MINISTERIO PBLICO DE LA NACIN

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FORENSES LABORATORIO DE GENETICA FORENSE

PNO N 3

Extraccin de ADN a partir de manchas de sangre

seca por el mtodo orgnico

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Objetivos:

Extraccin y aislamiento de ADN a partir de manchas de sangre seca. Muestras:

Sangre lquida obtenida con anticoagulante EDTA. Tcnica:

Mtodo de extraccin orgnica con fenol-cloroformo. Fundamento:

Este mtodo se fundamenta en la rotura de las membranas celulares por accin de la proteinasa K y purificacin del ADN libre mediante una mezcla de fenol-cloroformo (fase orgnica) que elimina los lpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas y finalmente solubilizar el ADN en una fase acuosa y su posterior concentracin en unos filtros que permiten el paso de molculas de tamao menor del ADN.

Equipos:

Microcentrfuga.

Vortex.

Nanofuga.

Campana de extraccin.

Bao Mara.

Refrigerador de 4 a - 4 C. Realizado por: Firma: Fecha:

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Extraccin de ADN a partir de manchas de sangre

seca por el mtodo orgnico

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Reactivos:

Buffer de extraccin

Proteinasa K

Ditiotreitol DTT

Fenol-cloroformo-alcoholisoamlico 25:24:1 Material de laboratorio:

Tijeras estriles.

Tubos de 1,5 ml de capacidad

Micropipetas de 1000 ul, 200 ul y 20 ul.

Puntillas con filtro para 1000 ul, 200 ul y 20 ul.

Procedimiento:

1. Cortar 1 cm de la tela que contiene la mancha de sangre y colocar dentro de un tubo eppendorf de 1,5 ml.

2. Resuspender en 300 ul de buffer de extraccin, aadir 7,5 ul de proteinasa K y 12 ul de DTT.

3. Incubar a 56 C durante 18 a 24 horas. 4. Retirar el trozo de tela y aadir 300 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico. 5. Centrifugar a mxima velocidad por 3 minutos. 6. Trasvasar la fase superior (acuosa) a un nuevo tubo Microcon 100 de 1,5 ml. 7. Previamente a este colocar 100 ul de agua estril. 8. Centrifugar a 2500 r.p.m. durante 25 minutos. 9. Aadir 200 ul de agua estril y centrifugar a 2500 r.p.m. por 20 minutos. 10. Aadir 100 ul de agua estril para recuperar. 11. Volcar el filtro sobre un nuevo tubo de 1,5 ml. 12. Centrifugar a 3500 r.p.m. por 5 minutos. 13. Quitar y desechar el filtro, dejando el lquido en el tubo donde se

encuentra el ADN. 14. Cuantificar el ADN por electroforesis en gel de agarosa

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Resultado:

P.N.T. N 11. Bibliografa:

Protocolos de trabajo, Laboratorio de Identificacin Gentica, Departamento de Medicina Legal y Toxicologa, Universidad de Granada Espaa. Luque Cabrera Jos, Fernndez Snchez Angel. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. 1ed. 2001. Harcourt. S.A.

Begoa Jarreta, Fabricio Gonzles, Tcnicas instrumentales en Gentica Forense. 1 ed; 2001. Fernando el Catlico.

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