19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 322 82721© Número de solicitud: 20060178851© Int. Cl.:

C12P 19/34 (2006.01)

C12R 1/46 (2006.01)

C12R 1/225 (2006.01)

12© PATENTE DE INVENCIÓN B1

22© Fecha de presentación: 03.07.2006

43© Fecha de publicación de la solicitud: 29.06.2009

Fecha de la concesión: 12.04.2010

45© Fecha de anuncio de la concesión: 23.04.2010

45© Fecha de publicación del folleto de la patente:23.04.2010

73© Titular/es:Consejo Superior de Investigaciones Científicasc/ Serrano, 11728006 Madrid, ES

72© Inventor/es: Tabasco Rentero, Raquel;Paarup, Torsten;Janer Otero, Carolina;Peláez Martínez, Carmen yRequena Rolanía, Teresa

74© Agente: Pons Ariño, Ángel

54© Título: Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas ybifidobacterias en leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.

57© Resumen:Procedimiento para la detección e identificación simultá-nea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias enleches fermentadas y en cultivos iniciadores para lechesfermentadas.El procedimiento permite la rápida y simultánea deteccióne identificación de diferentes especies de bacterias lác-ticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. acido-philus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies habitual-mente presentes en yogur y leches fermentadas que con-tienen probióticos. El procedimiento emplea cebadores deADN específicas diseñados a partir del gen 165 rRNA pa-ra las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa pa-ra bifidobacterias. El procedimiento de identificación me-diante amplificación específica por PCR se complementacon la separación de los productos amplificados medianteelectroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente des-naturalizante (DGGE). La ventaja del método radica enque es capaz de realizar en una sola reacción la identifi-cación conjunta de los cultivos mixtos presentes en lechesfermentadas.

Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP.ES

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DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacterias enleches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.

Sector de la técnica

La técnica se encuadra dentro del Área Agroalimentaria, en el Sector Lácteo, y desarrolla un procedimiento parala detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas y bifidobacterias específicas de poblacionesmixtas en yogures y leches fermentadas.

Estado de la técnica

Dentro del sector lácteo, el consumo de productos lácteos probióticos se encuentra en franca expansión, creciendodurante los últimos años no sólo en ventas sino también en la variedad de productos que se ofertan. Este hecho ha con-ducido a que desde enero de 2004 se incluyan en las estadísticas del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaciónlos datos sobre consumo de “yogur con bífidus” y “otras leches fermentadas”. El registro del volumen de consumo enEspaña de yogures y leches fermentadas comparativo entre mayo de 2004 y mayo de 2005 indica un incremento mediodel consumo de productos probióticos en un 18%, los cuales representan casi un 10% del total consumido de yogu-res y productos relacionados [http://www.fenil.org/Documentos/Sector/Consumo/CompAcumUltimoAno/consumo_comparativa_mayo05-04.pdf].

La detección y correcta identificación de los microorganismos empleados como probióticos comercialmente es degran importancia para garantizar la autenticidad de su etiquetado y, en su caso, para apoyar las posibles alegacionesde salud de estos alimentos. Los estudios de productos probióticos presentes en el mercado han reflejado, en general,una falta de precisión en la identificación/taxonomía de los microorganismos probióticos empleados tanto en diferentesproductos lácteos como en concentrados liofilizados y en preparados farmacéuticos/nutracéuticos [Fasoli, S., Marzotto,M., Rizzotti, L., Rossi, F., Dellaglio, F., Torriani, S. (2003) Int. J. Food Microbiol. 82:59-70; Temmerman, R., Pot,B., Huys, G., Swings, J. (2003) Int. J. Food Microbiol. 81:1-10]. Estudios recientes realizados sobre la diversidadde especies de lactobacilos y bifidobacterias presentes en leches fermentadas comercializadas en España indican unacreciente mejora en la equivalencia entre las especies etiquetadas y las presentes en el producto detectadas por técnicasmoleculares [Gueimonde, M., Delgado, S., Mayo, B., Ruas-Madiedo, P., Margolies, A., de los Reyes-Gavilán, C. G.(2004) Food Res. Int. 37:839-850]. Aún así, ninguna de las muestras analizadas en el estudio contenía más de unaespecie de lactobacilos probióticos y en la mayoría de leches fermentadas ni siquiera a Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus. La dificultad de estos estudios, por tanto, aumenta cuando concurren un mayor número de especiesen el mismo producto.

La identificación tradicional de microorganismos basada en características fenotípicas es bastante lenta y no siem-pre adecuada para la correcta identificación o diferenciación entre especies muy próximas taxonómicamente. El re-emplazo lógico sucedido en este aspecto ha sido el empleo de técnicas moleculares para complementar o sustentarla identificación de especies bacterianas. La mayoría de estas técnicas se han basado en el análisis de secuencias es-pecíficas presentes en genes integrantes del operón del ARN ribosómico y en las regiones intergénicas espaciadoras[Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. (1995) Microbiol. Rev. 59:143-169]. Este hecho se basa en el carácteruniversal del funcionamiento de estos genes que conduce a la presencia de regiones conservadas, amplificadas porcebadores universales, y de regiones variables que permiten establecer agrupaciones filogenéticas según el grado dehomología de las secuencias nucleotídicas y, por tanto, la identificación de especies bacterianas. Sin embargo, la com-paración de secuencias del gen 16S rRNA de bifidobacterias refleja una elevada analogía entre las especies (similitudque oscila entre 92 y 99%) que dificulta su diferenciación basada en el análisis de dicha secuencia, por lo que sehan buscado otros genes polimórficos para la identificación de estas especies, como es el que codifica para la enzimatransaldolasa [Requena, T., Burton, J., Matsuki, T., Munro, K., Simon, M.A., Tanaka, R., Tannock, G.W. (2002) Appl.Environ. Microbiol. 68:2420-2427].

La combinación de técnicas específicas para la detección e identificación bacteriana basada en técnicas molecu-lares como amplificación por PCR y separación de los fragmentos mediante electroforesis en gel de poliacrilamidacon gradiente desnaturalizante (DGGE), constituye una herramienta de gran utilidad para el estudio de poblacionesmicrobiológicas complejas en ecosistemas naturales sin necesidad de realizar una separación previa de los diferentescomponentes en la mezcla. El empleo de PCR-DGGE se ha aplicado a numerosas y complejas comunidades micro-biológicas [Muyzer, G., Smalla, K. (1998) Antonie Van Leeuwenhoek 73:127-141; Zoetendal, E. G., Collier, C. T.,Koike, S., Mackie, R. I., Gaskins, H. R. (2004) J. Nutr. 134:465-472], mientras que se ha incorporado sólo recien-temente en el estudio de comunidades microbiológicas presentes en alimentos fermentados [Ercolini, D. (2004) J.Microbiol. Meth. 56:297-314] y más concretamente en quesos [Randazzo, C.L., Torriani, S., Akkermans, A.D.L., deVos, W.M., Vaughan, E.E. (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68:1882-1892].

El objeto de la presente invención consiste en la aplicación de un procedimiento de detección e identificaciónrápida y específica de diferentes especies de bacterias lácticas y bifidobacterias presentes en poblaciones mixtas enleches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas, basado en el diseño de cebadores inéditos yespecíficos de especie para la amplificación por PCR de secuencias identificadas en regiones variables del 16S rRNAde S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus y L. casei subsp. casei y del gen de la transaldolasa

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en B. lactis y se complementa con la diferenciación de los fragmentos obtenidos mediante separación por DGGE. Lasespecies objeto del estudio son añadidas habitualmente como cultivos iniciadores en leches fermentadas probióticascomercializadas en España. Las ventajas del procedimiento son la rapidez y el análisis específico y simultaneo detodas las especies presentes en una misma muestra en estudio.

En relación a las patentes internacionales existentes relacionadas con el tema objeto de la presente invención, sedestacan: (i) la patente W09709448 publicada en 1997, solicitada por los inventores Alatossava, T. y Tilsala-Timis-jaervi, A. (Finlandia), que se caracteriza por emplear la secuencia de la región espaciadora entre los genes 16S y 23SrRNA para la identificación específica de lactobacilos y S. thermophilus; (ii) las patentes JP11151097 y JP11123093,publicadas en 1999 y solicitadas por la empresa Yakult Honska KK, que se caracterizan por la descripción de oligo-nucleótidos utilizables para la identificación genérica de bacterias lácticas y bifidobacterias, respectivamente; y (iii) lapatente W02005103294 publicada en 2005, solicitada por los inventores Park, Y.-H., Bae, J.-W., Rhee, S.-K., Park, J.R., Kim, B.-C. (Corea) que se caracteriza por emplear la tecnología de “microarrays” para la detección e identificaciónde bacterias lácticas, bifidobacterias y propionibacterias. No obstante, no existe ningún procedimiento patentado parala detección e identificación de bacterias lácticas y bifidobacterias en cultivos mixtos en leches fermentadas empleandola tecnología PCR-DGGE.

Descripción de la invención

- Breve descripción de la invención

Se ha desarrollado un procedimiento que permite la rápida detección e identificación de diferentes especies debacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especieshabitualmente presentes en yogur y leches fermentadas que contienen probióticos. El procedimiento emplea secuen-cias de ADN específicas (cebadores) diseñadas a partir del gen 16S rRNA para las especies de bacterias lácticas ydel gen de la transaldolasa para bifidobacterias y que se utilizan para la identificación del ADN procedente de lasmencionadas especies mediante amplificación específica por PCR. El procedimiento de identificación se complemen-ta con la separación de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradientedesnaturalizante (DGGE).

- Descripción detallada de la invención

El procedimiento de detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L.bulgaricus, L. casei, L. acidophilus) y de B. lactis presentes en cultivos mixtos en leches fermentadas se caracterizapor el empleo de cebadores específicos diseñados a partir de secuencias presentes en regiones variables del gen 16SrRNA para las especies de bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias y que el método queemplea es la amplificación específica mediante PCR. La semejanza en la longitud de los fragmentos amplificados nopermite una diferenciación de los productos de PCR en geles convencionales de agarosa, por lo que en la presenteinvención la aplicación del procedimiento en la identificación simultanea de las especies cuando se encuentran encultivos mixtos se completa mediante la separación de los productos amplificados en geles de poliacrilamida congradiente desnaturalizante (DGGE).

Los cebadores seleccionados se derivan de la secuencia nucleotídica presente en las regiones variables V1 y V2identificadas en el gen 16S rRNA para cada una de las especies de bacterias lácticas en estudio; para ello se ha ob-tenido mediante secuenciación automatizada la secuencia nucleotídica completa de dicho gen a partir de una ceparepresentativa de cada una de las especies. La secuencia del gen de la transaldolasa se ha obtenido a partir de trabajosanteriores [Requena, T., Burton, J., Matsuki, T., Munro, K., Simon, M.A., Tanaka, R., Tannock, G.W. (2002) Appl.Environ. Microbiol. 68:2420-2427]]. Los cebadores seleccionados se caracterizan porque cada pareja específica deoligonucleótidos diseñados, o de los derivados de la cadena complementaria, solamente generan un producto de am-plificación a partir del ADN genómico procedente de la especie para la que fueron diseñados (Fig. 1). La secuenciaobjeto de la amplificación con los cebadores específicos puede estar representada también por ARN, dependiendo delmétodo de preparación de la muestra. Las parejas de cebadores para cada una de las especies objeto de la invención sedescriben a continuación:

• S. thermophilus: Se utilizan los cebadores específicos Thermfor; SEQ ID N01 y Thermrev: SEQ ID N02que generan un producto de PCR de 157 pb.

• L. bulgaricus: Se utilizan los cebadores específicos Bulgfor: SEQ ID N03 y Bulgrev: SEQ ID N04 quegeneran un producto de PCR de 232 pb.

• L. acidophilus: Se utilizan los cebadores específicos Acidfor: SEQ ID N05 y Acidrev: SEQ ID N06 quegeneran un producto de PCR de 227 pb.

• L. casei: Se utilizan los cebadores específicos Casfor: SEQ ID N07 y Casrev: SEQ ID N08 que generan unproducto de PCR de 142 pb.

• B. lactis: Se utilizan los cebadores específicos Forlac: SEQ ID N09 y Revlac: SEQ ID N010 que generanun producto de PCR de 116 pb.

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Cuando los productos de PCR se van a separar mediante DGGE, se añade a uno de los cebadores la abrazaderaGC, es decir, una extensión de nucleótidos en posición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011. La seleccióndel cebador óptimo para contener la abrazadera GC se realiza experimentalmente a partir de cada una de las especiescon el objeto de obtener una escalera de productos amplificados perfectamente separados, de manera que mezcladosconstituyan un estándar de productos específicos (“ladder”) de referencia para la identificación de las especies en lasmuestras problema (Fig. 2).

La principal aplicación industrial del procedimiento desarrollado es la detección e identificación de diferentesespecies de bacterias lácticas y bifidobacterias en yogures y leches fermentadas que contienen cultivos mixtos de estasbacterias, con el objeto de determinar la autenticidad de la composición microbiológica mostrada en el etiquetadodel producto. El procedimiento descrito tiene aplicación tanto en investigación como en el desarrollo industrial deproductos y en el control de calidad de los mismos.

Descripción del contenido de las figuras

La Fig. 1 Productos PCR: muestra un electroforegrama de un gel de agarosa al 2% con los productos de PCRobtenidos por amplificación de ADN de S. thermophilus y de dos colonias cuantificadas como pertenecientes a estaespecie (carriles 2, 3 y 4). De forma similar se muestran los productos equivalentes a partir de ADN y colonias de L.bulgaricus (carriles 5, 6 y 7), L. acidophilus (carriles 8, 9 y 10), L. casei (carriles 12,13 y 14) y B. lactis (carriles 15,16 y 17). Los carriles 1, 11 y 18, son estándares de tamaño molecular de fragmentos de ADN.

La Fig. 2 Separación DGGE mezcla productos PCR: muestra un electroforegrama de un gel de poliacrilamidaal 9% con un gradiente entre 40 y 60% de urea 7 M y formamida al 40% con la mezcla de los productos de PCRespecíficos obtenidos del ADN puro de cada especie (“ladder”; carriles 1 y 7) y de los obtenidos a partir del ADNtotal extraído de leches fermentadas empleando los cebadores específicos para S. thermophilus (carril 2), L. bulgaricus(carril 3), L. casei (carril 4), L. acidophilus (carril 5) y B. lactis (carril 6).

Ejemplo de realización de la invención

Ejemplo 1

Identificación de colonias de S. thermophilus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. casei y B. lactis obtenidas en mediosdiferenciales y selectivos para el recuento de estas especies presentes en leches fermentadas

El procedimiento para la identificación de las cinco especies mencionadas se aplicó para confirmar la enumeraciónrealizada en medios selectivos y diferenciales a partir de muestras de leche fermentada comercial que indicaba en laetiqueta que contenía dichas especies. La comprobación de la conformidad de los recuentos se realizó en un 10% delas colonias crecidas en los diferentes medios diferenciales o selectivos que se describen en la Patente de invenciónProcedimiento para diferenciar y cuantificar bacterias lácticas y bifidobacterias en leches fermentadas que empleamedios de cultivo selectivos libres de antibióticos Para ello se utilizaron los cebadores descritos en la Tabla 1 ydiseñados a partir del procedimiento descrito en la presente invención.

(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1

Parejas de cebadores empleados para la identificación de S. thermophilus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. casei yB. lactis

Las colonias en estudio crecidas en los medios diferenciales y selectivos se suspendieron en 20 µL de agua milliQestéril y se calentaron a 100ºC durante 5 min; a continuación, la suspensión celular se congeló a -20ºC durante 24h. Para la PCR se emplearon 2 µL de la suspensión descongelada y se mezclaron con la pareja de cebadores corres-pondiente a la especie objeto de identificación (Tabla 1), a la concentración final en la reacción de 0,4 µM para cadacebador. A la reacción se añadieron los componentes estándar: dNTP (200 µM), MgCl2 (1,5 mM) y el tampón especí-fico para la reacción con TaqPolimerasa (Roche). La PCR es común para todas las parejas de cebadores: 35 ciclos contemperatura de desnaturalización a 94ºC, hibridación a 60ºC y elongación a 72ºC. Previo al primer ciclo de reacciónlas muestras se incubaron a 94ºC durante 3 minutos y después de finalizar el último ciclo se prolongó 5 minutos laelongación de fragmentos a 72ºC, seguido de refrigeración a 4ºC. Los productos de la reacción (5 µL) se analizaronmediante electroforesis en gel de agarosa al 2% para lo que previamente se centrifugaron las muestras a 10.000 rpmdurante 3 minutos con el objeto de sedimentar los restos celulares presentes en la reacción.

La identificación de las colonias se realizó mediante comparación de los productos amplificados procedentes delas colonias problema con los del ADN procedente de cada una de las especies puras (Fig. 1). La separación obte-nida no es suficiente en el caso de contar con cultivos mixtos en los que no se tengan identificadas previamente lascepas.

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Ejemplo 2

Detección e identificación mediante PCR-DGGE de S. thermophilus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. casei y B. lactispresentes en cultivos mixtos en leches fermentadas

El procedimiento descrito en la presente invención también puede emplearse para la detección e identificaciónespecífica de bacterias lácticas y bifidobacterias sin necesidad de realizar la separación previa de las especies mediantecultivo selectivo o diferencial. La detección e identificación de las cinco especies se aplicó en el análisis de muestrasde leche fermentada comercial que indicaba en la etiqueta que contenía dichas especies.

La obtención del ADN total de las muestras (mezcla de ADN procedente de todas las especies) se realizó a partirde 3 ml de leche fermentada, que se neutralizó a pH 6 con NaOH 1M, a los que se añadieron 10 ml de EDTA al 0,2%,pH 12, para dispersar las caseínas. Las células de sedimentaron mediante centrifugación durante 15 minutos a 6.000rpm. Para la extracción de ADN, las células se rompieron con bolas de vidrio (diámetro de 150-212 µm) y el ADN seprecipitó con isopropanol, previa eliminación de restos de material celular con acetato amónico 10 M y una mezcla24:1 de cloroformo:alcohol isoamílico. El ADN total se purificó finalmente mediante precipitación con etanol y seresuspendió en tampón Tris-HCl 10 M, pH 8, y EDTA 1 M.

Para la PCR se utilizaron 500 ng de ADN total y se siguieron las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo1, empleando los cebadores que se muestran en la Tabla 1, pero con la diferencia de que se añadió la abrazadera GCen los cebadores SEQ ID N01,4,5,7,10 ThermforGC, BulgrevGC, AcidforGC, CasforGC y RevlacGC.

Los productos de PCR obtenidos se añadieron (1 µL) a un gel de poliacrilamida al 9% con un gradiente entre 40 y60% de urea 7 M y formamida al 40% y se separaron mediante electroforesis a 130 V durante 4,5 horas.

Para la detección e identificación de las cinco especies que se mencionan en la invención se preparó un estándarde productos específicos (“ladder”) obtenido de la mezcla de 0,5 µL de cada uno de los fragmentos procedentes de laamplificación del ADN puro de cada especie (Fig. 2, carriles 1 y 7). La amplificación del ADN total obtenido de lasleches fermentadas con las parejas de cebadores específicos permite la detección e identificación de las especies debacterias lácticas y bifidobacterias presentes en la muestra (Fig. 2, carriles 2 a 6).

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REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas caracterizado por el uso de la técnica de reacciónen cadena de la polimerasa mediante una única reacción con cebadores que comprenden oligonucleótidos específicosde regiones variables del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias.

2. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 1, caracterizado porquese realiza la detección e identificación de diferentes especies de bacterias lácticas (S. thermophilus, L. bulgaricus, L.casei, L. acidophilus) en cultivos mixtos con B. lactis, especies habitualmente presentes en yogur y leches fermentadasque contienen probióticos en mezcla de las cinco especies o en las diferentes combinaciones binarias, ternarias ocuaternarias obtenidas a partir de las cinco especies.

3. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 2, caracterizadoporque los cebadores seleccionados para las bacterias lácticas se derivan de la secuencia nucleotídica presente entrelas regiones variables V1 y V2 del gen 16S rRNA y los cebadores seleccionados para B. lactis se derivan de regionesvariables presentes en la secuencia nucleotídica del gen de la transaldolasa.

4. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadopor utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que generan unproducto de PCR de 157 pb.

5. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadopor utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que generan unproducto de PCR de 232 pb.

6. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadopor utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que generan unproducto de PCR de 227 pb.

7. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizadopor utilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan un productode PCR de 142 pb.

8. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porutilizar la pareja de oligonucleótidos específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que generan un productode PCR de 116 pb.

9. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadoporque la identificación mediante amplificación específica por PCR se complementa con la separación de los productosamplificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente desnaturalizante (DGGE) para lo que en lareacción de PCR se añade a uno de los cebadores la abrazadera GC, es decir, una extensión de nucleótidos en posición5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011.

10. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porquela identificación de S. thermophilus, se hace añadiendo a SEQ ID N01 una extensión de nucleótidos en posición 5’constituida por la secuencia SEQ ID N011.

11. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porquela identificación de L. bulgaricus, se hace añadiendo a SEQ ID N04 una extensión de nucleótidos en posición 5’constituida por la secuencia SEQ ID N011.

12. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porquela identificación de L. acidophilus, se hace añadiendo a SEQ ID N05 una extensión de nucleótidos en posición 5’constituida por la secuencia SEQ ID N011.

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13. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porquela identificación de L. casei, se hace añadiendo a SEQ ID N07 una extensión de nucleótidos en posición 5’ constituidapor la secuencia SEQ ID N011.

14. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 9, caracterizado porque laidentificación de B. lacti, se hace añadiendo a SEQ ID N010 una extensión de nucleótidos en posición 5’ constituidapor la secuencia SEQ ID N011.

15. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadoporque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadoresindicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes a las cinco especies, a partir de una suspensión de las colonias,calentada a 100ºC y congelada a -20ºC y bajo las siguientes condiciones preferentes:

3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.

3 35 ciclos:

• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)

• Anillamiento a 60ºC

• Extensión a 72ºC

3 Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y los productos de la PCR centrifu-gados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa.

16. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadoporque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadoresindicados en las reivindicaciones 1 a 8 correspondientes a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientescondiciones preferentes:

3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.

3 35 ciclos:

• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)

• Anillamiento a 60ºC

• Extensión a 72ºC

3 Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y los productos de la PCR se analizanmediante electroforesis en gel de agarosa.

17. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizadoporque la amplificación de los fragmentos de doble cadena se realiza con las parejas de oligonucleótidos cebadores in-dicados en las reivindicaciones 9 a 14 correspondientes a las cinco especies, a partir de ADN total y bajo las siguientescondiciones preferentes:

3 un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos.

3 35 ciclos:

• Desnaturalización a 94ºC (30 segundos)

• Anillamiento a 60ºC

• Extensión a 72ºC

3 Incubación a 72ºC durante 5 minutos seguidos de refrigeración a 4ºC y 1 µL de los productos de PCR seseparan en un gel de poliacrilamida al 9% con un gradiente entre 40 y 60% de urea 7 M y formamida al40%.

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18. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según las reivindicaciones 15 y 16, caracterizadoporque utiliza como material de partida colonias y cultivos de las especies bacterianas, respectivamente.

19. Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas según la reivindicación 17, caracterizado porqueutiliza como material de partida leches fermentadas, yogures, derivados lácteos o alimentos que los contengan o losutilicen como ingredientes.

20. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 y SEQ ID N02 que generanun producto de PCR de 157 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en lechesfermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 15 y 16.

21. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 que generanun producto de PCR de 232 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en lechesfermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 15 y 16.

22. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 y SEQ ID N06 que generanun producto de PCR de 227 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en lechesfermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 15 y 16.

23. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. casei, SEQ ID N07 y SEQ ID N08 que generan unproducto de PCR de 142 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en lechesfermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 7, 15 y 16.

24. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 que generan unproducto de PCR de 116 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria en leches fermentadasy cultivos iniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 15 y 16.

25. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de S. thermophilus, SEQ ID N01 con una extensión de nu-cleótidos en posición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N02 que generan un producto de PCRde 197 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivosiniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 10 y 17.

26. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. bulgaricus, SEQ ID N03 y SEQ ID N04 con una ex-tensión de nucleótidos en posición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de272 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivosiniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 11 y 17.

27. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. acidophilus, SEQ ID N05 con una extensión de nucleó-tidos en posición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N06 que generan un producto de PCR de267 pb que permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivosiniciadores de leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 12 y 17.

28. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de L. casei, SEQ ID N07 con una extensión de nucleótidos enposición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011 y SEQ ID N08 que generan un producto de PCR de 182 pb quepermite la detección e identificación simultánea de esta bacteria láctica en leches fermentadas y cultivos iniciadoresde leches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 13 y 17

29. Pareja de oligonucleótidos cebadores específicos de B. lactis, SEQ ID N09 y SEQ ID N010 con una extensiónde nucleótidos en posición 5’ constituida por la secuencia SEQ ID N011 que generan un producto de PCR de 156 pbque permite la detección e identificación simultánea de esta bacteria en leches fermentadas y cultivos iniciadores deleches fermentadas por PCR según las reivindicaciones 1, 2, 3, 9, 14 y 17.

30. Kit de diagnóstico por PCR para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas ybifidobacterias en leches fermentadas y cultivos iniciadores de leches fermentadas caracterizado por amplificar unfragmento del gen 16S rRNA para las bacterias lácticas y del gen de la transaldolasa para bifidobacterias según losprocedimientos descritos en las reivindicaciones 1 a 17 y por emplear los cebadores descritos en las reivindicaciones18 a 29.

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones CientíficasTabasco Rentero, RaquelPaarup, TorstenJaner Otero, CarolinaPeláez Martínez, CarmenRequena Rolanía, Teresa

<120> Procedimiento para la detección e identificación simultánea y específica de bacterias lácticas y bifidobacteriasen leches fermentadas y en cultivos iniciadores para leches fermentadas.

<130> PCRLACBIF

<160> 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1<211> 20<212> DNA<213> Streptococcus thermophilus

<400> 1

acgctgaaga gaggagcttg 20

<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Streptococcus thermophilus

<400> 2

gcaattgccc ctttcaaata 20

<210> 3<211> 20<212> DNA<213> Lactobacillus bulgaricus

<400> 3

tcaaagattc cttcgggatg 20

<210> 4<211> 20<212> DNA<213> Lactobacillus bulgaricus

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tacgcatcat tgccttggta 20

<210> 5<211> 20

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<212> DNA<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 5

agcgagctga accaacagat 20

<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 6

aggccgttac cctaccaact 20

<210> 7<211> 21<212> DNA<213> Lactobacillus casei

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gcaccgagat tcaacatgga a 21

<210> 8<211> 21<212> DNA<213> Lactobacillus casei

<400> 8

gccatctttc agccaagaac c 21

<210> 9<211> 21<212> DNA<213> Bifidobacterium lactis

<400> 9

gcgctgggct gctctggaag c 21

<210> 10<211> 24<212> DNA<213> Bifidobacterium lactis

<400> 10

tggcgacgag ctcatcgaca tact 24

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OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© ES 2 322 827

21© Nº de solicitud: 20060178822© Fecha de presentación de la solicitud: 03.07.2006

32© Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA

51© Int. Cl.: Ver hoja adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría 56© Documentos citados Reivindicacionesafectadas

Categoría de los documentos citadosX: de particular relevanciaY: de particular relevancia combinado con otro/s de la

misma categoríaA: refleja el estado de la técnica

O: referido a divulgación no escritaP: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación

de la solicitudE: documento anterior, pero publicado después de la fecha

de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado

�5 para todas las reivindicaciones � para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe Examinador Página

02.06.2009 M. Cumbreño Galindo 1/2

Y RANDAZZO C. et al. Diversity, dynamics and activity of bacterial 1communities during production of an artisanal sicilian cheese asevaluated by 16S rRNA analysis. Applied and EnvironmentalMicrobiology. Abril 2002, Vol. 68, No 4, páginas 1882-1892.ISSN 0099-2240.

Y REQUENA T. et al. Identification, detection and enumeration of 1human Bifidobacterium species by PCR targeting the TransaldolaseGene. Applied and Environmental Microbiology. Mayo 2002,Vol. 68, No 5, páginas 2420-2427. ISSN 0099-2240.

X SATOKARI R. M. et al. Molecular approaches for the detection and 4,5,7(enidentification of bifidobacteria and lactobacilli in the human parte),13,gastrointestinal tractSystematic and Applied Microbiology. 2003, 14,18,19,Vol. 26, páginas 572-584. ISSN 0723-2020. 21(en

parte)

A GUEIMONDE M. et al. Viability and diversity of probiotic 1-21Lactobacillus and Bifidobacterium populations included incommercial fermented milks. Food Research International. 2004,Vol. 37, páginas 839-850. ISSN 0963-9969.

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 200601788

CLASIFICACIÓN DEL OBJETO DE LA SOLICITUD

Informe del Estado de la Técnica (hoja adicional) Página 2/2

C12P 19/34 (2006.01)C12R 1/46 (2006.01)C12R 1/225 (2006.01)