Post on 22-Jan-2016
• CINETICA ENZIMATICA
Dra EMMA GUERRERO HURTADO
CINETICA QUIMICACINETICA QUIMICA
Cinética Química es aquella parte de la Química que se encarga de estudiar la velocidad de una Reacción Química y los factores que permiten su control. Se limita a :
a) Reacciones Reversibles
CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS
• Según el número de moléculas:A P
A + B p
A + B + C P
SEGÚN EL NÚMERO DE REACCIÓN
R. Primer Orden: A P
V= -d A= K (A)dT
R. Segundo Orden: A+ B P
V= -dA = -dB ó + dP dT dT dT
V= K (A) (B)
CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teória para explicar la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima, en función a la concentración del sustrato.
La concentración de sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como función de [S].La expresión de Michaelis-Menten Vo = Vmax [S] Km + [S]
M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema :
Sacarosa Glucosa + Fructosa
Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales
a)(E) variable y (S) constante
b)(E) constante y (S) variable
invertasa
agua
(E)
A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimática
Vo
Vo & (E)
-------------------------------------------------------
Vo 1/2 Vmax
Sustrato KM
B) Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción
(S)
KM = Constante de Michaelis -Menten
Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reacción de interacción entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reacción
Vmax = Cuando el enzima se halla saturado
Se supone:
E + S ES
ES E + P
Como se relacionan Vmax, Km y Vo?
• Observemos : *
• K1 K3
• E + S ES E + P • K2 K4
• Que hay un solo sustrato
• Que la velocidad K4 se desprecia
• * Que la concentración del E es muy pequeña
• * Que la E puede estar como: E libre y ES
• * Que el equilibrio alcanzado por K1 es más rápido que K3, por lo que éste es limitante determina, o limita, la
cantidad de producto formado
POR LO QUE...
• LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:
• VO = K 3(ES)
• LA ECUACION RESULTANTE SERA:• VO =Vmax.(S)
•
Ecuac. MichaelisMenten
(S) + Km
La dependencia de la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuación de Michaelis-Menten como sigue:
.-1) Cuando [S] es igual que Km:
vo= Vmax*[S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = VmaxVmax Km + [S] [S]+ [S] 2[S] 22
2)2) Km= Km= K2 + K3/K2 + K3/ K1K1
Si K2>> K3 Km =K2/K1Si K2>> K3 Km =K2/K1
K m= K m= (E) (S)(E) (S) KK = = (E) (S)(E) (S) (ES) ES)(ES) ES)
SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA
• Vmax= K3 (ET)
• # de recambio
• K3= número de moléculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada
NÚMERO DE RECAMBIONÚMERO DE RECAMBIO
Carboxipeptidasa 102
Tripsina 102 a 103
Cinasas 103
Deshidrogenasas 103
Transaminasas 103
Anhidrasa carbonica 106
Superoxido dismutasa 106
catalasa 107
DETERMINACIÓN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL
Se tiene: vo= Vmax*[S] se invierte 1 = Km + [S] Km + [S] vo Vmax*[S]
Se factoriza 1 = Km * 1 + [S] vo Vmax [S] Vmax[S]
Se simplifica: 1 = Km * 1 + 1 vo Vmax [S] Vmax
La ecuación de la recta es: y = a * x + b
La ecuación de la recta es: y = a * x + b
donde: y = 1 y x = 1 Vo [S]
El valor de Km puede ser hallado a partir de la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la intersección negativa de x.
Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1v
KV s V
m
m x m x
-1/Km
1/Vmax
y = a * x + b
INHIBICION ENZIMATICA
• ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA
• APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.
INHIIBIDORES
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E + I EI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:
E + I E’
ES + I ESI
INHIBICIÓN REVERSIBLE
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, IMPIDIENDO LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, NO IMPIDE LA FIJACIÓN DEL SUBSTRATO a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva
E ES
EI
I
S
E + P
Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato
Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:
Ki = [E] [I]
[EI]
Inhibición Competitiva
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.
1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/Km
-1/(Km(1 + i/Ki))
1/Vmax
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
COO-
CH2
CH2
COO-
FAD FADH2COO-
CH
CH
COO-
Succinato Fumarato
SDH
Succinato deshidrogenasa COO-
CH2
COO-
Malonato
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
Inhibidorescompetitivos
COO-
CH2
CH2
COO-
Succinato
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
Inhibidores competitivoscomo ánalogos estructurales
del substrato
E ES
EI
I
S
E + PI
ESI
S
Inhibición No Competitiva
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
INHIBICION NO COMPETITIVA
• E + I EI
• I + ES ESI
• El agente quelante EDTA se une reversiblemente al
Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe así de
modo no competitivo a algunas enzimas que precisan
esos iones para su actividad.
DROGA USO TERAPEUTICO
ENZIMA AFECTADA
TIPO DE INHIBICION
Lovastina Hipercolestero
lemia
HMGCoA reductasa
Competitiva
5fluoroacil cancer Dihidrofolato reductasa
competitiva
alopurinol gota Xantino oxidasa
irreversible
cumadin anticoagulante Glutamilcar
boxilasa
competitiva
captopril hipertensión ECA competitiva
concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato, sino del Estado de Transición de la reacción.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que puede considerarse irreversible
Substrato
Estado detransición
Análogo deestado de transición
EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN LAS INTERACCIONES ENTRE LA ENZIMA Y EL SUSTRATO SON ÓPTIMAS
INHIBICIÓN IRREVERSIBLE
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente
E + I E’
-El efecto de los inhibidores irreversibles depende del -tiempo de actuación del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Reactivos de grupos -SH,
(a) Agentes alquilantes
E SH E S CH2 COO-
ICH2 COO- IHYodoacetato
(b) Compuestos insaturados
N CH2 CH3
O
O
E SHE S
N CH2 CH3
O
O
N-Etil maleimida (NEM)
Reactivos de grupos -SH, 2
(c) Formadores de mercáptidos
HOHg COO-
E SH E S Hg COO-
p-Hidroximercuribenzoato
(d) Oxidantes
Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro
Organofosfóricos
CH CH2 OHSer
PF O
CH
CH
H3C CH3
CH3H3C
CH CH2 O P O
CH
CH
H3C CH3
CH3H3C
Ser
DFP:diisopropilfluorofosfato
- Actúan sobre enzimas serínicas- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CN-
Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.
Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadísima toxicidad
SUBSTRATOS SUICIDAS
(Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola
-Tienen por tanto : (a) la especificidad del inhibidor competitivo y
(b) la potencia de los inhibidores irreversibles
E + I EI EI* E’ + I*
Modo de acción de los inhibidores suicidas
1 2 3
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
INHIBIDORES SUICIDAS,
- SISTEMA DE LA -LACTAMASA BACTERIANA
La utilización masiva de antibióticos -lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son porproducir una enzima, la -lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos -lactámicos.
R CO NHS
NO
CH3
CH3
COO-
R CO NHS
HN
CH3
CH3
COO-
CO
O-
-Lactamasa
Penicilina (activa)
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la -lactamasa, el ácido clavulánico
O
NO
COO-
CCH2OH
H-Lactamasa
O
HN
COO-
CCH2OH
H
CO
O-
O
HN
COO-
CCH2OH
H
CO
OCH2CHSer
Esta moléculareacciona con la
serina activa de la-lactamasa,
produciendo suinactivación
Ác.clavulánico
- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL
Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones delcerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradación de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO
HO
HO
CHOH CH2 NH2
O2 + H2O
NH3 + H2O2
HO
HO
CHOH CHO
Noradrenalina
Dihidroxifenilglicol
Monoaminooxidasa
La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamentalpara la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.
HC C CH N+CH3
CH3
N
NNH
N
H3C
H2C
O
OSE
R
N
NNH
NH
H3C
H2C
O
OSE
R
CH
CHCHN+H3C
H3C
Flavina
Flavina modificada
N,N’ dimetilpropargilamina
(pargilina)
Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina
CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES
1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple
Azahar:
A +E AE
A E + B AEB
B+ E BE
BE + A BEA
2) ORDENADA
MALATO + NAD
OXALACETATO + NADH.
E-NAD-MALATO 1 2
M.D
2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO
ASPARTATO + OXOGLUTARATO
OXALACETATO + GLUTAMATO
1) Aspartato + PLP-E NH3- PLP-E + Oxalacetato
2) Oxoglutarato + NH3 PLP-E + Glutamato
qué son las moléculas efectoras o moduladoras ?Son moléculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad catalítica.
No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.
Pueden ser el mismo sustrato denominado HOMOTROPICO o es otra sustancia al que se le conoce como HETEROTROPICO
ES DIFERENTE A LAS
ENZIMAS ANTES VISTAS?
¡SI!!
PORQUE LOS E.A. PRESENTAN 2 LOCALIZACIONES DE UNION DE LIGANDOS:1.- Las catalíticas (Centro Activo) a las que se une el sustrato.
2.- Las reguladoras (Centro Alostérico) a las que se unen las moléculas denominada efectores o moduladores.
S EF
S
EF
ENZIMA
CA C.ALOST.
ENZIMAS ALOSTERICAS
CINETICA SIGMOIDEA
La unión cooperativa de la primera molécula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unión de subsecuentes moléculas de sustrato a los otros sitios de unión: cooperatividad positiva
Enzimas
susceptibles de
ser modificadas
por moléculas
pequeñas.
ENZIMAS ALOSTERICAS
T
• ESTADO CONFORMACIONAL
R
Baja afinidad por el sustrato
Alta afinidad por el sustrato
MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS
MODELO CONCERTADO:
+ S
RR
RR
TT
MODELO SECUENCIAL :
+ S
+ S
RT
RR
TT