INTRODUCCIÓN

Vectores de clonación en bacterias

Clonación Un clon es un conjunto de células genéticamente idénticas, que proceden de un mismo progenitor por división celular. El proceso de clonación de genes implica la construcción de moléculas de ADN recombinante, en estas moléculas se incluye el gen, o fragmento de ADN, a clonar. La molécula de ADN recombinante es posteriormente introducida en células hospedadoras, para que se replique usando las enzimas de la célula, de modo que todas las células descendientes poseerán, al menos, una copia de la molécula recombinante. La obtención de las moléculas de ADN recombinante es un proceso que se realiza in vitro, pero la replicación en el interior de la célula hospedadora es un proceso totalmente in vivo. Las células hospedadoras son normalmente células bacterianas, aunque ocasionalmente también puede transferirse el ADN recombinante a células eucariotas, esto ocurre, sobre todo, cuando se quiere estudiar la expresión de genes eucariotas. La bacteria E. coli es la más usada para este fin. Se trabaja siempre con cepas modificadas genéticamente, a las que se les ha eliminado el sistema de restricción-modificación, para, de este modo, invalidar los sistemas que tiene la bacteria para evitar la intromisión de ADN extraño. Una molécula de ADN recombinante se compone de: ADN exógeno (o pasajero): es el gen, o fragmento de ADN, que se quiere clonar. Éste puede tener distintos orígenes: – Puede proceder de un genoma fragmentado. – Puede ser un fragmento específico de ADN, amplificado mediante PCR. – Puede ser ADNc (copia) procedente de ARNm. – O puede ser ADN simplexo, que deberá pasarse a duplexo para clonarlo. ADN vector: molécula que porta el fragmento de ADN exógeno. Se clasifican en: – Vectores de clonación: aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora. – Vectores de expresión: permiten transcribir y traducir la información genética dentro de la célula hospedadora.

Tipos: plasmidos, cosmidos, YACs, BACs, etc…

Cromosomas artificiales

Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1).

Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.

Los BAC se basan en el plásmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb. Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas:

1. Son menos complejos y por lo tanto más fáciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnología básica de los plásmidos bacterianos.2. Contienen menor cantidad de insertos híbridos (insertos compuestos por dos o más fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones

Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construcción de mapas físicos de cromosomas enteros.

Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciación, ya que aún organismos simples como el nematodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). En este caso se necesitarían 2.500 cósmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica.

Cromosomas artificiales bacterianos

Para cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que está implicado en la transferencia de información genética durante la conjugación bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseñados para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores BAC tienen los genes de replicación y de número de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico y sitios de restricción para insertar el DNA exógeno que se desee donar. Además, el sitio de donación está flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar moléculas de RNA y expresar así el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosómico, y para secuenciar el DNA del inserto clonado.

Cromosoma artificial bacteriano (BAC). El sitio de clonación múltiple tiene diversos sitios de restricción únicos para la inserción de DNA exógeno. Las flechas marcadas como T7 y Sp6 son regiones promotoras que permiten la expresión de los genes clonados entre estas regiones

Aunque la levadura es un organismo eucariótico, puede manipularse y crecer de manera parecida a las células bacterianas. Además, la genética de las levaduras se ha investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catálogo de mutaciones y unos mapas genéticos altamente detallados de sus cromosomas. En levadura hay un plásmido de origen natural, denominado “plásmido 2 micras” (o “plásmido 2μ”), que se ha utilizado para construir varios vectores de clonación para levadura. Combinando secuencias de plásmidos bacterianos con secuencias del plásmido 2 micras, se pueden producir vectores con muchas propiedades útiles.

• Cromosomas artificiales de levadura.Un segundo tipo de vector de levadura es el cromosoma artificial de levadura (YAC, del inglés “yeast artificial chromosome”). De tipo lineal, un YAC contiene telómeros de levadura en cada extremo, un origen de replicación (denominado secuencia de replicación autónoma o ARS), y un centrómero de levadura que permite la distribución del YAC replicado a las células hija durante la división celular. El YAC también contiene un marcador de selección en cada brazo (TRP1 y URA3), y un grupo de sitios de restricción únicos para insertar DNA.

Clonación en un cromosoma artificial de levadura (YAC). El cromosoma contiene secuencias teloméricas (TEL) provenientes de un protozoo ciliado, Tetrahymena, un centró mero (CEN), y un origen de replicación (ARS).

Estos elementos dan al vector de clonación las propiedades de un cromosoma. TRPI y URA3 son genes de levadura que son marcadores de selección para los brazos izquierdo y derecho del cromosoma, respectivamente. Cerca del centrómero hay una región que contiene varios sitios de restricción. Si se corta esta región con una enzima de restricción se rompe el cromosoma en dos brazos. El DNA a clonar se trata con la misma enzima, produciendo una colección de fragmentos. Los brazos y los fragmentos pueden ligarse juntos, y el cromosoma artificial puede insertarse en células huésped de levadura. Como los cromosomas de levadura son grandes, el cromosoma artificial puede aceptar insertos de hasta varios millones de pares de bases.En los YAC pueden insertarse segmentos de DNA de más de 1 megabase de longitud (1 Mb). La capacidad de clonar grandes trozos de DNA en estos vectores los ha convertido en herramientas importantes para construir mapas físicos de genomas eucarióticos, incluyendo el genoma humano. Muchas de las investigaciones del Proyecto Genoma Humano han dependido de la utilización de vectores YAC.Aunque la clonación en levaduras es uno de los sistemas actuales de huésped eucariótico más avanzado, también se están desarrollando otros huéspedes fúngicos. Además, otros sistemas huésped eucarióticos, entre los que se incluyen cultivos tisulares de células de plantas y de mamíferos, son muy prometedores.

Concepto de ADN recombinante El ADN recombinante es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de diferente origen. Generalmente se aplica este nombre a moléculas producidas por la unión in vitro de ADN proveniente de dos organismos diferentes que no se encuentran juntos. Normalmente se trata de ADN cromosómico que se une a un vector, comúnmente un plásmido bacteriano. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo conllevando a la modificación de rasgos existentes o a la expresión de nuevos rasgos. Son necesarias herramientas que linearicen los vectores y que corten el ADN cromosómico, es decir, se necesitan enzimas que tienen como sustrato el ADN. Después de obtenerse el ADN recombinante debe multiplicarse, para ello, se introduce en una bacteria, que se dividirá formando un clon en el que cada célula tendrá una copia del plásmido recombinante. Aplicaciones Industria farmacéutica y química: se usan bacterias para producir sustancias de interés para el hombre, como por ejemplo insulina. Industria alimentaria: se usan bacterias para producir colorantes alimenticios. Biorremediación: por ejemplo, degradación bacteriana de hidrocarburos. Agricultura y ganadería: producción de plantas y animales transgénicos. Medicina: técnicas de diagnostico molecular y terapia génica.

Restricción y modificación del ADN

En las técnicas de ingeniería genética se necesita fragmentar, modificar y multiplicar las moléculas de ADN, y para ello se utilizan enzimas de diferentes tipos: Enzimas nucleasas. Enzimas de modificación. Enzimas de polimerización.

Además se utilizan procedimientos químicos y físicos para fragmentar el ADN. Como método químico cabe destacar la hidrólisis del ADN por pH ácido. Los ultrasonidos y el cizallamiento son métodos físicos que fragmentan el ADN. Aunque a diferencia de los métodos enzimáticos, los procedimientos químicos y físicos son inespecíficos. Enzimas de restricción Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos. Tipos de nucleasas: Exonucleasas: escinden el último nucleótido del extremo 5' o 3' de un polinucleótido. Pueden degradar por completo un ácido nucleico lineal. Endonucleasas: cortan los enlaces fosfodiéster situados en el interior de los polinucleótidos. Estas enzimas no requieren un extremo libre, por lo que pueden cortar ácidos nucleicos circulares.

Las nucleasas pueden ser enzimas inespecíficas, es decir, que cortan el ácido nucleico independientemente del nucleótido que haya. Pero también existen endonucleasas (de restricción) que sólo cortan cuando reconocen una determinada secuencia nucleotídica. Las enzimas de restricción (o restrictasas) pueden reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. Existen tres tipos de enzimas de restricción (I, II, y III), forman parte de sistemas de restricción-modificación, estos sistemas hacen la función del sistema inmune en las bacterias. Cada enzima de restricción reconoce una diana, que también es reconocida por la enzima de modificación. Las enzimas de modificación son metiltransferasas que añaden grupos metilo a los nucleótidos de las dianas de restricción. Las restrictasas sólo reconocen la diana cuando ésta no está metilada. Cuando el ADN doble metilado en la diana de restricción se replica, se originan dos moléculas de ADN hemimetiladas, es decir, que sólo tienen metilados los nucleótidos de una cadena. En este caso las metiltransferasas metilan la cadena de nueva síntesis. En el caso de que un fago infecte a la bacteria, el ADN que introducirá no estará metilado, y por lo tanto será reconocido por las enzimas de restricción y será degradado. Por otro lado, existen fagos que no poseen dianas de restricción en su material genético, estos virus son por lo tanto resistentes a la acción de las enzimas de restricción. Se han descubierto más de 2.500 sistemas de restricción diferentes, y hay aproximadamente 300 enzimas de restricción comercializadas. El nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en:

1. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2. La cepa, si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli). 3. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.

De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se debe a: Nomenclatura

Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria co coli Especie de la bacteria R RY13 Cepa de la bacteria I La primera enzima

identificada Orden de identificación de la enzima

En cualquier caso, las dianas son siempre secuencias palindrómicas, esto es, secuencias de nucleótidos que son idénticas a su cadena complementaria cuando cada una es leída en la misma dirección química. 5'-GTATAC-3' |||||| 3'-CATATG-5' Secuencia de reconocimiento palindrómica El corte puede generar extremos romos o extremos protuberantes, según la enzima. Extremos romos: la enzima corta las dos hebras en el mismo punto.

5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' Extremos protuberantes: cuando el corte ocurre en puntos distintos en cada hebra. Pueden ser extremos protuberantes 5' o 3', según esté la región simplexa en el extremo 5' o en el 3' respectivamente.

5'---G AATTC---3' 5'---CTTAA G---3' 3'---CTTAA G---5' 3'---G AATTC---5' Extremos protuberantes 5’ Extremos protuberantes 3’ Los extremos protuberantes son cohesivos, es decir, pueden volver a ligarse si se restablecen los puentes de hidrógeno entres las bases nitrogenadas. Dos sistemas de restricción distintos pueden ser isoesquizómeros cuando ambos reconocen la misma diana de restricción o dianas muy parecidas, pero producen los mismos extremos cohesivos. Cuando se pretende obtener un alto grado de fragmentamiento del ADN se emplean enzimas de corte frecuente, que son aquellas enzimas que reconocen dianas de pocos pares de bases. Puesto que, una secuencia corta de nucleótidos aparecerá con más frecuencia en la molécula de ADN que una secuencia con muchos pares de bases. Pero las dianas de restricción no están distribuidas uniformemente en el ADN, sino que puede haber tramos con dianas muy próximas, y otros tramos que por azar casi no presenten dianas. Por ello, mediante estas técnicas no se puede obtener fragmentos de ADN del mismo tamaño.

Otras enzimas utilizadas en la producción de moléculas de ADN recombinante Enzimas de degradación Las enzimas de degradación que se usan en el laboratorio son nucleasas (exonucleasas y endonucleasas), son enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster. Es necesario valorar la enzima para determinar la concentración adecuada de enzima que hay que utilizar, ya que un exceso podría conllevar la degradación total del ADN que se esté estudiando. Las principales enzimas son: Exo λ: se trata de una enzima sintetizada por Escherichia coli cuando está infectada por el fago λ. Es una exonucleasa que degrada el ADN en dirección 5'→3', lo que da lugar a moléculas con extremos protuberantes 3'. Exo III de E. coli: es una exonucleasa presente en E. coli que degrada en sentido 3'→5', por lo que produce extremos protuberantes 5'. Actúa sobre moléculas de ADN intactas y también sobre sustratos mellados, es decir, sobre moléculas de ADN que presentan un espacio donde falta un enlace covalente, y por lo tanto tienen un extremo 3' sobre el que puede actuar la enzima. Exo VII de E. coli: enzima exonucleasa que utiliza moléculas simplexas como sustrato, es capaz de reconocer ambos extremos. Degrada el ADN simplexo en dirección 3'→5' y 5'→3', por lo tanto produce moléculas progresivamente más cortas. También es capaz de reconocer ADN semisimplexo, pero en tal caso sólo degradaría la parte simplexa de la molécula. Bal 31: es una enzima nucleasa que tiene actividad exonucleásica 3'→5' y origina extremos protuberantes 5'. También actúa como endonucleasa realizando cortes en el interior de la molécula de ADN. En el laboratorio esta enzima se usa para mutagenizar el ADN, ya que produce la deleción de los genes, esto es útil para determinar la parte codificante de dicho gen. Dependiendo del tiempo que esté actuando la enzima los fragmentos estarán más o menos delecionados. S1: enzima endonucleasa que corta extremos protuberantes en ambos sentidos.ADNasa I de E. coli: esta enzima puede actuar como endonucleasa tanto de cadena simple como de cadena doble. Si se trabaja con un tampón con Mg2+ la enzima corta solamente una de las dos cadenas, introduce mellas en la molécula de ADN. Pero ante la presencia de Mn2+ corta las dos cadenas en el mismo punto. En cualquier caso, siempre actúa sobre ADN duplexo. ARNasas: son enzimas endonucleasas que actúan sobre ARN monocatenario. Hay varios tipos: ARNasa A: rompe enlaces entre una pirimidina y otra base cualquiera. ARNasa T: rompe enlaces entre una guanina y otro nucleótido. ARNasa H: rompe sustratos híbridos ADN-ARN, por lo tanto, origina moléculas de ADN monocatenarias.

Enzimas de polimerización Son las ADN polimerasas y las ARN polimerasas. La mayoría de las enzimas de polimerización necesitan un molde para poder copiar, el molde puede ser una molécula de ADN o de ARN. Por ejemplo, las ADN polimerasas dependientes de ADN utilizan un molde de ADN, y las ADN polimerasas dependientes de ARN utilizan un molde de ARN. Además, estas enzimas también necesitan una cadena que proporcione un extremo 3' OH libre para formar el enlace fosfodiéster, esta cadena actúa como

cebador o primer. También se requieren los desoxirribonucleótidos trifosfato correspondientes para la síntesis de la nueva hebra. ADN polimerasa I de E. coli: participa en la replicación del cromosoma bacteriano corrigiendo los errores producidos. In vitro esta enzima tiene actividad polimerásica 5'→3', actividad exonucleásica 3'→5' (actividad correctora de pruebas) y actividad exonucleásica 5'→3'. La actividad correctora de pruebas permite a la enzima eliminar los nucleótidos mal apareados del extremo 3' de la cadena, y de este modo puede corregir sus propios errores. Y mediante la actividad polimerasa 5'→3' puede rellenar los huecos con los nucleótidos correspondientes. Al tratar la ADN polimerasa I con una proteasa específica se obtienen dos fragmentos de distinto tamaño. El polipéptido de mayor tamaño mantiene las actividades polimerásica 5'→3' y exonucleásica 3'→5', se denomina fragmento Klenow. Es útil para la investigación porque la actividad exonucleasa 5'→3' puede interferir en algunas aplicaciones experimentales al acortar los extremos 5' de las moléculas de ADN. El gen que codifica para el fragmento Klenow ha sido mutagenizado y se ha podido obtener un fragmento con actividad polimerasa 5'→3' solamente.YACs El cromosoma artificial de levaduras o YAC (yeast artificial chromosome) es el vector de clonación de mayor capacidad (hasta 2 Mb). Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura, portando un centrómero y telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras grandes secuencias de ADN, al comportarse como un cromosoma propio de este microorganismo eucariota. Son utilizados en construcción de genotecas genómicas, sin embargo, son más inestables que otros vectores como los BACs, que han acabado imponiéndose. Un problema que presentan los YACs es que el ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distintas del genoma. Los YACs contienen características de bacterias: – Origen de replicación (ori) de tipo plasmídico. – Gen marcador de resistencia a ampicilina (ampr).

Y características de levaduras: – Secuencia de replicación de levaduras (SRA). – Genes marcadores de selección: un gen TRP relacionado con el metabolismo del triptófano, y un gen URA relacionado con el metabolismo del uracilo. – Gen marcador de inserción sup, relacionado con el metabolismo de la adenina, interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS). Este gen identifica las células de levadura que incorporan el vector, ya que las células huésped que expresan

normalmente el gen sup muestran un color rojizo (sup+), mientras que las que presentan ADN recombinante adquieren un color blanquecino (sup–). – Centrómero (CEN), permite la segregación durante la división celular. – Dos secuencias teloméricas (TEL), procedentes de un ciliado del género Tetrahymena, pero que funcionan con las levaduras. Entre estas dos secuencias se sitúa una diana de restricción para la enzima BamHI. Procedimiento de clonación: se digiere el vector y el ADN que se quiere clonar con la misma restrictasa, o con restrictasas isoesquizómeras, para que ocurra el ligamiento entre ambas moléculas. Para que el vector se comporte como un cromosoma más de

la levadura hay que linealizarlo, mediante el uso de la enzima de restricción que reconoce la diana que se encuentra entre las regiones TEL, dejando, de este modo, funcionales las secuencias teloméricas. Los YACs se introducen en el interior de levaduras para que ocurra la clonación del ADN recombinante, pero también se pueden introducir en bacterias, pues poseen un origen de replicación de procariotas.