Biopsia Líquida mediante NGS de cfDNA en pacientes con ... · metastásicos (N) tienen distintos...
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Biopsia Líquida mediante NGS de cfDNA en pacientes con cáncer colorrectal Laboratorio de Nuevas Terapias (IIS-FJD)
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¿Podemos identificar a los pacientes que sufrirán metástasis en el Cáncer Colorrectal?
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Secuenciación de alta capacidad de exomas del ADN libre en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal ("biopsia
líquida") y su relación con el proceso metastásico PI13/01924 (2014-2016)
4
Dr. Damián García-Olmo Dra. Dolores García-Olmo
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Criterios de selección de los pacientes
5
Non-metastatic cohort
(N=10)
Metastatic cohort
(M=10)
Unclassifiable cohort
(U=10)
Inclusion criteria
- Age: 18 - 80 years
- Candidates to elective surgery
- Agreement with the informed consent
- Histological diagnosis: colon adenocarcinoma of enteroid pattern
- Tumor stages:
pT1-pT3
pN0
M0 (established by PET-CT)
R0
M1: liver metastasis with
an enteroid
adenocarcinoma pattern,
histologically
established.
- Tumor stages:
pT4 and/or pN1-pN2
M0 (established by PET-CT)
Exclusion criteria - Previous cancers in other locations
- Lynch syndrome or other hereditary intestinal cancers
PET-CT: Positron Emission Tomography - Computed Tomography
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Proyecto biopsia líquida ESTUDIO CLÍNICO
Pacientes CON Metas Hepáticas
n= 10
Pacientes SIN Metas Hepáticas
n= 10
Pacientes Inclasificicables
N=10
DISEÑO
Suecuenciación de exomas
Plasm
a P
MN
Definición de un panel genético
de posible valor pronóstico
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NGS en Biopsia Líquida para Cáncer Colorrectal
7
Kim ST et al. Oncotarget. 2015;6(37):40360-9. Zhou J, et al. PLoS One. 2016;11(7).
Paneles génicos
Perfiles mutacionales Dianas terapéuticas
Detección temprana de recidivas Fluctuaciones
ctDNA
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Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR
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[cfDNA] M > [cfDNA] N
U comparte características con M y N
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9 Mouliere et al (2012). Expert Opin Biol Ther. 12 Suppl 1:S209-15.
Biopsia Líquida: Patrón de fragmentación
Necrosis Fagocitosis
>1000 pb (>10000 pb)
Apoptosis 180-200 pb
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Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR
10
Patrón de fragmentación nucleosomal
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Análisis de la secuenciación
Secuenciación
•De señales de secuenciación a nucleótidos
•FASTQ, Cutadapt y Prinseq
Alineamiento
•Alineamiento a genoma de referencia
•BWA sobre Grch37
Calling de variantes
•Diferencias entre la muestra y la referencia
•VarScan, Samtools y VEP
Filtrado y anotación
•Seleccionar las variantes con potencial interés biológico
•GPRO
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64%
Biopsia Líquida mediante NGS en pacientes con CCR
12
GRUPO M=10 GRUPO N=10 GRUPO U=10
Alineamiento
Calidad
Bowtie (3 mismatches) Genoma de referencia hg38 % Alineamiento: 64-77 % Sin filtrados adicionales
FastQC Calidad de base>28 (puntualmente<22) Errores en las 10-11 primeras bases
Número de lecturas por paciente entre 45 y 87 millones (76 pb 50X)
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Biopsia Líquida en Cáncer Colorrectal
13
↑ cfDNA
KRAS NRAS BRAF EGFR …
Predicción y pronóstico Vigilancia y seguimiento
Detección temprana de progresión
- Bettegowda et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra24. - Misale S. Resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer: from heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discov. 2014;4(11):1269-80. - Spindler KL. Circulating free DNA as biomarker and source for mutation detection in metastatic colorectal cancer. PLoS One. 2015;10(4):e0108247. - Siravegna G et al. Clonal evolution and resistance to EGFR blockade in the blood of colorectal cancer patients. Nat Med. 2015;21(7):827. - Misale S et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature. 2012;486(7404):532-6. - Reinert Tet al. Analysis of circulating tumour DNA to monitor disease burden following colorectal cancer surgery. Gut. 2016;65(4):625-34.
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NGS
• Mapeo
Variantes
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Variantes filtradas: significado
72%
21%
6%
1% 0,2%
Variante sin
sentido
Variante
sinónima
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NGS en Biopsia Líquida para Cáncer Colorrectal
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Genetic alteration Sequencing methodology Reference
Copy number changes Rearrangements
Whole-Genome Sequencing Leary 2012
Copy number changes Whole-Genome Amplification Heitzer 2013
Copy number changes Whole-Genome Sequencing
(Plasma-Seq) Mohan 2014
Somatic mutations KRAS, NRAS, BRAF
NGS (Deep Sequencing) Sakai 2015
Somatic mutations 54-gene panel
Next-Generation Digital Sequencing Technology (DST)*
Kim 2015
Somatic mutations 15-gene panel
Massively Parallel Sequencing (Safe-Seq)
Tie 2015
MET amplification Whole-Genome Sequencing Ragvah 2016
Somatic mutations SNVs, Indels
Targeted Capture Sequencing Zhou 2016
* Guardant360 Panel
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Cobertura media por región
Ch
r1
Ch
r2
Ch
r3
Ch
r4
Ch
r5
Ch
r6
Ch
r7
Ch
r8
Ch
r9
Ch
r10
C
hr1
1
Ch
r12
Ch
r13
C
hr1
4
Ch
r15
Ch
r16
C
hr1
7
Ch
r18
Ch
r19
Ch
r20
C
hr2
1
Ch
r22
Ch
rX
Ch
rY
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PROYECTO PI13/01924
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Enfoque alternativo
Secuenciación de exoma a menor profundidad
Perspectiva global del cfDNA
Perfiles o rasgos diferenciales (aparte de SNPs): presencia diferencial de exones (DPE) Metastásicos vs no metastásicos Características tumorales y no tumorales
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Flujo de trabajo experimental
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Presencia Diferencial de Exones (DPE)
20
“Presencia Diferencial de Exones”
pv≤0.005
EdgeR
QLF LRT Unique
DPE 366 297 379
QLF ∩
LRT
Unique = Num QLF + Num LRT – Num (QLF ∩ LRT)
QLF LRT
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Análisis de Componentes Principales
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Clusterización
22
Método de Ward
Pacientes M y N separados en 2 grupos
Pacientes U entre los límites de ambos
Pacientes libres de recaída agrupados
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Presencia Diferencial de Exones (DPE)
Desarrollo de un algoritmo predictivo de metástasis
23
1. Los pacientes metastásicos (M) y no metastásicos (N) tienen distintos niveles de ciertos exones en plasma:
2. Estos perfiles de DPE permiten agrupar y clasificar a los pacientes.
3. A partir de los perfiles de DPE se ha desarrollado un algoritmo que puede tener potencial predictivo de metástasis en pacientes de CCR.
Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018 (in press)
Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018 (in press)
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Clasificación de Random Forest
24
Metastásico No metastásico
M1 0.68 0.32
M2 0.67 0.33
N1 0.36 0.64
N2 0.35 0.65
pv≤0.005
Test de comprobación
Clasificación de Random Forest ̶ capacidad predictiva del algoritmo
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Clasificación de Random Forest
25
Paciente Metastásico No metastásico
p04 0.60 0.40
p08 0.53 0.47
p12 0.48 0.52
p15 0.55 0.45
p23 0.56 0.44
p28 0.55 0.45
p57 0.49 0.51
p58 0.51 0.49
p63 0.60 0.40
p66 0.51 0.49
pv=0.005
Probabilidades obtenidas para el grupo U
Clasificación de Random Forest ̶ capacidad predictiva del algoritmo
M
M
HIPEC
HIPEC
EXITUS
N
N
N
N
N
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DPE vs paneles de mutaciones
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Estrategia fácil, rápida, no invasiva y económica Identificación de pacientes con alto riesgo de desarrollar metástasis Perspectiva más amplia vs paneles de mutaciones como biomarcadores clínicos
Concentración de DNA en el plasma Ruido de fondo Abundancia relativa de DNA tumoral Eficiencia de captura
Validez clínica limitada
PANELES
“Presencia Diferencial de exones” Transferencia horizontal − Genometástasis M y N agrupados y separados correctamente Algoritmo Identificación de M y HIPEC en grupo U
Valor predictivo
DPE
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Publicación y patente
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Secuenciación de alta capacidad de exomas del ADN libre en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal ("biopsia
líquida") y su relación con el proceso metastásico PI13/01924 (2014-2016)
28
Estudio de validación de un modelo predictivo de desarrollo de metástasis en pacientes con cáncer colorrectal mediante secuenciación de exomas en ADN libre
en plasma ("biopsia líquida") PI17/01233 (2018-2021)
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Un nuevo concepto: Presencia Diferencial de Exones (DPE)
29
Olmedillas-López et al. Cancer Medicine 2018
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MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN
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Laboratorio de Nuevas Terapias (FIIS-FJD)
Agradecimientos: S. Genómica y S. Masiva CBMSO
Begoña Aguado Ramón Peiró Fernando Carrasco
Genómica Parque Científico
Ricardo Ramos Servicio Genética FJD
Ana Bustamante Servicio de Cirugía FJD