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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Journal of Investigative Dermatology 2011;131:338 –
348
•Investigación y Desarrollo, Beiersdorf AG, Hamburgo, Alemania
•Laboratorio de Cronobiología, Charité 'Universita Berlín, Alemania
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Variaciones diarias en el medio ambiente
Ciclos de luz-oscuridad
Periodicidad - Evolución
Temperatura Disponibilidadde alimentos
Ritmo circadiano
(cerca – día 24 horas) Reloj circadiano
Introducción
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
Ritmo circadiano
Origen:•Células más primitivas•Proteger la replicación del ADN de la altaradiación ultravioleta durante el día
•Hongo Neurospora
Endógenos•Persisten en condiciones de laboratorio, aun sinestímulos externos•Modificables por señales exógenas
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“Reloj maestro” Núcleo supraquiasmático (NSQ) - Hipotálamo
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
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“Reloj maestro” Núcleo supraquiasmático (NSQ) - Hipotálamo
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
•Células ganglionares con unpigmento melanopsina
•Tracto retinohipotalámicollevan información al NSQ
•Glándula pineal: hormonamelatonina
•Si no ha sido suprimido por lapresencia de luz brillante
•Melatonina baja durante el día
y aumenta durante la noche
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“Relojes periféricos”
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
“Reloj maestro”
Zeitgebers
Luz, temperatura,alimentos, fármacos
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Nivel molecular
•
Células autónomas
•Modelo de retroalimentaciónmolecular
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
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Nivel molecular
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
Factores de transcripción del reloj circadiano•CLOCK: ciclos de producción del aparato locomotor circadiano kaput
•BMAL1: cerebro-músculos de hidrocarburos arilo receptor nuclear
translocator (ARNT)-like proteína-1
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Nivel molecular
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
Activa la transcripción de gen periodo1-3 (Per1-3) ycriptocromos 1 y 2 (Cry1 y Cry2)
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Nivel molecular
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
PER y CRY llevan a la represión de CLOCK/BMAL1 y lainhibición de su propia transcripción
24 horas
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Piel: Barrera entre cuerpo y medio ambiente
Relojes periféricos se han demostrado en piel murina y enfibroblastos de piel humana
Radiación UVTemperatura
Recuperación de la barreraPérdida de agua transepidérmicaProducción de sebopH y temperatura de la piel
¿Cómo este reloj puede regular la fisiología de la
epidermis?
¿Los queratinocitos de la epidermis poseen un relojcircadiano autónomo?
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
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Células para estudiar la fisiología epidérmica
controlada por el reloj circadiano
Líneas de células inmortalizadas
•Línea de células epidérmicas dequeratinocitos humano adulto bajocalcio temperatura (HaCaT)
•In vitro: se deriva de piel adulto normaly refleja fielmente el comportamiento dequeratinocitos
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción
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Cultivo celular:•Queratinocitos normales epidérmicos humanos deprepucio neonatal
•
Queratinocitos HaCaT
Prodecimientos:
•Inmunohistoquímica
•PCR
•Bioluminiscencia
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Materiales y métodos
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Materiales y métodos
Bioluminiscencia: producción de luz de ciertos
organismos vivos
Diseñaron que los queratinocitos HaCaT presentaranun gen que produce luciferasa + genes del reloj
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1º - Genes del reloj maestro:
•Inmunocitoquímica: anticuerpos
•CLOCK: núcleo•PER1: citoplasma y núcleo
•Co-tinción del núcleo: DAPI (40-
6-diamidin-20-phenylindol-dihydrochlorid)
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
Queratinocitos HaCaT
Queratinocitos neonatal primario
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•HaCaT + lentivirus•
Luciferasa + fragmento del gendel reloj Bmal1•Los ritmos circadianos sesincronizan con dexametasona y laactividad rítmica luciferasa
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
•Amortiguación de la oscilación: desincronización progresiva
de queratinocitos individuales
2º - Transcripción rítmica de los genes del reloj
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•Queratinocitos HaCaT – sincronizan con dexametasona - cosecha el ARNtotal - PCR transcriptasa inversa
•Se detectaron ritmos circadianos de Rev-Erba y Per3: alta amplitud
•Per1, 2 o Cry1, 2: menores oscilaciones de amplitud
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
2º - Transcripción rítmica de los genes del reloj
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
3º - Modificación de la dinámica del reloj
Farmacológico:•Interferencia con la fosforilación de las proteínas PER•Inhibidores CKI-7 y DMAT
El ritmo circadiano se alarga de manera significativa ydependiente de la dosis
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
Farmacológico:•Interferencia con la degradación de proteínas CRY•Interferencia de ARN - Fbxl3
El ritmo circadiano se alarga de manera significativo ysustancial
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•ARNsh•Silenciamiento de Bmal1 resultando en una revocación
completa de la ritmicidad
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional
Resultados
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadianofuncional, con propiedades indistinguibles de
otros relojes periféricos
Resultados
Transcripción rítmicade genes del reloj
Localización correcta de
la proteína del reloj
Alteraciones en la dinámicacircadiano del reloj (genética,
farmacológico)
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Variaciones de temperatura de 1-2ºK.
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos
HaCaT
Resultados
Temperatura corporal
Sincroniza los relojes periféricos
Conduce la expresión de genes circadianos enfibroblastos humanos
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos
HaCaT
Resultados
Los ritmos circadianos de Q-HaCaT se sincronizaron con dexametasona –
bioluminiscencia Bmal1
a y c -- ciclos de temperatura de 24 horas (calentamiento 12 horas 37ºC yfrío 12 horas 33ºC
b -- temperatura constante 37ºC
b y c -- las células fueron sincronizadas 8,5 horas de diferencia
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos
HaCaT
Resultados
•Bmal1: adoptó una relación estable con el ciclo de la temperatura y mayoramplitud (solo Dex)
•
Cuando la Temp fue constante las oscilaciones persistieron similares a losciclos anteriores
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos
HaCaT
Resultados
Comprobar
b.- HaCaT Dex 0 y - 8,5 horas + temperatura constantec.- Ciclos de temperatura 24h: sincronización gradual con latemperatura
R l d
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Los ciclos de temperatura puede arrastrar los relojescircadiano en los queratinocitos
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
La temperatura es un potente Zeitgeber dequeratinocitos HaCaT
Resultados
R l d
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Queratinocitos HaCaT:
•Ciclos de temperatura por 2 días y 1 día de temperatura constante
•Cosecha el ARN total cada 4 horas - PCR transcriptasa inversa
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
3.- Arrastre de la temperatura aumenta la expresióncircadiana de genes del reloj
Resultados
R lt d
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Resultados
Genes del reloj•Las amplitudes de los ritmos arrastradospor la temperatura fueron sustancialmentemayores
•Persistieron luego con temperaturaconstante
•Diferencias por el ritmo de expresión deacuerdo al ritmo circadiano (CRY - BMAL1)
R lt d
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Genes de salidaControlados por el reloj
Significativa expresión circadianade factores de transcripción
•Dbp: objetivo directo del relojcircadiano.
•Insig2a: gen implicado en lahomeostasis del colesterol
•Actina
•c-Myc: oncogen (ritmos solo contemperatura constante)
•
Gen receptor LDL y HMGCR:homeostasis del colesterol (ritmossolo con los ciclos de temperatura)
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Resultados
R lt d
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•Limitaciones célulasinmortalizadas
•
Interrumpe el control delciclo celular•Limitada capacidad dediferenciación
•Ciclos de temperatura•Per2, Per3, Ap-Erba, Insig2a:similar HaCaT
4.- Queratinocitos primarios de prepucio neonatal
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Resultados
U l j i di l i i H C TR lt d
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Resultados
Analizar la expresión de genes para identificarlos procesos fisiológicos que son controlados
por el sistema circadiano
Queratinocitos epidérmicosprimarios poseen un reloj
circadiano periférico
Este reloj se comporta de
forma muy similar al relojHaCaT
Algunos genes del relojidentificadas en HaCaTpueden ser validados en
queratinocitos primarios
U l j i di l ti it H C TDi ió
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•Abren la puerta del estudio de la relación molecular entre elreloj circadiano y la fisiología de la epidermis
•Temperatura actúa como potente Zeitgeber del reloj
•Las limitaciones de los modelos in vitro para el estudio delos ritmos circadianos puede por lo menos superar los ciclos
térmicos.
•Herramienta viable: resultados al comparar conqueratinocitos primarios
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Queratinocitos HaCaT como un nuevo sistema modelo paraestudiar el control circadiano de la fisiología epidérmica
Discusión
U l j i di l ti it H C TDi ió
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Colesterol:
•
Insig2a, HMGCR, gen receptor de LDL
•Esencial para diferenciación / proliferación de queratinocitos•Formación de la capa córnea•Se libera a partir de queratinocitos cornificados para formar
la barrera de lípidos epidérmica
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Posible papel de los genes controlados por el reloj en lafisiología epidérmica
Discusión
U l j i di l ti it H C TDisc sión
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•Oncogén c-Myc :
•Induce la proliferación de células madre epidérmicas•Estimula la diferenciación terminal de queratinocitos
•Dbp:•Involucra a la familia del citocromo P450•Metabolismo Vit D en los queratinocitos
Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Posible papel de los genes controlados por el reloj en lafisiología epidérmica
Discusión
Un reloj circadiano en los q eratinocitos HaCaTConclusión
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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT
Modelo para el estudio los ritmos circadianos en losqueratinocitos epidérmicos, que facilitaría la investigación en
la regulación circadiana de la fisiología epidérmica
Conclusión
Reloj circadiano de la epidermis, podría dar lugar a la
administración de fármacos optimizados y sofisticados para eltratamiento de enfermedades de la piel