CINETICA ENZIMATICA

LA CINÉTICA QUÍMICA ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS

REACCIONES BIOQUÍMICAS

Realizar ensayos en el laboratorio en diferentes condiciones experimentales para estudiar la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas aporta información sobre aspectos como la afinidad de la enzima por el sustrato o la eficiencia con la que se transforma ese sustrato en el producto de la reacción.

También pueden proporcionar información sobre ciertos detalles del mecanismo químico por el que transcurre la reacción catalizada.

Estos datos ayudan a predecir su comportamiento en el ambiente celular o su respuesta ante cualquier variación de las condiciones habituales.

Cinética de las reacciones de un solo sustrato

Los estudios de la velocidad de las reacciones enzimáticas de un solo sustrato se realizan mezclando una concentración conocida de enzima con una concentración concreta de sustrato, y midiendo la desaparición de sustrato o la aparición de producto a lo largo del tiempo.

Se observa una desaparición progresiva de sustrato y una aparición de producto hata llegar al equilibrio. Para una reacción reversible, en el equilibrio no hay cambio neto en las concentraciones de sustrato y producto.

Es la medida de la formación de producto o la desapariciónde sustrato por unidad de tiempo.

S P

E

Representación gráfica de este tipo de ensayo, se obtiene la siguiente curva de progreso

Curso de una reacción catalizada con una concentración de enzima constante.

La concentración de producto va aumentando de forma lineal hasta que el sustrato va desapareciendo en el transcurso del tiempo y la reacción alcanza el equilibrio. La velocidad inicial Vo se determina como la pendiente de la recta en el inicio de la reacción. La velocidad a cualquier tiempo t se representa como Vt .

En la primer etapa la reacción sigue una cinética d e primer orden hasta que la desaparición de sustrato es suficientemente elevada , (a partir de 10%) para que esta relación deje de ser lineal.

Por este motivo las medidas de velocidad se toman e n esta primer etapa lineal, se denominan velocidades iniciales Vo y se determinan como la pendiente de la curva al principio de la reacción.

Velocidad de una reacción se muestra a través de la con strucción de un gráfico perfil de velocidad expresando la concen tración de producto y el tiempo transcurrido

La pendiente de las tangentes a la curva que represen ta el perfil de velocidad, proporciona la velocidad de la reacción en ese punto, Vt, la velocidad cambia constantemente.

La velocidad inicial Vo de una reacción catalizada por una enzima va a depender de la concentración de sustrato [S]Si la cantidad de enzima permanece constante, a medida que aumenta la [S], Vo aumenta hasta que la enzima libre se agota, llegando a saturarse por el sustrato.

Un repaso de los mecanismos químicos de las reacciones…….

• La velocidad en cada punto es la pendiente de la rec ta tangente

• La velocidad de la reacción S P

Se expresa: - δ [S] = δ [P] = k [S] n

δt δt

v = k [S] n

La ecuación de velocidad indica que la velocidad in icial de una reacción va a depender de la concentración inicial d e reactivos [S] elevada a la potencia n, multiplicada por una consta nte k o constante de velocidad .

Esta información se puede llevar a otro tipo de gráfica que representa Vofrente a una concentración de sustrato.

Para representar Vo se toma el valor de la pendiente de la gráfica siguiente:

Curva de progreso para una serie de reacciones con diferentes concentraciones iniciales de sustrato.

La Vo (pendientes de las rectas) aumenta a medida que lo hace [S]

Primera etapa

lineal, a bajas [S], la reacción se comporta como de 1 orden

Segunda etapa

curvilínea, [S] intermedias, disminución de respuesta al aumento [S]

Ultima etapa

elevadas [S]. La velocidad no varía al aumentar [S]. Reacción orden 0

Para La mayoria de las reacciones catalizadas por enzimas , los datos experimentales proporcionan graficas en las que se identifican 3 zonas claramente diferenciadas:

Cada punto es un valor de Vo de la Ez obtenido en un tubo de ensayo, con [Ez] cte y [S] crecientes. Se obtiene un valor aproximado de Vmax

La actividad enzimática se determina cuantitativamente observando elefecto catalítico que produce la enzima. Para lo cual es necesario conocer:

1- la ecuación global de la reacción catalítica

2- un procedimiento analítico sencillo para determinar la desaparición del sustrato o la aparición de los productos de reacción

3- si la enzima necesita de cofactores

4- el valor de Km para el sustrato

5- su pH óptimo

6- la zona de temperatura en la que muestra actividad elevada y es estable

Los datos cinéticos obtenidos en el laboratorio permiten conocer aspectos sobre el mecanismo de la reacción enzimática estudiada.

A elevadas [S] la velocidad de la reacción no aumenta cuando lo hace la [S] debido a un efecto de saturación de la enzima por el sustrato.

El comportamiento cinético de aquellas reacciones en las que hay formación rápida del complejo ES, seguidas de una etapa posterior más lenta en la que se produce y libera el producto de la reacción se explica mediante la ecuación de Michaelis- Menten

E + S ES E + P

Vmax[S]

Km + [S]v =

Ecuación de Michaelis Menten

La hipérbola característica de la curva de saturación de l a enzima por el sustrato. Se expresa matem áticamente por la ecuación:

k-1 + k2

k1

Km =

k1

k-1

k2

Km concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de su velocidad máxima

[Ez] permanece constante y [S] es muy superior a la de la Ez.

• Km es el valor de la concentración de sustrato necesario p ara alcanzar la mitad de la velocidad m áxima

• En las reacciones enzim áticas en que participan m ás de un sustrato, cada uno de ellos posee su propia Km

• La Km representa una medida inversa de la afinidad de l a enzima por el sustrato.

• Un valor bajo de Km se relaciona con una gran estabil idad del complejo ES o sea elevada afinidad de la Ez por el S .

• Cuanto mayor es el valor de Km menor será la afinidad de la enzima por el sustrato.

• Se expresa en unidades de concentración

•El valor de Km varía de una enzima a otra y para la misma enzima difiere según los distintos sustratos.

Vmax[S]

Km + [S]v0 =

Vmax[S]

Km + [S]v0

=1

Ecuación de Lineweaver-Burk

Vmax

Km

v0

=1

+Vmax[S]

1 1

Vmax[S]

Km

v0

=1

+Vmax[S]

[S]

La forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten se conoce como gráfica de los dobles recíprocos o de Lineweaver-Burk y se utiliza para el cálculo de los parámetros cinéticos Km y Vmáx.

Factores externos que alteran la actividad enzim ática :

Concentración de la enzimaLas enzimas proteicas se aíslan de su fuente biológi ca (bacterias, hongos, tejidos animales y vegetales) mediante proce sos habituales de aislamiento y purificación de proteínas, por lo que la pureza no es absolutaUnidad de actividad enzim ática ( U): es la cantidad de enzima capaz de transformar 1,0 umol de sustrato por minuto a 25 °C en condiciones óptimas.Actividad específica: es el número de unidades enzim áticas por mgde proteína purificada. Constituye una medida de purez a.

Actividad y actividad específica

Se han representado como bolas de distintos colores las moléculasd e cualquier proteína aislada, y como bolas rojas, las unidades que tienen actividad.

En ambos casos el número de unidades de actividad es el mismo pero el tubo de la derecha tiene una mayor actividad específica debido a que las bolas rojas constituyen una mayor fracción del total del preparado.

TemperaturaEl aumento de temperatura conduce a un aumento en la velocidad de la reacción, que tiene un límite cuando se sobrepasa la temperatura de desnaturalización de la enzimaAumenta la energía cinética. Algunas son termoestables

Debajo 45 ºCaumento de la velocidad con la temperatura

Encima 45 ºCdesnaturalizacióntérmica de la enzima

pHLos cambios en el pH del medio pueden alterar el est ado de ionización de las cadenas laterales de los Aa ácidos y básicos.Estos cambios afectan la afinidad de la enzima por el sustrato y la formación del complejo ES

A pH extremos la proteína se desnaturaliza y la actividad biológicadecae

Inhibidors reversibles

Inhibidores irreversibles

Inhibidores no competitivos

Inhibidores competitivos

Se unen a la enzima a traves de un enlace covalente

Se unen a la enzima a traves de interacciones no cova lentesAlteran parámetros cinéticos

INHIBIDORES

Compuestos que pueden ralentizar o detener de forma esp ecífica la actividad enzim ática.

Resultan muy eficaces en la búsqueda y elaboración d e fármacos.

Su resultado puede ser reversible o irreversible

Inhibidores reversibles

Inhibidores acompetitivos

El inhibidor y el sustrato compiten por el mismo centr o activo de la Ez.Similitud estructural con el sustrato.

En condiciones de [S] elevadas con respecto a la [ I ] es muy poco probable que el I se una a la enzima: la reacción muestra Vmáx= VmáxI

Al aumentar la concentración de sustrato se desplaz a al inhibidor: Km ≠ KmI

Inhibición competitivaEl inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato, i mpidiendo la formación del complejo ES y del producto.

La velocidad m áxima permanece constante

El valor de Km aumenta

El etanol, un inhibidor competitivo para evitar la ceguera por intoxicación por metanol.

Las intoxicaciones con metanol pueden causar ceguera porque este alcohol es transformado en el hígado por la enzima alcohol deshidrogenasa en formaldehído, una sustancia que afecta gravemente al ojo.

La administración de etanol por vía venosa revierte esta situación.

El etanol actúa como inhibidor competitivo porque también es sustrato de la Ezalcohol deshidrogenasa.

La diferencia es que el etanol da acetaldehído que no afecta los tejidos.

E + S ES

EI + S ESI

II+ +

E + P

Ki Ki

Ks

KsE + S ES

EI + S ESI

II+ +

E + P

Ki Ki

Ks

Ks

El inhibidor muestra afinidad tanto por la enzima li bre como por el complejo ES.El inhibidor se une en un lugar distinto del centro activo de la Ez.En ninguno de los casos se obtiene producto.Su efecto no puede evitarse aumentando la [S].La Vmáx disminuye en presencia de inhibidor.

Inhibición no competitiva

Los inhibidores no competitivos disminuyen la Vmax de la reacción

Km permanece constante

Ej. El ácido iodoacético inhibe la transformación de glucosa en ácido láctico a nivel muscular porque compite con la enzima gliceraldehído fosfato deshidrogenasa

Inhibición acompetitiva

El inhibidor se une exclusivamente al complejo ES en un lugar diferente al centro activo.

Disminución de Vmáx i y de Km i

El inhibidor se une a ES, aumenta la afinidad de la Ez por el S, Kmi disminuye .

El sustrato No compite con el inhibidor, no podrá de splazarlo de su sitio de unión, ni siquiera aumentando la concentración de s ustrato. Vmáx i también disminuye.

Inhibidores irreversiblesSon moléculas que se suelen unir a la enzima median te enlaces covalentescon los residuos imprescindibles para la catálisis, impidiendo su función.

Este tipo de inhibidores no tienen un comportamient o cinético de Michaelis Menten

Su utilidad principal es la creación de fármacos: c ompuestos utilizados en la quimioterapia anticancerosa.

Ejemplos de algunos medicamentos y su mecanismo de acción.

Regulación de la concentración de la enzima porinhibición del producto final: Retroinhibición o feedb ack.Retroalimentación negativa en una ruta metabólica. El producto final Z de una ruta metabólica es el modu lador negativo de la enzima de la primer etapa.

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIM ÁTICA

Regulación alostéricaUna enzima alostérica heterotrópica muestra un sitio de unión para el modulador diferente del centro activo.Heterotrópica: el ligando es una sustancia diferent e al sustrato. Modulación positivas o negativas.

La unión del modulador produce un cambio de conform ación que hace que la enzima tenga mayor afinidad por el sustrato (mod ulador positivo)El cambio de conformación de la primera subunidad s e transmite a la segunda, que también presentará mayor afinidad por e l sustrato.

Regulación genética

Se impide el pasaje de ADN ���� ARN (transcripción) se impide la síntesis de la enzima