéndose necesario observar el efecto a menor

escala, como en este caso las coberturas.

4. REFERENCIAS BILBIOGRAFICAS

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