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Caracterización in silico e in vitro de péptidos antimicrobianos con
potencial antiparasitario
VALERIA VANEGAS SEGURA
DIRECTORA: HELENA GROOT DE RESTREPO, Universidad de los Andes,
Departamento de Ciencias Biológicas
CO-DIRECTORA: CAROLINA MUÑOZ CAMARGO, Universidad de los
Andes, Departamento de Ingeniería Biomédica
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
Facultad de Ciencias
Departamento de Ciencias Biológicas
Bogotá
2018
Caracterización in silico y evaluación de la actividad biológica en células
humanas y estabilidad en ambientes fisiológicos de nuevos péptidos
antimicrobianos, con potencial aplicación como moléculas antiparasitarias
Resumen
Las enfermedades infecciosas causadas por parásitos como la Malaria, la Leishmaniasis y la
enfermedad de Chagas son un importante problema de salud pública, especialmente en países
tropicales como Colombia. Aunque, en la actualidad se utilizan diferentes medicamentos para
controlar estas enfermedades, aún no se ha descubierto una estrategia exitosa; lo que ha
obligado a diseñar nuevos métodos para su control. Uno de los más prometedores son los
péptidos antimicrobianos (PAMs) que han demostrado tener gran potencial en contra de
diversos patógenos. En este estudio se caracterizaron in silico 16 péptidos antimicrobianos
teniendo en cuenta aspectos como su estructura y similitud con péptidos antiparasitarios
descritos previamente, además de un análisis in vitro para evaluar su actividad biológica en
células humanas. Por último, se realizó un análisis de estabilidad de los péptidos en diferentes
ambientes y se evaluó la diferenciación celular como la capacidad inmunomoduladora. Los
resultados de este estudio identificaron 4 péptidos antimicrobianos con capacidad
inmunomoduladora, no hemolíticos ni citotóxicos, entre los cuales, 2 pueden ser utilizados
en fases intracelulares y 2 en extracelulares de los parásitos. Éste estudio demuestra el
potencial de estos péptidos y muestra perspectivas para ser utilizados en posteriores estudios
como nuevas moléculas antiparasitarias.
Introducción
Las enfermedades infecciosas son causadas por microorganismos, como bacterias, hongos,
virus y parásitos. Estos últimos, son organismos eucariotas unicelulares, que usualmente
viven en ambientes acuosos y pueden poseer una reproducción sexual o asexual. Muchos de
ellos son parásitos obligados y pueden causar importantes enfermedades en humanos como la
Malaria, la Leishmaniasis, el Chagas, entre otras; causando millones de muertes en todo el
mundo cada año (WHO, 2015). Aunque se han desarrollado varios medicamentos y medidas
de prevención en contra de estas enfermedades, para muchas aún no se ha descubierto un
método eficaz para su control.
Actualmente en Colombia, enfermedades causadas por parásitos como: la Malaria, el Chagas
y la Leishmaniasis, representan un importante problema de salud pública, debido a que
aproximadamente el 85% del territorio rural está localizado por debajo de los 1600 metros
sobre el nivel del mar y las diferentes condiciones geográficas y climáticas son adecuadas
para el ciclo de transmisión de estas enfermedades que involucran la participación de
vectores (Rodríguez y colaboradores 2011). De acuerdo con los informes del Sistema de
Vigilancia Epidemiológica de Colombia, cada semana se reportan aproximadamente 1000
nuevos casos ocasionados por agentes parasitarios como: Plasmodium sp, Trypanosoma cruzi
y Leishmania sp (INS, 2018), demostrando que existe una necesidad urgente de encontrar
nuevos tratamientos y estrategias para poder controlar esta amplia problemática.
Desde el descubrimiento de los agentes etiológicos de la Malaria, el Chagas y la
Leishmaniasis, se han implementado diferentes métodos de control, sin embargo, factores
como: ciclos de vida complejos, un amplio repertorio de hospederos, diversos métodos de
evasión del sistema inmune, desarrollo de resistencia a los medicamentos, falta de vacunas
eficaces y resistencia a los insecticidas por parte de los vectores (Orjuela y colaboradores,
2018), contribuyen a la permanencia de estas enfermedades. De esta manera, estos factores
han disminuido la eficacia de los métodos antiparasitarios actuales y minimizan los logros
recientes. De acuerdo con este panorama, nuestro grupo de investigación se enfoca en
encontrar moléculas con potencial antimicrobiano, como alternativa a los medicamentos
tradicionalmente usados, como lo son los péptidos antimicrobianos (PAMs).
Los PAMs constituyen la primera línea de defensa en diferentes organismos y cada vez
cobran más importancia como una alternativa para luchar contra diferentes tipos de
patógenos (Jenssen y colaboradores, 2006). Los PAMs han sido aislados de diversos
organismos: desde bacterias hasta mamíferos como los humanos. Los anfibios y en especial
las ranas, son organismos que despiertan mucho interés en la búsqueda de péptidos
antimicrobianos y otras moléculas bioactivas. Esto se debe principalmente a la importancia
fisiológica de la piel en procesos vitales de estos organismos. Éste órgano en las ranas, es
altamente permeable y sin embargo, a lo largo de la evolución han desarrollado una estrategia
de defensa que se basa en la secreción de sustancias que producen las glándulas granulares de
la piel, que no solo producen grandes cantidades de moléculas biológicamente activas, sino
que también producen una gran diversidad de PAMs para controlar las diferentes clases de
patógenos, a los que se ven expuestos debido a las condiciones de su hábitat (Muñoz-
Camargo y colaboradores, 2016 y Su X y colaboradores 2007).
Estas moléculas son descritas como principalmente catiónicas, anfipáticas con menos de 100
residuos de aminoácidos de longitud, lo que les confiere la capacidad de actuar en
concentraciones micromolares en contra de un amplio espectro de patógenos como: bacterias,
hongos, virus y protozoos (D'Alessandro y colaboradores, 2015 y Mahlapuu y colaboradores,
2016).
Recientemente se ha encontrado que los PAMs tienen mecanismos de acción muy versátiles
que van desde desestabilización de la membrana de los patógenos, inhibición de la síntesis
proteica y de ácidos nucleicos. Así como también tienen la capacidad de tener funciones
inmunomoduladoras, quimioatrayentes (Conlon y colaboradores, 2014 y Pantic y
colaboradores, 2014) y citotóxicas (Guaní-Guerra y colaboradores, 2010). A pesar del
potencial de los PAMs, en la actualidad sus aplicaciones terapéuticas aún tienen limitaciones,
como la citotoxicidad en células sanas y la inestabilidad en ambientes fisiológicos (Da Costa
y colaboradores, 2015).
De acuerdo con lo anterior, el objetivo de este estudio fue caracterizar in silico y evaluar la
actividad biológica en células humanas y estabilidad en ambientes fisiológicos de nuevos
péptidos antimicrobianos derivados de piel de ranas (Groot y colaboradores, 2012 & Muñoz y
colaboradores, 2016) con potencial aplicación como moléculas antiparasitarias.
Materiales y métodos
1. Análisis in silico
1.1 Caracterización péptidos
Se analizaron 16 péptidos antimicrobianos aislados previamente en el Laboratorio de
Genética Humana de la Universidad de los Andes (Groot y colaboradores, 2012 & Muñoz y
colaboradores, 2016). Se utilizaron las bases de datos CAMPR3 (Waghu FH y colaboradores,
2015) y APD3 (Wang y colaboradores, 2016). CAMPR3 predice la probabilidad de ser
péptidos antimicrobianos bajo 4 algoritmos: SVM (Support vector Machines), Random
Forest, Artificial Neuronal Network y Discriminant. En la herramienta APD3: calcula y
predice de acuerdo con las siguientes características de las secuencias candidatas (PAMs):
hidrofobicidad, carga neta, hidropatía (GRAVY), índice de Boman, posible estructura
secundaria y carga neta.
1.2 Similitud con péptidos descritos y posibles mecanismos de acción
La alineación de péptidos se realizó utilizando las bases de datos: PIR (Chen y colaboradores
2013), APDR3 (Wang y colaboradores, 2016) y ParaPep (Mehta y colaboradores, 2014) para
predecir secuencias de péptidos antiparasitarios similares reportados anteriormente. Por otro
lado, basándose en su estructura, se identificaron las posibles actividades de estos péptidos,
como puede ser un efecto: antibacteriano, antifúngico, antitumoral, antiviral y antiparasitario
y su posible modo de acción en la membrana: desestabilizador, formador de poros y
despolarizador. Por último, se usó la herramienta CellPPD: Designing of Cell Penetrating
Peptides (Gautam, 2013) y Hemo PI (Chaudhary y colaboradores, 2016) para analizar la
probabilidad de que los péptidos tuvieran la capacidad de penetrar la membrana y de ser
hemolíticos respectivamente.
1.3 Estabilidad y vida media
Aunque se ha demostrado que los péptidos son buenos candidatos como alternativa
terapéutica para un amplio rango de enfermedades infecciosas, su uso en ocasiones es
limitado debido a su alta susceptibilidad a la degradación. Para determinar la estabilidad se
utilizó la herramienta ProtParam (Gasteiger E y colaboradores, 2005) y HLP (Sharma, A. y
colaboradores, 2014) para predecir la estabilidad de los péptidos en diferentes cultivos y en
ambientes altamente proteolíticos. Finalmente, se predijo con la herramienta PeptideCutter
(Gasteiger E y colaboradores, 2005) qué tipo de proteasas o sustancias podrían tener una
acción de escisión sobre los péptidos.
2. Síntesis de péptidos
La síntesis de los péptidos seleccionados se realizó en la Universidad Pompeu Fabra en
Barcelona (España). Los péptidos fueron sintetizados en fase sólida con Fmoc. Cada uno de
los péptidos crudos sintéticos se purificaron en una columna Venusil XBP-C18 RP-HPLC
(4,6 mm x 250 mm), eluyendo a una tasa de 1 ml por minuto, por medio de un gradiente
lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0.1% en agua por fase HPLC. La
espectrometría de masas con electrospray se utilizó para corroborar la pureza (> 98%) y la
identidad de los péptidos sintéticos. Los péptidos con capacidad de penetrar la membrana se
sintetizaron unidos a la Fluoresceína 5-isotiocianato (FTIC).
3. Evaluación de la actividad biológica en células humanas de los PAMs candidatos
3.1 Cultivo de las líneas celulares “immortalized human keratinocytes” (HaCaT)
ATCC®PCS-200-010™ y “human monocytic cell” (THP-1) ATCC® TIB-202™
La línea celular HaCaT fue mantenida en medio DMEM y la línea THP-1 en medio RPMI
1640, con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina e incubadas a 37°C y
5% CO2.
3.2 Evaluación citotóxica de los PAMs
Para evaluar el efecto de los péptidos frente a las células de mamíferos, se evaluó su
capacidad citotóxica a diferentes concentraciones en la línea celular de queratinocitos
humanos (HaCaT). Se sembraron las células a una densidad de 1x10e5 en una placa de 96
pozos por 24 horas. Luego fueron expuestas a 6 concentraciones de los péptidos (3.12, 6.25,
12.5, 25 y 50 µM). Para comparar con un medicamento actual contra para la Malaria; las
células fueron expuestas a la Cloroquina a 3 concentraciones (10, 25, 50 µM). Después de 24
horas de incubación, el reactivo MTT fue añadido en cada uno de los pozos, y fue incubado
por dos horas más. Finalmente, el medio fue removido y 100 µL de DMSO fue agregado. Los
resultados fueron leídos a 595 nm en un espectrofotómetro (Bio-Rad, Philadelphia, PA,
USA). Las células que no fueron expuestas a los péptidos se utilizaron como control
negativo. El porcentaje de viabilidad fue calculado como: Densidad óptica células
tratadas/Densidad óptica células control*100.
3.3 Evaluación hemolítica de los PAMs
La actividad hemolítica fue obtenida usando el protocolo por (Muñoz-Camargo, y
colaboradores 2018). La actividad de los péptidos seleccionados fue evaluada individual y en
tres combinaciones: 1. Conjunto de péptidos penetradores de membrana, 2. Conjunto de
péptidos no penetradores de membrana y 3. Conjunto de todos los péptidos. Los eritrocitos
fueron recogidos en un vacutainer con heparina y fueron lavados con solución salina. Los
péptidos seleccionados fueron diluidos con PBS 1X y llevados a 7 concentraciones (3,12,
6,25, 12,5, 25, 50 y 100 μM). Los eritrocitos con PBS se usaron como control negativo y con
tritón 100-x al 10% como control positivo. 100 μL de eritrocitos al 0.8 % de hematocrito y
100μL de péptidos fueron alicuotados. Cada suspensión de concentración se incubó a 37°C
durante 1 hora. Todas las suspensiones fueron centrifugadas durante 5 min a 3000 rpm y se
obtuvo 100 μL de cada sobrenadante y se determinó la hemoglobina liberada en un
espectrofotómetro a 405 nm. El porcentaje de hemólisis fue calculado como: ((Densidad
óptica muestra-Densidad óptica control negativo)/Densidad óptica control positivo-Densidad
óptica control negativo)*100).
3.4 Evaluación de la inducción de diferenciación de monocitos THP-1 a macrófagos
THP-1
El objetivo de este ensayo fue conocer de forma preliminar si existe un efecto
inmunomodulador de los péptidos. Para ello se determinó si los péptidos tienen capacidad de
producir la activación y diferenciación de los monocitos a macrófagos. De esta manera, se
realizó la siembra de la línea celular de monocitos humanos THP-1 en una placa de 96 pozos
y se expusieron a las concentraciones (6, 12, 25, 50, 100 µM) de los péptidos. Al tercer día se
realizó cambio de medio y por 7 días se verificó el cambio de morfología de células no
adherentes a células adherentes (macrófagos). El control negativo fueron las células en el
medio de cultivo sin exposición a los péptidos.
3.5 Visualización translocación en eritrocitos y Monocitos THP-1 de los PAMs
candidatos
Los péptidos con potencial de internalizar la membrana fueron marcados con Fluoresceína 5-
isotiocianato (FTIC, EX: 492 nm EM: 518 nm), y se utilizaron para visualizar la capacidad de
translocación en eritrocitos y monocitos THP-1 a 10 μM. Se utilizó el péptido Frenatin 2.3
(GG), para el cual se reporta actividad antimicrobiana, sin capacidad de penetrar la
membrana. El control negativo fueron las células sin los péptidos marcados. La visualización
se realizó en el microscopio de fluorescencia con el objetivo 60x (Nikon Eclipse TI, Melville,
NY). Las imágenes fueron analizadas en NIS-element viewer y FIJI (Schindelin y
colaboradores, 2012).
4. Estabilidad de los péptidos mediante espectroscopia de transmisión de infrarrojo con
transformada de Fourier (FTIR)
Se monitoreó la estabilidad de los péptidos según la transformación de su estructura
secundaria en ambientes fisiológicos con PBS 1X y en plasma humano. Se midió en el
equipo de FTIR (Alpha Bruker, Ettlingen,Germany) el cual es útil para determinar las
estructuras secundarias de las proteínas. Para ello se realizaron alícuotas de los péptidos
candidatos a 100 μM y se diluyeron cada uno en PBS 1X y en plasma humano 1:100
inactivado previamente a 56°C. Los péptidos se incubaron a 37°C y los datos fueron
recolectados en diferentes periodos, en solución PBS 1X (1h-3h-5h-7h) y en plasma cada 15
min hasta 90 min. Los datos espectrales se recogieron desde 1600-1700 cm-1, en donde las
bandas encontradas entre los números de onda 1654-1658 cm-1 pertenecieron a las proteínas
con estructuras de hélices α, 1,624, 1,627, 1,633, 1,638, 1,642 cm-1: láminas β, 1648 cm-1:
Random y 1,667, 1,675, 1,680, 1,685 cm-1: giros β (Yang H y colaboradores, 2015).
5. Análisis estadísticos
Los ensayos estadísticos fueron desarrollados en el programa R (R Development Core Team,
2008). En primera medida se realizó un análisis de los residuos para evaluar la normalidad y
la homocedasticidad de los datos y para los resultados de los ensayos de hemólisis y
citotoxicidad se evaluaron las diferencias significativas entre péptidos, con el test HSD de
Tukey considerando un valor de P significativo por debajo de 0.05 en todos los casos.
Resultados
1. Análisis in silico
1.1 Caracterización de 16 péptidos candidatos
La carga y la hidrofobicidad son las principales características para identificar péptidos
antimicrobianos, puesto que indica la habilidad que tendrán de interactuar y unirse a la
membrana de los microorganismos; los cuales poseen generalmente una carga negativa en su
membrana extracelular. En el anexo 1 se presentan las principales características referentes a
la estructura de los 16 péptidos: carga, % residuos hidrofóbicos, vida media y estabilidad. La
mayoría presentan características de actividad antibacteriana tanto para Gram + como Gram-,
sin embargo, 4 péptidos TK, AL, CV y LK (Tabla 1) presentaron la mayor identidad y el
mejor e-value con péptidos antiparasitarios descritos anteriormente (Tabla 2).
Tanto AL, CV como LK, presentan más del 50% de residuos hidrofóbicos, lo que le
permitiría interactuar a los péptidos significativamente con la membrana del microorganismo.
TK (Buforin II); el único reportado anteriormente, es el más inestable y es el que presenta el
mayor índice de Boman, lo que indica que este PAM puede unirse a otras proteínas, es decir:
el péptido puede ser multifuncional o emplear una variedad de diferentes roles dentro de la
célula, debido a su habilidad de interactuar con un amplio rango de proteínas. Asimismo, es
el que presenta el menor índice de Gravy, lo que indica que tiene una mayor probabilidad de
ser un péptido hidrofílico. De acuerdo con los ensayos in silico, los péptidos TK y AL pueden
tener la capacidad de penetrar las membranas, y los péptidos AL y LK la probabilidad de ser
más hemolíticos. Por último, las estructuras secundarias de los 4 péptidos se encuentran
dentro de uno de los grupos más diversos de los PAMs que son la hélices α. Este grupo posee
un amplio espectro de actividad que varía considerablemente y algunos péptidos reportados
dentro de este grupo tienen la habilidad para modular la respuesta inmune innata (Nijnik, A y
colaboradores, 2009).
Tabla 1. Caracterización in silico de 4 péptidos con potencial antiparasitario. Los péptidos fueron nombrados a partir del primer y último aminoácido de su secuencia. De acuerdo a los ensayos in silico, 4 de 16 de los
péptidos analizados tienen potencial actividad antiparasitaria. Se muestran los siguientes parámetros obtenidos en este estudio: Índice de
Gravy: Porcentaje hidrofobicidad e hidrofilicidad, un score debajo de cero es más probable de ser una proteína hidrofílica, mientras que
arriba de 0 es más probable de ser una proteína hidrofóbica. Índice de inestabilidad: un valor mayor de 40 es probable que la proteína sea
inestable, si es menor, la probabilidad es ser estable. Índice de Boman: Estimado del potencial que tiene el péptido de unirse a otro tipo de
membranas, proteínas como receptores. Una proteína tiene un alto potencial si su índice es mayor que 2.48 kcal/mol.
1.2 Similitud con péptidos antimicrobianos y posibles mecanismos de acción.
El péptido TK (Buforin II), reportado por Park y colaboradores en 1998, ha sido utilizado
previamente en contra hongos y bacterias Gram positivas y Gram negativas. Adicionalmente,
existe un reporte del uso de este péptido en contra del parásito del filo Apicomplexa:
Cryptosporidium parvum (Tabla 2). Su mecanismo de acción consiste en atravesar la
membrana debido a una prolina ubicada en la zona bisagra del péptido (Figura 1), penetrando
la célula y actuando directamente sobre el ADN. (Park y colaboradores, 2000).
El segundo péptido identificado fue AL, que posee una identidad del 68% y un e-value de
1xE-8 con el PAM Dermaseptina S4, el cual ya ha sido utilizado en contra de los parásitos
Trypanosoma sp, Leishmania sp y Plasmodium sp (Pinto y colaboradores, 2013).
En el caso del péptido CV, posee una identidad del 67% y un e-value 0.015 con el péptido
Moricin, que anteriormente ha sido estudiado en Trypansoma cruzi (Fieck, A y
colaboradores, 2010). Finalmente, el péptido menos similar a otros péptidos reportados
previamente es LK, y este tiene una identidad del 56% con un e-value de 0.14 con el PAM
Bombinin, que ha sido utilizado anteriormente en algunas especies de Leishmania (Mangoni
y colaboradores, 2006).
Tabla 2. Similitud y posible mecanismo de acción de los péptidos candidatos. Los 4 péptidos presentan actividades antiparasitarias y poseen similitud con péptidos antiparasitarios reportados anteriormente. La
herramienta Hemo PI, predijo la probabilidad que tenían los péptidos de lisar los eritrocitos y sus valores cercanos a 1 tienen la mayor
probabilidad de ser hemolíticos. Por otro lado, la herramienta PPD fue utilizada para predecir la capacidad que tienen los péptidos de ser
penetradores de membrana.
IDNombre
reportado
Peso
molecular
(Da)
Carga neta% Residuos
hidrofóbicosEstructura
Índice de
Gravy
Índice de
Boman
(Kcal/mol)
Actividad del péptido
TKReportado por
(Park et al.,
1996) Buforina II
2434.88 6 33 Hélice -0.638 3.34
Antibacteriano: Gram+, Gram-,
antifúngico, antitumorogénico y
antiparasitario
AL No reportado 1994.49 3 63 Hélice 0.763 -0.69Antibacteriano: Gram + Gram - y
antiparasitario
CV No reportado 1511.85 2 60 Hélice 0.76 0.02Antibacteriano: Gram+,
antigúngico y antiparasitario
LK No reportado 2271.77 1 52 Hélice 1.057 -1.22Antibacteriano: Gram +,
antifúngico y antiparasitario
Figura 1. Representación de la estructura del péptido Buforina II. Los residuos coloreados con rojo pertenecen a los aminoácidos: cargados positivamente, residuos hidrofílicos: azules, residuos hidrofóbicos:
amarillos y la zona blanca pertenece al aminoácido prolina. (Park y colaboradores, 2000).
1.3. Predicción in silico de la estabilidad y vida media de los péptidos.
Uno de los grandes problemas del uso de los PAMs es su inestabilidad en diferentes tipos de
fluidos, como: plasma sanguíneo, soluciones acuosas, entre otras. Por lo que es de gran
importancia conocer primeramente su estabilidad bajo condiciones in vitro previo a los
ensayos de inhibición con los parásitos.
El índice de inestabilidad permitió clasificar a TK y AL como inestables y CV y LK como
estables, en condiciones en un tubo de ensayo. Las predicciones de la vida media, indicaron
que todos los péptidos evaluados en el estudio podrían mantener su estructura in vitro en
reticulocitos durante horas. En contraste, a las predicciones de estabilidad en el entorno
proteolítico, el único péptido clasificado con estabilidad baja fue TK.
Por último, las predicciones realizadas con la herramienta Peptide Cutter, permitió conocer
que tipo de enzimas proteolíticas podrían degradar los péptidos, como por ejemplo la tripsina
que es encontrada en el sistema digestivo de muchos vertebrados.
ID Posible actividad Usado en parásitos Hemó PI PPD
Péptido Homólogo Identidad E-value
ALPermeabilizador de la
membrana Dermaseptin 68% 1.00E-08 Plasmodium sp 0.58 Si
CV Formador de poros Moricin 67% 0.015 Trypanosoma cruzi 0.46 No
LK
Formador de poros,
permeabilizador de la
membrana e
inmunomodulador
Bombinin 56% 0.14 Leishmania sp 0.58 No
SiCrytosporidium parvumTKInhibibor de funciones
celulares internas. 0.014100%
Homología con péptidos
Buforin II 0.47
Tabla 3. Evaluación in silico de la vida media y estabilidad de los péptidos candidatos en
diferentes condiciones. Las predicciones de vida media, obtenidas de acuerdo con el aminoácido N-terminal, indicaron que todos los péptidos pueden mantener su
integridad de estructura en diferentes cultivos. El índice de inestabilidad proporcionó una estimación de la estabilidad de la proteína en un
tubo de ensayo. Una proteína cuyo índice de inestabilidad es menor que 40 se predijo como estable, un valor superior a 40 predijo que la
proteína puede ser inestable. HLP: El conjunto de datos para el modelo desarrollado para la predicción de vida media se tomó de Gorris et.
(2009). Para el perfil de la estabilidad de péptidos en ambientes proteolíticos, se usaron las siguientes condiciones: Si la vida media (s) <0.1
entonces Estabilidad = Baja, Vida media 0,1 a 1,0, Estabilidad = Normal, Vida media > 1.0, Estabilidad = Alta. Por último, la herramienta
Peptide cutter: predijo las posibles proteasas o sustancias químicas que podían ejercer su efecto en el péptido.
2. Ensayo citotóxico de los péptidos en la línea celular HaCaT.
Para determinar si los péptidos disminuían la viabilidad celular de las células humanas, se
realizó el ensayo en las células HaCaT (queratinocitos humanos inmortalizados), como
modelo utilizado previamente para evaluar citotoxicidad de péptidos antimicrobianos
(Baranska y colaboradores, 2013). Los resultados indicaron que los 4 péptidos presentan una
baja citotoxicidad aún en la concentración más alta (Figura 2). No se presentan diferencias
significativas entre los valores de citotoxicidad de cada uno de los péptidos evaluados (Valor-
P>0.05). En la concentración 50 µM, la disminución de la viabilidad de las células fue
mayoritariamente causada por el péptido CV (25 %) a diferencia del péptido Buforina II (9
%). En contraste, al utilizar la Cloroquina a concentraciones similares a la de los péptidos, fue
capaz de disminuir la viabilidad celular en más del 80% (50 µM).
IDÍndice de
inestabilidadVida media. (h)
HLP
estabilidad(s)
Acción de enzimas
proteolíticas
TK 84.2
7.2 Reticulocitos, in vitro
>20 levaduras, in vivo
>10 E.coli in vivo
Baja: 0.0001
Pepsina, tripsina, termolisina,
LysC-LysN, Arg-C,Clostripaina,
quimiotripsina y proteinasa K
AL -0.41
4.4 Reticulocitos, in vitro
> 20 levadura, in vivo
>10 E.coli in vivo
Normal: 0.394
Tripsina, termolisina, proteinasa
K, LysC,LysN, ácido fórmico,
Asp-N, quimiotripsina, pepsina,
ácido iodosonbenzoico.
CV 35.01
1.1 Reticulocitos, in vitro
>20 levaduras, in vivo
>10 E.coli in vivo
Normal: 0.845
Pepsina, tripsina, termolisina,
LysC-LysN, ArgC, Clostripaina,
quimiotripsina y proteinasa K
LK 52.46
5.5 Reticulocitos, in vitro
0.05 levaduras, in vivo
0.03 E.coli in vivo
Alta: 0.589
Quimiotripsina, LysC, LysN,
pepsina, proteinasa K,
termolisina y tripsina
Figura 2. Evaluación del potencial citotóxico de los péptidos candidatos Las células HaCaT fueron expuestas a las concentraciones de los péptidos (3, 6, 12, 25, 50 µm) durante 24 horas. Todos los péptidos
presentaron niveles bajos de citotoxicidad a diferencia de la cloroquina, que si posee una disminución significativa del porcentaje de
viabilidad a una concentración de 50µM.
3. Ensayo hemolítico
Para que los péptidos antimicrobianos sean interesantes para aplicaciones sistémicas, deben
mostrar una baja toxicidad contra los eritrocitos. Por lo que es de gran importancia confirmar
que los péptidos no sean hemolíticos y únicamente puedan ejercer su efecto sobre los
parásitos. Los ensayos se evaluaron individualmente y en combinación; en caso de que
puedan llegar a ser usados para exhibir un efecto sinérgico. Se determinó que todos los
péptidos evaluados individualmente presentaron bajos porcentajes de hemólisis (Figura 3).
Los péptidos LK, AL y Buforina II presentaron menos del 10% de hemólisis para la
concentración más alta (100 µM). A diferencia del péptido CV que presentó el mayor
porcentaje de hemólisis <20% para la concentración mayor y mostró diferencias
significativas con los demás péptidos (Valor-P <0.05).
Al realizar la combinación entre péptidos, se logró evidenciar que hay diferencias
significativas entre la combinación de los 4 péptidos y las combinaciones dobles: TK+AL y
CV+LK (Valor-P <0.05). La combinación de los péptidos penetradores de membrana TK y
AL, causaron un efecto aditivo en el porcentaje de hemólisis y su resultado fue
significativamente mayor a diferencia de la combinación de CV+LK (Valor-P <0.05).
Figura 3. Capacidad hemolítica de 4 péptidos antiparasitarios, evaluados
individualmente. Eritrocitos humanos fueron cultivados con los péptidos durante 1 hora. La determinación de hemólisis fue determinada mediante la
liberación de hemoglobina en el medio y fue medida en un espectrofotómetro a 504 nm. El experimento fue realizado dos veces por
duplicado. El intervalo de confianza se presentó de color gris.
Figura 4. Capacidad hemolítica de los péptidos candidatos, evaluados en combinación. La determinación de la capacidad hemolítica se evaluó en 3 tipos de combinaciones. 1. Péptidos con capacidad de penetrar membrana
(TK+AL), 2. Péptidos sin capacidad de penetrar membrana (CV+LK) y 3. La combinación de los 4 péptidos antiparasitarios
(CV+LK+TK+AL). Para cada ensayo se utilizaron las mismas concentraciones y proporciones de cada péptido. El experimento fue
realizado dos veces por duplicado. El intervalo de confianza se presentó de color gris.
4. Capacidad de inducción de monocitos a macrófagos
Alguna de las capacidades que puede tener un PAM es la capacidad de ser
inmunomodulador, por lo que será capaz de promover inicialmente la diferenciación celular,
dando a lugar la inducción de citoquinas y procesos para destruir el agente infeccioso. De esta
manera, se evaluó de manera preliminar la diferenciación de los monocitos a macrófagos.
Los monocitos son células en suspensión y de forma redonda, a diferencia de los macrófagos
que son células adherentes y su morfología es elongada parecida a la de los fibroblastos. Al
exponer cada uno de los péptidos a los monocitos, se demostró que todos los péptidos
indujeron la diferenciación a macrófagos en el día de exposición 3 desde la concentración 6
µM (Figura 5), siendo péptido TK el de la mayor tasa de diferenciación.
Figura 5. Diferenciación de monocitos THP-1 a macrófagos después de la exposición de
los 4 péptidos candidatos a 6µM. Los monocitos fueron expuestos a los 4 péptidos candidatos a las concentraciones (6,12,25,50 y 100µM). Se encontró diferenciación a partir
de la concentración más baja. El cambio de morfología se presentó desde el 3 día y continúo hasta el último día de evaluación. La mayor
tasa de diferenciación fue para el péptido TK.
5.Visualización de la translocación de PAMs penetradores de membrana.
Después de haber confirmado con las herramientas in silico que los péptidos TK y AL
pueden internalizar la membrana, se verificó su capacidad in vitro, en eritrocitos y monocitos
humanos. En la Figura 6 se puede visualizar las diferencias entre TK y AL, péptidos
penetradores de membrana y GG péptido no penetrador de membrana. El péptido GG
“Frenatin 2.3S”, a diferencia de TK y AL, estuvo asociado únicamente a la membrana
externa del eritrocito. Tanto para los eritrocitos como los monocitos (Figura 7) se visualizó el
péptido marcado internalizado dentro de toda la célula. En los controles negativos no se
encontró ninguna señal emitida de fluoresceína.
Figura 6. Translocación de los péptidos en eritrocitos humanos. Los eritrocitos fueron expuestos una hora a los péptidos marcados con Fluoresceína 5-isotiocianato (FTIC) y luego se realizó su
visualización en microscopía de fluorescencia, utilizando un objetivo de 60x. A: péptido TK: Buforin II, B: péptido AL y C: péptido
Frenatin 2.3, D control negativo. Los eritrocitos con los péptidos penetradores de membrana se vieron totalmente fluorescentes en su
interior, a diferencia del eritrocito expuesto a Frenatin 2.3, que únicamente se visualizó la fluorescencia alrededor de la célula. Finalmente,
no hay señal de fluorescencia en las células control.
Figura 7. Translocación de los péptidos en la línea celular THP-1 monocitos
inmortalizados humanos. Los monocitos humanos fueron expuestos 1 hora a los péptidos a AL y a TK: Buforin II. Se visualizó la capacidad de los péptidos para
penetrar la membrana. Se visualizó en el interior de las células el péptido marcado con FITC. Las imágenes se obtuvieron longitudinalmente
cada 0.3 µM, la escala es de 15 µM para cada una de las imágenes. Las primeras tres imágenes correspondieron a microscopía de
fluorescencia y la última en microscopía de luz. A. Péptido TK, B. péptido AL y C. control.
6. Estabilidad de los péptidos candidatos
Para identificar el cambio de estructura secundaria de los péptidos en PBS 1X y plasma, se
obtuvieron los datos espectrales desde 1600 hasta 1700 cm-1. Con el fin de identificar la
posición de la amida I que ha sido bien estudiada para identificar las estructuras de proteínas
y polipéptidos. Se esperaron las bandas comprendidas entre los números de onda 1654-1658
cm-1 que correspondieron a los resultados de los análisis in silico de los PAMs descritos
anteriormente. El péptido liofilizado presentó una absorción de la amida I en la zona de 1633
cm-1 que corresponde a la estructura secundaria lámina β (Figura 8). Al recolectar los
espectros de cada uno de los péptidos primeramente en PBS, se logró evidenciar que no hay
ningún espectro con un único pico de absorción. Cada uno de ellos comprendió un rango más
amplio, en donde la absorción se encontró entre varios números de onda. En el caso del
péptido TK únicamente a la hora 5 de incubación, es cuando hubo una absorción en 1656 cm-
1 que indicó la presencia de la estructura de hélice α. A las 7 horas de incubación el péptido
comprendió en la zona de giros β. Para el péptido AL, la estructura de hélice α permaneció
hasta las 3 horas y la intensidad de la banda disminuyó considerablemente a las 5 horas. Por
su parte, CV se encontró mayoritariamente durante las 7 horas en la zona de láminas β; muy
poco se absorbió en la zona de hélice α . Por último, el péptido LK, durante las 7 horas
presentó una variación desde giros β hasta láminas β y la estructura de hélice α, sólo se
presentó a las 7 horas.
En contraste con el ensayo de PBS, cuando los péptidos se encontraron inmersos en plasma
humano, la estabilidad disminuyó rápidamente. Se observó como la estructura del péptido TK
y AL se mantuvo hasta los 75 min, a diferencia de los 90 minutos en donde la absorción
permaneció en la zona de láminas β (Figura 9). En el caso de los péptidos CV y LK, la
estructura que permaneció a los 90 minutos es la lámina β; muy poca absorción se generó en
la zona de hélices α. En lo que respecta, este ensayo permitió identificar que tanto en PBS
como en plasma humano, los péptidos presentaron diversas variaciones en la estructura
secundaria, por lo que la estabilidad es muy variable en el tiempo y en la solución en la que
se encuentren presentes los PAMs. Sin embargo, el ensayo en el plasma humano se acerca
más al comportamiento que puede llegar a tener estos péptidos, al estar en combinación con
diversos tipos de proteínas.
Figura 8. Determinación de estabilidad de los péptidos en solución PBS mediante FTIR. La medición se realizó desde 1 hora hasta las 7 horas (*1h *3h *5h *7h). En color negro representa los péptidos cuando se encuentran en su
forma liofilizada. En cada una de las gráficas se muestran en círculo, los números de onda: 1633 cm-1 que corresponde a uno de los espectros
para láminas β, 1648 cm-1 que corresponde a Random, 1656 cm-1 para hélices α y para algunas de ellas se presentó el pico de absorción en
1667 cm-1 que corresponde a giros β. El ensayo para cada péptido se realizó por duplicado para cada concentración.
Figura 9. Determinación de estabilidad de los péptidos en plasma mediante FTIR Los péptidos fueron incubados hasta 90 minutos en una solución de plasma inactivado y diluido 1:100 para que el contenido del plasma no
tuviera interferencias con la lectura de los péptidos. Cada espectro de los péptidos liofilizados se muestra de color negro. Cada espectro
corresponde al siguiente color: *15min*30 min *45min *60min *75min *90 min.
Discusión
En la actualidad, toma especial importancia los métodos terapéuticos, puesto que la mayoría
de los tratamientos usados actualmente para las infecciones parasitarias están perdiendo su
potencial (Ponte-Sucre y colaboradores, 2017). Es así, como cada día se considera el uso de
nuevas estrategias que puedan solventar este problema; como por ejemplo con el uso de los
péptidos antimicrobianos.
El estudio de los PAMs se ha convertido en un modelo para el descubrimiento de nuevas
medidas terapéuticas, que pueden también ayudar a solventar el problema del incremento de
la resistencia de medicamentos por parte de los parásitos, como por ejemplo con el
medicamento Artemisina para Plasmodium falciparum (Téllez, G. & Castaño, J. C. 2010).
Por lo que es de gran importancia identificar nuevos PAMs potenciales que puedan ser
utilizados en contra de parásitos de importancia médica. Sin embargo, para poder identificar
nuevos PAMs con potencial farmacéutico, es necesario evaluar inicialmente que no sean
citotóxicos, ni hemolíticos, y puedan ejercer su actividad antes de degradarse.
Los péptidos analizados en este estudio fueron aislados y hacen parte de los trabajos de
investigación del Laboratorio de Genética Humana (Groot y colaboradores, 2012), los cuales
fueron obtenidos de diferentes especies de anfibios. Se logró evidenciar que estos péptidos
aislados de la piel de las ranas, poseen diferentes mecanismos que pueden ser útiles para
combatir diversos patógenos.
La razón por la que se cree que estos péptidos pueden ser potenciales contra parásitos, es
porque a pesar de ser péptidos derivados de la piel de las ranas, estos organismos al igual que
los humanos pueden ser infectados por parásitos (Su X y colaboradores 2007, Van y
colaboradores 2007).
Mediante los ensayos in silico, se caracterizaron 4 péptidos con potencial uso en contra de
parásitos. Las cargas positivas, la hidrofobicidad y la estructura de hélices α, son
características esenciales presentes en los PAMs para que puedan interactuar con las
membranas de los microorganismos.
La predicción obtenida de los mecanismos de acción de los PAMs van desde la
desestabilización de las membranas hasta la internalización e inhibición de componentes
celulares. Asimismo, otro de las resultados fundamentales in silico que se dió a conocer, fue
la estabilidad, en donde los resultados sugieren los posibles cultivos y el tiempo en el que
pueden estar activos y otros ambientes como los proteolíticos en donde se pueden degradar
fácilmente. Es así, como los péptidos fueron susceptibles a una gran variedad de enzimas
como la tripsina y quimotripsina, que se pueden encontrar en el tracto digestivo, llegando a
degradar los PAMs fácilmente.
La alineación realizada con cada uno de los péptidos encontró secuencias similares de
péptidos antimicrobianos descritos anteriormente. El primer péptido identificado fue TK
llamado: Buforin II, el cual ya había estado reportado como un PAM (Park y colaboradores,
1998). Su mecanismo de acción descrito en 1998 describe la importancia de la presencia de
una prolina en la región bisagra de la proteína, que es esencial para su actividad
transmembranal. La actividad de la Buforina II es penetrar la membrana celular y unirse al
ADN y al ARN fuertemente, lo que permite la inhibición de funciones celulares básicas de la
célula (Park y colaboradores 1998). Debido al gran potencial de la Buforina II, este PAM ha
sido utilizado en contra de bacterias, virus, hongos y parásitos; como por ejemplo en
Cryptosporidium parvum (Giacometti y colaboradores, 2001).
El segundo péptido identificado fue AL y aunque no ha sido descrito anteriormente, posee
similitud con péptidos de la familia de las Dermaseptinas. Debido a lo anterior, su mecanismo
de acción probablemente al igual que las otras dermaseptinas, es la permeabilización y
disrupción de la membrana plasmática de las células blanco, a través del mecanismo
“carpet”, que consiste en la unión a la superficie, desestabilizando la integridad de la
membrana (Wimley W, 2010). Una de las ventajas de usar esta familia de péptidos es que no
suelen ser tóxicos hacia las células de mamíferos y que además pueden actuar en sinergia
exhibiendo mecanismos mucho más poderosos que individualmente (Nicolas P y Ladram A,
2013). En el caso de la Dermaseptina S4 (DS4), se ha reportado que el IC50 es de 0.22 µM
en P. falciparum (Mongui, A y colaboradores, 2015). Sin embargo, el potencial hemolítico de
la DS4 es alto para utilizarlo como una posible medida terapéutica (Efron, L y colaboradores,
2002), por lo que sería interesante utilizar a AL, debido a que posee un menor porcentaje de
hemólisis en comparación con otros estudios.
Los mecanismos de acción del péptido TK y AL son interesantes para utilizar en fases de
parásitos intracelulares, puesto que pueden penetrar la célula sin causar daño a la membrana.
Este mecanismo fue verificado en este estudio mediante el marcaje de los péptidos y la
visualización tanto en eritrocitos como en monocitos. Dada la habilidad de atravesar la célula,
sería interesante poder evaluar estos péptidos in vitro en contra de parásitos que poseen fases
intracelulares como: Toxoplasma gondii y Leishmania sp. Asimismo, estos péptidos podrían
servir como moléculas que pueden ser utilizadas en combinación con otros medicamentos,
para liberarlos al interior de las células infectadas por parásitos. Hay estudios en donde se
utilizan leucocitos como carriers, potenciando la entrega del medicamento al lugar de interés
con gran eficiencia (Mitchell, M 2015 & Pang L y colaboradores, 2016). Por lo que sí se
puede llegar a realizar un ensayo preliminar, internalizando los péptidos en combinación con
otros medicamentos en leucocitos y comprobar su efectividad de acción en contra de
parásitos de importancia médica.
El tercer péptido identificado fue CV, el cual tuvo una similitud con el péptido anteriormente
reportado Moricin. El mecanismo probable de acción es el de inducir poros en las membranas
de los patógenos llevando a cabo la lisis y finalmente a la muerte celular (Brogden, K, 2005).
Aunque la actividad de Moricin es reportada en mayor medida en contra de bacterias, se
reportó una dosis letal a 10 µM en el parásito Trypanosoma cruzi (Annabeth y colaboradores,
2010).
Por último, el péptido LK obtuvo una similitud con el péptido antiparasitario Bombinin (Shou
y colaboradores, 2018). Esta familia de péptidos tiene una actividad similar a Moricin, puesto
que puede formar poros en la bicapa de fosfolípidos de las membranas diana, causando la
permeabilización y lisis de la célula. La familia Bombinin, ha sido estudiada en contra de
células cancerígenas, bacterias, hongos y parásitos como Leishmania sp (Shou y
colaboradores, 2018, Simmaco y colaboradores, 2009).
Dado los posibles mecanismos de acción de LK y CV, sería interesante poder utilizarlos en
ensayos in vitro con fases de parásitos extracelulares como: los esporozoitos de Plasmodium
sp, promastigotes de Leishmania sp y tripomastigotes de Trypanosoma sp.
Por otro lado, algunos de los PAMs reportados, indican que al combinarlos pueden llegar a
tener un efecto sinérgico y aumentar su potencial en contra de los patógenos. Pensando en
poder utilizar in vitro los péptidos en contra de parásitos, se realizó el ensayo hemolítico con
los péptidos individuales y en combinación. Los resultados revelaron que tienen un
porcentaje de hemólisis muy bajo, lo cual es importante, puesto que el perfil lipídico de la
membrana de los eritrocitos puede cambiar cuando se encuentran infectados por parásitos,
como en Plasmodium sp y Leishmania sp (Tran y colaboradores, 2016 y De luna y
colaboradores, 2000) siendo más permeables, por lo que el efecto hemolítico aumenta. Los
ensayos in vitro confirmaron los in silico en donde, tanto el porcentaje de hidrofobicidad
como la herramienta Hemo prob, determinó la probabilidad de que los péptidos más
hidrofóbicos, tienen una mayor tendencia a ser hemolíticos (Tabla 1).
Asimismo, en los ensayos de citotoxicidad, se determinó que los péptidos son poco
citotóxicos en células humanas, lo cual es una gran ventaja, puesto que la mayoría de los
medicamentos utilizados actualmente para tratar las enfermedades parasitarias son muy
tóxicos y muchas veces no son efectivos (Lo y colaboradores, 2017 y Colley, 2000). En
contraste, la Cloroquina exhibió una disminución significativa de la viabilidad celular,
aunque es necesario resaltar que los valores de IC50 en Plasmodium sp teóricos varían desde
0.2 nM hasta >300 nM, dependiendo de la cepa y aislamiento (Suwaranusk y colaboradores,
2007 y Wirjanata y colaboradores, 2017). Es importante, que estos de ensayos de
citotoxicidad sean verificados en otras líneas celulares como en hepatocitos y en macrófagos,
que son blanco de varios parásitos.
Los péptidos reportados en este estudio, además se exhibir medidas potenciales en contra de
parásitos, algunos pueden tener características adicionales, como la de ser quimioatrayentes o
inmunomoduladores; promoviendo la producción de proteínas y el reclutamiento de células
del sistema inmune al sitio de la infección. Como por ejemplo el reclutamiento y activación
de macrófagos y mastocitos, la inducción de la producción de quimiocinas y alteración de
procesos de señalización (Haney y Hancock, 2013). En este estudio, se determinó que los 4
péptidos inducen la diferenciación de los monocitos a macrófagos. Los monocitos, sólo
tuvieron que estar expuestos únicamente una vez para ser estimulados y diferenciados a
células fagocíticas.
Con respecto a lo anterior, es necesario conocer el tipo de capacidad inmunomoduladora o
quimioatrayente que puedan tener los péptidos. Si la actividad es inmunomoduladora, se
deberá identificar la producción de quimiocinas que estimula cada uno de los péptidos y
definir si existe alguna especificidad de modular una respuesta hacia parásitos.
En próximos estudios, se deberá evaluar estas respuestas en diferentes tipos celulares, puesto
que la estimulación y liberación de moléculas es diferente. Como, por ejemplo, en el estudio
de Kim y colaboradores en el 2017, en donde expusieron el péptido antimicrobiano cNK-2 a
monocitos y a macrófagos y se determinó que hubo una notable diferencia significativamente
mayor en la expresión de IL-1β en los macrófagos a diferencia de los monocitos primarios.
Durante varios años, los péptidos antimicrobianos han presentado la problemática de que son
moléculas relativamente inestables, y más en las condiciones físicas, químicas y enzimáticas
que se pueden presentar in vivo. Por esta razón, es de gran importancia conocer la vida media
del péptido. En este estudio, inicialmente se evaluó los péptidos en PBS, en la Figura 8 se
puede evidenciar el cambio de estructura que puede llegar a tener el péptido en diferentes
horas de incubación, pasando de estar en una estructura de hélice α a láminas β en cuestión de
horas. Pero es más importante saber, la estabilidad de los péptidos, en un ambiente más
parecido a lo que ocurriría in vivo. Por lo que al evaluarlo en el plasma se aproxima a la
posible estabilidad y al comportamiento que pueden tener los péptidos al estar conjunto con
diversas proteínas. En resultado, los péptidos en plasma tienen una estabilidad que alcanza a
permanecer durante minutos. Es de gran consideración tener en cuenta, si la estructura de
hélices α en los péptidos son las únicas formas en las que van a tener acción sobre los
parásitos, o si al estar en otra conformación como por ejemplo: láminas β, también pueda
tener un efecto antiparasitario. Por lo que es necesario realizar ensayos de actividad con
parásitos para verificar su efecto y estabilidad in vitro e in vivo.
Aunque pueden llegar a ser péptidos inestables in vivo, se han realizado actualmente diversas
técnicas para poder mejorar significativamente la estabilidad de los péptidos en ambientes
proteolíticos (Zhao y colaboradores, 2016). Una de las estrategias para bloquear la
degradación proteolítica, implica la acetilación del extremo N para bloquear la actividad de
las aminopeptidasas. También se ha demostrado que la ciclación de péptidos mejora la
estabilidad de los péptidos en suero (Haney y Hancock, 2013). Del tal modo, diversas
medidas pueden proporcionar y mejorar las propiedades fisicoquímicas de los péptidos, para
optimizar sus características como agentes antiparasitarios.
Otro de los mecanismos que podría representar una alternativa para superar las desventajas
relacionadas con la vulnerabilidad a la digestión proteolítica, es el desarrollo de liposomas o
moléculas que encapsulen y protejan a los péptidos del ambiente externo (Gomaa y
colaboradores, 2017). Por lo que se puede seguir encontrando nuevas maneras de mejorar la
estabilidad de los péptidos y potenciar la entrega del PAM, para su uso en contra de diversas
especies de parásitos de importancia médica.
En conclusión, en este estudio se caracterizaron cuatro péptidos potenciales con actividades
antiparasitarias, dos de ellos son péptidos que pueden ser utilizados en las fases intracelulares
de los parásitos, y otros dos pueden ser usados en las fases extracelulares. Se reporta por
primera vez la capacidad de translocación en microscopía en los eritrocitos como en los
monocitos y su actividad inmunomoduladora que puede potenciar la actividad in vitro
antiparasitaria de cada uno de los péptidos. Los resultados aportan una nueva medida
prometedora para empezar a utilizar en ensayos in vitro con parásitos de importancia médica
y perspectivas que se deben tener en cuenta para el uso de los péptidos antimicrobianos.
Agradecimientos
Especialmente agradezco Helena Groot de Restrepo y a Carolina Muñoz Camargo por sus
útiles discusiones y supervisiones durante todo el proyecto. A Juan Carlos Cruz por su
supervisión de los ensayos de FTIR. A Elizabeth Suesca y al centro de microscopía, en donde
se desarrollaron las imágenes de fluorescencia. Al departamento de Ciencias Biológicas por
la financiación por medio del proyecto semilla. Finalmente, agradezco, a los grupos de
investigación de los laboratorios de Genética Humana y de Ingeniería biomédica en donde se
realizaron todos los ensayos de este estudio.
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Anexo 1
Tabla 1. Predicción de características de 16 péptidos antimicrobianos mediante
herramientas in silico.
Tabla 2. Predicción de la estabilidad de los péptidos antimicrobianos. Gravy: Porcentaje hidrofobicidad e hidrofilicidad, un score debajo de cero es más probable de ser una proteína hidrofílica, mientras que
arriba de 0 es es más probable de ser una proteína hidrofóbica. Índice de inestabilidad: un valor mayor de 40 es probable que la proteína sea
inestable, si es menor, la probabilidad es ser estable. Boman Índice: Estimado del potencial que tiene el péptido de unirse a otro tipo de
membranas, proteínas como receptores. Una proteína tiene un alto potencial si es Índice es mayor que 2.48 kcal/mol. Probabilidad de
antigenicidad: la probabilidad de que la proteína sea antigénica, en donde si es mayor a uno es potencialmente antigénica, el valor posee
75% de exactitud. Hemólisis PROB: valores cercanos a 1 mayor probabilidad de ser hemolíticos.
Tabla 3. Identidad de péptidos antimicrobianos similares descritos anteriormente y
posibles actividades y modos de acción.