1

Caracterización de cepas de levadura colombiana

Saccharomyces cerevisiae para su potencial uso en la producción

de cerveza "Colombian Ale"

Cristhian David Walteros Pinzón

Miguel Ángel Fernández Niño, Luis Humberto Reyes Barrios

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia

RESUMEN

La especie de levadura S. cerevisiae es de gran importancia en la industria cervecera que ha estado en auge

durante los últimos años, se han hecho innovaciones que logran diferenciar productos con características

aportadas por las materias primas de la región donde se fabrican. El presente estudio realizó el aislamiento,

identificación y caracterización de cepas de levadura S. cerevisiae nativas de Colombia para su posterior

implementación en una cerveza Colombian Ale que aporten características novedosas y llamativas al

producto final. El aislamiento se realizó en molinos de caña de azúcar en el municipio de Moniquirá-Boyacá

recolectando muestras en lugares propicios para el crecimiento de levaduras (vasijas con jugos de caña,

fermentos, mieles y melazas). La selección de cepas se realizó inicialmente por morfotipos similares a la

literatura macroscópica y microscópica, luego fueron identificadas molecularmente (genotipado) mediante

la técnica Colony PCR (Polymerase chain reaction) para reconocer el gen HO, ubicado en el cromosoma IV

(AM921677.1) presente en el ADN de S. cerevisiae, implementando el cebador ScHO que lo amplifica. Se

realizó la caracterización en 3 aspectos: crecimiento en extracto malta mediante la medición de densidad

óptica en el espectrofotómetro a 600 nm, producción de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares durante la

fermentación midiendo la concentración de los principales compuestos en el cromatógrafo de líquidos, y por

último organolépticamente preparando prototipos de cerveza Colombia Ale con ingredientes (malta y lúpulo)

que no aportaran características organolépticas diferenciables para evaluar el efecto de las cepas nativas. Se

obtuvieron 24 colonias con morfologías microscópicas asociadas a levaduras y 12 cepas identificadas

molecularmente como S. cerevisiae. Se caracterizaron 8 cepas nativas y una cepa control con variaciones en

perfiles de crecimiento y en la concentración de ácidos orgánicos (acético, cítrico, málico, láctico, succínico

y tartárico), alcoholes (etanol y metanol) y azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa) durante la fermentación,

y distintas características organolépticas entre cervezas, siendo la cepa CW12 la más llamativa por su dulzor

con notas a caña y syrup de frutas en aroma y sabor. Las cervezas alcanzaron un grado de alcohol de 4.5%

v/v en una fermentación de 10 días. Se logró aislar, identificar y caracterizar una cepa de levadura S.

cerevisiae nativa de Colombia con características organolépticas llamativas para una cerveza Colombian Ale,

obteniendo componentes balanceados y un crecimiento acelerado que indica una fermentación rápida. Se

propone realizar la caracterización de las cepas restantes y análisis más rigurosos para su posterior

implementación.

PALABRAS CLAVES: Saccharomyces cerevisiae, Caña de azúcar, Colony PCR, Levaduras nativas,

Fermentación, Gen HO, HPLC, Colombian Ale.

NOMENCLATURA

PCR Polymerase Chain Reaction YPD Yeast Peptone Dextrose

PM Peso molecular RPM Revoluciones por minuto

ρ Densidad Lbs. Libras

V Volumen PPM Partes por millón

C Composición Bp Pares de bases

OD_600 Densidad óptica a 600 nanómetros g Gramos

mol Moles

2

1. INTRODUCCIÓN

La fabricación de cerveza se puede dividir en dos grandes procesos, el primero está asociado a la maceración

de los granos, principalmente cebada germinada, para obtener las unidades de glucosa y maltosa presentes en

los polisacáridos que componen el almidón (amilosa y amilopectina) [1]. Esto se logra mediante la adición de

agua y calor para activar las enzimas (la mayoría de tipo α-amilasa y β-amilasa) que reducen las cadenas largas

de azúcares en otras más simples y fermentables, esta mezcla es conocida como mosto, al cual se le agrega

lúpulo con el fin de agregar aroma, sabor y amargor a la cerveza [2], que aunque no es el único ingrediente que

los aporta, ya que la levadura también lo logra, es el que más impacta en estos aspectos [3]. El segundo proceso

corresponde a la fermentación alcohólica del mosto mediante la acción de la levadura, en el cual se consume la

glucosa para generar alcohol y dióxido de carbono. Existen dos diferentes tipos de levadura que definen los dos

grandes grupos estilísticos de cervezas, la de baja fermentación (tipo lager) y la de alta fermentación (tipo ale).

Las cervezas tipo lager son fabricadas usando levaduras de la especie Saccharomyces pastorianus (también

denominada S. carlsbergensis), las cuales actúan a temperaturas de entre 7 y 13 °C y se suelen situar en el fondo

del fermentador. Las cervezas tipo Ale se fabrican usando levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae la

cual actúa a temperaturas de entre 12 y 24 °C y se sitúa en la superficie del mosto [4]. S. cerevisiae es un sistema

genético que, a diferencia de la mayoría de los otros microorganismos, presenta dos fases biológicas estables:

haploide y diploide [5]. Para efectos de este estudio se enfocó la investigación en la levadura de la especie S.

cerevisiae dado que es la más usada en la industria cervecera.

Se han realizado estudios para aislar levaduras nativas en varios lugares del mundo, los aislamientos se realizan

en ambientes que presenten las condiciones necesarias para la supervivencia y reproducción de estos

microorganismos. Esto se lleva a cabo con el fin de aumentar el potencial de los mostos y dar originalidad a los

distintos tipos de bebidas alcohólicas en las que se usa esta levadura. Para los vinos, por ejemplo, se realizó una

investigación en Querétaro – México con el fin de aislar, seleccionar e identificar levaduras del género

Saccharomyces que tuvieran buena eficiencia fermentativa, baja producción de dióxido de azufre (SO2) y ácido

sulfhídrico (H2S), resistencia al factor “killer” y tolerancia a niveles altos de etanol y SO2. El resultado de este

estudio indica que el 26% de las cepas aisladas pertenecían al género deseado y una de estas cepas nativas

produjo el mayor grado alcohólico, eficiencia de fermentación y conversión azúcar-etanol, comparable con el

de una cepa comercial específica [6]. Las cepas fueron identificadas mediante el método de PCR (Polymerase

chain reaction), al igual que en un estudio similar realizado en Uruguay [7]. El interés por aislar y usar cepas

nativas ha venido en aumento en todo el mundo, para bebidas como el vino se han realizado estudios desde la

Patagonia en Argentina pasando por Valencia – España, hasta Nueva Zelanda y Australia en donde se han

seleccionado levaduras nativas que tienen rápida aceptación en sus productos, los cuales se caracterizan por

elevada tipicidad y prácticas de última generación [6].

En Colombia se han realizado proyectos de investigación con el fin de aislar y caracterizar cepas de levaduras,

sin embargo, todos estos estudios se han enfocado en obtener las levaduras directamente de la fermentación

espontánea de una muestra de frutas tales como banano y pomarrosa en un recipiente hermético, por lo cual el

aislamiento no es propiamente de cepas de levadura silvestres. Las cepas aisladas en la fermentación del banano

fueron descritas morfológicamente como S. cerevisiae, no obstante, el método por el cual fueron identificadas

no es totalmente confiable, ya que se basan en una apreciación morfológica y unos controles de crecimiento en

ciertos medios en los que otras levaduras también podrían crecer [8]. Por otra parte, la investigación con la

pomarrosa arrojó 6 tipos levaduras que se lograron identificar, ninguna de ellas S. cerevisiae, y otros que no

fueron posibles de genotipar [9]. Adicionalmente, existe solamente un estudio que ha realizado el aislamiento

de levaduras nativas de Colombia en un ecosistema azucarero como lo es el de Puerto López en el Meta, el

semillero de investigación GERMINA de la Universidad Nacional aisló muestras recolectadas en el cultivo de

caña (suelo y fruto), agua de irrigación, trapiche (jugos de caña, mieles, melaza, bagazo) y productos

fermentados en vasijas y suelos. Realizaron los muestreos en época seca y de lluvias en donde se obtuvieron

239 muestras de cepas de las cuales 51 eran de S. cerevisiae, que fue la única cepa encontrada en las dos épocas

y cuyos perfiles metabólicos de fermentación indicaban posible variabilidad intraespecífica que resultó en 20

perfiles inter-delta únicos. Las muestras fueron diferenciadas genómicamente mediante el método de “Single-

Strand Conformation Polymorphism” (SSCP) y posteriormente para diferenciar intra-especie se utilizó la

técnica PCR [10].

3

Tan sólo en Colombia, durante el 2017 se consumieron 21.6 millones de hectolitros de cerveza, lo cual

representa cerca de $9.3 billones anuales [11]. La elaboración de esta bebida en nuestro país se realiza con

materiales no autóctonos; la levadura, la cebada y los lúpulos son importados dado que en Colombia no se

cultivan estos. Así pues, el propósito de este proyecto es el aislamiento y la caracterización de cepas de levadura

S. cerevisiae nativas en ambientes paneleros ubicados en molinos de caña de las veredas Jordán y Muñoces &

Camachos en el municipio de Moniquirá (Boyacá), para su posterior comparación con muestras comerciales de

levaduras en la elaboración de cerveza. Las muestras recolectadas en los molinos se incubaron para su posterior

selección mediante morfología, genotipado mediante la técnica PCR y finalmente realizar la caracterización de

cada una de ellas en 3 aspectos.

Para lograr todo esto se estudió previamente la morfología de las levaduras objetivo para lograr una primera

selección que aumente la probabilidad de encontrar los resultados esperados mediante la técnica PCR. La

morfología de S. cerevisiae es esférica, elipsoide u ovoide. Su tamaño varía con la edad de la célula, pero

generalmente oscila entre 4 y 14 micras, y puede vivir aislada o formando colonias. Se pueden observar

gemando ya que es la principal forma en que se reproduce la levadura cervecera. La célula madre produce una

pequeña “gema” en la pared celular, que aumenta gradualmente y se estructura poco a poco como una nueva

célula de levadura hasta que alcanza el desarrollo adecuado y se separa de la célula “madre” por estrangulación

dejando una cicatriz en la pared celular [12]. En estas células la membrana celular separa los componentes

celulares del medio externo, mientras que la membrana nuclear protege el material hereditario y tiene una pared

celular de quitina, dándole a la levadura la forma celular que la caracteriza. Esta pared evita daños osmóticos

dado que ejerce presión de turgor, proporcionándole a estos microorganismos cierta plasticidad en condiciones

ambientales dañinas. La pared celular y la membrana están conectadas por el espacio periplasmático [13].

Se utilizará la técnica Colony PCR con el fin de realizar copias de fragmentos de ADN que contengan el gen

específico de la especie estudiada. Para realizar esta técnica es necesario desnaturalizar las muestras de ADN

obtenidas en las colonias con el fin de separar de las dos cadenas de nucleótidos. Posteriormente se utilizarán

“primers” o cebadores que se adhieren a la cadena molde solo cuando cierto tipo específico de gen está presente

en este caso el gen HO del cromosoma IV (AM921677.1). Finalmente se realiza una prolongación de la cadena

de ADN utilizando una enzima polimerasa, esto consiste en incorporar nucleótidos a las regiones que han sido

hibridadas por los “primers”. Posteriormente para la identificación de las muestras obtenidas se debe realizar

una electroforesis de agarosa para ADN. Esta técnica es utilizada para identificar fragmentos de ácido nucleico,

consiste en disponer las muestras realizadas en la técnica PCR en pozos de gel de agarosa que posteriormente

es sometido a un campo eléctrico lo que hace que los ácidos nucleicos cargados negativamente se muevan al

polo positivo. Las piezas pequeñas viajarán más rápido mientras que las piezas largas tendrán un menor

desplazamiento. Con esto se logra una separación basada en el tamaño y una caracterización de la muestra [14].

Los “primers” seleccionados para el estudio fueron ScHO y LgHO que amplifican para el gen HO/cromosoma

IV AM921677.1 y Lg-HO y genes HO ⁄cromosoma IV AB027450.1/AB027451.1 respectivamente, ya se han

usado para identificar 3 especies importantes del género Saccharomyces, los cuales fueron S. cerevisiae para el

“primer” ScHO y S. bayanus y S. pastorianus para el “primer” LgHO [15]. Las secuencias de nucleótidos del

cebador ScHO son (5’}GTTAGATCCCAGGCGTAGAACAG{3’) para ScHO-F (Forward) y

(5’}GCGAGTACTGGACCAAATCTTATG{3’) para ScHO-R (Reverse); y para el cebador LgHO son

(5’}TGGAAAGTCTACGAGAACAAGCC{3’) para LgHO-F (Forward) y

(5’}CCTCTATGTGAAGTCCGTATACTG{3’) para LgHO-R (Reverse) [15]. La identificación con el cebador

que amplifica para otras especies de levaduras se realiza con el fin de estudiar la posibilidad de aislar de estos

ambientes otro tipo de microorganismos que también son de interés para otras industrias,

El gen HO, de nombre HOmothallic switching endonuclease, codifica una endonucleasa responsable de iniciar

el cambio de tipo de apareamiento, un proceso de conversión de genes en el que las células MATa se transforma

en células MATalfa o viceversa. La expresión de HO y, por lo tanto, la interconversión de tipo de apareamiento,

se produce exclusivamente en células madre haploides al final de G1 después de START, el punto que marca

el compromiso con la duplicación de eventos. Las cepas silvestres de S. cerevisiae expresan HO y, por lo tanto,

son homotálicas. En las cepas silvestres, el patrón de expresión asegura que, tras la germinación de una espora,

las levaduras inmóviles están, en última instancia, cerca de sus parejas de apareamiento. Por lo tanto, la mayoría

de S. cerevisiae silvestres son diploides [16].

4

Con todo esto en mente, el objetivo del estudio es lograr aislar, identificar y caracterizar levaduras nativas para

encontrar al menos una cepa específica de la especie S. cerevisiae cuyas características metabólicas de

fermentación sean elevadas y generen compuestos llamativos para la producción de cerveza, además de que

ofrezca unas características organolépticas distintas y especiales para su posterior aplicación en la fabricación

de una cerveza “Colombian Ale” que resalte el producto colombiano realzando las características propias de la

materia prima perteneciente a la región.

El objetivo principal es encontrar una cepa de levadura S. cerevisiae propicia para la producción de cerveza.

Los objetivos específicos son: aislar levaduras de ambientes paneleros, realizar la identificación de morfotipos

y genotipado, caracterizar su crecimiento y fermentación, caracterizar la producción y consumo de ácidos

orgánicos, fenoles, alcoholes y azúcares, producir y caracterizar organolépticamente una cerveza Colombian

Ale.

Para esto, en primer lugar, es necesario saber si es posible aislar la levadura de estos ecosistemas, además de

que estas levaduras aisladas pertenezcan a la especie objetivo con la ayuda de identificación microscópica y

molecularmente mediante genotipado. Luego caracterizar su crecimiento en medio extracto de malta con la

medición de la absorbancia. Posteriormente calcular mediante experimentos de fermentación su porcentaje de

conversión de glucosa a alcohol y la cantidad máxima de alcohol en la que la levadura puede sobrevivir, todo

esto mediante pruebas en medios malta. Realizando experimentos similares se desea observar y cuantificar la

producción de ácidos orgánicos, fenoles y alcoholes, además de su consumo de azúcares y estudiar la

producción de Kraussen de estas cepas. Finalmente, escalar esta producción de laboratorio a un bache de

cerveza artesanal de la marca “Chelarte” con la levadura nativa que fue aislada para lograr la producción de la

tan anhelada primera cerveza “Colombian Ale” y caracterizar acidez y otros parámetros organolépticos.

5

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Aislamiento

Se inicia con la preparación de instrumentos para recolección de muestras, realizando la preparación del medio

de cultivo con 35g de extracto de agar de malta al 2% en 1000 mL de agua destilada en un frasco schott, se

calienta para disolver completamente hasta homogenizar. Esto es suficiente para 50 placas de Petri [17]. Luego

se esteriliza el medio, las cajas de Petri e hisopos en la autoclave a 15 lbs de presión y 121°C durante 15 a 20

minutos [17], también se autoclavan los materiales necesarios para trasvasar el medio, un tubo Falcon de 25

mL sin tapa [18]. Lo siguiente es agregar el medio de cultivo a las cajas de Petri luego de que el medio salga de

la autoclave cuando su temperatura permita su manipulación. Realizar el procedimiento rápido para no dejar

gelatinizar el medio. Se midieron 25 mL de medio de cultivo en el tubo Falcon para agregarlos a cada caja de

Petri, esto se realiza cerca de un mechero y dentro de la cabina de flujo laminar horizontal previamente

esterilizada con solución esterilizante o etanol y luz UV durante 15 minutos, para evitar contaminación del

medio, es importante no incorporar burbujas y evitar colocar las tapas hacia abajo. Este procedimiento se repite

para las demás cajas, en esta ocasión 30 [18]. Luego de 15 minutos están listas las placas ya que el agar se

solidifica muy rápido a 42°C [19]. Es muy importante rotular el material en cada caja de Petri con el tipo de

medio y la fecha, o agregar las cajas a una bolsa plástica y etiquetarla. Posteriormente se almacena el material

boca abajo en el refrigerador a 4°C para evitar que se llene de agua la gelatina [18].

Con lo anterior ya podemos comenzar con la recolección de muestras en campo, se hace contacto con los

encargados de los molinos de caña o “trapiches” para coordinar la recolección asegurándose que el día del

muestreo sea uno de los últimos de la molienda (normalmente dura 6 días), con el fin de aumentar las

posibilidades de encontrar levaduras, y en lo posible, tomando las muestras luego de que termine la molienda,

esto está sujeto a que el molino no realice la limpieza justo al finalizar el proceso. Es necesario contactar al

menos 3 molinos distintos para comparar entre ellos y aumentar las posibilidades de encontrar levaduras. Se

empaca el material previamente adecuado para la recolección (cajas de Petri con medio de cultivo e hisopos)

en una nevera de icopor práctica para la movilización en campo, junto con todo el equipo necesario como

guantes, tapabocas, antibacterial y etanol para evitar contaminación a la hora de realizar el muestreo, además

de envolver las cajas en papel vinipel con el fin de disminuir el riesgo de que se destapen o rompan.

Se comienza con un recorrido de reconocimiento por el molino para identificar posibles puntos de interés en

donde se den las condiciones necesarias para la aparición de levaduras, con el fin de escoger 5 o 6 puntos por

molino en donde las condiciones de higiene no sean las mejores (recipientes en donde exista burbujeo y

superficies con restos de jugo de caña que no se hayan limpiado). Otros lugares que tienen gran potencial en

la aparición de levaduras son recipientes con miel, melaza, fermentación de guarapo o jugo de caña reposado.

Se asigna un número al molino y otro número al lugar de interés para poder realizar el rastreo posteriormente.

Ya identificados los lugares, y usando guantes y tapabocas, se prepara una caja de Petri por cada lugar

seleccionado y el recipiente con los hisopos. Luego se sostiene la caja de Petri boca abajo con una mano, se

toma rápidamente un hisopo, evitando al máximo la contaminación del recipiente que los contiene, y luego se

recoge la muestra impregnando completamente el hisopo con el líquido a estudiar, se levanta la parte inferior

de la caja para esparcir el líquido por toda la superficie del medio asegurándose de no dejar grumos y esparcir

por toda la caja la muestra. Esto debe realizarse suavemente ya que el medio puede romperse si se le realiza

mucha fuerza encima. Finalmente se tapa la caja y se desecha el hisopo sucio en otro recipiente.

Es de importancia tomar registro fotográfico del lugar donde se tomó la muestra y asignarle un nombre

asociado al tipo de muestra (bien sea miel, melaza, jugo de caña, guarapo, etc.) al número que se le otorgó a

cada lugar. Se debe rotular cada caja con el número del molino y el número del lugar de interés al cual

corresponde, al envolver la caja con vinipel se evita que se abra o se rompa, además antes de guardarla

nuevamente en la nevera de icopor es necesario rociar el vinipel con etanol. Hay que evitar al máximo la

contaminación cruzada para esto se deben tomar medidas como cambiar de guantes y usar etanol y antibacterial

al terminar el muestreo. Se debe repetir el procedimiento con todos y cada uno de los lugares de interés usando

una nueva caja de Petri, nuevos guantes y nuevo hisopo y luego repetir en cada molino. Luego de terminar con

todos los lugares, y para evitar que ingresen otros microorganismos no deseados se debe sellar la nevera de

icopor.

6

Las muestras se dejan crecer a temperatura ambiente durante un par de días luego de ingresarlas al laboratorio

y se deben guardar en una nevera refrigerada a 4°C para retrasar su reproducción con el fin de realizar una

identificación morfológica posteriormente.

2.2 Identificación macroscópica

En primer lugar se debe realizar una primera identificación de morfotipos de las muestras recolectadas, para

esto en la cabina de flujo laminar horizontal previamente esterilizada se toma cada placa de Petri con la muestra

recogida en el trapiche y se observar la morfología de las colonias encontradas en todo el medio de cultivo,

esto con el fin de identificar posibles colonias de levaduras, específicamente la morfología asociada a S.

cerevisiae, las cuales presentan colonias circulares, blanquecinas, con una textura similar a la crema y una

superficie brillante. También es posible seleccionar colonias con pequeñas variaciones de las características

antes mencionadas para obtener levaduras de otras especies, pero en general manteniendo el tono blanco-

amarillento [20]. Seleccionar las posibles colonias de levaduras haciendo una marca en el cristal de la placa de

Petri, que permita localizarlas rápidamente para su posterior siembra.

El aislamiento de las posibles colonias de levaduras se realiza mediante la técnica de agotamiento por repique,

para esto se necesita tener listas las cajas de Petri estériles con el mismo medio de cultivo (Agar de malta) en

donde se van a aislar las posibles colonias de S. cerevisiae, si hay muchas posibles colonias puede dividirse la

caja de Petri en 4 secciones, cada una para repicar una sola colonia y a cada sección se le asigna el número

correspondiente del lugar donde se tomó la muestra, es decir, de la caja de Petri de donde se aislará la colonia

(número de molino – número de lugar) además de agregarle una letra en caso de existir varias colonias

seleccionadas en la misma caja, rotular sobre cada sección en el cristal.

Todo el proceso debe realizarse cerca de un mechero bunsen para disminuir riesgo de contaminación. Ubicar

las colonias previamente marcadas en cada caja y con un aza tomar una colonia raspando el medio teniendo

cuidado de no romperlo. Tapar la caja de muestra y ubicar la caja del repique y la división que corresponden a

la colonia. En la caja del repique y en la división correspondiente sembrar la colonia pasando el aza una sola

vez en línea recta sobre el medio en el borde de la caja y esterilizar el aza en el mechero bunsen hasta que se

torne de color naranja. Se retoma el repique al final de la línea recta con el aza pasándola una sola vez en

dirección contraria y un poco hacia abajo haciendo una nueva línea recta, remarcar la línea pasando varias

veces el aza sin volver a tocar la recta anterior y volver a esterilizar. Repetir el procedimiento de repique en

zigzag hasta llegar al centro de la caja. No remarcar la última recta, simplemente pasarla una sola vez y

finalmente tapar la caja. El procedimiento debe hacerse con muy poca fuerza sobre el medio para evitar

romperlo.

Ilustración 1. Pasos para la siembra de levaduras por la técnica de agotamiento [21].

Repetir el procedimiento con todas y cada una de las colonias previamente seleccionadas para sembrarlas en

la caja y división correctas. Es importante realizar este procedimiento muy rápidamente para evitar

contaminación y que las levaduras sigan creciendo. Marcar las cajas con nombre, fecha y tipo de

microorganismo y llevarlas a una incubadora a 30°C durante 14 a 16 horas (overnight). Al finalizar la

incubación guardar las cajas a 4°C en el refrigerador.

7

2.3 Identificación microscópica

Se comienza con el aislamiento de posibles colonias en medio líquido YPD (Yeast-Peptone-Dextrose), para

esto se prepara el medio líquido agregando 10 gramos de extracto de levadura, 20 gramos de peptona y 20

gramos de dextrosa a 1000 mL de agua destilada en un frasco schott, y se calienta para disolver completamente

hasta homogenizar. Se debe esterilizar el medio y los tubos Falcon, además de los materiales que se usarán

para sembrar los microorganismos: una probeta de 10 mL y tantos Falcon de 25 mL como colonias que se

repicaron en el numeral 2.2, agregar los tubos Falcon abiertos a un beaker grande y cubrirlo con papel aluminio

para introducir todo a la autoclave a 15 lbs de presión y 121°C durante 15 a 20 minutos [16].

Dentro de la cabina de flujo laminar horizontal, previamente esterilizada se toma un tubo Falcon y se rotula

con la marca correspondiente a cada división de las colonias repicadas en el numeral anterior, luego se agregan

10 mL de medio de cultivo YPD medidos con la probeta. Inicialmente se debe esterilizar el aza en un mechero

bunsen hasta que se torne naranja y luego esperar a que se enfríe. Se retira una colonia simple de la división

correspondiente y se disuelve en el medio de cultivo del tubo Falcon. Se debe tapar el tubo y esterilizar

nuevamente el aza para repetir este procedimiento con todas y cada una las divisiones en un nuevo tubo Falcon.

Al finalizar la siembra se ubican los tubos en una gradilla y se tapan asegurándose que no queden totalmente

herméticos para luego llevarlos a una incubadora a 30°C durante 14 a 16 horas (overnight).

Pasado el tiempo necesario de incubación se procede a realizar la identificación a nivel microscópico, para

esto dentro de la cabina de flujo laminar horizontal se destapa el tubo Falcon con la muestra y con una

micropipeta de 10 microlitros y una punta previamente esterilizada en autoclave se extraen 5 microlitros de la

muestra y se agregan sobre una lámina de microscopio, se desecha la punta se tapa el tubo. Para visualizar las

células en el microscopio se cubre con una laminilla el líquido de la muestra. Es importante marcar la lámina

de la misma manera que el tubo Falcon para tener claro a cuál muestra pertenece.

En el microscopio se comienza a enfocar con el objetivo de menor ampliación, luego se aumenta hasta llegar

al objetivo de 50x, ya en éste tamaño se pueden identificar posibles morfologías microscópicas asociadas a

levaduras, específicamente la morfología asociada a S. cerevisiae que corresponden a células circulares,

elípticas u ovoides con un núcleo diferenciado ya que es una célula eucariota, además, debido a que se

multiplican rápidamente por gemación se origina una protuberancia sobre esta que va creciendo y acaba dando

lugar a otra célula más pequeña (al principio) que la célula inicial, así pues también se deben identificar posibles

células gemando [22]. Es necesario tomar una fotografía al encontrar los microorganismos deseados o no

deseados para su posterior análisis y guardarlas con la marca de la lámina para poder hacer el rastreo al final.

Como dato adicional se debe observar y anotar si los microorganismos se agrupan o se esparcen por todo el

medio para usar esta información en un análisis futuro.

Luego de repetir el procedimiento para todos y cada uno de los tubos Falcon, se deben desechar todas las

láminas y las laminillas en un beaker para posteriormente autoclavar. Ya con toda la información e imágenes

recolectadas se comienzan a seleccionar las fotos de los microorganismos cuya morfología corresponda a

posibles células de levadura S. cerevisiae y luego rotularlas con la marca del tubo (número de molino – número

de lugar – letra).

2.4 Identificación molecular

En primer lugar, se debe comenzar con el cultivo de microorganismos de control, para esto se realiza la

preparación de las cajas de Petri en donde se van a cultivar los controles tanto negativos como positivos

siguiendo la metodología usada en el numeral 2.2 en una caja para cada control. Es de importancia que los

microorganismos de control positivos contengan el gen a ampliar y que los controles negativos no, esto se

verifica en la literatura, para poder realizar un control válido.

Dentro de la cabina de flujo laminar horizontal se abre una caja de Petri con los microorganismos que se van

a repicar y con ayuda de un aza se toma una colonia del cultivo y en una caja estéril se repicar por agotamiento

como se ilustró anteriormente en el numeral 2.2. Se debe repetir el procedimiento para todos los controles,

esterilizando el aza después de acabar cada repique para evitar la contaminación cruzada, es posible usar

control positivo S. cerevisiae y negativo Pichia pastoris GS-115, los cuales deben estar en incubación durante

8

14-16 horas (overnight) a 30°C, y un control negativo E. coli BL-21 que se debe incubar a 37°C también

durante 14-16 horas.

Se realiza la preparación de “primers” o cebadores y todos los demás instrumentos para realizar la técnica

“Colony PCR” (Polymerase Chain Reaction), comenzando por autoclavar: 50 mL de agua ultra pura en un

frasco schott, 1 caja de puntas grandes (de 1000 microlitros), 1 caja de puntas medianas (de 100 microlitros),

40 tubos de PCR (tubos Eppendorf de 0.2 mL), 2 cajas de puntas pequeñas (de 10 microlitros) y 40 tubos

Eppendorf de 1.5 o 2 mL.

Para preparar los “primers” se deben poner en la microcentrífuga durante 5 segundos a 4000 rpm con el fin de

que todo el material se precipite al fondo, se debe revisar muy bien en los rótulos de cada tubo qué cantidad de

agua se debe agregar para preparar cada “primer” y a qué concentración quedará. En este caso cada uno de los

“primers” necesita 250 microlitros para obtener una concentración de 100 micromolar. El proceso de adición

de agua se realiza con agua estéril dentro de la cabina de flujo laminar horizontal esterilizada, posteriormente

realizar una fuerte agitación vórtex a cada uno de los tubos durante 5 minutos. Estos serán los “primers” de

stock.

Después, se debe preparar la solución de “primers” a usar (work solution), dentro de la cabina de flujo, se toma

un tubo Eppendorf de 1.5 mL y se adicionan 90 microlitros de agua estéril, posteriormente agregar 10

microlitros de la solución stock del primer, es importante rotular el tubo Eppendorf con el nombre del “primer”

y la letra F (Forward) o R (Reverse) según corresponda para evitar futuras confusiones. Se debe realizar este

procedimiento para todos los primers, y después de esto los “primers” quedarán con una concentración de 10

micromolar. Ya que la técnica es “Colony PCR” necesitaremos las colonias de las cajas con las divisiones

donde se realizó el repique, escogiendo sólo las divisiones que contienen colonias cuya morfología

microscópica es similar a la de S. cerevisiae obtenidas en el numeral 2.3.

Para comenzar la Técnica “Colony PCR” (Polymerase Chain Reaction) [23], con ayuda de una micropipeta de

100 microlitros y sus respectivas puntas se deben agregar 11.5 microlitros de agua estéril a cada uno de los

tubos PCR (#cajas = # colonias exitosas en la identificación microscópica + 3 para los controles). Después de

agregar el agua, con ayuda de una punta de 10 microlitros se toma una colonia simple de la división

seleccionada de la caja de Petri y se disuelven en el tubo de PCR con agua, al final desechar la punta y con una

nueva punta estéril repetir el procedimiento para cada una de las divisiones y cada uno de los controles. Para

simplificar y poder anotar en los pequeños tubos, se asigna un número a cada división y se debe anotar en cada

tubo según corresponda, de igual manera se deben marcar los tubos de los controles.

Luego, se deben colocar los tubos de PCR en el termociclador para romper las células y exponer el ADN

mediante dos ciclos, el primero a 99°C durante 5 minutos y el segundo a 4°C durante 2 minutos. Para precipitar

toda la solución de los tubos es necesario poner cada tubo de PCR en un tubo Eppendorf de 1.5 mL y luego

con ayuda de la microcentrífuga centrifugar durante 10 segundos a 4°C y 4000 rpm.

Con el ADN ya expuesto se comienzan a agregar a cada uno de los tubos y en el siguiente orden: 0.5 microlitros

del “primer” ScHO-F, 0.5 microlitros del “primer” ScHO-R (con puntas de 10 microlitros, desechar cada punta

después de agregar al tubo) y 12.5 microlitros de la solución DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (con

puntas de 100 microlitros, desechar cada punta después de agregar al tubo). Para asegurar una interacción

homogénea de todos los componentes se mezcla todo el contenido del tubo PCR con la misma punta de 100

microlitros configurando la micropipeta para 20 microlitros y pipeteando arriba y abajo. Esto se realiza con

cada uno de los tubos de PCR.

9

Ilustración 2. Colony PCR mix

Ya con todos los componentes mezclados, se deben poner los tubos en el termociclador para correr los

siguientes ciclos: Primero una etapa de choque térmico a 95°C durante 30 segundos, una segunda etapa de 30

ciclos de 90°C durante 30 segundos para la desnaturalización del ADN seguido de un annealing o templado a

55°C durante 30 segundos y posteriormente una elongación a 68°C durante 1 minuto, una tercera etapa a 68°C

durante 5 minutos para una extensión final, y una cuarta y última etapa de 5 minutos de enfriamiento a 10°C

[15]. Esto toma alrededor de 2 horas, luego de terminados todos los ciclos se procede a realizar la lectura en

gel.

Ilustración 3. PCR Cycle

En la electroforesis de ADN, se comienza ajustando la cama donde se pondrá el gel en la base de electroforesis

nivelándola con el ojo de burbuja y colocando el peine que contiene las divisiones de los pozos. Después de

tener lista la cama se comienza con la preparación de un gel al 0.9% de agarosa, para esto se agregan 0.4

gramos de agarosa a un matraz erlenmeyer y posteriormente 45 mL de buffer TBE al 1x. Para disolver

completamente la agarosa es necesario calentar la solución en el microondas con los siguientes ciclos: 30 seg,

15 seg, 15 seg, 20 seg. Entre ciclos se debe abrir la puerta del microondas y dejar enfriar durante 30 seg. Con

el fin de que se pueda observar la electroforesis se agregan 3 microlitros de HydraGreen y se mezcla con un

agitador hasta que quede homogéneo.

La mezcla se sirve en la cama antes preparada, asegurándose de no incorporar burbujas, se debe dejar enfriar

y polimerizar durante 45 minutos, ya que el HydraGreen es sensible a la luz se debe tapar la cama con papel

aluminio. Al solidificarse, se retira el peine con mucho cuidado para evitar dañar los pozos. En este punto se

pasa el gel con la cama a la cámara de electroforesis dejando los pozos del lado negativo (color negro) y se

llena la cámara con buffer TBE al 1x hasta cubrir totalmente el gel con la precaución de no pasarse del volumen

máximo. Es necesario preparar el marcador de peso midiendo para poder observar el tamaño del gen, para esto

se miden 0.5 microlitros de ADN ruler (en esta ocasión de 1Kb), 1.5 microlitros de agua estéril y 0.5 de ADN

Gel Loading Dye (6X) y se mezclan en un tubo de PCR estéril.

10

Con una micropipeta de 10 microlitros y sus respectivas puntas se toma una muestra de 8 microlitros de cada

una de las muestras en los tubos PCR además del marcador de peso y los controles. Se debe agregar la solución

con sumo cuidado a cada uno de los pozos en el gel, comenzando por el marcador de peso (preferiblemente en

la mitad del gel), los controles negativos y positivos cerca del marcador. Es necesario anotar las posiciones en

los que queda cada sustancia, tanto el marcador, los controles y las muestras para poder hacer el análisis

correctamente, esto se realiza para todas las muestras. En dado caso de sobrar muestra se guardan los tubos de

PCR en el congelador a -20°C. Después de todo esto se corre la electroforesis durante 1 hora y 5 minutos a

100 V, al finalizar el tiempo se debe dejar el gel con la cama sobre un papel para su posterior lectura en el

documentador de geles. Es posible reciclar el buffer que queda en la cámara de electroforesis.

Para la lectura de gel se prende y abre la bandeja del documentador de geles, la cual debe estar completamente

limpia. El gel debe posicionarse sobre la superficie teniendo cuidado de no dejar burbujas bajo el gel, en dado

caso se debe mover hacia distintas direcciones con el fin de eliminar todas las burbujas. Al cerrar la bandeja

se inicia el programa asociado al documentador (en este caso Image LabTM Software), y se crea un nuevo

protocolo en “Gel imaging”, en el menú “aplicación” seleccionar geles de ácidos nucleicos y “SYBR Green”

dejando lo demás por default. Se debe activar la opción “Lane and band detection” y “high”, en “Analyze

molecular weight” seleccionar en peso molecular estándar el marcador usado (en este caso NEB 1kb DNA

Ladder) y dejar lo demás por default. Se debe seleccionar “position gel” y el filtro 1, ya en este punto se procede

a acomodar el gel sobre la superficie de tal manera que quede en el centro y luego se corre el protocolo. Al

finalizar se deben eliminar todas las líneas de medición que realiza por default (manualmente una por una) y

en el menú “File” se selecciona “Export for publication” guardando la imagen en el destino deseado.

Para la identificación molecular de las cepas nativas de levadura S. cerevisiae se comienza observando las

bandas en cada columna de la imagen del gel. Al identificar el marcador de peso y los controles, asegurarse

que el marcador de peso tenga distintas bandas que se puedan asociar al valor del peso según la literatura del

ruler usado. De igual manera, asegurarse que el control positivo haya generado una banda gruesa en el lugar

esperado (en la banda de peso del gen que se quería multiplicar, en este caso 400 bp para el gen HO [15]) y

que los controles negativos no hayan generado ningún tipo de banda o en caso de hacerlo, la banda sea

completamente lejana al peso deseado.

Se deben identificar las muestras que tienen solamente una banda del mismo tamaño de bp o muy cercano al

del control positivo y anotar cuáles son, asociándolas con el número que se les asignó previamente, estas

muestras son cepas nativas de levadura S. cerevisiae. Se le debe asignar un nombre a cada cepa de levadura

que resultó ser positiva en la especie S. cerevisiae mediante un par de letras (el mismo para todas) y un número

desde 01 hasta el número total de cepas exitosas.

NOTA: Repetir los procedimientos para el otro par de “primers” que expresan otra especie de levadura (en

este caso se cambia S. cerevisiae por S. pastorianus o S. bayanus) y de igual manera para todas las muestras

asegurándose de siempre correr el marcador de peso y los controles. Se deben cambiar los controles por un

microorganismo de la especie a estudiar.

2.5 Caracterización de crecimiento

Se comienza con la preparación de las cajas de Petri en donde se van a cultivar las cepas nativas de S. cerevisiae

identificadas en el protocolo anterior, siguiendo el numeral 2.1, esto para tantas cajas como cepas exitosas.

Después de esterilizar la cabina de flujo laminar horizontal se ingresan las cajas de Petri y los cultivos de los

que se hará el repique (las cajas de Petri que tienen las divisiones de cada colonia aislada en el numeral 2.3).

Al tomar la caja de Petri con los microorganismos que se van a repicar (positivos en el numeral 2.4) con ayuda

de un aza se debe retirar una colonia del cultivo de la división para repicar la colonia por agotamiento en una

caja estéril como se ilustró anteriormente. Se debe tapar la caja y anotar sobre el cristal el nombre asignado en

el numeral anterior a cada una de las cepas positivas, este procedimiento se debe realizar para todas las cepas

de levadura nativa S. cerevisiae. Al finalizar se deben guardar las cajas de donde se tomaron las colonias

nuevamente en el refrigerador a 4°C (como respaldo). Y llevar las cajas sembradas una incubadora a 30°C

durante 14-16 horas (overnight).

11

Luego de tener las levaduras por aparte, se alista el material necesario para caracterizar su crecimiento. Para

esto se agregan 30 gramos de extracto de malta a 1000 mL de agua destilada en un schott y se disuelve en

plancha de calentamiento con ayuda de un agitador magnético hasta que quede homogéneo. Luego se preparan

los matraces erlenmeyer de 250 mL para autoclavar, primero lavando con detergente y secándolos

completamente, es importante hacer un tapón de gasa para ponerlo en el orificio y recubrir el tapón con papel

aluminio uniendo la gaza y el aluminio, esto con el fin de evitar que se contamine por dentro después y mejorar

la manipulación más adelante cuando se deban tomar las muestras. También se debe autoclavar el medio

preparado junto con 1 beaker de 100 mL, 1 beaker para desechar puntas y 2 cajas de puntas de 1000 microlitros.

También se necesitarán celdas para el espectrofotómetro, se debe marcar cada una con el número de cepa y

replica, además de otra celda marcada como el blanco, estas deben estar estériles para poder ingresarlas a la

cabina de flujo laminar horizontal.

Ya dentro de la cabina de flujo laminar horizontal, previamente esterilizada, se mide en el beaker 100 mL de

medio malta estéril para servir en cada erlenmeyer quitando el tapón, teniendo cuidado de que la gaza no toque

ninguna superficie, esto para todos los erlenmeyer. Sacar las cajas de Petri en donde se repicaron las levaduras

nativas comenzando con 3 solamente, y en la cabina de flujo laminar horizontal abrir cada una y tomar una

colonia con el aza para disolverla en cada uno de los erlenmeyer. Se debe realizar el proceso por triplicado y

para cada una de las 3 cepas nativas, se debe marcar en el erlenmeyer la cepa nativa correspondiente y el

número de réplica.

Usando la micropipeta se debe llenar cada celda con 2 mL de medio malta estéril, a la celda marcada como

blanco agregar 0.5 mL más. Luego se debe llenar cada celda con 0.5 mL de cultivo de cada erlenmeyer según

corresponda con la marcación y realizar pipeteo arriba y abajo para mezclar la solución. Recuerde desechar la

punta en un beaker de plástico y cambiarla para cada erlenmeyer, repetir el procedimiento para todos los

cultivos. Se debe poner a crecer la levadura en los erlenmeyer en una incubadora shaker precalentada

previamente a 30°C y una agitación de 200 rpm durante 36 horas.

Para analizar el crecimiento se lee la absorbancia de cada solución en el espectrofotómetro a 600 nanómetros,

primero leyendo el blanco y colocando ese valor como cero, posteriormente leer las demás soluciones

anotando el valor, la cepa y replica correspondientes. De igual manera se debe tomar la hora y el número de

lectura. Hay que desechar todas las soluciones en un beaker a excepción del blanco, el cual debe taparse con

parafilm ya que se reutilizará en las siguientes lecturas. Es importante lavar las celdas y secarlas muy bien

para tener datos confiables en las otras mediciones. Cada hora se deben sacar los erlenmeyer de la

incubadora y llevarlos a la cabina de flujo laminar horizontal para repetir el procedimiento, a excepción del

blanco, el cual permanece como al principio hasta completar las 36 horas.

NOTA: Este procedimiento debe repetirse 0 para todas las cepas de levadura nativas y además para la cepa

de control positivo S. cerevisiae CEN PK 2-1.

2.6 Caracterización de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares en la fermentación de cepas de

levaduras nativas de “Saccharomyces cerevisiae”

NOTA: Se debe realizar nuevamente el numeral 2.5 sin usar las celdas y la toma de lecturas cada hora para

retomar en la hora 36

Adicionalmente se debe realizar la toma y preparación de muestras autoclavando tubos Eppendorf de 2 mL,

un frasco schott con 100 mL de agua y una caja de puntas de 1000 mL. Dentro de la cabina de flujo previamente

esterilizada se debe realizar la toma de muestra pasadas las 36 horas de cada una de las fermentaciones de las

cepas nativas y la cepa control realizadas en los erlenmeyer. Tomar con una micropipeta 1.5 mL de cultivo y

agregarlo a cada tubo Eppendorf estéril, se debe marcar a qué cepa corresponde la muestra. Además, se debe

tomar una muestra del medio malta estéril (el inicial) para ver el cambio y el incremento o reducción de

sustancias. Para esto también se agrega a un tubo Eppendorf estéril 1.5 mL de medio y se marca como inicial.

En viales dispuestos para correr muestras en el HPLC se agregan las muestras recolectadas anteriormente, sin

embargo, antes deben ser filtradas con un filtro de 0.22 micrómetros para eliminar cualquier microorganismo

o sólido indeseado que pueda afectar la medición o el funcionamiento del equipo. Para esto, con una jeringa

12

se saca el contenido de cada muestra en el tubo Eppendorf y con un trompo y filtro se comienza a añadir el

contenido a uno de los viales además de marcarlo con el tipo de cepa. Este procedimiento se realiza para todas

las muestras usando un nuevo filtro para cada muestra y pringando la jeringa con agua. Luego se tapan los

viales asegurándose que la tapa tenga la parte lisa hacia dentro del vial.

Para la preparación y funcionamiento del HPLC se comienza seleccionando la columna con la cuál es posible

separar los componentes deseados de la muestra. Para este caso la columna Rezex RCM-Monosaccharide Ca+2

8% es la indicada ya que permite separar ácidos orgánicos, azúcares y alcoholes. Se deben realizar las curvas

de calibración para cada uno de los componentes que se desean obtener en la muestra, para esto se hacen

diluciones desde 50 ppm hasta 15000 ppm para los componentes de interés realizando 10 diluciones entre estos

rangos. Los componentes que se quieren separar son algunos ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares. La

preparación de las soluciones de cada concentración se realiza en tubos Eppendorf añadiendo una pequeña

porción del componente y sabiendo la concentración inicial se agrega agua destilada hasta encontrar la

concentración deseada, mediante la fórmula 𝐶1 ∗ 𝑉1 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 (Ecuación 1), es importante marcar la

concentración y el componente respectivo en cada tubo.

De igual manera que como con las muestras, se deben agregar las curvas de calibración realizadas

anteriormente en viales para el HPLC, repitiendo el procedimiento para todos los componentes y

concentraciones usando un nuevo filtro, es importante comenzar a filtrar desde la concentración más baja hasta

la más alta para evitar errores. Se debe preparar la fase móvil que está especificada para cada columna a la

concentración requerida, en este caso la fase móvil es ácido sulfúrico (H2SO4) a 2 micromolar. Es necesario

preparar varios litros a esta baja concentración ya que se correrán varias muestras, para esto se debe añadir en

un balón aforado la cantidad necesaria del componente puro para luego diluirla con el fin de encontrar la

concentración deseada, el volumen inicial del componente puro se halla con la ecuación antes expuesta 𝐶1 ∗𝑉1 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 (Ecuación 1).

La fase móvil que se preparó también debe ser filtrada con un filtro de 0.22 micrómetros para eliminar cualquier

sólido indeseado que pueda afectar la medición o el funcionamiento del equipo. Para esto se debe usar el equipo

de filtración del laboratorio junto con el filtro y una manguera conectada al vacío para acelerar la filtración.

Posteriormente la fase móvil es agregada al frasco schott que estará en el HPLC, no sin antes ser desgasificado

en el baño ultrasónico durante 10 minutos en el programa de desgasificación. Al poner el frasco en el baño

asegurarse de no dejarlo herméticamente cerrado para permitir que al gas salir de la solución.

Ubicar la fase móvil y la columna en los lugares correspondientes e ir añadiendo en el lugar de los viales, en

las primeras posiciones, las curvas de calibración previamente hechas, y luego las muestras a leer. Añadir el

nombre y la composición de cada uno de los viales en el programa del HPLC como un nuevo método y una

nueva secuencia, además si el vial es de calibración se debe especificar en el programa para que luego pueda

realizar la curva de teniendo en cuenta las composiciones registradas. Si el vial contiene una muestra, asignarlo

de esta manera en el programa y añadir un nombre según corresponda, cual la cepa o si es el medio estéril

(inicial).

Se debe añadir un vial de lavado con agua estéril previamente filtrado en la última posición de viales y agregar

un método de lavado al final del ciclo. Después de todo esto se comienza a correr el método haciendo que el

HPLC se equilibre primero con la fase móvil y luego si comenzar a iniciar la secuencia en donde se realiza la

lectura de las composiciones de las curvas y de las muestras. Este proceso dura aproximadamente 40 minutos

por vial

Al finalizar la lectura, se deben realizar las curvas para cada uno de los componentes basados en las mediciones

realizadas, posteriormente se crea un método que evalúe cada uno de los componentes en las muestras.

Seleccionar solamente las muestras de las fermentaciones y el medio inicial y correr el método anteriormente

hecho, identificando picos de los componentes y concentraciones. Realizar la integración automática a cada

una de las curvas arrojadas en las lecturas de las muestras, y de existir alguna integración mal realizada

corregirla manualmente para cada uno de los componentes y para cada una de las muestras. Al terminar de

realizar la integración manualmente guardar los cambios y correr el reporte generado en PDF para cada una de

las muestras de la fermentación y solución inicial del medio, obteniendo los componentes presentes en cada

una de ellas y su respectiva concentración.

13

2.7 Producción y caracterización organoléptica de cerveza hecha con levadura nativa

“Saccharomyces cerevisiae”

En primer lugar, para esta caracterización se debe comenzar con la preparación de la levadura nativa con el fin

de dejarla en fase exponencial. Se realiza el mismo procedimiento del numeral 2.5 hasta poner a crecer la

levadura en los erlenmeyer en una incubadora shaker precalentada previamente a 30°C y una agitación de 200

rpm. En las curvas de crecimiento observar qué cantidad de tiempo deben permanecer creciendo hasta que

lleguen a fase exponencial (normalmente 14-16 horas). Pasado este tiempo, en la cabina de flujo laminar se

agregan 50 mL de cultivo de cada uno de los erlenmeyer a un tubo Falcon de 50 mL previamente esterilizado

y se anota en cada tubo el nombre de la cepa.

Los tubos deben ser centrifugados en la centrífuga refrigerada durante ciclo de 20 minutos a 4000 rpm y 4°C,

al finalizar el ciclo se debe desechar el sobrenadante de cada y posteriormente agregar los 50 mL restantes de

cultivo de cada una de las cepas al tubo correspondiente y cerrar herméticamente el contenido. Para evitar que

sigan creciendo las levaduras se deben poner los tubos en una nevera de icopor con hielo para detener el

crecimiento de las levaduras y luego llevarlos lo más pronto posible a la cervecería artesanal que se encargará

de la producción de cerveza para que use una levadura en cada bache de cerveza.

Para la producción de cerveza se prepara un mosto de cerveza base con un tipo de malta que no añada en gran

proporción sabores u olores exóticos al producto final, simplemente los sabores y olores base de la malta,

además de un lúpulo que de igual manera no impacte el sabor u olor y solo añada el amargo característico de

la cerveza. Esto se prepara en recipientes de 3 litros estériles en donde se realizará la fermentación

asegurándose de tener tapones que permitan un cierre hermético con espacio para un airlock que permita la

salida del CO2 y evite el ingreso de cualquier microorganismo no deseado. Se debe añadir el mosto a cada uno

de los recipientes (1 para cada levadura nativa y otro adicional para una levadura control) y posteriormente

agregar las levaduras previamente preparadas en los tubos Falcon. También es importante agregar a uno de

estos recipientes con mosto una levadura control que normalmente se use en la producción de cerveza y la cual

no aporte en gran medida sabores u olores al producto final.

Al cerrar los recipientes se deben mantener todos a una misma temperatura. Es importante observar muy

detenidamente el avance de la fermentación durante los 8 a 15 días que puede durar y anotar las características

del mosto durante este tiempo. Al terminar la fermentación, al mismo tiempo en todos los recipientes, se

trasvasan las cervezas en botellas color acre rotulándolas con el tipo de cepa de levadura usada. Antes de cerrar

herméticamente la botella se debe añadir azúcar para continuar la fermentación y generar CO2 para que la

cerveza quede carbonatada y no añada sabor u olor. Se debe hacer lo mismo para todos los recipientes

asegurándose de agregar la misma cantidad de azúcar a cada botella y de marcar correctamente cada una de

ellas. Es importante tomar una muestra del mosto inicial y de la cerveza final para realizar la medición de la

densidad y el pH con el fin de realizar una comparación entre ellas. Finalmente se dejan carbonatar durante un

par de días dichas cervezas y se guardan en el refrigerador a 4°C para que se enfríen e incorporen todos los

sabores y olores posibles para su posterior degustación.

Para la cata de cerveza se debe reunir un panel de catadores con el fin de evaluar las distintas cervezas

realizadas con levaduras nativas. Se establece un formato de evaluación con 3 ítems importantes: color, aroma

y sabor, para que cada evaluador dé su veredicto. Con el fin de contextualizarlos se debe explicar el proceso

de producción y sus variaciones entre cervezas, además del objetivo del proyecto. Para limpiar el paladar de

los sabores y quitar los aromas que persistan se ofrece agua y galletas de soda. La cata se debe llevar a cabo

en un espacio cerrado y con buena iluminación para que se aprecie completamente el color y el aroma.

Al destapar la cerveza se sirve inmediatamente en vasos pequeños de vidrio traslúcidos muy limpios que

permitan apreciar el color de la cerveza y su turbidez. Se pasan a los catadores exponiéndoles qué tipo de

cerveza van a degustar y a cuál levadura corresponde. Los evaluadores comienzan la cata y llenan sus

formularios, mantener la cata en silencio y sin realizar ningún tipo de gesto para evitar influenciar los

resultados. Después de que todos hagan su evaluación, realizar los comentarios pertinentes para determinar si

hay veredictos muy contradictorios o por el contrario todos se alinean en el mismo resultado. Es importante

tener en cuenta en la cata el retro gusto y la duración de las sensaciones, al igual que su intensidad.

14

Se realiza el mismo procedimiento con todas y cada una de las cervezas en un vaso distinto, ofreciendo entre

cervezas agua y una galleta de soda que elimine cualquier sabor y aroma que persista en el comensal. Al

finalizar se recolectan los formatos, no sin antes pedir que realicen un ranking de las cervezas.

2.8 Creación de bancos criogénicos

En primer lugar, se debe realizar la preparación de la solución de glicerol al 50%, para esto se adicionan 50

mL de glicerol al 100% y 50 mL de agua destilada a un frasco schott y se mezcla con un agitador magnético

calentando levemente hasta que esté totalmente homogéneo. Para preparar el medio líquido se agregan 10

gramos de extracto de levadura, 20 gramos de peptona y 20 gramos de dextrosa a 1000 mL de agua destilada

en un frasco schott, se calienta y mezcla con agitador magnético para disolver completamente hasta que quede

homogéneo. Es muy importante esterilizar el medio tapando el frasco schott asegurándose de que no quede

hermético, la solución de glicerol al 50%, además de los demás implementos como puntas y los crioviales de

1.5 mL en la autoclave a 15 lbs de presión y 121°C durante 15 a 20 minutos [17].

En la cabina de flujo laminar horizontal previamente esterilizada se agregan 10 mL de medio de cultivo YPD

a un tubo Falcon y se rotula con la marca correspondiente a cada levadura o control. Para sembrar inicialmente

se debe esterilizar el aza en un mechero bunsen hasta que se torne naranja y se espera a que se enfríe para luego

retirar una colonia simple de la caja de Petri y disolverla en el medio de cultivo del tubo Falcon. Se repite este

procedimiento para todas y cada una las levaduras y controles en un nuevo tubo Falcon esterilizando el aza al

cambiar de microorganismo. Al finalizar se ponen los tubos en una gradilla, asegurándose que no queden

totalmente herméticos, para llevarlos a una incubadora a 30°C durante 14 a 16 horas (overnight), a excepción

del control negativo (E. coli Bl-21) que se debe incubar a 37°C durante el mismo tiempo.

La preparación de soluciones a criogenizar comienza añadiendo 1 mL de solución de glicerol a cada criovial,

luego se adicionan 500 microlitros de cultivo de la levadura o control que cultivamos previamente y se pipetea

arriba y abajo para mezclar completamente. Se debe rotular muy bien el criovial con el nombre del

microorganismo y continuar repitiendo el mismo procedimiento para todas las levaduras y controles. Se debe

llenar el formato de criogenia con el tipo de microorganismo (S. cerevisiae, Pichia pastoris, E. coli) y la

subespecie (nombre asignado a cada cepa y CEN PK 2-1, GS-115, BL-21) además de la fecha de realización

de la criogenia, el nombre de la persona que la realizó y la posición en que quedó cada microorganismo.

15

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En primera medida se realizó el acercamiento con los dueños y encargados de los molinos de caña o trapiches

del municipio de Moniquirá en Boyacá logrando que 4 de ellos nos permitieran realizar la recolección de

material biológico en cada uno de los molinos. Estos molinos se encuentran en una vereda llamada Muñoces &

Camachos reconocida en la región por ser una vereda panelera donde se cultiva principalmente la caña de azúcar

tanto en fincas de gran extensión como en pequeños lotes. Se indagó por la fecha en la que se llevarían a cabo

las moliendas programadas en el mes de febrero encontrando que un mismo fin de semana 2 de los 4 molinos

estarían terminando las moliendas, y los otros dos habrían acabado un día atrás. Se preparó todo el material

necesario para la recolección en campo, un par de días antes de ir a los lugares de interés. Ya estando en el

lugar, se planeó un recorrido que permitiera tomar las muestras en un solo día comenzando por el molino

llamado ‘La Manuelita’ de ahora en adelante el molino número 1. Este molino es el que había acabado su

molienda el día anterior, sin embargo, no se había realizado la limpieza por lo que existían varios residuos que

se podían observar por todo el lugar. Se realizó un primer recorrido por el molino identificando 3 lugares de

interés. El primero en una de las pailas donde se cocina el jugo de caña, el segundo en el lugar donde se almacena

la melaza gruesa en condiciones de suciedad, y el tercero en un recipiente con melazas limpias y una leve

espuma sobre estas. Se siguió la metodología de aislamiento 2.1 obteniendo las primeras 3 cajas de Petri con

material biológico.

El siguiente molino en cuestión es ‘El manantial’ de ahora en adelante molino número 2, al llegar al lugar aún

se encontraban en la molienda, luego de casi 10 días de molienda continua, por lo que existían gran cantidad de

residuos por todo el lugar y líquidos frescos también. En el recorrido por el trapiche se identificaron 7 lugares

de interés debido a que aún estaba en funcionamiento y no se había limpiado ninguna superficie. El 1er lugar

fue un recipiente en el que se filtra el jugo de caña en su primera cocción, el 2do en un tanque donde se almacena

la melaza gruesa y sucia, el 3ro en un recipiente donde se prepara el jugo de la cáscara de balso que se usa como

aglutinante para limpiar el jugo de caña de las impurezas que éste pueda traer [24], el 4to lugar corresponde a

donde se filtra el jugo al llegar a la zona de pailas, el 5to en el piso cerca de las últimas pailas donde se halló

jugo de caña reposado, el 6to fue en un recipiente en donde llega el jugo que sale de la caña recién molida, el

7mo fue donde se le hace la primera filtración a este jugo de caña.

El molino número 3 nombrado ‘Jordán’ también se encontraba en proceso de producción, pero ya había acabado

de moler toda la caña y estaban terminando de procesar el jugo. Al realizar el recorrido se encontraron 8 lugares

de interés que incluían también fermentos realizados con los jugos y mieles del propio trapiche. El 1ro lugar

fue seleccionado justo bajo el ‘trapiche’ (los rodillos que exprimen la caña) donde caen residuos de jugo de

caña y se quedan estancados. El 2do en el primer recipiente donde se filtra el jugo que contiene residuos de

bagazo de caña. El 3ro en la bandeja que lleva el jugo recién exprimido hacia donde se hace el primer filtrado.

El 4to lugar de interés fue en medio de los rodillos que exprimen la caña y llevaba un día sin manipularse, en

donde se encontraron residuos de caña y jugo. El 5to fue en la primera paila de la cocción del jugo de caña, esto

se realiza justo después del primer filtrado. El 6to lugar fue un recipiente de plástico grande (de 20 litros) a

media capacidad, donde se prepara el guarapo (jugo de caña fermentado), este líquido se encontraba burbujeante

por lo que allí se estaba realizando un proceso de fermentación y tendrían que existir levaduras. El 7mo lugar

fue en un valde con el guarapo diluido, allí el burbujeo era menor. El 8vo lugar fue de una vasija metálica que

contenía la miel caramelizada después del proceso y la cual era usada para preparar el guarapo.

El último molino llamado ‘Santos Miguel’ de ahora en adelante molino número 4 había acabado la molienda el

día anterior y se había realizado la limpieza justo después de terminar, sin embargo, aún se encontraban algunos

pocos lugares con residuos. Al realizar el reconocimiento del lugar se ubicaron 5 lugares de interés. El 1er lugar

fue en uno de los recipientes en donde comienza el proceso de filtrado del jugo de caña, el cual tenía aún jugo

reposado. El 2do estaba ubicado debajo del ‘trapiche’ donde se exprime la caña que aún contenía residuos tanto

de jugo como de bagazo, aunque llenos de suciedad. El 3ro fue ubicado en el recipiente donde se almacenan las

melazas gruesas y sucias, el recipiente estaba a media capacidad. El 4to lugar corresponde a un recipiente donde

se prepara el jugo de cáscara de balso que ya contenía lodos. El 5to fue seleccionado en el piso al lado de las

pailas donde se encontraron restos de miel. De igual manera dos puntos extras el 6to (también denominado

Blanco 1) se tomó en un tronco hueco que contenía jugos. Y finalmente el 7mo (denominado Blanco 2) se tomó

en el piso cerca al trapiche donde había jugos reposados. Se pueden encontrar las fotos de los lugares y sus

16

respectivas muestras en el Anexo 1, en total se evaluaron 25 sitios en todos los molinos. Estas fotografías se

tomaron un día después de recolectar las muestras.

Tabla 1. Molinos y sus respectivos lugares de toma de muestras.

Molino #1 Molino #2

La Manuelita El Manantial

Lugar Característica Lugar Característica Lugar Característica

1 Jugo caña cocción 1 Jugo caña cocción 5 Jugo piso

2 Melaza gruesa 2 Melaza gruesa 6 Jugo caña inicial

3 Melaza limpia 3 Jugo balso 7 Jugo 1er filtrado

4 Jugo 2do filtrado

Molino #3 Molino #4

Jordán Santos Miguel

Lugar Característica Lugar Característica Lugar Característica Lugar Característica

1 Vasija trapiche 5 Jugo caña cocción 1 Jugo filtrado 5 Piso mieles

2 Jugo 1er filtrado 6 Guarapo 2 Vasija trapiche 6 Jugo tronco

3 Jugo caña inicial 7 Guarapo diluido 3 Melaza gruesa 7 Piso trapiche

4 Trapiche 8 Miel caramelizada 4 Jugo balso

Se dejó incubar cada caja de Petri a temperatura ambiente durante 3 días para que todos los microorganismos

en las muestras lograran desarrollarse y se pudiera apreciar fácilmente a plena vista su morfología macroscópica

en fase exponencial. Los primeros resultados se pueden evidenciar en el crecimiento de las muestras

recolectadas en los trapiches, donde ya se pueden apreciar distintas formas y colores de colonias donde se

encuentran los microorganismos. Después del análisis de morfología se lograron identificar 11 cajas de Petri de

muestras que contenían microorganismos cuya morfología macroscópica a plena vista se asemejaba a levaduras

y en específico a levaduras del género S. cerevisiae, esto significa que en 11 de los 25 lugares evaluados se

encontraron posibles levaduras, es decir, una tasa de acierto del 44% lo que indica que se seleccionaron

adecuadamente los lugares cuyas condiciones promovían a la aparición de estos microorganismos. Cabe resaltar

que en cada molino se encontraron al menos 2 lugares que arrojaron resultados positivos en la identificación

macroscópica.

La mayoría de las colonias seleccionadas presentaban morfología circular, similar a una semiesfera de color

blanquecino y textura cremosa. Algunas otras colonias seleccionadas presentaban una diferencia en el color,

con un tono amarillento. También se seleccionaron unas colonias que, aunque presentaban todas las

características de S. cerevisiae tenían un borde seco, con una textura totalmente diferente a la del centro de la

colonia, estos bordes se quebraban generando estrías en la colonia. Así como se pudieron identificar algunas

colonias simples también se encontraron colonias que crecían aglomeradas, algunas de ellas fueron

seleccionadas ya que presentaban las características correctas. De igual manera, se encontraron varias muestras

con gran suciedad ya que los lugares donde se tomaron tenían cenizas u otros solidos que no eran posibles de

separar. Algunas cajas que fueron descartadas por no contener posibles colonias presentaban un olor

desagradable y morfologías macroscópicas similares a hongos esporulados.

Las fotos de las muestras cuyos microorganismos presentan posible morfología de levaduras se encuentra en el

Anexo 2. En las fotografías se pueden apreciar las marcas que se realizaron ubicando las colonias con mayor

probabilidad de ser levaduras. En algunas placas de Petri solamente se encontró una sola posible colonia

mientras que en otras cajas se ubicaron 4 (las que tenían mejor aspecto y estuvieran más aisladas) ya que había

gran cantidad de posibles colonias en una sola caja. El molino que arrojó la mayor cantidad de posibles colonias

fue el número 3, esto puede deberse a que aún estaba en proceso de producción y ya un día atrás habían

terminado la molienda de toda la caña, promoviendo a la aparición de levaduras ya que en este tiempo los jugos

permanecen estáticos en las vasijas por la acumulación de éste y la planta no tenía la capacidad para usar todo

el jugo. Los lugares asociados a vasijas o pisos donde se encontraban los jugos de caña, melazas gruesas y

limpias, además de las mieles fueron exitosos. Por el contrario, los únicos lugares que no tuvieron posibles

levaduras fueron los relacionados a las vasijas con jugo de cáscara de balso. Esto se debe a que este líquido no

contiene los nutrientes necesarios para la aparición de levaduras y su temperatura es baja.

17

Tabla 2. Molinos y lugares exitosos en la identificación macroscópica.

Molino #1 Molino #2

Imagen 1. Toma de muestras en molino 1.

La Manuelita El Manantial

Lugar Característica Lugar Característica

1 Jugo caña cocción 1 Jugo caña cocción

3 Melaza limpia 4 Jugo 2do filtrado

Molino #3 Molino #4

Jordán Santos Miguel

Lugar Característica Lugar Característica

5 Jugo caña cocción 1 Jugo filtrado

6 Guarapo 5 Piso mieles

7 Guarapo diluido 6 Piso trapiche

8 Miel caramelizada

Los siguientes resultados se pueden apreciar en el primer aislamiento realizado mediante la técnica de repique

por agotamiento que se logró desde las colonias seleccionadas previamente. En este caso se usó menor espacio

para cultivar ya que había un promedio de 2 posibles colonias por cada lugar y de hacerse en una sola placa

esto representaría un gasto innecesario de reactivos tales como el medio de cultivo. Sin embargo, se asume un

mayor riesgo de contaminación externa y contaminación cruzada, por esta razón esta contaminación ocurrió en

una de las cajas, la cual se contaminó al hacer el repique (contaminación externa) con un hongo verde y en otra

caja en una de las divisiones se observa que la colonia seleccionada tiene morfología de hongo con esporas, que

no es lo deseado y puede generar una contaminación cruzada ya que las esporas pueden migrar fácilmente hacia

las otras divisiones. Las fotografías de estos repiques se pueden observar en el Anexo 3.

Debido a que el primer repique, en el que se lograron aislar 24 colonias, cada una en una división, tenía muestras

que evidentemente no eran levaduras, además de la existencia de una caja contaminada con un microorganismo

no deseado, se tuvo que realizar un segundo repique también con la técnica de agotamiento. Este segundo

cultivo se realizó desde colonias presentes en el primer repique y unos aislamientos adicionales de más cepas

desde las muestras originales tomadas en campo. Esto para aumentar las posibilidades de que alguna de las

colonias fuera S. cerevisiae y así mismo disminuir la tasa de fracaso asociada a las colonias que evidentemente

no eran levaduras y a la posible contaminación por esporas que pudo generar el hongo no deseado.

Así pues, en este segundo repique se obtuvieron 36 divisiones con posibles colonias de levadura cuya

morfología macroscópica tiene características de S. cerevisiae: Colonias circulares, blanquecinas, con una

textura similar a la crema y una superficie brillante. También se seleccionaron colonias con pequeñas

variaciones de las características, para obtener levaduras de otros géneros o especies, pero en general

manteniendo el tono blanco-amarillento. Estas colonias aisladas pueden apreciarse en las fotografías del Anexo

4. En este segundo repique se tuvo mayor control en el repique para evitar la contaminación y así no se obtuvo

ninguna caja contaminada. Por otra parte, se mejoró la técnica del repique para generar más colonias simples y

se disminuyó el tiempo de crecimiento a 12 horas para obtener colonias más pequeñas para que no se juntaran

entre ellas.

Al obtener tantas divisiones con posibles colonias se puede aumentar la tasa de éxito en la búsqueda de

levaduras, sin embargo, esto también dificulta la manipulación de las cepas. Para disminuir este número y estar

cada vez un poco más seguros de que los microorganismos sean levaduras se continúa al siguiente nivel de

identificación a una escala microscópica de la morfología de las células. Esta identificación se realizó tanto para

las colonias del primer repique, 13 descartando algunas de ellas que estaban contaminadas y otras que no tenían

la morfología macroscópica deseada, como para el segundo repique en el que las 36 divisiones fueron

seleccionadas ya que todas las aisladas estaban con la morfología macroscópica correcta. El número de colonias

por lugar se puede observar en la siguiente tabla.

18

Tabla 3. Número de colonias por lugar seleccionado macroscópicamente para identificación microscópica y nivel de

floculación.

Identificación macroscópica

Marca Característica Flocula Repique # colonias Marca Característica Flocula Repique # colonias

#1-1 Jugo caña

cocción

Muy

baja 1 3

#3-7 Guarapo

diluido Media

1 2

2 6 2 3

#1-3 Melaza

limpia Media

1 2 #3-8

Miel

caramelizada Baja

1 3

2 1 2 4

#2-1 Jugo caña

cocción Media

1 2 #4-1 Jugo filtrado

Ligera

alta

1 1

2 3 2 1

#2-4 Jugo 2do

filtrado

Ligera

baja

1 1 #4-5 Piso mieles Alta

1 2

2 2 2 2

#3-5 Jugo caña

cocción

Muy

alta

1 4 #4-7 Piso trapiche

Ligera

alta

1 2

2 9 2 2

#3-6 Guarapo Baja 1 2 Rep 1 24

60 2 3 Rep 2 36

Al realizar los cultivos líquidos para poder observar las células en el microscopio e identificar entre otros

aspectos, que las células sean eucariotas con un núcleo definido, también se pudieron observar otros resultados

interesantes antes de realizar la observación microscópica, tales como la floculación de estas posibles levaduras

en un medio líquido, en este caso YPD. Esto se observó tanto para las colonias del primero como para las del

segundo repique. Esto significa un primer avance de los resultados del tono o turbidez de la cerveza que se hará

con las levaduras.

Al organizarse los tubos Falcon desde el más traslucido hasta el más turbio se observaron distintos grados de

floculación. En este caso los que presentaban mayor floculación y precipitación de células fueron las colonias

recolectadas en el molino número 3 en el lugar 5 pertenecientes a una vasija con jugo de caña en cocción pero

que aún estaba caliente. Contrariamente sucedió con las colonias asociadas a el molino número 1 en el primer

lugar de recolección, estas muestras presentaban una turbidez alta, por lo tanto, una muy baja floculación y un

color blanquecino debido a la dispersión de células por todo el medio, estas colonias fueron recolectadas en un

jugo de caña reposado durante un par de días. La imagen de la floculación del segundo repique se puede observar

a continuación, las demás imágenes se encuentran en el Anexo 5 y 6 para el primer y segundo repique

respectivamente.

Imagen 2. Floculación en medio líquido YPD de colonias identificadas macroscópicamente, segundo repique.

Esta tendencia de floculación se mantuvo para los dos repiques. La floculación se encuentra relacionada

directamente con la atenuación, capacidad que tiene una levadura de consumir alcohol. Las levaduras que

presentan una alta floculación generalmente realizan la fermentación en poco tiempo lo que influye en que se

precipiten con mayor rapidez a diferencia de las de baja floculación. Un claro ejemplo de levaduras con baja y

alta floculación son las levaduras belgas Safbrew S-33 e inglesa Safale US-04 respectivamente [25]. Es

19

importante mencionar que en este punto sólo se ha realizado la identificación macroscópica, por lo tanto, no es

confiable que todos los microorganismos presentes en las muestras sean levaduras y la floculación se deba entre

otras cosas a una fermentación distinta (láctica o acética). Para estar más seguros de que fuera el

microorganismo deseado se continuo con la identificación microscópica y así poder realizar un análisis más

acertado respecto a la floculación.

Después de analizar las fotografías de la morfología de las células que se cultivaron en medio líquido YPD,

capturadas en el microscopio a un acercamiento de 50x, se encontraron 24 células cuyas características

morfológicas a una escala microscópica concordaban con la morfología de la levadura S. cerevisiae expuesta

en la literatura. Esta morfología corresponde a células eucariotas multilaterales ovaladas o redondas y

pseudohifas rudimentarias (en ocasiones bien desarrolladas) con tamaños que oscilan entre los 5 y 10

micrómetros [26], debido a que la reproducción de estos microorganismos se realiza por gemación son

comúnmente observadas en este proceso con pequeñas gemas desprendiéndose de sus paredes [27]. Algunas de

ellas se presentaban con menor tamaño, además de una gemación más lenta y presente en pocas células a

diferencia de otras muestras en las que prácticamente todas las células se encontraban en proceso de

reproducción por gemación. Esto puede deberse a la fase en la que se encuentra el crecimiento de las células,

las que presentaban gemación en casi todas sus células muy seguramente se encontraban en una fase

exponencial en donde su reproducción es acelerada y la fermentación comienza a darse. Por el contrario las

muestras en cuyas células no presentaban casi gemación estaban en una fase inicial en la que las células

comienzan a adaptarse al medio y comienzan a reproducirse, o en una fase inicial, la más probable, debido a

que ya se habían incubado durante 14 horas y es en esta fase en donde la fermentación ya está avanzada y las

células comienzan a dejar de reproducirse y a comenzar a morir debido a las altas concentraciones de etanol

presentes en el medio y la falta de glucosa.

De igual manera se encontraron varias morfologías que evidentemente no correspondían a levaduras de esta

especie ya que tenía formas alargadas, estos microorganismos muy posiblemente correspondían a E. coli o

Bacilus megaterium, y otras morfologías con pequeñas células circulares unidas unas a otras en línea sin ningún

tipo de gemación posiblemente estas pertenecían a la especie Streptococcus pneumoniae o Bacilos de Pfeiffer

[28]. Hay que resaltar que de las 49 colonias cultivadas en medio líquido y analizadas en el microscopio, casi

el 50% arrojaron una morfología concordante con la de la literatura, así pues, la tasa de éxito fue muy alta. En

las siguientes fotografías se observa una imagen de la morfología microscópica de una las células de la colonia

aislada de las muestras recolectadas en el lugar 6 del molino número 3 perteneciente al jugo de caña fermentado

(guarapo), y otra imagen de la morfología de levadura S. cerevisiae encontrada en la literatura [29]. En este par

de imágenes se puede observar las grandes semejanzas entre las morfologías de las células, se puede apreciar

el núcleo totalmente definido en ambas fotografías, además de la morfología circular u ovoide con algún tipo

de punta en uno de los extremos de la célula. De igual manera se puede apreciar la gemación de las células en

donde se genera una pequeña protuberancia que va creciendo hasta que alcance el mismo tamaño de su célula

madre y se separe. Las fotografías de todas las morfologías encontradas en los cultivos pueden observarse en

el Anexo 7 para el primer repique y en el Anexo 8 para el segundo.

Imagen 3. Morfología microscópica 3.6 B.

Imagen 4. Morfología S. cerevisiae literatura [29].

20

Para las muestras del primer repique, de las 14 evaluadas se encontró que 12 de ellas presentaban una morfología

similar a la de la literatura, y para el segundo repique se establecieron también 12 de las 36 que se evaluaron.

Los porcentajes de éxito para el primer y segundo repique fueron del 85% y del 34% respectivamente. En el

segundo repique disminuyó mucho el porcentaje debido a que una gran parte de las muestras (9) pertenecían a

un mismo lugar del molino número 3, sin embargo, las evaluaciones de los microorganismos para todas estas

muestras resultaron ser negativas para S. cerevisiae. Este lugar correspondía al jugo de caña en cocción a alta

temperatura, si bien esta morfología no es asociada a la levadura en cuestión, es posible que sí perteneciera a

otro tipo de levadura u otro tipo de microorganismo como bacterias y por esta razón los resultados de floculación

para todas estas colonias en medio líquido YPD fue muy alta.

También se pudo percatar que dentro del mismo cultivo se encontraban varias morfologías de microorganismos,

esto indica que alguna de las muestras se encontraba contaminada, y esto seguramente pudo darse a la hora de

cultivar las colonias en el medio líquido por no se realizarse la esterilización del aza correctamente. El

microscopio usado ofrecía distintos filtros con los que se mejoraba la identificación de los microrganismos, uno

de ellos fue el filtro negativo que permitía observar las células de un color gris-azul brillante con un fondo

negro, haciendo uso de este filtro el borde de las células era más evidente y por lo tanto la gemación se hacía

más clara. En la siguiente imagen se pueden observar 2 pares de células gemando, una de ellas con dos gemas

(una más pequeña que otra), además de células aisladas en el medio. Se encontraron también muestras en las

que varias células estaban aglutinadas en un pequeño espacio. Y como era de esperarse teniendo en cuenta la

teoría, las principales muestras cuyas células estaban aglutinadas correspondían a las que tenían una floculación

media alta, es decir menor turbidez. El núcleo de las células que presentaban aglomeración era más notorio y

de igual manera las células se encontraban en gemación. Se pueden observar una muestra dispersa y una

aglomerada en las siguientes fotografías.

Imagen 5. Morfología microscópica células dispersas con

filtro negativo muestra 3.6 B.

Imagen 6. Morfología microscópica células aglomeradas

muestra 3.7 B.

Las células muestran una posible tendencia a ser levaduras y adicionalmente en caso de que todas fueran de la

misma especie S. cerevisiae puede existir variación intraespecífica debido al comportamiento de las células

entre ellas como la aglomeración de estas. Ya en este punto la certeza de que las cepas seleccionadas en la

escala microscópica sean levaduras es bastante alta además de que realmente pertenezcan a la especie S.

cerevisiae, sin embargo, aún no se puede afirmar completamente ya que pueden existir microorganismos con

morfologías microscópicas muy similares entre ellos, pero pueden ser totalmente distintos, incluso pueden no

ser levaduras o ni si quiera hongos. Por esta razón se debe ahondar en la escala con el fin de identificar con total

certeza la especie en cuestión. Para esto es necesario entrar a la escala molecular con el fin de usar el ADN de

la célula como la característica más especial y única de la célula y así identificar sin espacio a equivocaciones

la especie de los microorganismos seleccionados microscópicamente. Para esto se usó la técnica Colony PCR

con el fin de ampliar un gen específico de la célula, el gen HO con ayuda de “primers” o cebadores que se

acoplan al inicio y final del gen [15]. Se relacionaron la marca de las muestras exitosas en la identificación

microscópica con un número, así como se muestra en la siguiente tabla:

21

Tabla 4. Asignación número a marcas de colonias con morfología microscópica similar a S. cerevisiae.

Ajustes PCR “primers” ScHO

Controles Muestras exitosas

Marca Repique # asignado Marca Repique # asignado

CEN-PK 2-1 (+) NA 1 #3-6 A 2 14

Pichia pastoris (-) NA 2 #3-6 B 2 15

E. coli (-) NA 3 #3-8 A 1 16

Muestras exitosas #3-8 B 1 17

#1-1 A 1 4 #2-BL A 1 18

#1-1 B 1 5 #2-1 B 1 19

#3-7 A 1 6 #3-7 A 2 20

#3-6 A 1 7 #3-7 B 2 21

#3-6 B 1 8 #3-8 A 2 22

#2-1 B 1 9 #3-7 C 2 23

#4-1 A 1 10 #1-1 A 2 24

#1-3 A 1 11 #1-1 B 2 25

#2-1 A 2 12 #1-1 D 2 26

#2-BL A 2 13 #1-1 C 2 27

NOTA: Para los “primers” LgHO se usó la misma nomenclatura sin embargo no había control positivo.

Siguiendo la metodología propuesta en el numeral 2.4 para los “primers” que amplifican el gen HO para la

especie S. cerevisiae (ScHO), se obtuvieron algunos problemas en los resultados de las electroforesis ya que las

bandas del gel que se corrió para las muestras de la 15 a la 27 tienen una inclinación y puede existir variación

en tamaños. Aunque esto también puede deberse a que la electroforesis del segundo gel fue leída horas después

de terminado el ciclo de 45 minutos a 100V. Las bandas del marcador de peso en el primer gel se observan con

gran facilidad y distanciadas correctamente, siendo la última banda la asociada a un peso de 500 bp. Sin

embargo, en el segundo gel el marcador corrió con mayor dificultad y no es tan notorio al leerse en el

documentador de geles, no obstante, con un pequeño arreglo en contraste también se encuentran diferenciadas

las bandas y en especial la última banda de 500 bp.

La electroforesis, llevada a cabo con las muestras a las que se les realizó la técnica de Colony PCR, arrojaron

que efectivamente el control positivo amplificó el gen HO a un tamaño de 400 bp ya que la banda generada se

encuentra después de la última banda generada por el marcador de peso. Por el contrario, el control negativo

asociado a Pichia pastoris no amplió el gen debido a que no lo contiene en su ADN y por lo tanto no marcó

ningún tipo de banda, sin embargo, el otro control negativo asociado a E. coli BL-21 corrió de manera extraña

ya que generó dos tipos de bandas, una cerca de 1000 bp y otra cerca de 300 bp. Esto quiere decir que algún

tipo de gen fue ampliado, sin embargo, esto es poco probable por lo que puede deberse a algún tipo de

contaminación cruzada al momento de disolver las colonias en agua. Para confirmar esto se debió realizar una

segunda electroforesis volviendo a realizar la técnica de Colony PCR, esta vez teniendo mayor cuidado con la

contaminación. Adicionalmente en esta nueva electroforesis se intentaba confirmar que las cepas que arrojaron

una banda a este tamaño (400 bp) lo volviesen a realizar. Las imágenes de estos geles asociados a la repetición

de la técnica Colony PCR se encuentran en el literal A del Anexo 8.

Por otra parte, 12 bandas en las que se corrían muestras de colonias recolectadas en los trapiches arrojaron un

resultado positivo para el gen HO que se amplió correctamente ya que todas las muestras tienen una banda a un

tamaño de 400 bp, bajo la banda de 500 bp hecha con el marcador de peso, o muy cercanas a esta siendo similar

a la banda del control positivo. Esto nos confirma y permite estar seguros de que las 12 colonias que

amplificaron son de la especie S. cerevisiae con total certeza [15]. Sin embargo, cabe resaltar que dentro de la

especie es posible encontrar variaciones intraespecíficas que pueden dar lugar a diferencias en el ADN entre las

12 cepas. Se resaltan algunas bandas con mayor brillo, esto se debe a una mayor concentración del gen en la

PCR realizada y puede deberse a un mayor contenido de ADN relacionado a una mayor cantidad de muestra

(colonia) agregada al tubo de PCR y disuelta en agua. Se obtuvieron los resultados de las electroforesis

22

realizadas con las muestras tratadas mediante el método de Colony PCR y se pueden observar los primeros

geles leídos en el documentador de geles en las siguientes imágenes:

Imagen 7. 1ra electroforesis Colony PCR muestras 1-14.

Imagen 8. 1ra electroforesis Colony PCR muestras 15-27.

Hay que resaltar que hubo una cepa en específico, la cepa número 20, que dio positiva en el primer gel de

electroforesis, pero sin embargo al volverse a realizar la técnica y leer los resultados del gel en el documentador

de geles, no amplificó la banda y por lo tanto no fue exitosa para S. cerevisiae esta imagen se puede observar

en el literal A del Anexo 8. Por el contrario, todas las demás muestras exitosas generaron una banda tanto en la

primera como en la segunda electroforesis. No obstante, el problema que presentaba la marcación del control

negativo E. coli BL-21 se repitió en este segundo intento, sin embargo, solo se generó la banda inferior por

debajo de 300 bp y fue más tenue que en el primer intento. Esto nos indica que en efecto el par de “primers”

que amplifican el gen HO para la especie S. cerevisiae tiene algún efecto en el microorganismo de control

negativo, no necesariamente ampliando el gen HO ya que el microorganismo E. coli BL-21 no contiene este

gen en su ADN [30], pero puede generar otro tipo de interacción con otro gen que debe ser estudiado

posteriormente. Sin embargo, esto no afecta los resultados y análisis que podamos hacer sobre las muestras ya

que el otro control negativo dio un resultado correcto, pero es muy inusual que esto ocurra.

23

Se realizó la técnica de Colony PCR para las mismas muestras y controles, pero esta vez empleando el par de

“primers” que amplifican para levaduras de las especies S. bayanus y S. pastorianus. Sin embargo, hay que

resaltar que el control positivo del anterior método de PCR ahora se convertirá en un control negativo, es decir

que existirán 3 controles negativos y ningún control positivo. Esto afecta notablemente el análisis que podamos

realizar sobre los resultados ya que no se puede asegurar que el método PCR se realizó exitosamente sin poseer

un control positivo que lo corrobore. No obstante, se realizó el protocolo y al leer el gel se obtuvo que ninguna

cepa de muestra o control generó algún tipo de banda a excepción de la muestra número 21 como se observa en

la imagen del literal B del Anexo 8. Esto ocurrió debido a un error al momento de poner las muestras en los

pozos ya que se corrió la muestra ampliada con el “primer” ScHO en vez de la muestra realizada con el “primer”

LgHO.

Lo anterior generaba una incongruencia ya que la cepa entonces daba positivo para los dos primers, algo

imposible, por lo tanto este error se corroboró en una tercera electroforesis corriendo todas las muestras de PCR

realizadas con la cepa 21 y de igual manera para la cepa 20, los resultados de esta electroforesis se encuentran

en el literal C del Anexo 8. En esta imagen se puede corroborar que efectivamente la cepa 21 sólo amplifica

para el “primer” ScHO ya que generó la banda que concuerda con el control positivo, y por el contrario no

generó ninguna banda para el “primer” LgHO. Respecto a la cepa número 20 se obtuvo que en el primer intento

amplificó para S. cerevisiae, pero para el segundo no, lo que genera un posible error en la respuesta final. Al

igual que la cepa número 21, la número 20 no generó ningún tipo de banda para el “primer” LgHO.

Teniendo en cuenta lo anterior se afirma que se encontraron 12 cepas asociadas a S. cerevisiae con un posible

error en la cepa número 21 que debe ser corroborada en estudios posteriores. Por el contrario, ninguna cepa

amplió para el “primer” LgHO y por lo tanto ninguno de los microorganismos recolectados pertenecen a la

especie S. bayanus o S. pastorianus. En la siguiente tabla se exponen los resultados de las bandas de muestras

con valores en 400 bp relacionadas a su marca de muestra y el lugar. Estas cepas son positivas para S. cerevisiae

y por lo tanto se le asignó un nombre a cada una para una mejor manipulación en los siguientes experimentos.

Tabla 5. Asignación de nombres a cepas nativas colombianas S. cerevisiae.

Cepas nativas levadura S. cerevisiae

Marca Repique # banda Descripción muestra Nombre

#1-1 B 1 5 Jugo caña cocción CW01

#3-7 A 1 6 Guarapo diluido CW02

#3-6 A 1 7 Guarapo CW03

#3-6 A 2 14 Guarapo CW04

#3-6 B 2 15 Guarapo CW05

#3-8 A 1 16 Miel caramelizada CW06

#3-8 B 1 17 Miel caramelizada CW07

#3-7 A 2 20 Guarapo diluido CW08*

#3-7 B 2 21 Guarapo diluido CW09

#3-8 A 2 22 Miel caramelizada CW10

#3-7 C 2 23 Guarapo diluido CW11

#1-1 B 2 25 Jugo caña cocción CW12

* posible error

Ya teniendo plenamente identificadas las cepas de levadura nativas de Saccharomyces cerevisiae se procedió a

caracterizarlas en primer lugar por su crecimiento. Los datos recolectados en el espectrofotómetro, la

absorbancia en este caso corresponde al OD (densidad óptica) que se relaciona con la cantidad de células

presentes en la muestra, en este caso el medio extracto malta, debe ser manipulada para generar una gráfica que

se pueda analizar fácilmente. Esta manipulación consistió en calcular la concentración de células hallando la

relación entre el OD inicial (del medio sin ningún tipo de cultivo) y la densidad medida cada hora para cada

cepa. A esta relación se le debe aplicar logaritmo natural ya que el comportamiento del crecimiento en estos

microorganismos en exponencial y de esta manera se puede apreciar el cambio con mayor facilidad. Para efectos

de este estudio se caracterizaron solamente 8 de las 12 cepas nativas debido a que su manipulación era compleja,

y podía incurrir en un mayor riesgo de contaminación, de igual manera el tiempo que tomaban estos

24

experimentos era demasiado y al no tener los equipos suficientes para realizar la caracterización de todas las

cepas al mismo tiempo se deben realizar varias veces los experimentos. Para seleccionar las 8 cepas se acudió

a sus diferencias morfológicas a plena vista, su forma de crecer y su agrupación en colonias, las 8 cepas con

mayor variabilidad fueron seleccionadas para las caracterizaciones.

La Ecuación 2. Concentración de células. fue la que se aplicó para obtener este resultado que se puede analizar.

Los resultados del crecimiento durante 36 horas para cada una de las cepas y el control se pueden observar en

la Ilustración 4. De igual manera para observar con mayor detenimiento el crecimiento en las tres distintas

etapas (inicial, exponencial y final) consultar el Anexo 9.

Los datos se dividieron en dos procesos de crecimiento ya que la limitación del tiempo en la toma de datos

generaba un espacio de 12 horas sin datos de absorbancia, y lo cual no permitía observar correctamente la

tendencia en la fase exponencial. Para esto se decidió realizar dos incubaciones, una primera incubación para

tomar los datos desde la hora 0 hasta la hora 10, que retomaba las mediciones desde la hora 24 hasta la hora 36.

La segunda incubación permitía la toma de datos desde la hora 13 hasta la hora 23 y para estas mediciones se

dejaban incubando las cepas desde la noche anterior justo antes de cerrar el laboratorio. El crecimiento de las

cepas puede tener algún error asociado a la diferencia de la cantidad de colonia añadida para el primer y segundo

crecimiento que se realizó. Sin embargo, los datos son congruentes y no tienen gran variación entre ellos.

Algunas tomas de datos están distanciadas 3 horas, esto se debe a la limitación de tiempo en el laboratorio, y

otras tomas están distanciadas 2 horas, esto ya que no era necesario tomarlas cada hora debido a que no se

notaba un cambio relevante en los datos entre toma y toma.

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐿𝑁 (𝑂𝐷600

𝑂𝐷600 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)

Ecuación 2. Concentración de células.

Ilustración 4. Crecimiento de cepas de levadura nativas S. cerevisiae.

Como era de esperarse la función de crecimiento es exponencial para todas las cepas ya que según la literatura

la mayoría de las células de S. cerevisiae crecen de esta manera [31], sin embargo, existen diferencias entre la

pendiente de cada una de las cepas ya que algunas tienen un crecimiento más rápido. Cabe resaltar que se hizo

el crecimiento desde una colonia simple por lo que existe un tiempo muerto en el que la colonia comienza a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Co

nce

ntr

ació

n [

LN

(OD

_6

00

/OD

inic

ial_

60

0]

Tiempo [h]

CW01 CW03 CW06 CW07 CW08

CW10 CW11 CW12 CEN-PK

25

acoplarse al medio y a reproducirse lentamente, esto también difiere entre cepas ya que algunas culminan esta

etapa en un menor tiempo comenzando la fase exponencial desde la hora 5, como por ejemplo la cepa CW03.

A grandes rasgos se puede observar que las cepas tienen un tiempo muerto similar y culminan en una

concentración muy cercana de 3.7 en promedio.

Analizando el comportamiento de la curva de crecimiento se puede observar que la gran diferencia que existe

entre las cepas se da en la fase exponencial ya que es en donde existe mayores deltas de concentraciones entre

una cepa y otra. Al inicio y final del crecimiento no se aprecia una diferencia relevante entre las concentraciones

de las distintas cepas ya que las concentraciones iniciales al igual que las finales no cambian en gran medida

entre una hora y otra. Sin embargo, la cepa que crece con mayor rapidez es la CW03, la cual logra salir de la

fase inicial en un menor tiempo, alcanzando así la fase exponencial cerca de la hora 4. Las diferencias iniciales

entre cepas no son realmente notorias ya que las barras de desviaciones estándar se cruzan entre sí, cabe resaltar

que en ciertas horas de la fase inicial si es posible tener una diferencia relevante entre las concentraciones de

las cepas, en la hora 7 por ejemplo se puede apreciar una diferencia significativa entre las concentraciones de

la cepa CW03 y las cepas CW01, CW10 y CW12. Esto mismo ocurre en la parte final del crecimiento, en donde

la de mayor de concentración final es la cepa CW10 con un valor de 3.78 y la de menor concentración es la

CEN-PK 2-1 con un valor promedio de 3.62. En varias horas de esta etapa las desviaciones estándar se cruzan

y por lo tanto no existen diferencias significativas entre algunas de las cepas.

Aunque todas las cepas nativas difieren entre ellas, algunas de ellas con una diferencia significativa, la variación

no es tan grande como la que tienen respecto a la cepa control CEN PK 2-1, esta cepa por su parte es la que

tiene una taza de crecimiento más lenta, tiene el mayor tiempo de fase inicial y por lo tanto una fase exponencial

tardía. Cabe resaltar que esta cepa también es la que menor concentración tiene al final del crecimiento con un

valor de 3.62. Esto nos permite intuir que la cepa control tendrá una fermentación más lenta que las demás

cepas además de un posible grado de alcohol más bajo. Todas las cepas tienen diferencias significativas de

concentración en al menos un punto con cualquier cepa, esto basado en las diferencias y el no cruce de barras

de desviación estándar en al menos una hora. De igual manera las tendencias de las curvas varían entre las cepas

y aunque algunas pueden ser similares en tendencia los valores son muy distintos. Las cepas con mayor similitud

respecto a tendencia y valores similares son los pares de cepas CW03-CW06, y CW03-CW01.

Las cepas con mayor diferencia entre ellas respecto a tendencia y valores, a excepción de la cepa CEN-PK 2-1

que difiere con todas, son los pares de cepas CW06-CW12, y CW10-CW12. La cepa CW12 es la que tiene un

crecimiento, en general, más lento respecto a las demás cepas nativas. No obstante, consigue llegar a una

concentración alta, la segunda más alta. Esto puede indicar que, aunque la fermentación no se realizará tan

rápido como por ejemplo usando la cepa CW03 o CW10, si nos garantiza que se conseguirá un alto contenido

de alcohol. En la siguiente tabla se encuentran ordenadas de mayor a menor la rapidez con la que crecen las

cepas siendo el parámetro de diferencia la hora en la que alcanzan el 5% de su valor final. También se puede

observar la concentración final promedio (tomando los datos de las últimas 5 horas) para saber cuál es la cepa

que logra tener una mayor densidad de células en el medio al final de la fermentación.

Tabla 6. Valor final de crecimiento y hora de crecimiento exponencial para las levaduras.

Concentración final

[LN(OD_600/ODinicial_600]

Tiempo en horas para

llegar al 5% del valor final

Cepa Valor Cepa Valor

CEN-PK 3.619 CW11 3.00

CW07 3.639 CW03 3.04

CW11 3.644 CW06 3.24

CW03 3.673 CW12 3.34

CW08 3.677 CW01 3.73

CW01 3.689 CW08 3.98

CW06 3.706 CW07 4.01

CW12 3.725 CW10 4.55

CW10 3.763 CEN-PK 5.37

26

Analizando la Tabla 6 se observa que existe diferencia significativa entre los valores finales de concentración

de cada una de las cepas. La de mayor concentración como antes se mencionó es la cepa CW10 con gran

diferencia sobre la cepa CW12 que ocupa el segundo lugar. Por su parte la cepa CEN-PK 2-1 obtiene la menor

concentración pasadas las 36 horas de crecimiento, y la cepa nativa con menor concentración es la cepa CW07

con un valor de 3.639. Por otra parte, la cepa con la mayor rapidez de crecimiento es la CW11, la cual alcanza

el 5% de su valor final en tan sólo 3 horas, esto indica que será la cepa en terminar su fase inicial más rápido y

por lo mismo la que comienza la fase exponencial más pronto. Por el contrario, la cepa que más tarda en crecer

es la CEN-PK 2-1 que obtiene el 5% de su valor final pasadas 5.37 horas, por esto mismo es la cepa que más

tarda en su fase inicial y su fase exponencial comienza tardía.

Respecto a las cepas nativas, la de menor rapidez es la cepa CW10, esto es interesante ya que también, como

se mencionó anteriormente, es la que alcanza la mayor concentración. Esto indica que, aunque tarda en su fase

inicial bastante tiempo, solamente para alcanzar el 5% de su concentración final toma cerca de 4.6 horas, y su

fase exponencial es tardía, de igual manera es la fase exponencial con mayor pendiente. Es de las cepas que se

reproduce más rápidamente.

Teniendo en cuenta lo anterior es posible afirmar que existen diferencias sólidas entre las cepas nativas, y aún

una mayor diferencia respecto de la cepa control. Esta variación respecto a la caracterización de crecimiento

nos permite ir considerando una variabilidad intraespecífica entre las cepas nativas, ya que los resultados

sugieren que no se reproducen con la misma rapidez y por lo tanto no asimilan los azúcares de igual manera e

incluso no soportan la misma concentración de etanol. Para estar más seguros de esta variabilidad

intraespecífica se hicieron más caracterizaciones en otros aspectos.

Se realizó la caracterización de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares para cada una de las cepas evaluando la

concentración inicial y final de los principales componentes de estos grupos de compuestos. Esta

caracterización se realizó siguiendo la metodología del numeral 2.6 y haciendo uso del HPLC para realizar la

medición de los compuestos. Después de varios intentos de medición de concentraciones a diferentes diluciones

de las muestras a evaluar se obtuvo que ninguna dilución ofrecía valores lógicos de concentraciones, se acercó

a valores lógicos la dilución 1:1 de las muestras en agua destilada, sin embargo, al no realizar ningún tipo de

dilución y medir las concentraciones de las muestras puras el HPLC arrojó los mejores resultados y los más

lógicos.

Se realizaron curvas de calibración para ácidos orgánicos (acético, cítrico, málico, láctico, succínico y tartárico),

alcoholes (etanol y metanol) y azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa). Esto con el fin de evaluar los compuestos

producidos por cada una de las levaduras y la concentración final de los mismos. Los siguientes resultados

muestran la concentración en la hora 0 y 36 de la fermentación de cada una de las cepas resaltando en azul la

cepa con la concentración más baja y en rojo la concentración más alta de cada componente en partes por millón.

Tabla 7. Resultados de composiciones de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares para cada cepa mediante HPLC.

Composición inicial y final de los fermentos en PPM

Compuesto Hora CW01 CW03 CW06 CW07 CW08 CW10 CW11 CW12 CEN-PK

2-1

Glucosa 0 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8 2024.8

36 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 56.6

Sacarosa 0 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2 17722.2

36 294.6 276.6 224.5 214.8 263.9 224.2 126.2 245.7 391.7

Fructosa 0 553.8 553.8 553.8 553.8 553.8 553.8 553.8 553.8 553.8

36 0.0 134.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 109.9 0.0

Etanol 0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

36 1628.4 0.0 1104.1 2640.7 3765.5 1687.2 5436.6 3876.3 4321.5

Metanol 0 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8 2072.8

36 509.5 1587.7 2177.7 2197.3 2531.6 491.6 2544.6 2389.2 1919.3

Ácido

acético

0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.00 0.00

36 94.2 9782.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 37.6 0.00

27

Ácido

cítrico

0 54.7 54.7 54.7 54.7 54.7 54.7 54.7 54.7 54.7

36 47.3 46.5 69.5 69.5 72.0 72.8 72.1 72.8 59.3

Ácido

láctico

0 75.7 75.7 75.7 75.7 75.7 75.7 75.7 75.7 75.7

36 40.2 496.0 59.0 33.4 44.0 36.5 36.2 47.3 33.0

Ácido

málico

0 503.2 503.2 503.2 503.2 503.2 503.2 503.2 503.2 503.2

36 0.0 0.0 25.8 15.9 4.6 24.1 7.7 0.0 0.0

Ácido

succínico

0 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1 1777.1

36 282.5 166.1 148.9 179.4 164.5 150.5 248.8 158.6 342.9

Ácido

tartárico

0 221.7 221.7 221.7 221.7 221.7 221.7 221.7 221.6 221.6

36 13.6 164.2 10.1 9.9 22.7 11.9 8.3 8.3 49.7

El principal análisis que se debe realizar es la conversión de glucosa a etanol, partiendo del hecho de que por

acción de la levadura es el único compuesto que se fermenta con el fin de producir alcohol etílico, la ecuación

que rige la fermentación alcohólica es la siguiente:

1 𝑚𝑜𝑙 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 → 2 𝑚𝑜𝑙 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 + 2 𝐷𝑖ó𝑥𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑜 Ecuación 3. Fermentación alcohólica general.

Para hallar las moles de glucosa en la solución inicial simplemente se pasa de la concentración de ppm a

porcentaje dividiendo el valor de la Tabla 7 en 10000. Ya teniendo el valor en porcentaje se multiplica por el

volumen de la solución inicial que se fermentó, en este caso fue de 100 mL. Luego los mL iniciales se pasan a

g mediante la densidad de la glucosa (1.56 g/mL) y finalmente se hallan las moles dividiendo este valor sobre

el peso molecular (180.156 g/mol), como se puede observar en la Ecuación 4. Estos serán los moles iniciales

de glucosa en la muestra. Para hallar los moles teóricos de etanol que se producirían en caso de convertirse toda

la glucosa en alcohol etílico, simplemente se multiplican las moles iniciales de glucosa por 2 como lo presenta

la Ecuación 6. Posteriormente, para hallar los moles finales reales de etanol se realiza el mismo procedimiento

que con la glucosa simplemente cambiando los valores de densidad (0.798 g/mL) y de peso molecular (46.07

g/mol) para hallar el contenido de moles finales real de etanol para cada cepa de levadura como se ilustra en la

Ecuación 5. Finalmente, para hallar el porcentaje de conversión se realiza la relación entre los moles teóricos y

reales de etanol en la muestra, siguiendo la Ecuación 7.

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖 [𝑚𝑜𝑙] =

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎[𝑝𝑝𝑚]10000

∗ 𝑉[𝑚𝐿] ∗ 𝜌 [𝑔

𝑚𝐿]

𝑃𝑀 [𝑔

𝑚𝑜𝑙]

Ecuación 4. Glucosa inicial.

𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑟𝑒𝑎𝑙 [𝑚𝑜𝑙] =

𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙[𝑝𝑝𝑚]10000

∗ 𝑉[𝑚𝐿] ∗ 𝜌 [𝑔

𝑚𝐿]

𝑃𝑀 [𝑔

𝑚𝑜𝑙]

Ecuación 5. Etanol final real.

𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 [𝑚𝑜𝑙] = 2 ∗ 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 [𝑚𝑜𝑙] Ecuación 6. Etanol final teórico.

𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛 [%] =𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑟𝑒𝑎𝑙 [𝑚𝑜𝑙]

𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 [𝑚𝑜𝑙]∗ 100

Ecuación 7. Conversión de glucosa a etanol.

Realizando los cálculos correspondientes se encuentra que los porcentajes de conversión para cada una de las

cepas son los siguientes:

Tabla 8. % de conversión de glucosa a etanol en la fermentación por cada cepa.

Conversión de etanol

CW01 80.44% CW07 130.44% CW11 268.55%

CW03 0.00% CW08 186.00% CW12 191.48%

CW06 54.54% CW10 83.34% CEN-PK 213.46%

Se puede observar que, si bien existe algún error en la medición ya que el porcentaje de conversión es mayor al

100% en algunos casos, el error es estándar para todas las muestras entonces es posible hacer una comparación

entre ellas. Hay que resaltar el principal resultado que sorprende y es la no aparición de etanol en la fermentación

de la cepa CW03, esto debe tratarse de manera especial. Por otra parte, el porcentaje de conversión más alto los

obtuvo la cepa CW11, por muy lejos de su predecesora la cepa control CEN-PK. El menor porcentaje fue

conseguido por la cepa CW06. Las cepas CW01 y CW10 obtuvieron una conversión similar por lo que se puede

28

intuir que la capacidad fermentativa de ambas en muy similar además de su tolerancia al etanol. Otro par de

cepas con porcentajes similares fueron las cepas CW08 y CW12 las cuales tienen un alto porcentaje de

conversión.

Se pueden realizar análisis más completos enlazando la información del crecimiento y de la fermentación, por

ejemplo, si bien la cepa que convirtió la mayor cantidad de glucosa en etanol fue la cepa CW11 esta también

es la cepa que crece con mayor rapidez, por lo tanto, esta cepa es la más resistente al etanol y es la que fermenta

la glucosa en menor tiempo. De igual manera esta cepa fue la que obtuvo una concentración mayor de metanol

al final de la fermentación. No obstante, respecto a la concentración de sacarosa y de ácido tartárico, la cepa

CW11 obtuvo los menores porcentajes entre todas las otras cepas. También es importante mencionar que el

valor más bajo de etanol fue el de la cepa CW03 con 0 ppm, sin embargo, esta cepa también es la que tiene la

mayor concentración de ácido acético (por mucho mayor contenido que las demás) esto puede deberse a que la

muestra estaba contaminada con una acetobacteria al momento de la fermentación, la cual luego de que la

levadura convirtiera toda la glucosa en etanol procedía a convertir el alcohol etílico en ácido acético [32]. Sin

embargo, también fue la que mayor ácido tartárico y ácido láctico produjo, por lo que en este recipiente se

llevaron a cabo al menos 3 fermentaciones distintas.

Existe otra posible respuesta a este resultado poco común que dejaría atrás una contaminación por bacterias, ya

que se ha tenido conocimiento de algunas cepas de S. cerevisiae que no contienen el gen HXK2, el cual se

expresa cuando las células de levadura se cultivan en un medio fermentable utilizando glucosa, fructosa o

manosa como fuente de carbono, y Curiosamente, Hxk2p también desempeña un papel en el envejecimiento

celular replicativo porque la eliminación de HXK2 mejora significativamente la longevidad de la levadura [33].

Un estudio informó que la cepa con deleción hxk2 co-consumió galactosa y sacarosa, junto con glucosa.

Además, se observó el consumo conjunto de glucosa y etanol durante la fase de crecimiento exponencial inicial.

En S. cerevisiae, el co-consumo de etanol y glucosa (en presencia de abundante glucosa) nunca se había

informado anteriormente. En sus resultados, el estudio identificó que la cepa de deleción hxk2 consumió etanol

Ilustración 6. Producción de Etanol y Ácido acético

Ilustración 5. Consumo de Glucosa y Fructosa.

29

en presencia de glucosa abundante en el crecimiento exponencial temprano, luego cambió a la producción de

etanol durante el crecimiento exponencial tardío y luego cambió volviendo al consumo de etanol después de

que se agotó la glucosa [34].

Otro estudio también halló evidencia de la producción de ácido acético por parte de la levadura la especie S.

cerevisiae usada para fermentar vinos. Esto puede ser relacionado junto con el estudio anterior ya que el alcohol

etílico es precursor del ácido acética en la fermentación acética llevada a cabo por algunos microorganismos.

El estudio encontró que la levadura del vino produce ácido acético como un subproducto de la respuesta al

estrés hiper osmótico causado por las altas concentraciones de azúcar (> 35% p/v) en el mosto de uva. En los

experimentos realizados se observó que la cepa ST de S. cerevisiae produjo las cantidades más bajas de ácido

acético y glicerol, mientras que la cepa VIN7 produjo las cantidades más altas de ácido acético y glicerol. El

análisis de la expresión génica global reveló que los genes implicados en la formación de glicerol y ácido acético

se expresaron en niveles más altos en VIN7 que en ST [35]. Así pues, se encuentra evidencia sólida en la

literatura de la posibilidad de la levadura S. cerevisiae de consumir etanol tal como se planteó en el párrafo

anterior debido a la ausencia de un gen y también de la posible producción de ácido acético debido a la presencia

de otros genes que realizan la formación de este compuesto, tal como se explicó en el presente párrafo.

Esta posible razón y teoría toma mayor fuerza al disminuir la posibilidad de contaminación con algún tipo de

bacteria, ya que durante los experimentos se realizaron 2 fermentaciones (una sin agitación) y en las dos se

encontró que la cepa CW03 presentaba un color más claro y amarillento que las demás, como se puede apreciar

en el Anexo 12. Adicionalmente, al realizar una prueba olfativa de estos fermentos al final de las 36 horas en

las dos fermentaciones y en la muestra que se realizó en la caracterización de crecimiento, la cepa CW03

resaltaba entre las demás por sus notas a vinagre, la muestra desprendía un fuerte olor acético. De igual manera

la muestra CW03 que se usó para caracterizar el crecimiento era la que presentaba un color más amarillo.

Teniendo en cuenta esto, la posibilidad de que todas las muestras de la cepa CW03, tanto en el crecimiento

como en las dos fermentaciones, presentara algún tipo de contaminación es poco probable. Entonces, es posible

que esta cepa tenga características de deleción del gen HXK2 o incluso tenga en mayor cantidad los genes que

realizan la formación del ácido acético, y es posible que consuma glucosa y etanol al mismo tiempo para

producir ácido acético. Esto argumentaría los resultados del HPLC en el cual no se obtuvo concentración de

etanol o glucosa y sin embargo la concentración de ácido acético fue muy alta.

Es bien interesante la fermentación de esta cepa porque de igual manera fue la única en obtener fructosa al final

de la fermentación ya que en las demás cepas la fructosa desaparecía completamente. Además de que la

concentración del ácido cítrico encontrado para esta cepa es la menor entre las cepas. El crecimiento de CW03

también es acelerado, es la segunda en crecer más rápido y en entrar a la fase exponencial más rápidamente.

La cepa CW10 fue la que terminó con una concentración de metanol menor. La cepa control CEN PK por su

parte fue la única cepa que no alcanzo a convertir toda la glucosa y por lo tanto es la que tiene mayor cantidad

de glucosa al final de la fermentación. De igual manera, respecto a la sacarosa también es la que contiene la

mayor composición por lo que los azúcares no fueron consumidos en su totalidad. El ácido succínico obtuvo su

mayor valor en la fermentación de la cepa control.

Por su parte, la cepa CW12 fue la que mayor concentración de ácido cítrico obtuvo y se esperarían entonces

notas cítricas en una cerveza preparada con esta cepa. La menor concentración de ácido succínico fue la

obtenida por la cepa CW06 que a su vez obtuvo la mayor concentración de ácido málico.

Para poder analizar y relacionar mejor estos resultados es necesario evaluar el impacto de estos componentes

en los sentidos tanto de olfato como de gusto. Ya que las características organolépticas nos permitirán confirmar

que estos compuestos están presentes en la cerveza o al menos que sí se pueden percibir con alguno de los dos

sentidos: olfato y gusto. Para esto la parte final fue la implementación de las levaduras en la producción de un

prototipo de cerveza y así poder ver las variantes que ofrecían las distintas levaduras, esto se realizó con la

ayuda de la cervecería artesanal “Chelarte” y un catador profesional.

Para el proceso de producción se seleccionó una cepa de levadura que no afectara notoriamente los aspectos

organolépticos de la cerveza control. Esta levadura mantuvo los sabores y aromas base de la malta y no añadió

ninguna nota especial. La cepa control fue la levadura seca SafAle US-05, la cual es una levadura de la marca

30

Fermentis de tipo Ale de origen americana y da lugar a cervezas de sabor limpio y con buen final en boca,

además de generar una espuma densa y estable con baja concentración de diacetilo y un paladar final limpio,

fresco y vivaz [36]. Se prepararon 3 litros de cada una de las cervezas fermentadas con cada cepa y se midió la

gravedad específica y el pH del mosto inicial, así como para cada una de las cervezas al final de la fermentación.

La fermentación se llevó a cabo en recipientes herméticos de vidrio iguales para todas las cepas, la única

variación entre recipientes era la cepa de levadura, la temperatura estuvo constante a 20°C.

Los valores iniciales, para el mosto, para la gravedad específica fue de 1.042 y para el pH de 5.31, valores

normales para un mosto regular para una cerveza tipo Ale. En la siguiente tabla se presenta la disminución de

la gravedad específica para cada una de las cepas, esto puede ser una medida indirecta del alcohol en la muestra,

entre más haya disminuido significa que hay mayor cantidad de alcohol en la cerveza ya que la densidad, que

es semejante a la gravedad específica, del alcohol es menor. Por lo tanto, también se puede establecer que la

cerveza que alcanzó una mayor conversión de glucosa es la que tiene la mayor disminución de la gravedad

específica. Respecto al pH final de la cerveza, lo esperado es que disminuya notoriamente, teniendo en cuenta

que un pH adecuado debe estar entre 3.8 y 4.5 [37].

Tabla 9. Gravedad específica y pH para cervezas con levadura nativa.

Disminución gravedad específica pH final

CW07 0.028 CONTROL 4

CW06 0.028 CW12 4.25

CW12 0.028 CW01 4.28

CW10 0.028 CW10 4.36

CW01 0.028 CW03 4.37

CW11 0.030 CW11 4.4

CW03 0.031 CW07 4.42

CW08 0.033 CW06 4.42

CONTROL 0.033 CW08 4.46

En la anterior tabla se encuentran ordenadas las cepas con las que se realizó la cerveza de menor a mayor por

la diferencia de gravedad específica, y de igual manera de menor a mayor por el pH final de la cerveza. Hay

que resaltar que todas las cepas nativas, a excepción de la CW08, tuvieron un menor cambio en la gravedad

específica que la cepa control y por lo tanto produjeron una menor cantidad de alcohol. Sin embargo, todas

estuvieron muy cercanas al control y es posible que alcancen un porcentaje mayor al dejarse mayor tiempo

fermentando. Las cepas CW07, CW06, CW12, CW10 y CW01 tuvieron el mismo cambio en la densidad por

lo que se intuye que tienen una capacidad fermentativa similar, con un valor de alcohol semejante y además

una resistencia al etanol muy parecida. Resaltaron las cepas CW11, CW03 y CW03 que fueron las que tuvieron

la mayor diferencia, que intuye una fermentación con mayor rapidez tal como se demostró en la caracterización

de crecimiento para la cepa CW11, por lo tanto, estos resultados son congruentes.

Respecto a la medición final de porcentaje de alcohol en cada cerveza, al realizarse con un hidrómetro la

precisión no es buena y por lo tanto sólo se puede asegurar que no hubo mayor diferencia entre las cepas,

además de que todas tuvieron un valor cercano a 4.5% de alcohol por volumen.

Por parte del pH, la cepa control fue la que tuvo el valor más bajo, por lo tanto, la cerveza más ácida, todas las

cepas nativas tuvieron un pH mayor a 4.25 y se encontraron variaciones entre ellas de cerca de 0.2, la cepa

nativa que obtuvo la cerveza con mayor acidez fue la CW12 y por el contrario la cepa que obtuvo una acidez

más baja fue la CW08. Sin embargo, todas las cepas estuvieron en el rango adecuado y en general tuvieron

variaciones entre ellas a excepción de la cepa CW07 y CW06 que obtuvieron un pH igual de 4.42. Teniendo en

cuenta esto se puede pronosticar que la cepa CW12 va a ser la que presente mayores notas ácidas entre las cepas

nativas. También podemos esperar una variación significativa entre la acidez de la cerveza hecha con la cepa

control y las demás cepas nativas.

El siguiente paso en la caracterización organoléptica es la cata. Esta se realizó teniendo como principal ayuda

y director de panel de catadores al catador profesional Juan Camilo Riveros con número 2348 de Beer Judge

31

Certification Program (BJCP). Y recopilando los datos de las evaluaciones de las distintas cervezas se logró un

consenso de características cuyos resultados de cada una de las cervezas preparadas con las cepas de levadura

S. cerevisiae nativa y la cepa control se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 10. Características organolépticas cervezas preparadas con cepas nativas de levadura S. cerevisiae.

Control CW01 CW03 CW06 CW07

Aroma Maltas pálidas

Frutosos

Lúpulos cítricos

Malta pálida

leve con

fenoles

Notas a clavo

bien marcadas

Ligera malta

pálida dulce con

banano bien

maduro que se

apodera del

aroma

Malta pálida

con

penetración

limpia, ligeros

fenoles

Ligeramente

pálida con

fenoles medios

y componente

sulfúrico bajo

Sabor Cuerpo medio

con sabor bajo a

lúpulo y

presencia de

maltas pálidas

con un ligero

dulzor residual

Fenólica,

sabor medio a

clavo con una

sequedad

intensa

Buen dulce de

malta con banano

marcado y un

cejo de especias

que realza la

malta y banano

Malta pálida

con un toque

de grano y

fenoles en el

retrogusto

Alcoholes

superiores

presentes

fenoles y sulfur

bajo dulzor

residual y

malta

Apariencia Floculación

media-baja

(Turbidez media)

Floculación

media-baja

Turbidez

Floculación

media

Floculación

media-baja

Floculación

baja

CW08 CW10 CW11 CW12

Aroma Plástico, llanta

quemada, ligero

alcohol

Fenoles clavo ligeros,

malta pálida y un poco

de naranja con sulfur

Fenoles bajos, lujo de

banano, cítricos naranja

y mandarina, malta

pálida ligera

Aroma a syrup de

frutas, como

mermelada de

durazno, esteres

frutales complejos

que realzan las

maltas pálidas

Sabor Compuestos

sulfúricos

marcados con

un ligero toque

brett

Sabor a malta con

fenoles y sulfur con un

ligero cítrico y un

amargor seco que no

sostiene, termina dulce

Dulzor a malta con

ligeros fenoles y un

toque cítrico con una

sequedad bien marcada y

astringente potencia de

alcoholes superiores

Buen sabor a malta

dulce. Armonía en

el balance de los

sabores, sabor a

syrup y a durazno

Apariencia Floculación

media

Floculación baja Floculación media Floculación media-

alta

Al relacionar las características descritas organolépticamente con los anteriores resultados de composiciones

obtenidos en el HPLC, se pueden encontrar las congruencias entre las características composicionales y

organolépticas. El caso que más resalta es el asociado a la cepa CW11, la cual en los resultados de cromatografía

de líquidos obtuvo las mayores concentraciones tanto de alcohol etílico como de metanol, y es congruente con

los resultados de la cata en donde se mencionan los alcoholes superiores y la presencia de ligeros fenoles o

fenoles bajos tanto en el aroma como en el sabor.

Por otra parte, se puede apreciar que el ácido málico presente en las muestras de las fermentaciones realizadas

en el laboratorio corresponde en algunas cervezas, como la realizada con la cepa CW03, al descriptor de banano,

fruta que tiene como ácido predominante en sus componentes al ácido málico [38]. La cepa CW12 que arrojó

la mayor concentración de ácido cítrico y una presencia de alta de fructosa en las fermentaciones leídas en el

HPLC, obtuvo en descriptores organolépticos, tanto en aroma como en sabor, frutas cuya composición de este

ácido es elevada además que contienen gran cantidad de azúcar de fructosa, por lo tanto, los resultados son

congruentes. Sin embargo, para lograr realizar más asociaciones de componentes con características

organolépticas se deben caracterizar las fermentaciones en más compuestos.

32

Otro resultado interesante es la baja calificación de la cerveza realizada con la cepa CW08, cuyos descriptores

realmente no corresponden a las características de una cerveza. En lugar de ser llamativos por su gusto en los

comensales, fue llamativa por su olor desagradable, llevando a que algunos catadores no la bebieran. Esto puede

tener relación con los resultados obtenidos en la PCR, en donde en el primer intento de identificación molecular

se establece que pertenece a la especie deseada, pero en el segundo intento comienza a tener un problema de

identificación ya que no arroja la banda característica. Entonces teniendo en cuenta estos descriptores de la cata,

y aunque puede ser posible que la cerveza haya adquirido algún microorganismo no deseado que haya generado

la contaminación de esta, es probable que la cepa CW08 no pertenezca a S. cerevisiae y por lo tanto se deben

realizar más estudios sobre esta e incluso repetir un par de veces más la técnica de Colony PCR hasta tener la

certeza de que pertenezca o no a la especie deseada.

Se puede observar que la cepa con las mejores características organolépticas, tanto en aroma como en sabor, es

la CW12 por sus aromas y sabores frutales, su ausencia de sulfuros y principalmente la característica de ser

franca (congruente) entre sabor y olor. La cerveza contiene notas muy marcadas a la caña de azúcar, a miel y

por esto resalta entre las demás. Según el catador profesional, Juan Camilo Ríos, las características que

proporciona esta levadura a la cerveza se puede aprovechar en gran magnitud usándola para fermentar un mosto

realizado con café o chocolate (cacao) como materias primas, esto debido a su dulzor y sus características

frutales que realzarían los aromas y sabores del café y del cacao que mucho llaman la atención, tanto de los

consumidores nacionales como extranjeros. Esta cepa ofrece unas características organolépticas distintas y

especiales para la fabricación de cerveza “Colombian Ale” y puede resaltar el producto colombiano de cervezas

de chocolate (caco) y café realzando las características propias de la materia prima usada perteneciente a la

región.

Cabe resaltar que las cervezas difirieron en gran medida en sus descripciones organolépticas, aunque comparten

un par de descriptores entre ellas siempre existe uno que resalta y genera una diferencia muy marcada entre los

sabores u olores finales de las cervezas. Es por esto por lo que se intuye que exista una variación intra-especie

entre las cepas nativas recolectadas.

33

4. CONCLUSIONES

Los resultados demostraron que en efecto los lugares seleccionados en los ambientes del trapiche tienen las

características necesarias para la aparición y reproducción de la levadura de la especie S. cerevisiae. También

se logró realizar la correcta recolección y aislamiento de las cepas de esta especie mediante la identificación

macroscópica en la que 60 cepas fueron seleccionadas como posibles levaduras ya que su morfología era similar

a la de la literatura. Esto indica que los lugares que fueron seleccionados tuvieron gran éxito en la aparición de

levaduras y es posible aislar levaduras de otras especies en estos ambientes de molinos de caña. Luego se

pudieron determinar microscópicamente 25 cepas, las cuales fueron seleccionada debido a que sus morfologías

microscópicas a un acercamiento de 50x eran muy similares al microorganismo deseado.

Posteriormente, y para estar totalmente seguros mediante la técnica de Colony PCR se lograron identificar

molecularmente (mediante un genotipado) con total certeza estos microorganismos, esto con base en los

resultados arrojados por la electroforesis de ADN en donde las bandas de 12 de las muestras que se realizaron

mediante PCR dieron un tamaño de 400 bp, al igual que la cepa de control positivo para S. cerevisiae CEN-PK

2-1 al realizar la ampliación del gen HO presente en el cromosoma IV del ADN general para esta especie. Esto

también nos permite intuir que, si bien se presentaron morfologías microscópicas de levaduras en algunas

muestras cuyo resultado mediante la técnica PCR no fue exitoso, pueden existir otro tipo de levaduras en estos

ambientes que quizá también sean de importancia en otras industrias.

Las 12 cepas de levaduras nativas de la especie S. cerevisiae fueron aisladas en los ambientes del molino de

caña o trapiche y posteriormente identificadas. Luego se caracterizaron mediante la curva de crecimiento en

donde todas crecieron a mayor una tasa de velocidad que la de la levadura control y con un valor más alto de

densidad óptica al final, es decir una concentración de células mayor en el fermento final. Esto indica que las

levaduras nativas tuvieron una mayor resistencia al etanol y una fermentación más rápida que la levadura

control, resaltándose entre ellas la cepa CW10 la cual obtuvo la mayor concentración de células al final del

crecimiento en la fase estacionaria (fase final) con un valor de 3.76. Otra cepa que resalto debido a su rapidez

para salir de la fase inicial y comenzar la fase exponencial fue la cepa CW11, esto ya que tan sólo en 3 horas

alcanzó el 5% de su valor de concentración final. Es importante mencionar que todas las cepas fueron

caracterizadas por el crecimiento desde una colonia simple y en promedio todas las cepas nativas cerca de la

hora 5 estaban comenzando la fase exponencial, la cual finalizaba en la hora 20. A diferencia de la cepa control

la cual comenzaba su fase exponencial en la hora 6 y terminaba cerca de la hora 24, por lo tanto, esta cepa

realiza una fermentación más lenta que las cepas nativas.

De igual manera, las cepas se caracterizaron mediante la producción de ácidos orgánicos (acético, cítrico,

málico, láctico, succínico y tartárico), alcoholes (etanol y metanol) y azúcares (fructosa, glucosa y sacarosa)

durante la fermentación, en donde se resaltan los compuesto alcohólicos para la cepa CW11, la cual logró una

mayor conversión de glucosa y por lo tanto una mayor producción de etanol con poco más de 5436 ppm, esto

tiene relación con la caracterización de crecimiento ya que también fue la que mayor densidad óptica alcanzó y

por lo tanto su resistencia al etanol es alta, de igual manera esta cepa tuvo la mayor concentración de metanol

al final de la fermentación con 2545 ppm, por el contrario las concentraciones más bajas de sacarosa y de ácido

tartárico con valores de 126 ppm y 8.25 ppm respectivamente corresponden a esta cepa.

La cepa CW03 fue la que más concentración final de ácido acético contenía con casi 10000 ppm y en esta cepa

sucede algo interesante ya que no hubo concentración final de etanol, sin embargo, toda la glucosa se consumió

por lo tanto se puede afirmar que si se realizó la fermentación alcohólica. Y es posibles que como se mencionaba

en el análisis esta cepa tenga una delación del gen HXK2 lo que permite que haya un consumo de glucosa y

etanol por parte de las células para una posterior conversión en ácido acético tal como lo hacen algunas cepas

de S. cerevisiae usadas para fermentar vinos y que también presentan genes asociados a la formación de este

ácido. La otra posibilidad que puede responder a estos resultados es una eventual contaminación de la muestra,

sin embargo, es poco probable ya que se evidenció presencia de este compuesto en al realizar la prueba olfativa

de las 2 fermentaciones y la muestra de crecimiento. No obstante, se deben realizar más estudios para observar

realmente que es lo que sucede durante toda la fermentación en esta cepa o una secuenciación del genoma que

permita evidenciar la presencia y ausencia de los genes anteriormente mencionados. Se debe resaltar que esta

cepa también obtuvo las mayores concentraciones de ácido láctico (496 ppm) y tartárico (164 ppm) así como

la menor concentración de ácido cítrico (46 ppm).

34

Las demás cepas que tuvieron los picos más altos y bajos en las concentraciones son las cepas, CW06 con el

mayor resultado de ácido málico (26 ppm) y la menor concentración de ácido succínico (149 ppm), CW10 con

el pico más bajo de metanol (491 ppm), CW12 con la mayor concentración de ácido cítrico (73 ppm) y

finalmente la cepa control CEN-PK 2-1 que tuvo las concentraciones más altas de glucosa (57 ppm),

Sacarosa(392 ppm) y ácido succínico (343 ppm), además de la concentración más baja de ácido láctico con tan

sólo 33 partes por millón. Las demás concentraciones para las otras cepas se mantuvieron en el promedio y

están balanceadas entre ellas sin ningún punto de interés.

Durante la caracterización se tuvo especial cuidado con la cepa CW08 ya que esta arrojó ser negativa para el

microorganismo en cuestión en alguna de las electroforesis de ADN y técnicas de PCR realizadas, Al realizar

la cata de las cervezas prototipo se encontraron descriptores extraños a la cerveza en la fermentación realizada

con esta cepa, descriptores que no entran en las características propias de una cerveza que en general fueron

desagradables tanto en aroma como en sabor. Por lo tanto, se debe realizar un análisis más exhaustivo,

nuevamente la identificación molecular (genotipo) sobre esta cepa ya que puede existir la posibilidad de que no

sea S. cerevisiae.

En la preparación de las cervezas cambió un poco el ranking de alcohol final obtenido por cada muestra, siendo

la cepa CW08 y CW03 las de más alta concentración, sin embargo, se debe resaltar que la medición de alcohol

en la cerveza realizada es menos precisa debido a que se midió con un hidrómetro que simplemente mide el

cambio de densidad y lo relaciona con todos los alcoholes en la muestra y no sólo el etanol como es el caso del

HPLC. Por parte del pH, la cerveza más ácida entre las cepas nativas fue la de la cepa CW12 con 4.25 y la más

básica fue la CW08 con 4.46, no obstante, sus valores fueron más altos que el de la cepa control (SafAle US-

05) con un resultado de 4 en el pH. Respecto a la cata se obtuvieron distintos patrones sensoriales en las cepas

lo que puede relacionarse con una posible variabilidad intraespecífica entre las cepas nativas.

Relacionando los resultados de la cata con los obtenidos en el HPLC la cepa más balanceada en los grupos de

compuestos de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares fue la cepa CW12, debido a que fue la de mayor

concentración de ácido cítrico y un alto valor de fructosa se obtuvieron unas características cítricas y frutales

en la cerveza. Por estas razones, la cepa CW12 fue la designada de forma unánime como la cepa con mejores

características organolépticas para la producción de cerveza, con grandes posibilidades en una cerveza a base

de café y chocolate (cacao) debido a sus aromas y sabores frutales que pueden resaltar los aromas y sabores de

estas materias primas, la ausencia de sulfuros y componentes indeseados y principalmente la característica de

ser franca (congruente) entre sabor y aroma, además sus elevadas notas de dulzor con notas a caña de azúcar la

hacen una cepa llamativa y con grandes propiedades que ofrece unas características organolépticas distintas y

especiales para su aplicación en la fabricación de cerveza “Colombian Ale”, propiedades que lograrían resaltar

el producto colombiano realzando las características propias de la materia prima usada perteneciente a la región.

Para el trabajo futuro se recomienda realizar la caracterización de las 4 cepas restantes que se aislaron y se

identificaron como S. cerevisiae mediante los mismos métodos, Además de realizar una caracterización más

amplia, con una mayor cantidad de compuestos y en otros ámbitos como producción de Kraussen. También se

evoca a realizar mayores aislamientos en estos tipos de ambientes (molinos de caña) para recolectar cepas de

otras especies que puedan ser de interés tales como S. bayanus o S. pastorianus mediante el “primer” LgHO

usando un control positivo que valide la técnica de Colony PCR, y otro tipo de microorganismos que sean de

interés. Se deben realizar investigaciones más rigurosas y con más tomas de datos durante la fermentación para

observar cómo cambia el perfil de los diferentes compuestos a medida que transcurre el tiempo. Es de

importancia realizar un especial análisis sobre la cepa CW08 que puede pertenecer a otra especie, practicando

de nuevo la técnica PCR para esta cepa además de otras técnicas que no dejen espacio a errores. Debido a los

resultados obtenidos en la cepa CW03 sería muy interesante lograr identificar por completo en términos de

intraespecie el ADN de estas células con el fin de corroborar la teoría planteada de la presencia y ausencia de

los genes que tienen impacto sobre la fermentación y producción de ácido acético. De igual manera, aunque

hay indicios debido a la morfología de las células observadas en el microscopio de estas cepas de S. cerevisiae

encontradas sean diploides se deben realizar los estudios y experimentos pertinentes para corroborarlo. Por

último, se debe prestar especial atención sobra la cepa CW12 para realizar más estudios con el fin de

caracterizarla en muchos aspectos y poder emplearla en la producción de la cerveza “Colombian Ale”.

35

5. REFERENCIAS

[1] M. Calvo, «BIOQUIMICA DE LOS ALIMENTOS: ESTRUCTURA DEL ALMIDON,» MILK

SCIENCE, Universidad de Zaragoza, 2009. [En línea]. Available:

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/almidon.html. [Último acceso: 2019 03 09].

[2] M. Anthea, J. Hopkins, C. W. McLaughlin, S. Jhonson, M. Q. Warner, D. LaHart y J. D. Wright,

Human Biology and Health, Nueva Jersey (Estados Unidos): Prentice Hall, 1993.

[3] C. L.Loviso y D. Libkind, «Síntesis y regulación de compuestos del aroma y el sabor derivados de la

levadura en la cerveza: ésteres,» Science Direct, vol. 50, nº 4, pp. 436-446, 2018.

[4] A. Connelly, «The Guardian: The science and magic of beer | Andy Connelly,» 2019 Guardian News &

Media Limited or its affiliated companies, 29 07 2011. [En línea]. Available:

https://www.theguardian.com/science/blog/2011/jul/29/science-magic-beer?intcmp=239. [Último

acceso: 09 03 2019].

[5] L. Dongyou, de Handbook of nucleic acid purification, Miami, Boca Raton: CRC Press, 2009, p. p.

174.

[6] D. E. Miranda Castilleja, «Aislamiento, selección e identificación de levaduras Saccharomyces spp.

nativas de viñedos en Querétaro, México,» Agrociencia, México, vol. 49, nº 7, pp. p. 759-773, 2015.

[7] V. Machado y F. Artigas, «Aislamiento, selección e identificación de levaduras nativas con propiedades

enológicas en uvas Tannat,» Universidad ORT Uruguay, Facultad de Ingeniería, Montevideo -

Uruguay, 2017.

[8] C. Guevara Bravo, J. Acevedo y C. Peláez Jaramillo, «AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE

UNA LEVADURA FLOCULANTE PARA PRODUCIR ETANOL DEL BANANO DE RECHAZO,»

Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, vol. 12, nº 2, pp. 151-159, 2014.

[9] L. C. Trujillo y S. E. Hernández, «Aislamiento y caracterización de levaduras presentes en el fruto del

Syzygium malaccense (l.) Merr. &L.M Perry (pomorroso) en la comuna 1 de la ciudad de Neiva-

Huila,» Revista Ingeniería y Región, vol. 13, nº 1, pp. 37-45, 2015.

[10] P. F. Brandão, A. del Pilar Mendez y M. E. Velásquez Lozano, «Aislamiento, caracterización y

evaluación de levaduras nativas del municipio de Puerto López (Meta) para la producción de etanol,»

Grupo de Estudios para la Remediación y Mitigación de Impactos Negativos al Ambiente

(G.E.R.M.I.N.A.), Laboratorio de Microbiología Ambiental y Aplicada, Departamento de Química,

Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - Colombia, 2012.

[11] Economía y Negocios, «La marca de $ 6,5 billones a la que Bavaria le renovó la imagen,» EL Tiempo,

2018. [En línea]. Available: https://www.eltiempo.com/economia/empresas/consumo-de-cerveza-en-

colombia-258608. [Último acceso: 09 03 2019].

[12] M. P. TORRES TORRES, «VALORACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA DEL

PRODUCTO EN PROCESO EN UNA PLANTA PRODUCTORA DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS,»

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, FACULTAD DE CIENCIAS, CARRERA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL, 19 07 2007. [En línea]. Available:

https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/8788/tesis16.pdf?sequence=1. [Último

acceso: 09 03 2019].

[13] A. Rubín Martín, «Saccharomyces cerevisiae: características, morfología y ciclo de vida,» Lifeder.com,

2019. [En línea]. Available: https://www.lifeder.com/saccharomyces-cerevisiae/#Morfologia. [Último

acceso: 09 03 2019].

[14] A. Perez de Castro, «Universidad Politécnica de Valencia. Reacción en cadena de la polimerasa

(Polymerase Chain Reaction, PCR),» Riunet.upv.es, 2012. [En línea]. Available:

https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%

20polimerasa.pdf. [Último acceso: 09 03 2019].

[15] G. De Melo Pereira, C. Ramos, C. Galvão, E. Souza Dias y R. Schwan, «Use of specific PCR primers

to identify three important industrial species of Saccharomyces genus: Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces bayanus and Saccharomyces pastorianus,» Letters In Applied Microbiology, vol. 51, nº

2, pp. 131-137, 2010.

36

[16] SGD The Saccharomyces Genome Database, «Saccharomyces Genome Database, Descripción de HO /

YDL227C,» Universidad de Stanford, Stanford, 2019. [En línea]. Available:

https://www.yeastgenome.org/locus/S000002386. [Último acceso: 21 06 2019].

[17] Himedia, «2% Malt Extract Agar,» Technical Data, Himedialabs.com, 2011. [En línea]. Available:

http://himedialabs.com/TD/M1964.pdf. [Último acceso: 16 06 2019].

[18] Teach.Genetics, «Making Agar Plates,» Genetic Science Learning Center, Teach.genetics.utah.edu,

2015. [En línea]. Available: https://teach.genetics.utah.edu/content/microbiology/plates/. [Último

acceso: 2016 06 2019].

[19] ASSIST Australian School Science Information and Support For Teachers and Technicians,

«STANDARD OPERATING PROCEDURE: Preparing agar plates,» Assist.asta.edu.au, 2016. [En

línea]. Available:

https://assist.asta.edu.au/sites/assist.asta.edu.au/files/SOP%20Preparing%20agar%20plates_v2.pdf.

[Último acceso: 16 06 2019].

[20] P. B. Camba, «Consellería do Medio Rural. Xunta de Galicia: Estación de Viticultura y Enoloxía de

Galicia,» 2019. [En línea]. Available:

http://mediorural.xunta.gal/fileadmin/arquivos/investigacion/evega/calidademb.pdf. [Último acceso: 20

06 2019].

[21] L. G. Gómez, «UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR. Técnicas de siembra para hongos y

bacterias,» 2011. [En línea]. Available:

https://www.google.com/url?sa=i&source=images&cd=&ved=2ahUKEwi43_WGiInjAhUInlkKHV1-

C8YQjhx6BAgBEAI&url=https%3A%2F%2Fsemilleroluzverde.jimdo.com%2Fapp%2Fdownload%2F

9797072868%2FLaboratorio%2B3%2B-

%2BSiembra.pdf%3Ft%3D1535558096&psig=AOvVaw2WsRuqPbo5Oj065a. [Último acceso: 20 06

2019].

[22] Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Delegación de Cataluña, «Seres Modélicos.

Entre la naturaleza y el laboratorio,» 2019. [En línea]. Available:

http://seresmodelicos.csic.es/llevat.html. [Último acceso: 20 06 2019].

[23] New England Biolabs, «PCR Protocol for Taq DNA Polymerase with Standard Taq (Mg-free) Buffer

(M0320),» 2019. [En línea]. Available: https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/taq-dna-

polymerase-with-standard-taq-mg-free-buffer-m0320. [Último acceso: 20 06 2019].

[24] W. F. Quezada-Moreno y I. Gallardo-Aguilar, «Obtención de extractos de plantas mucilaginosas para la

clarificación de jugos de caña,» RTQ "Revista de Tecnología Química" Universidad del Oriente, vol.

34, nº 2, pp. 114-123, 2014.

[25] L. Cuellar, «Cerveza artesanal,» 25 Diciembre 2016. [En línea]. Available: https://www.cerveza-

artesanal.co/que-significa-floculacion-en-la-levadura-y-porque-es-importante-saberlo/. [Último acceso:

20 06 2019].

[26] H. Feldmann, Yeast: Molecular and Cell Biology, Wiley-Blackwell, 2010.

[27] L. Yuqing y Z. Xuedong, Atlas of Oral Microbiology: From Healthy Microflora to Disease, Elsevier

Inc., 2015.

[28] Universidad de Granada, «Tamaño y forma de las células procariotas,» 14 Octubre 2014. [En línea].

Available: https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/03forma.htm. [Último acceso: 20 06 2019].

[29] M. Rachel Watson, «Universidad de Wyoming. THE VIRTUAL EDGE: Lab 13 Fungi,» 2019. [En

línea]. Available: https://www.uwyo.edu/virtual_edge/lab13/fungi_results.htm] . [Último acceso: 20 06

2019].

[30] H. Jeong, H. J. Kim y S. J. Leeb, «Complete Genome Sequence of Escherichia coli Strain BL21,»

American Society for Microbiology (ASM): Genome Announcements, vol. 3, nº 2, p. 15, 2015.

[31] D. R. C. Garay y H. R. J. Campos, «CINETICA DE CRECIMIENTO Saccharomyces cerevisiae,»

2014. [En línea]. Available: https://slideplayer.es/slide/1465530/. [Último acceso: 20 06 2019].

[32] A. Rodriguez, «Obtencion de Acido Acetico Mediante Fermentacion Directa Del Alcohol Etilico

Utilizando Acetobacter Aceti,» 19 Febrero 2014. [En línea]. Available:

https://es.scribd.com/doc/207954678/Obtencion-de-Acido-Acetico-Mediante-Fermentacion-Directa-

Del-Alcohol-Etilico-Utilizando-Acetobacter-Aceti. [Último acceso: 20 06 2019].

37

[33] SDG The Saccharomyces Genome Database, «Saccharomyces Genome Database: HXK2 / YGL253W

Overview,» 2019. [En línea]. Available: https://www.yeastgenome.org/locus/S000003222#literature.

[Último acceso: 20 06 2019].

[34] L. M. Raamsdonk, J. A. Diderich, A. Kuiper, M. v. Gaalen, A. L. Kruckberg, J. A. Berden y K. V.

Dam, «Co‐consumption of sugars or ethanol and glucose in a Saccharomyces cerevisiae strain deleted

in the HXK2 gene,» Yeast, vol. 18, nº 11, pp. 1023-1033, 2001.

[35] D. J. Erasmus, «Production of acetic acid by Saccharomyces cerevisiae during icewine fermentations,»

University of British Columbia Library, Vancouver, 2005.

[36] Fermentis, «www.fermentis.com Technical data sheet SafAle™ US-05 - Fermentis,» 2016. [En línea].

Available: https://fermentis.com/wp-content/uploads/2017/10/SafAle-US-05-2.pdf. [Último acceso: 20

06 2019].

[37] University Post, University of Copenhagen, «What's the pH of beer? The true origins of the pH scale,»

25 06 2014. [En línea]. Available: https://uniavisen.dk/en/whats-the-ph-of-beer-the-true-origins-of-the-

ph-scale/. [Último acceso: 20 06 2019].

[38] A. K. B. Nocua, «ANALISIS DEL BANANO,» 14 05 2014. [En línea]. Available:

https://prezi.com/gvrvptlys4v0/analisis-del-banano/. [Último acceso: 20 06 2019].

[39] F. Fierro Fierro, «Electroforesis de ADN,» de Herramientas moleculares aplicadas en ecología:

aspectos teóricos y prácticos, Tlalpan, México, D.F, Secretaría de Medio Ambiente y Recursos

Naturales (Semarnat). Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático (INECC). Universidad

Autónoma Metropolitana-Iztapalapa (UAM-I), 2014, pp. 27-51.

38

ANEXOS

1. Lugares de toma de muestras en molino y cajas de Petri recolectadas

A. Molino ‘La Manuelita’

1

2

3

39

B. Molino ‘El Manantial’

1

2

3

4

5

6

7

40

C. Molino ‘Jordán’

1

2

3

4

5

6

7

8

41

D. Molino ‘Santos Miguel’

1

2

3

4

5

6

7

42

2. Lugares exitosos macroscópicamente

43

3. Primer repique de posibles colonias identificadas macroscópicamente

44

4. Segundo repique de posibles colonias identificadas macroscópicamente

45

5. Floculación en medio líquido de las colonias del primer repique

46

6. Floculación en medio líquido de las colonias del segundo repique

47

7. Morfología microscópica de las posibles levaduras cultivadas en medio líquido YPD,

primer repique

1.1 A

1.1 B

1.1 C

2.1 A

2.1 B

2.BL A

2.BL B

3.5 A

3.5 B

3.6 A

3.7 A

3.8 A

3.8 B

48

8. Morfología microscópica de las posibles levaduras cultivadas en medio líquido YPD,

segundo repique

1.1 A

1.1 B

1.1 C

1.1 D

1.1 E

1.1 F

1.3 A

2.1 A

2.1 B

2.1 C

2.4 A

2.4 B

2.BL A

2.BL B

1.5 A

3.5 B

3.5 C

1.5 D

3.5 E

3.5 F

49

3.5 G

3.5 H

3.5 I

3.6 A

3.6 B

3.6 C

3.7 A

3.7 B

3.7 C

3.8 A

3.8 B

3.8 C

3.8 D

4.1 A

4.5 A

4.5 B

50

9. Geles de electroforesis para muestras y controles

A. Segundo intento técnica Colony PCR con “primer” ScHO

B. Tercer intento técnica Colony PCR con “primer” LgHO

51

C. Nueva lectura 1er 2do y 3er técnica PCR de las muestras 20 y 21

52

10. Crecimiento de las cepas dividido en la parte inicial, exponencial y final.

Concentración vs horas.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0 1 2 3 4 5 6 7

0,20

0,60

1,00

1,40

1,80

2,20

2,60

3,00

3,40

3,80

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

3,30

3,40

3,50

3,60

3,70

3,80

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

53

11. Cambio de composición de ácidos orgánicos, alcoholes y azúcares para cada cepa

durante la fermentación.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido acético

0

0,0008

0,0016

0,0024

0,0032

0,004

0,0048

0,0056

0,0064

0,0072

0,008

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido cítrico

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido láctico

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0,055

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido málico

00,015

0,030,045

0,060,075

0,090,105

0,120,135

0,150,165

0,18

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido succínico

00,0020,0040,0060,0080,01

0,0120,0140,0160,0180,02

0,0220,024

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Ácido tartárico

54

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0,50,55

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Etanol

00,020,040,060,08

0,10,120,140,160,18

0,20,220,240,26

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Metanol

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0,22

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Glucosa

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Sacarosa

00,005

0,010,015

0,020,025

0,030,035

0,040,045

0,050,055

0,06

0 12 24 36

Co

nce

ntr

ació

n [

%]

Tiempo fermentación [Horas]

Fructosa

55

12. Fermentaciones de medios extracto de malta con levaduras nativas después de 36

horas

56