Post on 12-Jan-2015
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO
EN MICROBIOLOGÍA
Raúl Gil OrtsMIR 2 Análisis Clínicos
INDICEINTRODUCCIÓNTINCIONESCULTIVOSTÉCNICAS DIRECTASMÉTODOS MOLECULARESMALDI-TOFTÉCNICAS FUTURAS
INTRODUCCIÓN-Procesos manuales
-Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los mismos en las muestras.
- Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado - Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no crece en los medios de cultivo.
- Los resultados no se ven alterados por la administración previa de antimicrobianos.
- Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los antimicrobianos
TINCIÓN-Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente
- Morfología microscópica y características tintoriales
Tinción Aplicación Resultados Comentarios
Gram Diagnóstico presuntivo, sobre todo en neumonía y meningitis bacteriana
Deteccíón de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes
Requiere experiencia;Puede diferenciar levaduras
Azul de metileno Gránulos metacromáticos de corinebacterias
Morfología general y seleccionada
Corynebacterium diphteriae
Wright-Giemsa LBA, preparaciones de Tzanck, muestras con fondo celular complejo
Morfología general de las estructuras celulares
Permite visualizar bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones virales
TinciónTinción Aplicación Resultados Comentarios
Ziehl-NeelsenKinyoun
Muestras (ESP, LBA, LCR, orina, etc) para identificar BAAR y diferenciar de actinomicetales
BAAR muestran un color rojo granate, sobre fondo azul, permite detectar también parásitos como Cryptosporidium y Ciclospora
Las micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias son bacilos arboriformes y ramificados
Microscopía de campo oscuro
Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria
Se ven espiroquetas móviles
Requiere experiencia
Tinta china Examen directo de la extensión de LCR, sangre y orina para Crytococcus
Cryptococcus posee una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un fondo oscuro
Tinción inversa, la cápsula no se tiñe; requiere experiencia para diferenciar leucocitos de levaduras
TinciónTinción Aplicación Resultados comentarios
KOH 10% Examen directo de las extensiones de piel, pelos y uñas para ver dermatofitos
Visualiza elementos fúngicos
Digiere las proteínas de las muestras y facilita la visualización
Blanco Calcoflúor Examen LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estructuras fúngicas y algunos quistes parasitarios
Las levaduras y mohos muestran una fluorescencia blanquecina suave
Tinción fluorescente que se fija a la pared celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias.Requiere M. Fluoresc.
Auramina-rodamina
Útil para la búsqueda de BAAR en una variedad de muestras clínicas.
Extensiones concentradas de sedimentos de micobacterias
Tinción preferida para BAAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestrasRequiere M. Fluoresc.
TINCIÓN
GRAM
neumococo
TINCIÓN
GRAM
LCR: Neisseria meningitidis Exudado uretral:Neisseria gonorrea
TINCIÓN
Blanco calcoflúor
Candida albicans
TINCIÓN
Auramina
Zhiel-Neelssen
TINCIÓN
Tinta China
Cryptococcus neoformans
CULTIVOS BACTERIANOS
Nivel Hemocultivos- Forma tradicional - Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas) - Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-
48h)- Técnica rápida - Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo
Extraer 10 ml de sangre
Centrifugar 1500 rpm
5 min
Centrifugar3 ml sobrenadante Repartidos 2 tubos
Eppendorf13000 rpm
1 min
IDENTIFICACIÓN - 3-4hANTIBIOGRAMA – 6-12h
- LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL
SEDIMENTO
TÉCNICAS DIRECTAS
-Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR)
- mínima manipulación
- reducen el tiempo del proceso analítico
-También denominadas “point-of -care test“
-Beneficio:- Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor
tiempo mejor evolución enfermedad
-técnicas :- Inmunocromatografía- Enzimoinmunoanálisis- Inmunofluoerescencia indirecta
- PCR a tiempo real
TÉCNICAS DIRECTAS
Test/Microorganismo
Muestra Técnica S E
Antígeno neumococo Orina, LCR, LPL ICT 66-70 90-100
Antígeno legionella Orina ICT 76 99
Plasmodium Sangre ICT 87-100
52-100
S. pyogenes Frotis faríngeo EIA 53-99 62-100
Antígeno VRS Frotis nasofaríngeo ICT 59-97 75-100
Antígeno rotavirus Heces ICT 75-99 95
S. aureus (MRSA)S. agalactiaeEnterovirus
Frotis nasalFrotis vaginalLCR
PCR t.r. 86-9494-9797
93-9596-100100
VIH Sangre ICT 99-100
99-100
TÉCNICAS DIRECTAS
Microorganismo Muestra Técnica
Haemophilus influenzae Muestra respiratoriaLíquido pleural
LA
Virus gripe A y B Moco nasofaríngeoExudados nasal y faríngeo
IFI, ICT, EIA
Metaneumovirus Moco nasofaríngeo IFI
Virus parainfluenza 1, 2, 3
Moco nasofaríngeo IFI
Adenovirus Moco nasofaríngeoExudados nasal y faríngeo
IFI, ICT
TÉCNICAS DIRECTAS
Antígeno neumococo Antígeno legionella Plasmodium
Antígeno VRS
TÉCNICAS DIRECTAS
S. pyogenes Rotavirus Toxina C. difficile
Entamoeba hystolitica
EIA
MÉTODOS MOLECULARES
PNA-FISH - peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization
- Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los microorganismos.
- Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli,Enterococcus spp, Ps. Aruginosa o fungemias por Candida spp. En aproximadamente 3 horas
Métodos moleculares
PNA-FISH
S. aureus
Ps. aeruginosa
MÉTODOS MOLECULARES
PCR en tiempo real
- Modificación de PCR convencional- Mejora la rapidez en la detección- Mejora en Sensibilidad y Especificidad
- Detecta a la vez que amplifica - Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con
el empleo de geles agarosa
- Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95% - Tiempo de ejecución 1.5 horas
MÉTODOS MOLECULARES
-PCR a tiempo real
- Test comercializados:
- Detección MRSA en frotis nasales
- Detección Enterococcus spp. resistentes a glucopéptidos en frotis rectales
- Clostridium difficile en heces
- S. agalactiae en frotis vaginal y rectal en embarazadas
- Enterovirus en LCR
- Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C
MÉTODOS MOLECULARES
PCR t.r.
Detección: - S. aureus resistente a meticilina - Clostridium difficile - Enterovirus en LCR - S. agalactiae
MALDI-TOF- Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight- Se describió hace 30 años-Se diseñó para analizar biomoléculas- uso reciente para la identificación de microorganismos-Técnica:
- Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la energía emitida
- las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son sometidas a una aceleración en un campo eléctrico
- son separadas según masa y carga hasta que llegan a un detector
- el perfil de proteínas generado se compara con una base de datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación
MALDI-TOF
Ventajas:- Rapidez- más barato que sistemas habituales- puede identificar la mayoría de microorganismos habituales
Uso:-para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias- puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos- puede detectar proteínas concretas
- proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así staphylcoccus resistentes a oxacilina.
Técnicas futuras
Multiplex PCR tiempo real
Técnica Septifast de Roche. Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos frecuentes.Aún no comercializado
Secuencición del ADN: pirosecuenciación
Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato liberado durante la síntesis de ADNPermite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado:
- genotipado de bacerias y virus- reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH- caracterizar bacterias resistentes a antibióticos
Técnicas futuras
Sistema StaphPlex
Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que permiten identificar :
-a nivel de especie diferentes estafilococos
- identificar resistencia a antibióticos más utilizados
GRACIAS