BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS

Acta biol. Colomb., Vol. 14 No. 1, 2009 55 - 86

BIODEGRADACIN DE COMPUESTOS ORGNICOSPERSISTENTES (COP): I. EL CASO DE LOS BIFENILOS

POLICLORADOS (PCB)

Biodegradation Of Persistent Organic Pollutants (POPs):I The Case Of Polychlorinated Biphenyls (PCB)

ZIV ARBELI1,2*1Direccin de Desarrollo Sectorial Sostenible, Ministerio de Ambiente,Vivienda y Desarrollo Territorial, Calle 37 No 8-40, Bogot, Colombia.2Facultad de Agronoma, Universidad Nacional de Colombia. SedeBogot, A.A. 14490; Bogot, D.C., Colombia. [email protected]*Direccin actual: Unidad de Saneamiento y Biotecnologa Ambiental,Departamento de Biologa, Pontifica Universidad Javeriana.

Presentado 31 de mayo de 2008, aceptado 10 de diciembre de 2008, correcciones 21 de enero de 2009.

RESUMEN

Los contaminantes orgnicos persistentes poseen propiedades txicas, son resistentesa la degradacin, se bioacumulan y son transportados por el aire, el agua y las espe-cies migratorias a travs de las fronteras internacionales; en consecuencia se de-positan lejos del lugar de su liberacin, acumulndose en ecosistemas terrestres yacuticos. Para atender a esta problemtica a nivel mundial se firm el 23 de mayode 2001 el Convenio de Estocolmo. Aunque por ahora los COP estan prohibidos enla mayoria de los pases, todava existen en el mundo muchos sitios contaminadoscon estas sustancias. La remediacin de sitios que presentan contaminantes orgni-cos persistentes requiere consideraciones distintas a las contempladas en la recupe-racin por contaminacin de hidrocarburos. El siguiente texto revisa la literaturasobre la biodegradacin anaerbica y aerbica de los bifeniles policlorados (PCB) ylas posibles estrategias para estimular dicha biodegradacin. La degradacin de losdems COP ser descritas en textos adicionales.

Palabras clave: contaminantes orgnicos persistentes (COP); bifeniles policlorados(PCB); biodegradacin; biorremediacin.

ABSTRACT

Persistent organic pollutants are chemicals that are toxic to humans and wildlife, remainintact in the environment for long periods, accumulate in living organisms and canbecome widely distributed geographically by air, water or migrating species. As a result,these contaminants have been found all over the world including in places, such as thePolar Regions, which are very far from their application site. The Stockholm Conventionwas signed in 23/5/01 in order to cope with this international environmental problem.

Although POPs were banned by most countries, there are still a lot of sites contaminatedwith these substances. The remediation of these sites is problematic and requiresdistinct considerations from those which are established for hydrocarbon remediation.This manuscript reviews the literature about anaerobic and aerobic biodegradation ofpolychlorinated biphenyls (PCB) and possible strategies to stimulate these processes.The degradation of the other POPs would be reviewed in additional texts.

Key words: Persistent organic pollutants (POPs); Polychlorinated biphenyls (PCB);Biodegradation; Bioremediation.

INTRODUCCIN

Los Contaminantes Orgnicos Persistentes (COP) son un grupo de sustancias sint-ticas de alto riesgo para la salud humana y el medio ambiente. Estas sustancias hansido encontradas alrededor del mundo, incluidas algunas zonas muy alejadas deaquellas en donde se emplearon tales contaminantes, e.g. las zonas polares, ademsde poblaciones humanas e, incluso, en la leche materna (MacDonald et al., 2000;Polder et al., 2003; She et al., 2007). Para atender esta problemtica a nivel mundial,se firm el 23 de mayo de 2001 el Convenio de Estocolmo. En el texto del conveniose describen las propiedades de los COP de la siguiente forma: los contaminantesorgnicos persistentes tienen propiedades txicas, son persistentes a la degradacin,se bioacumulan y son transportados por el aire, el agua y las especies migratorias, atravs de las fronteras internacionales y depositados lejos del lugar de su liberacin,acumulndose en ecosistemas terrestres y acuticos (Convenio de Estocolmo:http://www.pops.int/documents/convtext/convtext_sp.pdf).Hasta ahora, las caractersticas de los COP incluidos en el Convenio de Estocolmo(esto es, PCB, dioxinas, furanos, aldrina, dieldrina, DDT, endrin, clordano, hexaclo-robenceno, mirex, toxafeno y heptacloro) responden a patrones muy similares, puesse trata de molculas orgnicas cclicas cloradas; 11 de stas son policclicas. Por lotanto, es posible realizar muchas generalizaciones sobre su degradacin y compor-tamiento ambiental. No obstante, entre los candidatos a COP que se estn discu-tiendo en estos momentos se encuentran sustancias con propiedades diferentes. Elcaso ms llamativo es el del sulfonato de perfluorooctano (PFOS), no lipoflico, dis-persable en agua por su capacidad tensioactiva, y que no se bioacumula en los tejidosgrasos, sino mediante la unin a protenas con una distribucin muy diferente a la delos COP considerados hasta el momento. Evidentemente, la evaluacin de estasustancia requiere un modelo conceptual muy diferente al de los COP incluidos hastala fecha (MAVDT, 2007a).En los ltimos aos se han adelantado en Colombia algunas actividades relacionadascon los COP, entre las cuales se encuentra la prohibicin de produccin y uso dealdrin, dieldrin, endrin, mirex, toxafeno, hexaclorobenceno (HCB), DDT, heptacloro yclordano; se elaboraron inventarios de su existencia (MAVDT, 2007b; MAVDT,2007c; MAVDT, 2007d); estudios sobre sus posibles efectos en la salud (MAVDT,2007e) y anlisis socio-econmico sobre la implementacin del Convenio deEstocolmo en Colombia (MAVDT, 2007f). A partir de estos inventarios, actualmente

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se est desarrollando el Plan Nacional de Aplicacin del Convenio de Estocolmo enColombia.La problemtica colombiana relacionada con los sitios contaminados con estas sus-tancias est muy ligada al uso intensivo de plaguicidas y al manejo de transfor-madores elctricos. El manejo inadecuado como consecuencia de la falta de cono-cimiento sobre su toxicidad y la carencia de normas y controles adecuados, puedeconllevar a problemas de contaminacin ambiental. En el campo agrcola grandescantidades de plaguicidas se han tornado obsoletos, debido a la reduccin del reasembrada de ciertos cultivos (por ejemplo, el caso del algodn), y a la prohibicin deluso de algunos plaguicidas organoclorados. Estos plaguicidas fueron abandonados oenterrados, y posiblemente han contaminados las reas en donde se encuentran. Deigual forma, el manejo inadecuado de transformadores elctricos o aceites dielc-tricos contaminados con PCB en talleres de mantenimiento y en bodegas de almace-namiento son la causa de contaminacin en el sector elctrico. No obstante lo ante-rior, en el pas an no se ha abordado con suficiente rigor un inventario que incluyaanlisis qumico de suelos, sedimentos o cuerpos de agua para la verificacin de sitiossospechosos por contaminacin de COP.Por su naturaleza, los compuestos orgnicos persistentes son dficiles de degradar. Labiodegradacin, que para muchos contaminantes es el principal mecanismo dedegradacin, es limitada en el caso de los COP. La dificultad de degradacin de COPse atribuye a su estructura qumica estable (gran tamao molecular y alto nmero decloros), a su carcter xenobitico y a su baja biodisponibilidad, dada su baja solubi-lidad en agua y fuerte adsorcin al suelo (Hatzinger y Alexander, 1995; Focht, 2003).Por lo tanto, el xito de la bioremediacin para tratar compuestos de tipo COPtodava es limitado. Por ello, las tcnicas ms usadas en el control de la contamina-cin por estos compuestos son la incineracin, la excavacin y disposicin en rellenossanitarios de seguridad y el aislamiento del contaminante en el sitio, mediante capasque eviten o disminuyan su dispersin y su contacto con organismos del tope de lapirmide trfica (Layton et al., 1998; EPA, 2000; Magar, 2003; Ross, 2004). En Colombia hay varias firmas con considerable experiencia en caracterizacin yremediacin de sitios contaminados. Sin embargo, esta experiencia se basa principal-mente en hidrocarburos. La remediacin de sitios contaminados con COP se ha con-vertido en un reto en Colombia y en el exterior. El objetivo del presente documento esla revisin de procesos biolgicos de degradacin de bifenilos policlorados (PCB)(Fig. 1). Este grupo de molculas se compone de 209 diferentes congneres de acuer-do a la cantidad y posicin de los tomos de cloro y fueron utilizadas ampliamenteen la industria en transformadores condensadores, intercambiadores de calor, siste-mas hidrulicas, tintas, pinturas y lubricantes, entre otros (MAVDT, 2007d). La de-gradacin de los dems COP ser descrita en un artculo adicional.

MECANISMOS DE DEGRADACIN DE MOLCULAS HALOORGNICASLos COP se consideran compuestos xenobiticos (que fueron sintetizados por primeravez por el ser humano) y, por lo tanto, que son forneos del medioambiente y la micro-biota. Sin embargo, en los ltimos aos se ha encontrado que ms de 3.000 molculasrganocloradas se producen naturalmente por organismos tales como bacterias, hon-

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gos, insectos, organismos marinos, plantas y mamferos, as como tambin, medianteprocesos abiticos tales como actividad volcnica e incendios forestales (Gribble, 2003;Haggblom y Bossert, 2003; Meharg y Killham, 2003; van Pe y Unversucht, 2003). Deesta forma, en los microorganismos han evolucionado varios mecanismos para la de-gradacin de compuestos organoclorados (Fetzner, 1998; Haggblom y Bossert, 2003;van Pe y Unversucht, 2003). De hecho, se considera que la degradacin microbiana dedichos compuestos es el mayor mecanismo que previene su acumulacin en el am-biente. En este sentido, se puede hablar de ciclos biogeoqumicos de compuestos orga-noclorados, de la misma forma como se habla del ciclo del carbono o del ciclo delnitrgeno etc., (Haggblom y Bossert, 2003). No obstante, en el ltimo siglo, la produc-cin industrial de compuestos haloorgnicos increment dramticamente la carga y lavariedad de dichos compuestos en el planeta. Mantener esta tendencia y no compen-sarla con el incremento de la taza de degradacin, ocasionar acumulacin de dichoscontaminantes, con el consecuente incremento de los riesgos para la salud humana y elmedio ambiente. Esta situacin es especialmente preocupante en los casos de lasmolculas ms resistentes para la biodegradacin como los COP. Ahora bien, son conocidas numerosas bacterias y hongos que pueden degradarcompuestos haloorgnicos en diversas rutas metablicas bajo condiciones aerbicasy anaerbicas. La biodegradacin de molculas haloorgnicas ocurre, por suerte, conenzimas no especficas (co-metabolismo) o mediante enzimas altamente especficasque tienen como fin el de aprovechar tales molculas como fuente de nutrientes y/oenerga que aportan al crecimiento de dichos microorganismos (Alexander, 1999). En el co-metabolismo el papel natural de la enzima de degradacin es el metabolismode otra molcula (normalmente no contaminante), pero, dada la baja especifidad dela enzima, afortunadamente esta podra degradar contaminantes con estructurassemejantes. Normalmente este proceso es lento, no completo (degradacin parcial)y adems, los microorganismos que lo realizan no se benefician de tal proceso. Porel contrario, tal proceso podra ser inhibitorio para los microorganismos, dado quela enzima puede estar ocupada con el sustrato equivocado (inhibicin competitiva)o el producto de la reaccin ser txico (Ensign et al., 1992; Mars et al., 1998; vanHylckama Vlieg y Janssen, 2001). A pesar de la ineficiencia del co-metabolismo, aveces se usa este tipo de reacciones en biorremediacin a nivel de campo, siempre ycuando no exista una mejor opcin. Los dos ejemplos ms importantes de procesosde co-metabolismo de contaminantes haloorgnicos son la oxidacin de solventesclorados como PCE y TCE, y de bifenilos policlorados (PCB; Alvarez-Cohen y Speitel,2001; Arp et al., 2001; Pieper, 2005). En otros casos el contaminante puede servir a los microorganismos como una fuentede uno o ms elementos esenciales para su crecimiento (carbono, nitrgeno, fsforo,

Figura 1. Estructura qumica de PCB.


o energa; Alexander, 1999). En este escenario la biodegradacin est relacionada conel crecimiento de los microorganismos. Para este tipo de degradacin las enzimas sonnormalmente especficas y, por tanto, la tasa de reaccin es mucho ms rpida.Adems, en tales casos la contaminacin da una ventaja ecolgica a los microorga-nismos que llevan a cabo el proceso de degradacin, pues al hallar una fuente deenerga su poblacin ir en aumento y, a su vez se incrementar la tasa de degra-dacin en mayor medida (Alexander, 1999).Para la estimulacin de la degradacin de un contaminante se puede considerar la rutametablica de la degradacin y sus requerimientos; as como la fisiologa de la bacteriaque produce la degradacin. Entre los factores ms importantes encontramos: 1) elpapel del contaminante en la reaccin, e.g. fuente de carbono, donador de electrones,aceptor final de electrones, inhibidor (como en co-metabolismo); 2) sustratos adiciona-les de la reaccin e.g. oxgeno; 3) el donador y aceptor final de electrones para capturarenerga; 4) condiciones ptimas para el crecimiento de los microorganismos quedegradan el contaminante (potencial rdox, temperatura, pH, etc.) y 5) las caracters-ticas del sitio contaminado (pH, nutrientes, potencial rdox, temperatura, etc.).Los diferentes mecanismos de degradacin de molculas haloorgnicas han sidodescritos en varias revisiones de literatura (Fetzner, 1998; Haggblom y Bossert, 2003;van Pe y Unversucht, 2003). En el presente texto mencionaremos tres ejemplos paramostrar el efecto de la ruta metablica sobre los mecanismos de estimulacin de losprocesos de degradacin. Los dos primeros ejemplos se relacionan con la deshalo-genacin oxidativa y deshalogenacin hidroltica. En ambos casos, la etapa clave enla degradacin es la incorporacin de uno o dos grupos de hidroxilos. En la deshalo-genacin oxidativa, la fuente de oxgeno es molecular (O2) y por tanto ocurre estric-tamente en condiciones aerbicas, mientras que en la deshalogenacin hidroltica lafuente del oxgeno es la molcula de agua y puede ocurrir bajo diversas condicionesrdox, segn el requerimiento del aceptor de electrones de la bacteria responsable poresta reaccin (respiracin aerbica, desnitrificacin, etc.). Un tercer ejemplo tiene que ver con la deshalogenacin reductiva, en donde el tomode cloruro se reemplaza por un tomo de hidrgeno y dos electrones (Holliger et al.,1999; Smidt y de Vos, 2004). Esta reaccin puede ocurrir en condiciones aerbicas oanaerbicas. En muchos casos de deshalogenacin reductiva el compuesto halo-orgnico juega el papel de aceptor final de electrones en respiracin anaerbica,donde la energa liberada en la oxidacin del donador de electrones se utiliza paraformar gradiente de protones y posteriormente para sintetizar ATP. Este proceso seconoce con el nombre de halorespiracin o deshalorespiracin y las bacterias impli-cadas en l normalmente son anaerbicas obligatorias. En este sentido, para estimu-lar la halorespiracin es necesario asegurar las condiciones anaerbicas y adicionarfuentes de carbono y un donador de electrones (e.g. hidrgeno). Entre las generalizaciones de la biodegradacin de compuestos rganoclorados se hadeterminado que los compuestos que presentan menor nmero de cloros son mssusceptibles a degradacin aerbica (e.g. deshalogenacin oxidativa y deshalogena-cin hidroltica) y, por el contrario, entre mayor nmero de cloros es ms alto el gradode susceptibilidad a degradacin anaerbica (deshalogenacin reductiva; Fetzner,1998; Haggblom y Bossert, 2003; van Pe y Unversucht, 2003). De hecho, para algu-


nos compuestos como los PCB, dioxinas y furanos, altamente clorados, la nicamanera para ser degradados completamente es a travs de una etapa anaerbica enla cual ocurre la declorinacin reductiva. Solo entonces el producto menos cloradopuede degradarse aerbicamente, en ocasiones hasta alcanzar su mineralizacincompleta. Por lo tanto, en el caso de muchos de los COP parece ms atractiva laposibilidad de emplear un proceso anaerbico-aerbico combinado (Fetzner, 1998;Haggblom y Bossert, 2003; van Pe y Unversucht, 2003).

BIODEGRADACIN DE BIFENILOS POLICLORADOS (PCB)Los Bifenilos Policlorados (PCB) fueron utilizados ampliamente desde 1929 hasta1978 en equipos elctricos como transformadores, condensadores, intercambiadoresde calor, sistemas hidrulicos, as como tambin en la fabricacin de pinturas yplsticos. Aproximadamente, se han producido en el mundo 1324.000 toneladas dePCB que en gran cantidad han ocasionado contaminacin al medio ambiente (Iwataet al., 1993; Breivik et al., 2002a; Breivik et al., 2002b; Meijer et al., 2003; Breivik et al.,2007). Al respecto, se estima que solamente en el ro Hudson en Estados Unidosfueron liberados entre 95 a 603 toneladas de PCB (EPA, 2000). Las molculas de PCB se componen de dos anillos de fenilos con 1 a 10 tomos decloro (Fig. 1). Existen 209 posibles congneres de los PCB, de acuerdo a la cantidady posicin de los cloros. Aproximadamente 189 congneres fueron identificados enmezclas comerciales, 36 de los cuales estn considerados como los ms significativospor su abundancia y alta toxicidad (McFarland y Clarke, 1989). Es importante men-cionar que los PCB fueron comercializados en diferentes mezclas, caracterizadas porel grado de clorizacin, e.g., Aroclor 1221, 1242 y 1260 contienen respectivamente,21%, 42% y 60% de cloros en peso. Existe, sin embargo, gran diferencia entre losdistintos congneres de PCB en cuanto a su comportamiento ambiental (persistencia,sorpcin, transporte y bioacumulacin) y toxicidad. En este sentido, los PCB conmayor cantidad de cloros son ms resistentes, se adsorben con ms fuerza al suelo osedimento y tienen mayor tendencia a bioacumularse. Por ejemplo, la solubilidad dePCB cambia de 6 ppm en monoclorobifenil a 0,007 ppm en octaclorobifenil (Borja etal., 2005). Los congneres ms txicos presentan una conformacin co-planar.Dichos congneres no tiene cloros en posicin orto, por el contrario, tienen cloros enlas dos posiciones para y, por lo menos, en las dos posiciones meta. Estas molculasse parecen estereo-qumica y toxicolgicamente a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxin(TCDD) y, por lo tanto, se denominan como-dioxin (Dioxin-like; McFarland yClarke, 1989). Segn la lista, elaborada por la Organizacin Mundial de la Salud, delas Toxicidades Equivalentes a Dioxinas (TEQ por su siglas en ingls) de varios com-puestos de como-dioxin, la TEQ de distintos congneres de PCB vara de 0,00001a 0,1, en comparacin con la mxima TEQ de 1,0 que fue asignada a 2,3,7,8-TCDD(van den Berg et al., 1998; van den Berg et al., 2006; Haws et al., 2006).Para llevar a cabo la remediacin de un sitio contaminado con PCB hay que tener encuenta que la contaminacin es una mezcla de congneres. Esto es especialmenteclave cuando se trata de degradacin biolgica. Las enzimas que catalizan la degra-dacin presentan un rango limitado de molculas que pueden ser degradadas y hastala fecha, an no ha apareci la Sper-Bacteria, de tal suerte que para la biorreme-


diacin de sitios contaminados con PCB es mejor contar con la comunidad micro-biana. La degradacin secuencial anaerbica-aerbica es especialmente importantepara PCB, ya que los congneres con mayor nmero de cloros se transformanexclusivamente en condiciones anaerbicas en procesos de deshalogenacin reductivay los productos de declorinacin, congneres de menor nmero de cloros, sedegradan exclusivamente en condiciones aerbicas (Wiegel y Wu, 2000; Abraham etal., 2002; Master et al., 2002). Esta combinacin es mucho ms importante en lasmezclas comerciales de mayor clorizacin del PCB (e.g. Aroclor 1260), e.g., la incu-bacin anaerbica (cuatro meses) antes de la incubacin aerbica con la cepa LB400fue indispensable para la degradacin de Aroclor 1260 (Master et al., 2002), mientrasque mejor solo un poco (70% versus 67%) la degradacin aerbica de Aroclor 1248con la misma cepa (Evans et al., 1996). Aunque la investigacin sobre la biodegradacin y biorremediacin de PCB se haadelantado consideradamente en los ltimos 25 aos (para revisiones de literaturasvase Bedard y Quensen, 1995; Furukawa, 2000b; Wiegel y Wu, 2000; Abraham et al.,2002; Bedard, 2003; Magar, 2003; Ohtsubo et al., 2004; Pieper, 2005), todava existenmltiples barreras que han de superarse para lograr un tratamiento eficaz que puedadisminuir las concentraciones de PCB a niveles aceptables (Tiedje et al., 2002). Lasbarreras son: 1) la baja solubilidad y biodisponibilidad de PCB; 2) la baja eficiencia dedeshalogenacin anaerbica; 3) la baja eficiencia de degradacin aerbica; 4) ambosprocesos (anaerbicos y aerbicos) degradan preferiblemente PCB sin substitucin decloro en posicin de orto, lo que resulta en la acumulacin de productos orto. En loque sigue discutiremos cada barrera y las estrategias para superarlas.

LA BAJA BIODISPONIBILIDAD DE PCBLa biodisponibilidad de compuestos orgnicos se considera una de las ms importan-tes causas que influyen en la tasa de degradacin, adems de que la baja disponibilidades considerada como un factor importante que hace a un compuesto recalcitrante(Alexander, 1999; Focht, 2003). Este factor podra limitar tanto la degradacin aer-bica como la anaerbica. Adicionalmente, se considera que la baja disponibilidad esuno de los factores primordiales que explican porqu las metodologas que funcionanen el laboratorio, no funcionan en el campo. En este sentido, la adsorcin de compues-tos orgnicos al suelo con el tiempo va fortalecindose y, por lo tanto, la desconta-minacin de sitios que fueron contaminados aos atrs es ms compleja y difcil(Hatzinger y Alexander, 1995; Alexander, 1999; Alexander, 2000).Algunos intentos de superar esta barrera se han concentrando en la aplicacin desurfactantes (e.g. Singer et al., 2000; Fava y Piccolo, 2002; Ferrer et al., 2003). Sinembargo, el xito de dicho mtodo an se encuentra limitado. Esto puede explicarsedebido a la toxicidad de varios surfactantes para los microorganismos y por el en-trampamiento de PCB en las micelas que no genera ningn aumento de la biodis-ponibilidad (Ohtsubo et al., 2004). Adicionalmente, la inhibicin de la degradacinpuede atribuirse al hecho de que los surfactantes pueden cambiar la composicin dela comunidad microbiana, estimulndo bacterias que pueden degradar tales surfac-tantes (Colores et al., 2000). Adems, el surfactante puede disociar las bacterias queestn adsorbidas junto a los contaminantes en la matriz y, por lo tanto, alejarlas de


estos (Stelmack et al., 1999). En condiciones anaerbicas es posible que la adsorcinde bacterias y PCB en el mismo slido estimule su deshalogenacin (Arbeli y Ronen,2003), y existen especulaciones acerca de que compuestos como los PCB se desha-logenan, tambin, en su forma adsorbida o slida (Ballerstedt et al., 2004; Arbeli etal., 2006), tal vez de una manera semejante a la reduccin de hierro slido (Ruebushet al., 2006).Varios estudios han mostrado que los surfactantes de la familia Tween son menostxicos que otros (Laha y Luthy, 1992; Van Hoof y Jafvert, 1996; Yeh et al., 1998).Adems, se encontraron que los surfactantes Tween 60, 61 y 65 pueden servir comofuente de carbono y donadores de electrones para la deshalogenacin reductiva dehexaclorobenzeno (HCB; Yeh y Pavlostathis, 2005). Tween 80 estimul la desha-logenacin reductiva de HCB (hasta cinco veces ms) en concentraciones bajas oiguales a la concentracin micelar crtica (30-1200 mg/L), pero, inhib el proceso enconcentraciones significativamente mayores (1,500-5,000 mg/L) (Van Hoof y Jafvert,1996). Por otro lado, Tween 80 inhibi varias cepas de Dehalococcoides spp. (Amos etal., 2007). Aunque el ltimo estudio fue dirigido para realizar deshalogenacin detetracloroetileno (PCE), diferentes estudios han mostrado la importancia de dichognero y otros relacionados en la deshalogenacin de PCB (Bunge et al., 2003; Fennellet al., 2004; Fagervolt et al., 2005; Watts et al., 2005; Yoshida et al., 2005; Yan et al.,2006; Kjellerup et al., 2008). Es posible que los biosurfactantes tengan mayor xito enla remediacin, dado que tienen menor toxicidad y son ms biodegradables (Golyshinet al., 1999; Ron y Rosenberg, 2001; Makkar y Rockne, 2003; Fava et al., 2003; Mulligan,2005) y, al menos, un estudio ha mostrado que el biosurfactante rhamnolipid estimulla deshalogenacin reductiva de PCB (Cho et al., 2004). Con todo, un mayor conoci-miento sobre la compleja interaccin entre suelo, surfactante, contaminante y micro-organismos puede ayudar en el diseo de mejores estrategias para la aplicacin desurfactantes en la remediacin de sitios contaminados (Pieper, 2005).

LA BAJA EFICIENCIA DE DESHALOGENACIN ANAERBICAEl metabolismo anaerbico de PCB se produce mediante deshalogenacin reductiva.Actualmente se conocen ocho procesos distintos de declorinacin reductiva de PCBsegn su selectividad, la posicin del cloro y de los cloros vecinos. Estos procesos hansido descritos con ms detalle en otras revisiones (Bedard y Quensen, 1995; Wiegel yWu, 2000; Bedard, 2003). Varios estudios indican que diversos procesos son reali-zados por distintos grupos de bacterias (e.g Wu et al., 1997; Cutter et al., 2001; Wuet al., 2002; Kjellerup et al., 2008). El proceso ms comn es la desclorizacin de uncloro en posicin meta o para situados entre dos cloros (Doble Flanked). El que losigue es la declorizacin de cloro en posicin meta o para situados al lado de un cloro(Flanked). Y menos comunes que los anteriores es la declorizacin de los cloros sinotros cloros al lado en posiciones meta o para (Bedard, 2003). La declorizacin me-nos comn se desarrolla en posicin orto. Este proceso fue observado en el labora-torio, aunque para congneres de menor importancia en mezclas comerciales de PCB(Berkaw et al., 1996; Wu et al., 1997; Kuipers et al., 1999). Teniendo en cuenta lo an-terior, la combinacin de dos o ms procesos complementarios es ideal para lograrmayor desclorizacin. Este tipo de combinacin ha sido observada en algunos sitios


(Bedard, 2003). Los productos dominantes (pero no exclusivos) de esta etapa sonPCB con menos cloros: entre uno a tres cloros en posiciones orto y orto + para (Evanset al., 1996; Maltseva et al., 1999). Por ejemplo, 2-, 4-, 2,4-, 2,6-, 2,2-, 2,4-, 2,2,4-,y 2,4,4-clorobifeniles fueron 70 a 85% (molar) de los productos de desclorizacinanaerbica de Aroclor 1242 (Maltseva et al., 1999).La investigacin sobre la deshalogenacin reductiva de PCB ha presentado por muchosaos dificultades al cultivar las bacterias que llevan a cabo dicha deshalogenacin. Sinembargo, se ha logrado un gran avance en los ltimos aos, inicialmente al ser identi-ficadas las cepas o-17 y DF-1, filogenticamente cercanas a Dehalococcoides, como lasresponsables de la desclorizacin de PCB en cultivos de enriquecimiento (Cutter et al.,2001; Wu et al., 2002). Posteriormente, se descubri que los cultivos puros deDehalococcoides cepa 195 y cepa CBDB1 pueden deshalogenar PCB, dioxinas polyclo-radas y furanas polycloradas (Bunge et al., 2003; Fennell et al., 2004). Finalmente,algunos estudios que emplearon mtodos moleculares con muestras ambientales hanestablecido la importancia del gnero Dehalococcoides y otras filogenticamente cercanasen la deshalogenacin reductiva de PCB y dioxinas clorados (Fagervolt et al., 2005;Watts et al., 2005; Yoshida et al., 2005; Yan et al., 2006; Kjellerup et al., 2008). Una deestas cepas, DF-1, ha sido aislada recientemente (May et al., 2008) y su genoma est enproceso de secuenciacin (http://genomesonline.org/index.htm). Estos nuevos resul-tados seguramente van a ampliar el conocimiento sobre la deshalogenacin reductivade PCB en los prximos aos y, en gran medida, esto redundar en el mejoramiento delproceso de biorremediacin en el campo.Ahora bien, se han propuesto varias estrategias para estimular la deshalogenacinreductiva de PCB: 1) adicin de fuente de carbono y donador de electrones; 2) adi-cin de surfactantes; 3) adicin de otro compuesto halogenado; 4) adicin de FeSO4;5) adicin de un consorcio microbiano con capacidad de deshalogenacin reductivade PCB. Estas estrategias se discutirn en lo que sigue.1.Adicin de fuente de carbono y donador de electrones. En condiciones naturales(suelo, sedimento etc.) el carbono se considera como el nutriente limitante para elcrecimiento bacteriano (Aldn et al., 2001; Koch et al., 2001). Dado que en el procesoanaerbico el PCB sirve como aceptor de electrones, y los anillos aromticos quedanintactos, las bacterias que preforman la halorespiracin necesitan una fuenteadicional de carbono y donador de electrones para estimular el proceso (Nies y Vogel,1990; Wiegel y Wu, 2000). Adems, la adicin de una fuente de carbono estimularel consumo de aceptores de electrones alternativos que podran inhibir la deshaloge-nacin (Arbeli et al., 2006). Por lo tanto, el primer nutriente para lograr la biostimu-lacin de la deshalogenacin reductiva es probablemente el carbono. Varios estudios (uno, especficamente, sobre sedimentos del ro Bogot, Graca-Chaves et al., 2007) han mostrado que la adicin de fuentes de carbono estimula ladehalogenacin reductiva (Leahy y Shreve, 2000; Aulenta et al., 2005). Normalmente,los halorespiradores pueden utilizar sustratos de uno a tres carbonos (Holliger et al.,1999), aunque es posible agregar fuentes de carbono ms complejas como glucosa,molasa o almidn. En condiciones anaerbicas dichas fuentes de carbono sern fer-mentadas a alcoholes, cidos grasos e hidrgeno que pueden alimentar los halores-piradores. Actualmente no hay una nica fuente de carbono que se considere ideal

para estimular la dehalogenacin anaerbica de PCB (Wiegel y Wu, 2000). Dado queeste proceso se lleva a cabo por diferentes bacterias, es lgico que bacterias distintas,necesiten fuentes distintas de carbono, por ejemplo, la cepa o-17 se estimula poracetato (Holoman et al., 1998; Cutter et al., 2001), mientras la cepa DF-1 puede cre-cer con formato (Wu et al., 2002). Por su reactor Tiedje et al., 2002, han sugeridoutilizar fuentes de carbono simples como el etanol, que no influir en la biodispo-nibilidad de PCB. Adems del carbono otros nutrientes pueden ser limitantes entre los que se cuentanel nitrgeno, el fsforo y las vitaminas. En ensayos de laboratorio se usan normal-mente productos tales como extractos de levadura o de carne para suplir dichosnutrientes. Sin embargo, en los procesos de biorremediacin en el campo puedenutilizarse productos econmicos que contienen estos nutrientes. Por ejemplo, elEnvironmental Protection Agency de EEUU (EPA) ha desarrollado un protocolo debioestimulacin de degradacin anaerbica de toxafeno utilizando sangre de ani-males como fuente de nutrientes (EPA, 2005).2. Adicin de otro compuesto halogenado. Mltiples estudios han demostrado quela deshalogenacin reductiva de PCB podra ser estimulada mediante la adicin deotros compuestos halogenados como bifeniles (e.g. 2,6-dibromobifenil) y benzoatoshalogenados (Van Dort, et al., 1997; Bedard et al., 1998; DeWeerd y Bedard, 1999;Cho et al., 2002). Dichos compuestos probablemente son aceptores de electronespreferibles por los halorespiradores, estimulando el crecimiento de estas bacterias y,como consecuencia, incrementando adems la tasa de deshalogencin de PCB. Estaestrategia ha sido probada en campo exitosamente (Bedard et al., 1995). Aparente-mente, esta es unas de las estrategias ms exitosas para la estimulacin de la deshalo-genacin reductiva de PCB, pero, el mayor reto an es encontrar un compuestoambientalmente seguro y econmico que pueda ser utilizado a escala real.3. Adicin de FeSO4. Otra estrategia probada exitosamente en estudios de labora-torio es la adicin de FeSO4 (Zwiernik et al., 1998). En uno de estos estudios se agre-garon 10 mM de FeSO4 al sedimento del ro Hudson, inoculado en un caldo de cultivoen condiciones anaerbicas. La declorizacin de PCB (Aroclor 1242), preliminarmen-te en posicin meta y para, se increment considerablemente. Los autores sugierenque en este caso los deshalogenadores son reductores de sulfato. El sulfato sirve paraaumentar dichas bacterias, de tal modo que cuando se agota el sulfato, se inicia elproceso de deshalogenizacin del PCB. El papel del hierro se aprecia en la titracin desulfides generados en la reduccin de sulfato que podran ser txicos para el procesode la deshalogenacin reductiva (Zwiernik et al., 1998). Este estudio parece ser pro-metedor, dado que FeSO4 es relativamente econmico y no presenta efectos negativospara el medio ambiente. Sin embargo, hasta donde he investigado, esta estrategia nose ha probado en otros estudios. Aunque Tiedje et al., 2002, agregaron FeSO4 a sureactor, no han comparado este reactor con uno sin FeSO4, adems, el alcance del es-tudio no est completamente claro. Adicionalmente, en los ltimos aos, los estudioshan resaltado la importancia de las bacterias de la familia de Dehalococcoides en ladeshalogenacin anaerbica de PCB. Hasta donde se sabe, dichas bacterias no sonreductoras de sulfato (Kube et al., 2005; Seshadri et al., 2005) siendo contradictoriocon la hiptesis de Zwiernik et al., (1998).



4. Bioaumentacin. La bioaumentacin (adicin de bacterias deshalogenantes al sitiocontaminado) podra ser beneficiosa en ambientes donde no se encuentran bacteriascon capacidad de deshalogenacin de PCB. Para la deshalogenacin de mezclas dePCB es probable que sea necesario agregar consorcios microbianos con ampliacapacidad de deshalogenacin reductiva. Dado que en diversos lugares se han encon-trado diferentes procesos de deshalogenacin, es posible que al someter el PCB a dospoblaciones bacterianas con actividades compatibles resulte un proceso de desha-logenacin ms completo (Tiedje et al., 2002). Varios estudios han mostrado la facti-bilidad de bioaumentacin en dehalogenacin reductiva de PCB (Natarajan et al.,1996; Natarajan et al., 1997; Tiedje et al., 2002), mientras que, por el contrario, otrosensayos han fallado (Wu y Wiegel, 1997; Bedard et al., 1997). El ensayo de Tiedje et al., 2002, es ejemplo exitoso de bioaumentacin al nivel delaboratorio, demostrando tambin la complejidad de la bioaumentacin. Los autoresadicionaron a un suelo contaminado cultivos de enriquecimiento de dos orgenesdistintos que pueden llevar acabo procesos complementarios de deshalogenacin: 1)sedimento de Silver Lake que presenta capacidad de deshalogenar PCB altamenteclorados, pero su alcance es limitado dado que puede deshalogenar solo cloros enposicin meta adyacentes a otro cloro (proceso N: Wiegel y Wu, 2000); 2) sedimentode ro Hudson con la capacidad limitada en la deshalogenacin de PCB altamenteclorados pero pueden remover cloros de posiciones meta y para sin necesidad de quehaya presencia de cloro adyacente (proceso M y Q respectivamente: Wiegel y Wu,2000; Quensen et al., 1990, Tiedje et al., 2002). Al contrario de lo esperado al com-binar estos dos sedimentos se expres principalmente el proceso M frente a una tasainsignificante de los procesos N (del Silver Lake) y Q (del ro Hudson). Por otro lado,fue mucho ms exitoso adicionar microorganismos enriquecidos de sedimento delSilver Lake, dejndolos actuar para expresar el proceso N y, posteriormente, paradeshalogenar los productos de dicho proceso, agregar el cultivo de sedimento del roHudson que expresa los procesos M y Q. La combinacin de los tres procesos dicomo resultado la acumulacin de congneres con cloros en posicin orto. El por-centaje de congneres que tienen cloros solo en posicin orto se increment del 1%en Aroclor 1260 al 39% en los productos de la deshalogenacion.

LA BAJA EFICIENCIA DE DEGRADACIN AERBICALa degradacin aerbica es considerada un proceso de co-metabolismo (Hernandezet al., 1995; Pieper, 2005), aunque existen ejemplos de crecimiento de bacterias co-pladas a la degradacin de mono, di o tri-clorobifeniles (Potrawfke et al., 1998; Kimy Picardal, 2000; Kim y Picardal, 2001, Adebusoye et al., 2008b). En ambos casos elproceso est catalizado por enzimas especializadas en la degradacin de bifenil (laruta de bifenil - bph) o compuestos aromticos similares. Afortunadamente, estasenzimas tambin pueden catalizar la degradacin de bifeniles clorados. Sin embargo,dado que el sustrato natural de estas enzimas es bifenil, la tasa de degradacin dePCB es mucho menor y, en muchos casos, se forman productos no completos de de-gradacin. Estos productos y los de la degradacin de clorobenzoato (e.g. catecolclorado) pueden inhibir la degradacin o ser txicos a las bacteria (Bartels et al.,1984; Sondossi et al., 1992; Stratford et al., 1996; Blasco et al., 1997; Dai et al., 2002;

Hiraoka et al., 2002; Vaillancourt et al., 2002; Cmara et al., 2004; Parnell et al., 2006). La ruta metablica de la degradacin de bifenil, su gentica y sus enzimas fueronestudiadas ampliamente (Ohtsubo et al., 2004; Pieper, 2005). En esta ruta, el bifenilse convierte en cido benzoico y en cido 2 hidroxi-penta-2,4-dienoico (Fig. 2). Esteltimo, se convierte, a su vez, en acetil-Co-A y piruvato que alimentan el ciclo deKrebs. Para muchas bacterias el producto final de la degradacin de bifenil o PCB esel benzoato o el clorobenzoato respectivamente (Pieper, 2005), mientras que otrasbacterias pueden metabolizar tambin benzoato y clorobenzoato (Arensdorf y Focht,1994; Potrawfke et al., 1998; Kim y Picardal, 2000, 2001; Kitagawa et al., 2001;Adebusoye et al., 2008a).

Figura 2. La ruta de degradacin aerbica de bifenil y PCB. Los compuestos son: (A) bifenil; (B) cis2,3-dihidro-2,3-dihidroxybifenil; (C) 2,3-dihidroxybifenil; (D) 2-hidroxy-6-oxo-6-fenilhexa-2,4-cidodienoico; (E) 2-hidroxy-penta-2,4-cido dienoico; (F) cido benzoico.

Las molculas aromticas son antiguas y abundantes en la naturaleza e ingresan alambiente a travs de mltiples rutas, tales como: actividades geotrmicas y volcni-cas, cometas y polvo espacial, y mediante su produccin en plantas (Liu et al., 2004;Singer et al., 2003; Singer et al., 2004). De acuerdo con esto, las bacterias degrada-doras de PCB son abundantes y diversas (Pieper, 2005; Leigh et al., 2006) y se hallantambin en suelos o sedimentos no contaminados (Macedo et al., 2007). Se aislaron degradadores de PCB de diversos gneros como Pseudomonas, Burkholderia,Achromobacter, Comamonas, Ralstonia, Sphingomonas, Acinetobacter, Rhodococcus y Bacillus(Pieper, 2005). Es importante resaltar que bacterias aisladas no necesariamente repre-sentan la comunidad nativa ni a los degradadores importantes del suelo (e.g. Tillmannet al., 2005; Ritz, 2007). Por ejemplo, el anlisis de un suelo con mtodos independientesde cultivo indic que bacterias de los gneros Pseudonocardia, Kribella, Nocardiodes ySphingomonas son las degradadoras dominantes de bifenil, mientras que los Rhodococcusssp. representaron el 73% de los aislamientos (Leigh et al., 2007). Los genes de degrada-cin estn ubicados en plsmidos u otros elementos genticos mviles (Nishi et al.,2000; Stecker et al., 2003; Takeda et al., 2004; Pieper, 2005). Por lo tanto, la degrada-cin aerbica de PCB no se puede correlacionar con un gnero particular de bacterias.Es decir, aunque muchas cepas degradadoras se encuentren en algunos gneros (e.g. losmencionados arriba) no todos los miembros de estos gneros son degradadores de PCBy, adems, no son los nicos gneros que pueden degradar PCB. En este sentido, lapresencia o ausencia de dichos gneros en un sitio contaminado con PCB, de ningunamanera puede utilizarse como indicador de la degradacin de tales compuestos. Un mejor indicador para el potencial degradativo de PCB de una comunidad micro-biana es la identificacin de los genes de degradacin. Estos genes pueden ser detec-


tados mediante tcnicas moleculares como PCR, o hibridizacin con cebadores osondas especficas para dichos genes (Erb y Wagner-Dbler, 1993; Leigh et al., 2007).Sin embargo, tambin hay variabilidad en tales genes y por tal motivo hay que tenercuidado al interpretar los resultados de este tipo de estudios. Las enzimas de degra-dacin de PCB conocidas hasta la fecha pertenecen a una misma familia y, probable-mente, tienen un ancestro comn. Sin embargo, estas enzimas presentan gran va-riabilidad (Asturias et al., 1995; Masai et al., 1995; Fortin et al., 2005; Pieper, 2005).Por ejemplo, las enzimas BphA de Rhodococcus globerulus P6 y Rhodococcus sp. sepaRHA1 son ms cercanas filognicamente a las dioxigenasas del tulueno que al BphAde las cepas Burkholderia xenovorans LB400 y Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707(Asturias et al., 1995; Masai et al., 1995). Finalmente, se debe recordar que, hasta lafecha, la mayora de los estudios han analizado enzimas de degradacin originadaspor bacterias aisladas y, por lo tanto, no necesariamente son buenas representantesde las enzimas ms importantes en el campo (e.g. Leigh et al., 2007). Se espera quelos mtodos moleculares independientes del cultivo brinden una mejor aproximacinsobre las enzimas importantes in situ (Leigh et al., 2007; Suenaga et al., 2007). La degradacin de bifenil es llevada a cabo mediante una serie de enzimas (Fig. 2). Eneste sentido, si la primera enzima no puede metabolizar un congnere, la degradacinno se obtendr. Al contrario, si una enzima en la mitad de esta cadena no podrametabolizar el metabolito clorado, este metabolito se acumular. La primer enzima,BphA, tiene todava mayor influencia dado su regioespecifidad de la dioxigenacin, esdecir, los carbonos que preferiblemente va a oxidar, influyen en la eficacia del catlisisde las siguientes enzimas en la ruta (Cmara et al., 2007). Un ejemplo de la especifidad de BphA para diferentes congneres tiene que ver con losdos grupos BphA en bacterias gram negativas (Mondello et al., 1997). El primer grupode BphA tiene un rango relativamente estrecho de congneres y, normalmente, puededegradar congneres con pocos cloros (hasta cutro cloros) y puede oxidar exclusiva-mente los carbonos 2 y 3 (Fig. 2). Los tetraclorobifeniles con cloros en posicin 2 y 5son sustratos pobres para estas enzimas y, hasta la fecha, ninguno de ellos puede de-gradar 2,5,2,5-CB. Por otro lado, dichas enzimas son superiores en la degradacin decongneres en dos cloros en las posiciones para como 4,4-CB y 4,2,4-CB. El represen-tante ms estudiado de este grupo es el Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 (Furukaway Miyazaki, 1986). El segundo grupo de enzimas tiene un rango relativamente amplio decongneres que se pueden degradar y una mayor flexibilidad en la posicin de loscarbonos que pueden oxidarse. Estas enzimas pueden oxidar congneres con un altonmero de cloros (hasta seis sustituciones por bifenil) y tienen la capacidad de oxidarlos carbonos de posicin 3 y 4, lo que permite la oxidacin de 2,5,2,5-CB. Por otrolado, los congneres en dos cloros en las posiciones para como 4,4-CB y 4,2,4-CBson degradados ms lentamente por estas enzimas. El representante ms estudiadode este grupo es el Burkholderia xenovorans LB400 (antes Pseudomonas; Bopp, 1986).Diferentes congneres pueden tener diversos cuellos de botella en la cadena meta-blica, que va a dar como resultado una acumulacin de distintos metabolitos.Como se mencion anteriormente, algunos de estos metabolitos son txicos y ladegradacin, afortunada para nosotros, resulta ser un suicidio para la bacteria. Enlos estudios acerca de estos cuellos de botella se han identificado las enzimas BphA


(Seeger et al., 1995; Brhlmann y Chen, 1999), BphC (Dai et al., 2002) y BphD (Seahet al., 2000). La enzima BphB tiene un rango relativamente amplio de degradacin ynormalmente no limita la degradacin de PCB (Pieper, 2005), pero cuando la BphAfue mejorada genticamente, la BphB se convirti nuevamente en el cuello de botella(Brhlmann y Chen, 1999). El cuello de botella depende del congnere y la bacteria.As pues, diferentes bacterias tienen distintos rango de bifeniles para degradar. Sinembargo, se pueden hacer varias generalizaciones (Furukawa et al., 1978):

1.La degradacin aerbica es ms eficiente con un menor nmero de cloros(normalmente entre 1-3 cloros), lenta y limitada en 4-6 y prcticamente ausentecon un nmero mayor a 6 cloros.

2.La oxidacin del PCB ocurre en posicin 2 y 3.3.Los PCB que tienen dos cloros en la posicin orto en el mismo anillo (2,6-) o en

anillos diferentes (2,2) son muy resistentes a la degradacin. 4.Generalmente los PCB que contienen todos los cloros en el mismo anillo se

degradan ms rpido que aquellos que contienen el mismo nmero de cloros,pero que se distribuyen entre los dos anillos.

5.El rompimiento aerbico del anillo aromtico ocurre en el anillo que posee unnmero menor de cloros.

6.Existen excepciones, y las reglas mencionadas arriba son nicamente gene-ralizaciones. Por ejemplo, hay reportes sobre la degradacin de 2,2-bifenil (Kim yPicardal, 2001), o sobre el ataque preferido al anillo clorado (Kim y Picardal,2001), o a la oxidacin de posiciones 3 y 4 (Seeger et al., 1999) etc.

Biodegradacin de clorobenzoato. Uno de las factores claves para el xito de la degra-dacin de PCB es la mineralizacin eficaz del clorobenzoato (Bedrard, 2003; Pieper,2005). La degradacin parcial del clorobenzoato produce metabolitos txicos talescomo clorocatecol, protoanemonin y cido 5-cloroformil-2-hidroxipenta-2,4-dienoi-co (Bartels et al., 1984; Sondossi et al., 1992; Arensdorf y Focht, 1994; Blasco et al.,1997; Prez-Pantoja et al., 2003; Denef et al., 2006; Martnez et al., 2007). Dichos me-tabolitos pueden acumularse dado que muchas bacterias tienen rutas no completasde degradacin de clorobenzoato (Pavlu et al., 1999; Bedrard, 2003; Pieper, 2005).Algunos autores han encontrado dificultades para enriquecer degradadores de cloro-benzoato (Brunsbach y Reineke, 1993; Pavlu et al., 1999), mientras que otros hanencontrado que dichos degradadores son abundantes y diversos en suelos prstinos(Fulthorpe et al., 1996; Fulthorpe et al., 1998). La degradacin depende de la estructura del clorobenzoato (nmero y posicin de loscloros) y en muchos casos diferentes bacterias degradan diferentes clorobenzoatos(Pavlu et al., 1999). Lo anterior es importante, dado que en sitios contaminados conmezcla de PCB se espera encontrar mezclas de productos de clorobenzoato. Las di-ferentes rutas de degradacin fueron descritas por Peel y Wyndham, 1997 y Pieper,2005, algunas de stas sern mencionadas brevemente en lo que sigue. El clorobenzoato puede transformarse en clorocatecol (e.g. la ruta de clc: Dorn yKnackmuss, 1978), la hidroliza de 4-clorobenzoato produce un 4-hidroxibenzoato (laruta de fcb: Klages y Lingens, 1979), la dioxigenacin de 3-clorobenzoato y 3,4-di-clorobenzoato en posicin 4 y 5 produce 5-cloroprotocatechuato (Nakatsu y Wyndham1993). En la medida en que se planee la bioaumentacin con degradadores de cloro-


benzoato, ser prudente elegir rutas que no generen productos txicos (Blasco et al.,1997). La ruta de 3-oxoadipate (Pieper, 2005) genera el potente antibitico proto-anemonin (Blasco et al., 1997), y la ruta de meta cleavage que convierte a 3-cloro-catecol en cido 5-cloroformil-2-hidroxipenta-2,4-dienoico se considera como unareaccin de suicidio (Bartels et al., 1984). Aparentemente las rutas preferidas sonaquellas que eliminan el cloro en la primera etapa de oxidacin y la orto cleavagede clorocatecol (Blasco et al., 1997; Tiedje et al., 2002). Adicionalmente, esimportante anotar que la bacteria debe tener un buen balance entre la produccin yeliminacin de metabolitos, de tal manera que los productos txicos nunca se acu-mulen. En este sentido, la consideracin final tendr que tener en cuenta cada casoparticular, segn el clorobenzoato especfico (o la mezcla especfica) y las diferentesbacterias disponibles.

LA ESTIMULACIN DE LA DEGRADACIN AERBICA1. Estimulacin de co-metabolismo. En tanto que la degradacin de PCB se hace enbuena parte por co-metabolismo, donde las bacterias que llevan a cabo la degradacinno pueden aprovechar el PCB por crecimiento, una de las posibles estrategias paraestimular dichas bacterias es agregar una fuente de carbono adicional que estimuleel crecimiento de los degradadores de PCB. La fuente ideal de carbono para estimularespecficamente los degradadores de PCB, debe inducir la expresin de los genes dedegradacin y, adems, no ser una fuente txica. Por ejemplo, la glucosa no es unabuena eleccin dado que estimula un amplio rango de bacterias, y no necesariamentepresenta ventajas ecolgicas a los degradadores de PCB, asimismo, no induce la expre-sin de los genes de degradacin de bifenil. Por el contrario, el bifenil puede ser el sus-trato ideal, ya que los degradadores de PCB se alimentan naturalmente de estecompuesto, y tiene como ventaja, el inducir los genes de degradacin. De acuerdo conesto, algunos trabajos han mostrado que el bifenil puede estimular la degradacinde PCB (Brunner et al., 1985; Harkness et al., 1993; Fava y Bertin, 1999). Sin embargo,el bifenil es carcinignico (Focht, 2003) y, por lo tanto, no es buen candidato para seragregado al ambiente. Algunos estudios han demostrado que sustancias derivadas deplantas, tales como flavonoides (Donnelly et al., 1994) y terpenes, especficamente car-vono, limoneno y p-cimeno (Focht, 1995; Gilbert y Crowley 1997; Tandlich et al. 2001)pueden estimular la degradacin de PCB. De igual manera Hernandez et al., 1997,mostraron que la adicin de cscara de naranja o follaje al suelo con PCB estimul ladegradacin del contaminante y aument el nmero de degradadores de PCB. Similar-mente, se ha encontrado que los degradadores de PCB (y de bacterias en general) sonms numerosos cerca a las races y, aparentemente, diferentes degradadores de PCBpresentan preferencias hacia races de plantas especificas (Leigh et al., 2006) lo queresalta la potencialidad de la fitorremediacin (Pieper, 2005).2. Bioaumentacin. Los problemas mencionados sugieren que la bioaumentacin seatomada como una opcin importante en la degradacin aerbica de PCB. La bio-aumentacin puede dar respuesta a las siguientes problemticas:

a.La bioaumentacin puede solucionar la baja concentracin de degradadores dePCB. Esto es importante dado que la degradacin de PCB se lleva a cabo median-te co-metabolismo y las bacterias que los degradan no crecen.


b.La bioaumentacin puede solucionar la baja concentracin de bacterias con ca-pacidad de mineralizacin de clorobenzoato. Una manera para evitar la toxicidadde los metabolitos de la degradacin aerbica de PCB es agregar o estimular otrasbacterias que pueden degradar dichos metabolitos. Esta estrategia ha sido pro-bada exitosamente por Fava y Bertin, 1999, quienes mostraron que la agregacinde degradadores de monoclorobenzoato estimul la degradacin de PCB.

Dado que el PCB es una mezcla, puede resultar ventajoso agregar una mezcla de bac-terias con capacidades complementarias para degradar diferentes congneres relevantesde PCB y sus productos txicos. Una primera opcin es elegir cepas conocidas o aislarnuevas para disear este tipo de mezcla. Es importante sealar que los criterios de elec-cin de las cepas deben incluir, adems de su capacidad de degradar diferentes cong-neres o metabolitos, tambin su compatibilidad al ambiente, su capacidad de degradarPCB en bajas concentraciones (alta afinidad al sustrato) y alta capacidad de sobreviviren el ambiente. Una opcin alternativa tiene que ver con tomar una muestra del sitiocontaminado, enriquecer las bacterias degradadoras de PCB en un reactor (por ejemploen la presencia de bifenil y PCB) y retornar esta mezcla al ambiente contaminado. Adi-cionalmente, se pueden agregar consorcios bacterianos de fuentes tales como el com-post o el lodo de plantas de tratamiento de agua residual (Di Toro et al., 2006). Final-mente, se pueden agregar una o ms bacterias modificadas genticamente. La ltimaopcin sigue siendo todava terica, dado que es prohibido liberar al ambiente este tipode bacterias. En este sentido, la tarea de buscar nuevas bacterias con nuevos genes y condiferentes afinidades al PCB, sigue siendo todava importante. Esta tarea podra ser fa-cilitada a travs de nuevos mtodos que permitan analizar rpidamente altas cantidadesde muestras (high-throughput; Kahl y Hofer, 2003; Goddard y Reymond, 2004).3. Mejoramiento de bacterias por ingeniera gentica. Es posible que la complejidadde la degradacin de PCB inhiba la evolucin de una bacteria que degrada PCBeficientemente. Es decir, si apareciera una mutacin exitosa en la primera enzima,puede ser que la oxidacin ms eficiente de PCB resultare en mayor acumulacin demetabolitos txicos. Si bien, es probable que en el futuro la evolucin natural encon-trar una solucin a esta complejidad, la evolucin artificial (ingeniera gentica)puede acelerar el proceso. Teniendo en cuenta lo dicho, pueden considerarse variasestrategias para mejorar la capacidad de las bacterias degradadoras de PCB:

a.Modificar las enzimas para ampliar el rango de los congneres que pueden degra-dar, o para aumentar la velocidad de la reaccin o, en algunos casos, para reducirsu sensibilidad a los productos txicos de la degradacin (Ohnishi et al., 2004).

b.Agregar genes de degradacin de clorobenzoato, de tal manera que se evite laacumulacin de productos txicos, como el clorocatecol. Adems, mejorando lacapacidad de crecimiento del degradador en presencia de PCB.

c.Aumentar la expresin de los genes de degradacin de PCB, por ejemplo, elimi-nando el sistema de control para que la expresin sea constitutiva, o cambiandoel promotor para que la induccin se realice mediante otra molcula que puedaser liberada al ambiente.

Como se mencion anteriormente, la degradacin de PCB se lleva a cabo a travs deuna serie de enzimas y es posible que estas deban ser modificadas en su totalidad oparcialmente. Por ejemplo, al mejorar la enzima BphA, la BphB se convierte en el cuello


de botella para algunos congneres (Brhlmann y Chen, 1999). La modificacin de lasenzimas puede ser planeada o, por el contrario, ejecutada al azar (Ang et al., 2005).En modificaciones planeadas se identifican aminocidos claves, segn la comparacinentre dos enzimas similares con actividades distintas (Kimura et al., 1997; Mondelloet al., 1997) o segn la estructura tridimensional de la enzima (Suenaga et al., 2002) yse cambian tales cidos por otros (mutagnesis en sitio dirigido).Esta estrategia puede ahorrar mucho trabajo en el laboratorio y sirve, adems, paraprobar hiptesis acerca de la importancia de algunos aminocidos en la degradacin,as como tambin, aportan en la elaboracin del mecanismo de la catlisis. Sinembargo, normalmente es imposible identificar todas los aminocidos claves y, anms difcil, encontrar parejas o aminocidos con efectos sinergsticos. Para encontrarestos sitios es necesario aplicar mutaciones aleatorias (Suenaga et al., 2001; Zielinskiet al., 2006). En este sentido, esta ltima estrategia es ms engorrosa y tediosa, perose parece ms a la evolucin natural. De hecho, se pueden aplicar varias rondas demutaciones: despus de la primera ronda, se eligen los mejores mutantes y, a su vez,a estos mutantes se les aplica de nuevo un procedimiento de mutacin aleatoria, enlo que se denomina evolucin artificial (Harayama, 1998; Zhao, 2007). Muchas investigaciones se han concentrado en el mejoramiento de la primera enzimaBphA (Furukawa, 2000a, Ohtsubo et al., 2004). La subunidad BphA1 es consideradala ms importante en la determinacin de la especifidad para diferentes congneres,as como tambin, para la determinacin de la tasa de reaccin (Furukawa, 2000a,Ohtsubo et al., 2004), aunque la subunidad de la enzima tambin influye en estadeterminacin (Hurtubise et al., 1998). Los primeros trabajos probaron, de maneraracional, la importancia de varios aminocidos sobre la especifidad de la enzima paradiferentes congneres y para la posicin de la oxidacin (es decir, la posicin en dondese insertan los hidrxidos). Estos trabajos compararon los genes bphA en Burkholderiaxenovorans LB400 (antes Pseudomonas; Bopp, 1986) y Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707(Furukawa y Miyazaki, 1986). La gran subunidad de la primera enzima BphA1 en estassepas difiere en 20 de 459 aminocidos (~4,36%) y las otras 3 subunidades son simi-lares en un 99,3 a 100% de los aminocidos. Sin embargo, el rango de la degradacinde diferentes congneres es muy distinto (Kimura et al., 1997; Mondello et al., 1997).Con la determinacin de las posiciones en donde la secuencia de estos aminocidosse diferencia, y las mutaciones especficas en estas posiciones, se pueden identificaralgunos aminocidos que son responsables de la especifidad de la enzima (Kimura etal., 1997; Mondello et al., 1997). Por ejemplo, cambiando Thr 376 (KF707) a Asn 376(LB400) en la sepa KF707 se ampla el rango de PCB que puede degradarse de ma-nera similar a la sepa LB400 (Kimura et al., 1997). Asimismo, diferentes mutacionesen la misma posicin dieron como resultado diferencias de especifidad para la degra-dacin de PCB y dibenzofurano (Suenaga et al., 2006). De igual manera, cambiandoPhe 336 (LB400) a Ile 336 (KF707), o Asn 338 (LB400) a Thr 338 (KF707) en la cepaLB400 se mejora su capacidad a degradar 4,4-CB (Mondello et al., 1997). Suenaga et al., 2002, propusieron un modelo tridimensional de bphA1, confirmandola cercana de dichas posiciones al sitio activo de la enzima. Asimismo, sus estudiosensancharon el conocimiento de la influencia de mutaciones en estas posiciones y sualrededor (Suenaga et al., 2002; Suenaga et al., 2006). Es importante sealar que


hasta la fecha, el mejoramiento de la actividad de bphA para algunos congneres, dacomo resultado un detrimento de su actividad en otros congneres y an no se halogrado construir la sper enzima.Una estrategia distinta, pero que podra aplicarse en combinacin con la estrategiaanterior, es la adicin de enzimas de degradacin de clorobenzoato a bacterias quedegradan PCB. Esto mejora el crecimiento de las bacterias, ya que puede aprovecharel carbono del benzoato, y en tanto evita la acumulacin de productos txicos incre-menta su sobrevivencia. Esta estrategia ha sido probada exitosamente paraBurkholderia xenovorans LB400 y Rhodococcus sp. cepa RHA1 y Cupriavidus necator RW112(Rodrigues et al., 2001; Rodrigues et al., 2006; Wittich y Wolf, 2007). Al elegir losgenes de degradacin de clorobenzoato es recomendable escoger rutas metablicasque eviten la formacin de productos txicos (ver arriba).Finalmente, es posible incrementar la expresin de los genes de degradacin mediantela modificacin de su regulacin. Esta estrategia se ha probado exitosamente porOhtsubo et al., 2003, pues determinaron que no solamente se increment la tasa dedegradacin, sino que tambin se agregaron, sorprendentemente, habilidades paradegradar nuevos congneres.La ingeniera gentica an est en el nivel de ensayos, a su vez, la aplicacin de micro-organismos modificados genticamente todava est prohibida, aunque en los lti-mos aos se han empezado a valorar los posibles efectos de su aplicacin (Aguirre deCrcer et al., 2007). Es posible suponer que su aplicacin en reactores de maneracontrolada pueda ser ms viable, para evitar su salida al medio ambiente (e.g. me-diante esterilizacin). La aprobacin de su uso estimular ms investigaciones en estadireccin con el propsito de construir un sper degradador, mejorado en todoslos genes de la ruta metablica, que contenga varias copias de dichos genes con capa-cidades complementarias para degradar diferentes congneres, y que, adems, tam-bin incluya genes de mineralizacin de todos los posibles clorobenzoatos, con unamayor expresin de tales genes, con capacidad de produccin de surfactantes y quetienen genes de quimiotaxis por PCB.

EVALUACIN DE RIESGO SEGN SITIO Y SEGN CONGNERES O TOXICIDADLa evaluacin de riesgo fue aceptada en muchos pases como herramienta importantepara determinar niveles aceptables de contaminantes en el ambiente y las metas deprocesos de remediacin (Tarazona, 2002; Tarazona y Vega, 2002; MAVDT, 2007a;Wolska et al., 2007). Las tablas genricas que determinan dichos niveles se refieren alos peores casos posibles para dar proteccin en amplias condiciones ambientales ya toda la poblacin. Por lo tanto, en muchas ocasiones (que no representan el peorcaso posible) se pueden aceptar niveles ms altos de contaminacin, siempre y cuan-do, estos niveles no signifiquen mayor riesgo a la salud humana o al medio ambiente.Dichos niveles se determinan mediante un proceso de evaluacin de riesgo y son espe-cficos dependiendo del sitio. Por ejemplo, en el peor caso posible el riesgo de expo-sicin por inhalacin a los receptores que estn a 10 m del suelo contaminado sepresenta cuando el suelo no retiene (adsorbe) el contaminante (e.g. suelo arenoso),cuando el viento sopla 24 horas al da en la direccin de los receptores y cuando losreceptores permanecen 24 horas en el lugar. Por otro lado, en la realidad el suelo


puede ser orgnico y retiene fuertemente el contaminante, el viento es dbil, no cons-tante, y sopla en distintos direcciones; y los receptores permanecen en el lugar nica-mente una hora al da. Evidentemente, en cada caso, el nivel mximo del contami-nante en el suelo que no va a generar efectos adversos a la salud de los receptores esdistinto y, por lo tanto, la meta de remediacin podra ser especfica para cada caso(Tarazona, 2002; Fernndez et al., 2006; MAVDT, 2007a). En el caso de los PCB puede considerarse tambin la variacin en la toxicidad de losdiferentes congneres. Como fue mencionado anteriormente la TEQ de distintoscongneres de PCB vara de 0,00001 a 0,1, en comparacin con 2,3,7,8-TCDD(McFarland y Clarke 1989; van den Berg et al., 1998; van den Berg et al., 2006; Haws etal., 2006). Las tablas genricas que determinan niveles mximos permisibles decontaminacin de PCB como conjuntos de congneres son conservadoras conside-rando el peor caso posible, mientras que al analizar la concentracin de los distintoscongneres en el sitio puede evaluarse mejor el riesgo segn la toxicidad de cada uno.De igual manera hay que tener en cuenta que en procesos de biorremediacin, los pro-cesos aerbicos que pueden romper el anillo aromtico son ms eficientes en remocinde masa, pero dado que ataca los congneres menos clorados, son menos eficientesen la remocin de toxicidad. Por otro lado, los procesos anaerbicos no logran elrompimiento de la molcula y, por lo tanto, la disminucin en la concentracin delcontaminante es limitada, resultando en un bajo porcentaje de remocin de masa. Sinembargo, este proceso ataca preferiblemente congneres ms txicos, es decir, loscongneres co-planares, y el porcentaje de remocin de la toxicidad podra ser muchomayor (Mousa et al., 1998; Quensen et al., 1998; Magar, 2003; Ganey y Boyd, 2005). Revisando la literatura sobre los resultados de estudios toxicolgicos y epidemio-lgicos de PCB, Ross, 2004, lleg a una conclusin todava ms radical. Dado que losnicos efectos notables sobre personas expuestas en su trabajo a elevadas concen-traciones de PCB fue la irritacin de piel y ojos, y que la exposicin a PCB de fuentesambientales es mucho menor con una tendencia constante a decrecer desde laprohibicin de la produccin de PCB, el autor dedujo que el riesgo de PCB de fuentesambientales es bajo. Teniendo en cuenta esta conclusin y los elevados costos dedescontaminacin, Ross consider que la remediacin de zonas contaminadas conPCB reporta pocos beneficios a la salud humana.

CONCLUSIONES

La degradacin de PCB ha sido estudiada ampliamente. Sin embargo, su aplicacinen campo es an muy limitada. En general, es recomendable usar un esquema cons-tituido por un proceso de degradacin anaerbica, seguido por uno de degradacinaerbica, complementado todo esto con la totalidad de la comunidad microbianaque es esencial para degradar un amplio rango de congneres, adems de un grannmero de productos de degradacin. La complejidad de la remediacin de sitioscontaminados con PCB requiere de conocimientos detallados y, por tanto, es nece-sario seguir investigando y mejorando la biodisponibilidad de PCB, la deshaloge-nacin reductiva y el proceso de degradacin aerbica para superar las barrerasrelacionadas con la biorremediacin de sitios contaminados con PCB.


AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por la Agencia Canadiense de Desarrollo Internacional.Quiero agradecer a Gustavo Adolfo Silva por su revisin detallada del texto.

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BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS

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