Aplicaciones de la PCR enfermedades - unizar.es · 1 Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de...

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Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería:

enfermedades hereditarias y no hereditarias

Inmaculada MartInmaculada Martíín n [email protected]@unizar.es

Enfermedad genéticaDesviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas

2

¿Cómo reconocerlas?

Historia familiar – análisis de pedigríes:

Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero

Reconocimiento del modo de herencia

Control de filiación

¿Cómo reconocerlas?Epidemiología de la enfermedad

Aparición de casos puntualesAparición en estirpes

Análisis de pedigríes

Determinación del tipo de herencia

3


Examen físico:Buscar cambios estructurales, fenotipos característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.


Examen laboratorial:Estudios bioquímicos, inmunológicos, citogenéticos y de genética molecular.

4

Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria

Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente

Factor genético1. Enfermedades (o rasgos) monogénicas:

• Con herencia mendeliana más o menos regular• Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc.

2. Enfermedades de herencia multifactorial1. Poligénicas2. Monogénicas con importante componente ambiental

3. Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías)1. Se detectan al microscopio2. Se originan en la meiosis3. No heredables o herencia irregular4. Afectan a muchos genes cuadro grave, muchos letales

Caracteres Mendelianos

Online Mendelian Inheritance in Animals: http://omia.angis.org.au/

395972131135149215229280Modelo en animales

292538689770136126224Modelos humana

3722171513244368Caracterizados a nivel molecular

1310726829354775131Monogénicos

4970179186193215280376489Fenotipos totales

ConejoCabraPolloOvejaCaballoCerdoGatoVacaPerro

20/01/09

5

Enfermedades en bovino

CVM (malformación vertebral compleja)BLADDUMPSHIPERTROFIA MUSCULAR “hm”MULEFOOT O SINDACTILISMOCITRULINEMIA

http://www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef/facts/93-007.htm

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

BLADBLAD

6

VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL

BLAD GROBET y cols. (1992)

"Enfermedad autosómica

recesiva que afecta a descendientes del toro holstein O. Ivanhoe, abuelo paterno de

C. M. Ivanhoe Bell "

VI JORNADASPRODUCCION ANIMAL

Difusión rápida de enfermedadeshereditarias (con frecuencia baja)17% Mejores toros de EEUU y

Canada son portadores de BLAD

HOLSTEINIZACION

ESPAÑA

MOET IA

Shuster y cols. (1992)

7

VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBLAD

Un gen autosómico letal recesico

Ganado vacuno Holstein

BASE MOLECULAR:

Deficiencia de la proteína Mac-1(Complejo CD 11B/CD18)

Leucocitos no pueden trasportarse desde lasangre a lugares de infección

BTA 1 (U 10)

CONTROL:

AFECTA:

LOCALIZACION:

VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBLADBLAD

SINTOMAS

Muerte de las 7 semanas a los 8 meses

FiebreDiarreas

UlceracionesGingivitisAnorexia

Retraso creto.InfeccionesPneumonia

Ganglios grandes

LESIONES

*Necrosis ganglionar*Riñones atroficos

*Serositis en rumen*Enteritis ulcerativa

*Ausencia de neutrofilos en tejidos blandos*Hiperplasia de foliculos linfoides*Edema en áreas paracorticales

*Congestión esplénica*Vasos dilatados

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Alteraciones del complejo

CD11/CD 18

VACUNO BLAD

HUMANA LAD

PERRO "Sindrome de

granulopatía canina

VI JORNADASPRODUCCION ANIMALBASE MOLECULAR

Dos mutaciones

Silente

Sustitución en la posición 128de A por G

(Glicina por Ac. Aspártico) D128G

ALTERACION DE LA PROTEINAMac1 (CD 11/CD 18)

Secuencia anómala del gen CD18:Defecto de expresión del CD18

Falta subunidad α en laintegrinaβ2

Alelo raro "D128G"

9


FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18OLIGONUCLEOTIDOS:

CONDICIONES DE AMPLIFICACION:94º C., 10'

Desnaturalización 94º C.. 15"HibridaciónElongación 69º C., 20"35 x

VISUALIZACION DEL FRAGMENTO:Gel de agarosa al 4 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)

Desnaturalización previa

DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION:Taq I 65º C.Hae III 37º C.> 4 horas

VISUALIZACION DEL PRODUCTO DIGERIDO:Gel de agarosa al 5 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)

5' TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3'5' GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG3'

VI JORNADASPRODUCCION ANIMALAMPLIACION POR PCR:

58 bp del gen CD18

D128/D128 :

HeterocigotosSanos, portadores

Homocigotos recesivosEnfermos

Homocigotos dominantesSanos, no portadores

3 GENOTIPOS

D128/D128G :

D128G/D128G :

10


G G C C T C G A C C

G G C C T C G G C C

7 bases 13 bases

7 bases 13 bases

30 bases

28 bases

8 9 10 11 25 26 2827

8 9 10 11 25 26 2827 29 30

Hae III

Hae III

Taq I

Hae III

19 bases9 bases

9 bases 49 bases

25 bases 33 bases

58 bases (Taq Ino encuentra secuencia de corte)

Alelo MUTADO (D 128 G)

Secuencia reconocida porTaq I Secuencia reconocida porHae III

Lugar de corte de Taq I Lugar de corte de Hae III

Fragmento originado por digestión con Taq I Fragmento originado por digestión con Hae III

Leyenda

* La mutación se produce en labase 28

Alelo NORMAL(D 128)


T H N

T H N

T H N

19 bp

9 bp

25 bp 30 bp 33 bp

49 bp

58 bp

+

_

Individuo NORMAL (TL) D 128 / D 128

Individuo PORTADOR (BL) D 128 / D 128 G Individuo ENFERMO D 128 G / D 128 G

T: DNA digerido con Taq I H: DNA digerido con Hae III N: DNA no digerido

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DIAGNOSTICO DE BLAD

Diagnóstico: PCR + Taq I

G/G D/GD/GD/GD/G D/D


DIAGNOSTICO COLECTIVO

" A partir de la muestra recogida de un tanque lechede una explotación, conocer de forma rápida y

económica la existencia de hembras portadoras "

Método PCR detecta: " Presencia de un portador enuna muestra de un tanque de leche correspondiente al

ordeño de 40 hembras "

12

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

SSPSSP

DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)

$

13


MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina

Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado)

HerenciaAutosomica

recesiva


DETECCIÓN POR LIGAMIENTO- Halotano- Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)

14


C

199bp

PCR199bp

T 165bp 34bp

BsiHKA I

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Diagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias

Susceptibilidad/ResistenciaSusceptibilidad/ResistenciaGenéticaGenéticaScrapieScrapie

Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:

EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino

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ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

- hereditaria- esporádica- infecciosa

AnimalesHumanas

KuruEnfermedad de Creutzfeld-JakobInsomnio Familiar Fatal

Encefalopatía Espongiforme BovinaEnfermedad Transmisible del VisónSCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino

Susceptibilidad genética

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES

Depósitos de PrPSc Pérdida neuronal y gliosis

Espongiosis Vacuolización

18

Encefalopatías Espongiformes Transmisibles

Agente causal de tipo infeccioso

PrP (Proteína Prión)

PrPC PrPSc

Cambio de conformación

Proteína sensible a proteasas Proteína resistente a proteasas

depósito en tejidos celulares

Sistema linfoide SNC

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

GEN PRNP (Proteína prión)

• Secuencia muy conservada en un gran número de especies (230-256 aa)

• Alto grado de polimorfismo

relacionado conSUSCEPTIBILIDAD

Período de incubación(humano, ovino ycaprino)

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Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:


Implicaciones genéticas de las EETsNPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental

Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.

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Implicaciones genéticas de las EETs

Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie.

NPU:

sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo)

Dickinson (1968):Gen “sinc” (Scrapie incubation): Estudios experimentales en ratones.

Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A)

s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)

Implicaciones genéticas de las EETs

La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie.Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón.Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanasEn ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP .Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad

Gen de la proteína prión (PRNP):

21

Factores genéticos de las EETsImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:


Gen PRNPLongitud 16-22 kpb:

2 o 3 exones según la especie

Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb)

Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie

Altamente conservado entre especies.

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Gen PRNP

ORF 3’UTRExon1 Exon2 Exon3

Proteína PrP murina

Péptido señal

Repet. octapéptidos

1 23 51 90 231 254213178

196180

S S UniónGPI

CHO CHO

Proteína PrP humana

1 245

Http://www.errnm.cbcu.carn.ac.uk

Gen PRNP

23

Gen PRNPIdentificación y localización del gen PRNPEspecie Localización Especie Localización

Bos taurus 13q17 Homo sapiens 20pter-p12

Bufalus bufalis 14q15 Mus musculus 2

Cervus elaphus 2 Ovis aries 13q15

Capra hircus 13q17 Rattus norvegicus 3q35

Equus caballus 22 Vulpes fulva 14

Gen PRNPHomología de secuencia

Humano vs BovinoHumano vs OvinoBovino vs Ovino

66.7 %65.4 %94.0 %

Prusiner (1998)

24

Gen PRNP

Mutaciones puntuales:

Inserciones y delecciones de octapéptidos

GTC GCC Val Ala

PHGGGWGQ

Polimorfismos

Gen PRNP

Prusiner (1998)

Polimorfismos

25

Factores genéticos de las EETsImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:


Genética de las EETs humanas

• Polimorfismo más importante: Codón 129

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

Met/MetVal/Val

Susceptibilidad

http://www.bse.org.uk/report/volume2

26

Genética de las EETs humanasEnfermedad de Creutzfeldt-Jakob

• Mutación más común en el codón 200

- Sustitución de Lisina por Glutamina

- 70% de familias

• Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente

Familiar



27





28


Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

• Hipótesis muy probable:

Se produce una mutación somática del gen PRNP

en un número muy reducido de células.

Esporádica

Factores genéticos de las EETsIntroducciónImplicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de abasto:


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Genética de las EETs en ratón

Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino

Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie.Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano.Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.

Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs

QTL: Quantitative Trait LociCaracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes.

El periodo de incubación es un carácter cuantitativoEl ratón como animal modelo:

Razones económicasControl del manejoDisponibilidad de líneas consanguíneas con periodos de incubación muy distintos.

Loyd et al. (2001)

30

Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs

CAST/Ei NZW/OlaHsd CAST/EiNZW/OlaHsd

F1

F2

Loyd et al. (2001)

Genética de las EETs en ratónAnálisis de la F2:• Inoculación intracerebral con scrapie• Determinación del periodo de incubación (1000 anim)• Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma)• Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación.

Chr. 2

Chr. 11

Chr. 12

Loyd et al. (2001)

Otros QTLs:Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001)

Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad

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Genética de las EETs en ovinoGen PrP ovino

Tamaño del gen 20kpbProteína de 256 aaHomología con bovino (94%)

Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ≠ de la ovina en 7 u 8 posiciones

Localización: 13 (13q17/18)

32

INTRODUCCIÓN

GEN PRNP OVINO

• Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007)

Codones136154171

SCRAPIE CLÁSICO

Codón141

SCRAPIE ATÍPICO (Nor98)

4 codones asociados a susceptibilidad

En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro: M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K(Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007;

Bossers y cols., 2000)

Efecto protector

Estudios de los diferentes codones según la

raza

Codón 136VV136 SusceptibilidadAV136 SusceptibilidadAA136 SusceptibilidadAA depende de la raza:

CheviotIle de FranceFlemishSwifter

ResistenciaSwaledaleTexelLacauneRomanov

Susceptibilidad

Genética de las EETs en ovino

33


Estudios de los diferentes codones según la raza

Codón 154

Codón 171

RR154 No determinadoRH154 Cierta resistenciaHH154 Resistencia

QQ171 ResistenciaQR171 ResistenciaRR171 Resistencia 1 Suffolk en Japón


Definidos los codones se establecen las posibles variantes

A R R

A H Q

A R H

A R Q

V R Q

Cierta resistencia

Cierta susceptibilidad

Susceptibilidad

34

Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a

la enfermedad se definen 5 categorías de riesgo:

R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie

R2: Riesgo bajo individual y de la progenie

R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del

otro parental

R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que

R5: El mayor riesgo a scrapie



Riesgo 4ARQ/ARQARR/VRQ

Riesgo 5ARQ/VRQVRQ/VRQ

Riesgo 3ARR/ARQRiesgo 1ARR/ARR

Categoría de riesgoGenotipo

Razas: Charolaise y Blue de Maine

35


Razas: Bluefaced y Leicester

Riesgo 2ARR/AHQAHQ/AHQ

Riesgo 4ARR/ARQARQ/ARQ

Riesgo 5ARQ/ARQ

Riesgo 1ARR/ARR

Categoría de riesgoGenotipo


¿Qué sucede en nuestras razas?

Comunidad Autónoma de Aragón

¿Qué sucede en los animales con scrapie

pertenecientes a nuestras razas?

¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?

36

* Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas:

Rasa Aragonesa.Ojinegra.Cartera.Maellana.Ansotana.

* Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP.

Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés

Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol

Material y Métodos- Razas estudiadas :

Rasa Aragonesa. (4 Rebaños)Ojinegra. (4 Rebaños)Cartera. (2 Rebaños)Maellana. (2 Rebaños)Ansotana. (1 Rebaño)

- De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras.

- Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit.


37

- Condiciones de la PCR:

0,20,2mMmM0,250,25CebadorCebador--RR

0,2mM0,2mM0,250,25CebadorCebador--FrFr

------2525HH22O hasta O hasta

1,5mM1,5mM0,750,75ClCl22MgMg

120120mMmM2,42,4dNTPsdNTPs

1X1X2,52,5Tp10XTp10X

ConcentraciConcentracióón n finalfinal

Volumen / Volumen / ReacciReaccióónn

((mlml))

Componentes de la Componentes de la reaccireaccióónn

94ºC 5min

72ºC 5min

94ºC 30secTaºC 30sec72ºC 1min

(x40)

Material y Métodos


* Codones 136 y 154 con BspHI. (O’Doherty et al., 2000)

* Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999)

- PCR/RFLPs:

- SECUENCIACIÓN:

* Amplificación de toda la región codificante.

- F: 5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3’- R: 5’-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3’

* Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación.

Material y Métodos


38

Resultados

136 y 154

171

- PCR/RFLPs:

368241179+189

AR AH VR

127

R Q/H

918160

PCR

PCR171

R/Q H PCR171149125

PC

RA

RR

/AR

RA

RR

/AH

Q

AH

Q/A

HQ

AR

R/A

RQ

AR

Q/A

HQ

AR

R/A

RH

AH

Q/A

RH

AR

Q/A

RQ

AR

Q/A

RH

AR

Q/V

RQ


Resultados

R1

R2

R3

R4

R5

Ansotana Cartera Maellana

Ojinegra Rasa Aragonesa

44%31%

15%39%

47%

14%6% 4%

26%

48%

26%

83%

12%2.5% 2.5%

72%

24%

2% 2%

Porcentaje de animales según su nivel de riesgo

Susc

eptib

ilida

d

–

+

R. Aragonesa:46 ARQ/ARQ2 ARR/ARQ

Acín et al. (2004) Vet Rec

Scrapie


39

Resultados

* Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171.

* Se detectaron polimorfismos en 14 codones.

* Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina:

101 (Q R)151 (R G)151 (R H)172 (Y D)175 (Q E)

- SECUENCIACIÓN:

* Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs.

Codon 171


Conclusiones

* Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie.

* El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono.

* La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros.

* La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos.


40

POLIMORFISMOS DEL GEN PRNPEN OVINO MARROQUÍ

Serrano et al. (2007) Vet Rec

MATERIAL Y MÉTODOS

OVINO MARROQUÍ: 154 animales• Animales

89 D’man 43 Boujâad 22 Sardi

• Extracción de DNA de sangre enteraGenomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare)

• Amplificación por PCRFragmento de 768 pb: región codificante de PRNP

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí


41

--

0,05U/µl

100-500ng

0,2

0,2

1,5120µM

1X

Concentración final

0,5Taq polimerasa (5U/ml)

2DNA

0,5Cebador-R (20mM)5’-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3’

0,5Cebador-F (20mM)5’-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3’

50H2O milliQ hasta

1,5Cl2Mg (50mM)4,8dNTPs (1,25mM)5Tampón 10X

Volumen (µl)Componentes

PROTOCOLO de PCR

Programa

94ºC 2min

94ºC 15seg60ºC 15seg72ºC 20seg72ºC 5min

x 30 ciclos

Purificación del producto de PCR

ExoSAP-IT (USB)

SECUENCIACIÓN

MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en ovino marroquí


Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes)

• Optimización de la reacción de secuenciación

4H2O milliQ

1Cebador-F / R (3,2mM)

10TOTAL

1Producto PCR4Mix (Big Dye)

Volumen / Reacción(ml)Componentes

Programa 96ºC 1min

96ºC 10seg50ºC 5seg60ºC 4min

x 25 ciclos

Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización

ABI PRISM 3100

MATERIAL Y MÉTODOS

• Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas



42


Electroferogramas de los fragmentos DNA Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit)

CGT CAT (His Arg)

Raza D’man

Codón 114

Codón 146

AAT AGT (Asn Ser)

Raza Boujâad

171 176

114

146

Nuevo

Nuevo

10 polimorfismos conocidos(112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237)

RESULTADOS

silentes


Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos relacionados con susceptibilidadFrecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171

ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD

ARR CIERTA RESISTENCIA

ARQ/ARQ

ARR/ARQ

SUSCEPTIBILIDAD

(razas mediterráneas)

(Mutaciones en codón 171)Haplotípicas Genotípicas


0

20

40

60

80

Boujâad D'man Sardi

Frec

uenc

ia (%

) ARQARRARH

0102030405060

Boujâad D'man Sardi

Frec

uenc

ia (%

) ARQ/ARQARR/ARQARR/ARRARH/ARQ

43

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS• Otros polimorfismos Frecuencias alélicas

228943Total

2.32.252.35KAAA97.797.7597.65NAAC176

017.950DGAT10082.05100YTAT172

001.17SAGT10010098.83NAAT1462.37.8517.5RCGT

97.792.1582.5HCAT1434.5019.8FTTT

95.510080.2LCTT14102.80RCGT

10097.2100HCAT1142.31.70TACG

97.798.3100MATG112

SardiD’manBoujâadAminoácidoSecuenciaCodón

NUEVO

NUEVO(Acín y cols., 2004)

Nor98


438922Total2.332.252.27ARQK176

-17.98-ARQD172

1.16--AS146RQ17.447.874.54AR143RQ19.77-4.54AF141RQ

-2.80-R114ARQ-1.682.27T112ARQ

25.5841.5754.55ARQ3.49--ARH

30.2325.8531.83ARRBoujâadD’manSardiHaplotipos

10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS

Frecuencias haplotípicas


44

Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas

africanas

Gran variabilidad genética

Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda)

Las mutaciones detectadas aparecen también en otras

razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de

las migraciones desde el continente africano

Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS Y DISCUSIÓN




45

GEN PRNP CAPRINO

INTRODUCCIÓN

• 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante(Acutis y cols., 2008)

• 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie:

I142MH154RW102G + 3 repeticiones de octapéptidos

Período de incubación(Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006)

Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols., 2007;Vaccari y cols., 2006)

H143RN146S y N146DQ222K

• Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC)

POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS MARROQUÍES

Serrano et al. (en prensa) An Genet

46

CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales

MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en caprino marroquí

80 D’man 57 Chaouni

• Animales

• Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1)

• Análisis estadístico: GENEPOPARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas)

• Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específicaSecuenciación


Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS

145

138 139

101

Análisis de electroferogramas (BioEdit)3 NUEVAS MUTACIONES

AGCAGG (Arg Ser)

D’man

Codón 139

Codón 145

GGC GAC (Gly Asp)

Chaouni y D’man

CGG CAG (Gln Arg)

D’man

Codón 101

10 polimorfismos conocidos


47


• Nuevas mutaciones

98.8100RAGG

98.1100QCAG101

0.61.8DGAC99.498.2GGGC145

1.90RCGG

1.30SAGC139

8057Total

D’manChaouniAminoácidoSecuenciaCodón

Frecuencias alélicas

Frecuencias bajas (< 2 %)


Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos conocidos

4041.2STCC240 6058.8PCCC

99.499.1IATA142 0.60.9MATG77.574.6RCGT154 22.525.4HCAT98.898.2QCAG222 1.31.8KAAG

97.595.6MATG137

10098.2GGGC127 01.8SAGC

2.54.4IATA

8057Total

07VGTG10093GGGG37

D’manChaouniAminoácidoSecuenciaCodón

Frecuencias alélicas

CIERTA RESISTENCIA

FRECUENCIAS INTERMEDIAS

Serrano et al (en prensa) An Genet

48


• Mutaciones silentes:

Codón 181: GAC GAT (Asp) (1.8% en raza D’man)

Codón 42:

Codón 138:

CCA CCG (Pro)

AGC AGT (Ser)

LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC)

(Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007)


CC CCAGCodón 42 Codón 240Codón 138

CCA TCCCA/GG AGCAGG/C GG/AC CG/AT

Codón101

Codón 139

Codón145

Codón 154

GGT(PrP) Rev

42 240138101 139 145 154

PCR alelo-específica

Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí

PP240 PS240 SS240

Secuenciación (cebador específico- S240)

139138

Heterocigotos

Serrano et al (en prensa) An Genet

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• Determinación de haplotipos PCR alelo-específicaS240

P240

1.31.8SKRGIRMGQG1211.910.5PQHGIRMGQG111014.9SQHGIRMGQG100.61.8SQRDIRMGQG90.60.9PQRGMRMGQG81.30PQRGISMGQG72.54.4PQRGIRIGQG601.8PQRGIRMSQG5

1.90PQRGIRMGRG407SQRGIRMGQV3

43.741.1PQRGIRMGQG226.215.8SQRGIRMGQG1

D’manChaouni24022215414514213913712710137Haplo

Frecuencias haplotípicas17 Estimados

(ARLEQUIN)

10 Chaouni13 D’man

12 haplotipos (3 nuevos)

28 genotipos diferentes

(4 no reales)Serrano et al. (en prensa) An Genet

Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas

Gran variabilidad genética

Cierta resistencia a scrapie (H154)

Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas deItalia y Grecia

Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí

RESULTADOS Y DISCUSIÓN


50

Genética de las EETs en bovino

Secuencia aminoacídica de la PrP bovina ≠ de la ovina en 7 u 8 posiciones.Polimorfismos:

22 mutaciones silentes12 cambios aminoacídicosRepeticiones de octapéptidos

5 copias (5/5).6 copias (6/6). El más común5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto).

Gen PrP bovino

Sin relación con la susceptibilidad a

BSE

Genética de las EETs en bovinoPosible control genético:

Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC:

23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58

12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT.

Forma atípica: USA 2006:

E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria

¿Otros genes?

Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002);

BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).

51

Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:No HereditariasNo HereditariasLeishmaniosisLeishmaniosis

ENFERMEDADES ENDEMICAS

SALUDImpacto económico y social

Diagnóstico precoz

SALUDImpacto económico y social

Diagnóstico precoz

PROTOZOOS del género LeishmaniaEnfermedad que afecta al hombre y perroZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON(OMS indicadora de SIDA)

Riesgo calidad de vida - SaludMorbilidad y mortalidad

52

LEISHMANIOSIS

Presencia de factores ecológicos:VECTORES

RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO

Presencia de factores ecológicos:VECTORES

RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO

TECNICAS CLASICASObservación microscópica en ganglio o médulaMétodos serológicos:IFI

NUEVAS TECNICASReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Diagnóstico problemático

PCR

SENSIBLE

ESPECIFICA

ECONOMICO

EFICAZ

Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias

Kinetoplastos:Pequeños círculos de DNA con genes repetidos

SSUrRNA

18SrRNA

Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei,

Trypanosoma cruzi, ...

53

Comparar-Zona candidataSecuencias hospedador: humano y perroSecuenias del vector: artrópodoSecuencias del Kinetoplasto: parásito

Diagnóstico directo del agente etiológico:Diferenciar portadores, enfermos y sanos

PCR

Ampliación del DNA

94ºC --- 5'94ºC --- 1'60ºC --- 1'72ºC --- 1'72ºC ---10'4ºC --- hasta recoger muestra

Termociclador 9600 Perkin Elmer

35 ciclos

muestra 15μl.

54

ACTIVIDADES REALIZADAS

Análisis de los fragmentos amplificados

Comprobación: Digestión con enzimas de restricción - RFLP Comparar modelos de Leishmania con bibliografía Evitar falsos positivos: - Análisis de un animal sano - Control negativo ( muestra sin DNA) - Control positivo (DNA de enfermo) - Control de DNA (en muestras de amplificación -)

Electroforesis horizontal gel agarosa 2% Tinción:Bromuro de Etidio - UVA

Fragmento de 603 bp

DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA

Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces

Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre.

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