Costa Rica, 27 de abril Costa Rica, 27 de abril –– 2 de mayo 20092 de mayo 2009

Hilda Ma. BolaHilda Ma. Bolañños Acuos Acuññaa

Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa

INCIENSA INCIENSA –– Costa RicaCosta Rica

.

Diagnóstico de laboratorio de vibrios

causantes de ETAs

..

DiagnDiagnóóstico de laboratorio de stico de laboratorio de vibriosvibrios

causantes de causantes de ETAsETAs

CaracterCaracteríísticas microbiolsticas microbiolóógicas gicas

Los miembros del gLos miembros del géénero nero VibrioVibrio son:son:

Bacilos Bacilos GramGram--negativos (0,5 a 0,8 x negativos (0,5 a 0,8 x

1,4 a 2,6 1,4 a 2,6 µµm)m)

MMóóviles por flagelos polaresviles por flagelos polares

Anaerobios facultativosAnaerobios facultativos

Oxidasa positivos Oxidasa positivos (excepto (excepto V. V. metschnikoviimetschnikovii))

Su metabolismo es fermentativoSu metabolismo es fermentativo

Miembros de la familia Miembros de la familia VibrionaceaeVibrionaceae((AeromonasAeromonas, , PlesiomonasPlesiomonas y Vibrioy Vibrio))

DiferenciaciDiferenciacióón entre el gn entre el géénero nero VibrioVibrio y otros y otros

GramGram--negativos oxidasa (+) negativos oxidasa (+)

--++--Gas de glucosaGas de glucosa

----++Prueba de cordPrueba de cordóónn

---- (+)(+)++Crecimiento en agar Crecimiento en agar TCBSTCBS

----++Crecimiento requiere o es Crecimiento requiere o es estimulado por iones estimulado por iones Na+Na+

--++++FermentaciFermentacióón de manitoln de manitol

++----FermentaciFermentacióón de inositoln de inositol

++++++FermentaciFermentacióón de glucosan de glucosa

PlesiomonasPlesiomonasAeromonasAeromonasVibrioVibrioPrueba bioquPrueba bioquíímicamica

VibriosVibrios de importancia clde importancia clíínicanica

++++++V. V. mimicusmimicus

++++V. V. alginolyticusalginolyticus

++++++++++V. V. vulnificusvulnificus

(+)(+)++++++V. V. parahaemolyticusparahaemolyticus

++++++++V. V. choleraecholerae no O1 no O1 (incluyendo O:139)(incluyendo O:139)

(+)(+)++++V. V. choleraecholerae O1O1

SepticemiaSepticemiaInfecciInfeccióón de n de

heridas, oheridas, oíídosdos

GastrointestinalGastrointestinal

PresentaciPresentacióón cln clíínicanicaEspecieEspecie

++: Presentaci++: Presentacióón mn máás coms comúún; +: otra presentacin; +: otra presentacióón cln clíínica; (+) presentacinica; (+) presentacióón poco usualn poco usual

Vibrio choleraeVibrio cholerae

V. V. choleraecholerae O1*O1*

•• 2 biotipos: Cl2 biotipos: Cláásicosico

El TorEl Tor

•• 3 3 serotiposserotipos: : InabaInaba

OgawaOgawa

HikojimaHikojima

V. V. choleraecholerae no O1no O1(> 200 (> 200 serogruposserogrupos):):

•• V. V. choleraecholerae O139 *O139 *

•• V. V. choleraecholerae no O1, no O1,

no O139no O139

* Cepas epid* Cepas epidéémicasmicas

75% infección asintomática*

2% enfermedad grave

5% enfermedad moderada

18% enfermedad leve

Espectro clEspectro clíínico del cnico del cóóleralera

* Portadores: personas que * Portadores: personas que queque no presentan sno presentan sííntomas pero pueden ntomas pero pueden

transmitir la enfermedad. Importantes en diseminacitransmitir la enfermedad. Importantes en diseminacióón de la enfermedad.n de la enfermedad.

RecolecciRecoleccióón y transporte den y transporte de

muestras fecalesmuestras fecales

•• En el perEn el perííodo agudo de la enfermedadodo agudo de la enfermedad

•• Antes de iniciar el tratamiento antibiAntes de iniciar el tratamiento antibióótico tico

•• Heces enteras o hisopado fecal en Cary Blair Heces enteras o hisopado fecal en Cary Blair (m(mááx. x.

5 d5 díías)as) a temperatura ambientea temperatura ambiente ((no refrigerarno refrigerar))

•• Es ideal procesar la muestra dentro de 2 a 4 horas Es ideal procesar la muestra dentro de 2 a 4 horas

despudespuéés de recolectadas de recolectada

•• Normas de bioseguridadNormas de bioseguridad

FlujogramaFlujograma de aislamiento de de aislamiento de vibriosvibrios

a partir de materia fecala partir de materia fecal

APAAPA

Agar TCBS / TSAAgar TCBS / TSA

Muestra de materia fecal Muestra de materia fecal

V. cholerae O1, O139 o no O1 no O139

35- 37º C x 6-8 hs

35 - 37º C x 18-24 hs

KIA KIA –– LIA LIA -- indol indol -- estrestríía TSAa TSA

35 -37º C x 18-24 hs

Pruebas bioquPruebas bioquíímicas micas

complementariascomplementariasOxidasa, cordOxidasa, cordóónn

SerotipificaciSerotipificacióón O1 y O139n O1 y O139

Crecimiento de Crecimiento de vibriosvibrios en agar TCBSen agar TCBS

Sacarosa (-)V. mimicus

V. parahaemolyticus

Sacarosa (-)V. mimicus

V. parahaemolyticus

Agar TCBSAgar TCBS

Sacarosa (+)V. cholerae

Sacarosa (+)V. cholerae

DiferenciaciDiferenciacióón bioqun bioquíímica de mica de vibriosvibrios

causantes de causantes de ETAsETAs

--++----FermFerm. arabinosa. arabinosa

------++FermFerm. sacarosa. sacarosa

++------FermFerm. lactosa. lactosa

SSRRSSSSSens O129 Sens O129 (10 (10 µµgg))

SSSSSSSSSens O129 Sens O129 (150 (150 µµgg))

++++----CrecCrec. 8% . 8% NaClNaCl

++++++++CrecCrec. 1% . 1% NaClNaCl

----++++CrecCrec. 0% . 0% NaClNaCl

VerdesVerdesVerdesVerdesVerdesVerdesAmarillasAmarillasColonias en TCBSColonias en TCBS

V. V.

vulnificusvulnificusV. V.

parahaemolyticusparahaemolyticusV. V.

mimicusmimicusV. V.

choleraecholeraeCaracterCaracteríísticastica

AglutinaciAglutinacióón:n: organismo (antorganismo (antíígeno) + suero inmune (anticuerpo)geno) + suero inmune (anticuerpo)

SerotipificaciSerotipificacióón de n de Vibrio Vibrio choleraecholerae

•• Cultivo fresco Cultivo fresco (18(18--24 horas)24 horas)

•• Control de aglutinaciControl de aglutinacióónn

•• Seguir especificaciones de Seguir especificaciones de

fabricantes de antisuerosfabricantes de antisueros

Si el antisuero contiene Si el antisuero contiene aglutininasaglutininas contra la bacteria se produce rcontra la bacteria se produce ráápidamente una pidamente una

aglutinaciaglutinacióón fuerte, firme y granularn fuerte, firme y granular

Cepa con Cepa con caractcaract BQ de BQ de V. V. choleraecholerae en ABHI o ATSen ABHI o ATS

Aglutinar en SS Aglutinar en SS 0.85%0.85%

Cepa rugosaCepa rugosa++

--

Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero polypoly O1O1

++V. V. choleraecholerae O1O1

--

V. cholerae no O1Aglutinar con Aglutinar con antisuero O139antisuero O139

++V. V. choleraecholerae O139O139

--

V. V. choleraecholerae no O1, no O139no O1, no O139

11

DeterminaciDeterminacióón de factores de n de factores de virulencia (PCR)virulencia (PCR)

Pasajes en ASPasajes en AS

SerotipificaciSerotipificacióón de n de Vibrio Vibrio choleraecholerae

NOTIFICAR *NOTIFICAR *

SerotipificaciSerotipificacióón de n de V. V. choleraecholerae O1O1

Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero InabaInaba

++

--

Aglutinar con Aglutinar con antisuero antisuero OgawaOgawa

++V. V. choleraecholerae O1 O1 OgawaOgawa

11

V. V. choleraecholerae O1 O1 InabaInaba NOTIFICAR * NOTIFICAR *

NOTIFICAR *NOTIFICAR *

DeterminaciDeterminacióón de factores de n de factores de virulencia (PCR) y PSAvirulencia (PCR) y PSA

Si aglutina con Si aglutina con InabaInaba y y OgawaOgawa corresponde al serotipo corresponde al serotipo HikojimaHikojima (el aislamiento se debe (el aislamiento se debe referir a un Centro de Referencia Internacional para su confirmareferir a un Centro de Referencia Internacional para su confirmacicióón)n)

RSI: Cólera por V. cholerae O1, O139: NOTIFICACION INTERNACIONAL

DiferenciaciDiferenciacióón de los biotipos den de los biotipos de

V. V. choleraecholerae O1O1

++--HemHemóólisis en agar sangre de carnerolisis en agar sangre de carnero

++--Lisis por bacteriLisis por bacterióófago El Tor 5fago El Tor 5

--++Lisis por bacteriLisis por bacterióófago clfago cláásico IVsico IV

--++Zona de inhibiciZona de inhibicióón alrededor del disco n alrededor del disco

de de polimixinapolimixina B (50U)B (50U)

++--VogesVoges ProskauerProskauer (+ 1% (+ 1% NaClNaCl))

El TorEl TorClCláásicosico

BiotipoBiotipoEnsayoEnsayo

DesempeDesempeñño del o del CholeraCholera--SMART en el SMART en el

diagndiagnóóstico rstico ráápido del cpido del cóólera en Costa Ricalera en Costa Rica

BolaBolaññosos H, H, etet al. 200al. 2004. Desempe4. Desempeñño de los sistemas o de los sistemas CholeraCholera--SMART y SMART y PathogenPathogen DetectionDetection KitKit en el en el

diagndiagnóóstico del cstico del cóólera. Rev. lera. Rev. PanamPanam. Salud P. Salud Púública 16:233blica 16:233--241.241.

•• Evaluar el desempeEvaluar el desempeñño de dos pruebas ro de dos pruebas ráápidas utilizadas en pidas utilizadas en

Costa Rica para el diagnCosta Rica para el diagnóóstico del cstico del cóólera en comparacilera en comparacióón n

con el cultivo tradicionalcon el cultivo tradicional

•• Evaluar la utilidad del anEvaluar la utilidad del anáálisis de la motilidad lisis de la motilidad ““al frescoal fresco””, ,

como tamizaje para priorizar el uso de las pruebas rcomo tamizaje para priorizar el uso de las pruebas ráápidaspidas

•• Proponer una estrategia para el uso de estas pruebasProponer una estrategia para el uso de estas pruebas

Materiales y mMateriales y méétodostodos

Se procesaron 237 especSe procesaron 237 especíímenes fecales:menes fecales:

PathogenPathogen DetectionDetection KitKitTMTM

SMARTSMARTTMTM

Cultivo Cultivo ((““standard de orostandard de oro””))

Sensibilidad analSensibilidad analíítica del SMARTtica del SMART

0

2

4

6

8

10

12

0 6 12 18 24 30 36 42 48 Horas Horas

log

log

10

10u

f cu

f c/m

l/m

l

•• AltaAlta

•• MedianaMediana

•• BajaBaja

(l(lííquidas, agua de arroz)quidas, agua de arroz)

((semisemi--formadas, moco y sangre)formadas, moco y sangre)

(h. rectales o muestras post(h. rectales o muestras post--antibiantibióótico)tico)

ResultadoResultado

SMART-D SMART-6 SMART-18Motilidad Motilidad Motilidad

Cultivo-D Cultivo APA-6 Cultivo APA-18

AnAnáálisislisis de la motilidadde la motilidad

Sospechosa Sospechosa 65 (47%)65 (47%)

NoNo sospechosasospechosa73 (53%)73 (53%)

Todas negativas Todas negativas

por por V. V. choleraecholerae y y

otros otros vibriosvibrios

V. V. choleraecholerae O1 O1

V. V. choleraecholerae no O1 no O1

V. V. mimicusmimicus, otros, otros

ObservaciObservacióón n

de motilidad de motilidad (n = 138)(n = 138)

ConclusionesConclusiones

�� Las prueba rLas prueba ráápida de SMART mostrpida de SMART mostróó un desempeun desempeñño excelente o excelente (100% (100%

especificidad y 100% sensibilidad)especificidad y 100% sensibilidad) al establecer el diagnal establecer el diagnóóstico de stico de V. V. choleraecholerae

O1 en todas las muestras de heces que fueron positivas por cultiO1 en todas las muestras de heces que fueron positivas por cultivo, vo,

en un tiempo menor.en un tiempo menor.

�� Estas pruebas, utilizadas en conjunto con la observaciEstas pruebas, utilizadas en conjunto con la observacióón de la n de la

motilidad de la muestra, constituyen un recurso accesible para smotilidad de la muestra, constituyen un recurso accesible para ser er

utilizado en la vigilancia del cutilizado en la vigilancia del cóólera, alera, aúún en pan en paííses en vses en víías de as de

desarrollo. desarrollo.

Muchas graciasMuchas gracias