Tutorial de Uso Metamorph:

Configuración básica de una MACRO de captura

Unidad de Microscopia

2Abrir macro: APPS>>Multi Dimensional Acquition

Para configurar nuestra sesión de trabajo debemos abrir desde el menú general del Metamorph el comando: APSS >>MULTI DIMENSIONAL ACQUISITION

De este modo accederemos a una“macro”(guía básica) para configurar las condiciones básicas de nuestro experimento

Abrir Guía de Configuración

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Configurar macro:MAIN

Apartado MAIN

En este primer apartado seleccionamos todas las aplicaciones que queremos realizar en nuestra sesión de trabajo:

-Timelapse(Series Temporales) y/o

- Z Series (Series en Z)

Las opciones que podemos configurar son:

TIMELAPSE:para realizar Series Temporales

MULTIPLE STAGE POSITIONS:permite introducir más de un único punto de muestreo .

Es posible configurar múltiples puntos de muestreo en cada porta y/o placa de cultivos.

MULTIPLE WAVELENGHTS:nos permite introducir más de un único canal de fluorescencia.

Es posible configurar hasta 6 canales :5 filtros de fluorescencia + luz transmitida

Z SERIES:para realizar Series Z

4Configurar Guardado archivos: SAVING

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Apartado SAVING

Nos permite dar nombre a los archivos de las capturas y seleccionar una carpeta de guardado de los archivos

(1)-En”Description” podemos introducir una extensa descripción del experimento y/o datos de interés que quedarán grabados y asociados a todos los archivos de captura.

(2)-”Select directory”Cada laboratorio tiene asociada una carpeta para guardar las capturas de sus sesiones . Se accede a ella desde “Mis documentos”>>Usuarios imágenes.

(3)-”Increment base name if file exists”.Es necesario activar SIEMPRE esta casilla para que el programa nos guarde automáticamente las diferentes capturas.

(4)-”Base name”:introducimos el nombre con el que se guardarán las capturas.

5Configurar Series temporales:TIMELAPSE

Apartado TIMELAPSE

Nos permite definir la duración total del experimento y los intervalos a los que se producirá la captura

Debemos configurar 2 parámetros :

(1)-TIME INTERVAL : introducimos el tiempo entre capturas(en milisegundos,segundos,minutos u horas).

(2)-DURATION: introducimos la duración total del experimento(en segundos,minutos u horas).

(3)-NUMBER OF TIME POINTS.En función de los intervalos de captura y la duración total del experimento el programa nos calcula e indica el número total de puntos que tomará en la serie .

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6Configurar puntos muestreo:STAGE

Apartado STAGE

Nos permite introducir múltiples posiciones de muestreo.

¿Cómo?

(1)-El programa conserva los puntos grabados en la última macro configurada , lo primero que hay que hacer es borrar estos puntos : pinchamos en cada uno de ellos y eliminamos clicando con la cruz roja.

(2)-Buscamos y enfocamos una posición y la nombramos en POSITION LABEL.

(3)-Grabamos la posición clicando en la flecha negra.

MUY IMPORTANTE:

Para introducir nuevos puntos repetimos el proceso SOLO recordar que es necesario introducir un nuevo nombre (position label) antes de grabar el nuevo punto , de otro modo , borraremos el punto anterior al sobreescribirlo.

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7Configurar número de canales:WAVELENGHTS

Apartado WAVELENGHTS

En este primer apartado debemos definir el número de canales/marcadores que vamos a utilizar y que deberemos configurar uno a uno.

Es posible configurar hasta 6 canales:

-5 filtros de fluorescencia:

-GFP-YFP-Cy3-Cy5-Dapi

-Luz Transmitida normal

8Configurar canales:WAVELENGHTS

Apartado WAVELENGHTS

Una vez seleccionado el número de canales es necesario configurar cada uno por separado optimizando el valor de los tiempos de exposición

¿Cómo?

(1) Illumination: Introducimos el filtro en su versión “cámara”:(existen 2 variantes para cada filtro: “binocular” y “cámara”)

(2) Exposure: Es FUNDAMENTAL optimizar el tiempo de exposición para cada canal , para ello abrimos y capturamos una imagen simple en el modo”ACQUIRE” , anotamos el valor más optimo de exposición y lo introducimos en la macro.

(3) El resto de parámetros deben mantenerse intactos :

Auto expose: NEVERAcquire: EVERY TIME POINTAutofocus: NEVER

(4) La opción” Z series with the wavelenght” SÓLO debe estar activada para realizar Z Series (no en timelaspse)

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9Configurar Series Z :MODO 1

Apartado Z SERIES.Modo 1_Range around Current

(1)-Enfocamos la preparación en el punto de interés , la posición del enfoque se muestra en “CURRENT POSITION”.

(2)-Activamos la casilla “RANGE AROUND CURRENT.

(3)-Introducimos el grosor de las secciones en “STEP SIZE”(0,5 ó 1 micras son adecuados).

(4)-Introducimos en “RANGE” el número de Z que hará (en igual número ) por encima y por debajo del plano enfocado.

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10 Configurar Series Z: MODO 2

Apartado Z SERIES

Modo 2_Ajuste manual

(1)-Enfocamos la preparación en el punto de interés , la posición del enfoque se muestra en “CURRENT POSITION”.

(2)-Desactivamos la casilla “RANGE AROUND CURRENT y automáticamente SE ACTIVAN las casillas TOP // BOTTOM

(3)-Pasamos a modo Visión VIDEO y delimitamos los extremos (superior e inferior)(top y bottom)desplazándonos con el micrómetro.

(4)-Introducimos el grosor de las secciones en “STEP SIZE”(0,5 ó 1 micras son adecuados).

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11Configurar visionado capturas:DISPLAY

Apartado DISPLAY

Permite configurar el modo de visionado de las capturas en pantalla.

2 opciones:

DEFAULT: Configurada por defecto , permite visualizar en pantalla las capturas a medida que están se van realizando .

MINIMIZE IMAGES DURING ACQUISITION: No muestra en pantalla las capturas.

12Configuración macro:SUMMARY

Apartado SUMMARY

Genera un sumario con toda la información detallada sobre las condiciones configuradas para el inicio de la captura .

De interés el dato del tamaño en disco duro que ocupará el trabajo

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Capturando imagenesCapturando imagenes

(1)-Una vez que iniciamos la captura en las condiciones configuradas se pasa a un modo visión en el que el programa nos muestra las capturas separadas por canales (filtros de fluorescencia).

(2)-Acompañado de un visor que nos informa del estado exacto de la captura : punto de muestreo , tiempo de muestreo , segundos restantes para la siguiente captura)

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Configuración básica de una MACRO de captura.

-Abrir macro: APPS>>Multi Dimensional Acquition.................................2-Configurar macro:MAIN............................................................................3-Configurar Guardado archivos: SAVING..................................................4-Configurar Series temporales:TIMELAPSE..............................................5-Configurar puntos muestreo:STAGE.........................................................6-Configurar número de canales:WAVELENGHTS....................................7-Configurar canales:WAVELENGHTS......................................................8 -Configurar Series Z :MODO 1...................................................................9-Configurar Series Z: MODO 2.................................................................10-Configurar visionado capturas:DISPLAY................................................11-Configurar macro-sumario:SUMMARY..................................................12-Capturando imágenes................................................................................13

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Campus Miguel de Unamuno 37007 Salamanca (Spain)Campus Miguel de Unamuno 37007 Salamanca (Spain)