Facultat  de  ciències    

 Memòria del Treball de Fi de Grau

Cinética de oxidación del hierro en agua de mar en presencia exopolisacáridos y sustancias húmicas

mediante un sistema quimioluminiscente automático

María Magdalena Moyà Bosch

Grau de Química

Any acadèmic 2014-15

DNI de l’alumne: 43189882E Treball tutelat per Luis Miguel Laglera Baquer Departament de Química

S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

Paraules clau del treball: Quimioluminiscencia, especiación redox. hierro, polisacáridos, biodisponibilidad.

ÍNDICE DE CONTENIDOS 1. Resumen 2 2. Introducción 3 3. Objetivos 5 4. Hipótesis del trabajo 6 5. Fundamento instrumental 7 6. Materiales y Métodos 9 7. Diseño experimental 16 8. Resultados y discusión 19 9. Conclusiones 29 10. Bibliografía 30 1

1. RESUMEN La comunidad científica ha dedicado la última década al estudio de la asimilación de hierro por parte de microorganismos concretos. Lo que si se sabe es que la gran mayoría de los microorganismos prefieren la especie reducida el hierro, es decir, hierro (II). Para estudiar la biodisponibilidad hemos propuesto el estudio de la cinética de oxidación del hierro (II) en agua de mar, en presencia de sacáridos, polisacáridos y sustancias húmicas mediante quimioluminiscencia. Hemos planteado la hipótesis de que los polisacáridos presentes en agua de mar disminuyen la cinética de oxidación del hierro (II) de manera que aumentan su vida media en agua de mar. En el resultado fue el que esperábamos; pero en agua de mar diluida 1:5, el resultado fue totalmente contrario, es decir, la presencia de polisacáridos incrementaban la cinética de oxidación del hierro (II), reduciendo la vida media.                                                                                                                2  

2.  INTRODUCCIÓN           De todos los ciclos químicos que se dan en el océano, el ciclo del hierro es uno de los que tiene más importancia para estudiar debido a que el hierro es un oligonutriente que se encuentra en concentraciones muy bajas, limitando la biomasa del fitoplancton y la fijación de CO2 atmosférico como carbono orgánico particulado (Martin , Coale et al. 1994; Coale, Johnson et al. 2004). Existiendo esta limitación, el océano reduce su capacidad de aplacar el efecto invernadero. El hierro tiene una solubilidad mínima en agua de mar debido al pH de ésta (~10-11 M) (Liu and Millero 2002); esto es el motivo por el que las concentraciones de éste son tan bajas. El hierro que esta disuelto en agua de mar esta complejado por unos ligandos (materia orgánica), de los cuales no se conoce muy bien su origen y naturaleza (Rue and Bruland 1995; van den Berg 1995; Wu and Luter 1995). Los científicos han propuesto una lista en la que aparecen los posibles ligandos, siendo los principales: productos microbianos, como los sideróforos (Barbeau, Rue et al. 2003; Mawji, Gledhill et al. 2011) y sus productos de degradación (Hunter and Boyd 2007); sustancias húmicas (Laglera and van den Berg 2009); y exopolisacáridos (Hassler, Schoemann et al. 2011). La baja solubilidad inorgánica del hierro se ve incrementada resultando concentraciones de Fe en el océano, ~10-9 M, debido a dicha complejación orgánica. (Liu and Millero 1999; Liu and Millero 2002).

El hierro se puede encontrar en aguas naturales en dos estados de oxidación, como Fe (III) o como Fe (II). La forma Fe(II) es una especie termodinámicamente inestable en presencia de oxígeno pero de gran importancia ambiental ya que es la especie bioasimilable por el fitoplancton marino. El Fe (III) esta complejado y es insoluble en agua, mientras que el Fe (II) no se sabe si se encuentra complejado y es muy soluble en agua. La biodisponibilidad entre ambos es totalmente opuesta. El hierro (III) no es biodisponible, en cambio el hierro (II) es biodisponible.       De esta manera se crea un equilibrio dinámico entre el hierro (III) y el hierro (II). La biodisponibilidad del hierro va a ser función de la vida media que tenga el Fe(II) formado. La biodisponibilidad se puede ver afectada por la presencia de otras sustancias, por ejemplo, los polisacáridos ligados al hierro. En la Figura 1, se puede ver el ciclo del hierro, en el que el hierro (III) se reduce a hierro (II) mediante la fotolisis de complejos de Fe (III) con ligandos orgánicos, L (en nuestro estudio serán diferentes polisacáridos); o mediante el radical superóxido. Posteriormente, se da la reoxidación del hierro (II) a hierro (III) mediante el O2, 𝑂!·!o H2O2, quedando una especie intermedia sin quelar, Fe (III)’, y que pasa a formarse el complejo de hierro (III) otra vez.                                                                3  

 Figura  1.  Ciclo  del  hierro  en  agua  de    mar.  

   

Al existir la interacción de materia orgánica con el Fe(II), se alarga su vida media y se supone un aumento de su biodisponibilidad. Se conoce que las secreciones de diatomeas (González, Santana-Casiano et al. 2012) y las sustancias húmicas (Rose and Waite 2003) tienen este efecto pero no se conoce nada sobre uno de los principales grupos de ligandos orgánicos naturales como son los polisacáridos. En este trabajo investigaremos, mediante detección del hierro (II) por quimioluminiscencia, si existe esta interacción. 4

3. OBJETIVOS Los objetivos propuestos en la realización de este trabajo se resumen a continuación:

-­‐ Realizar una revisión bibliográfica de los polisacáridos usados, del luminol, del NOM, del SRFA y de la quimioluminiscencia.

-­‐ Ensamblar el sistema analítico en flujo y todas las unidades básicas de este y ponerlo a punto.

-­‐ Realizar un estudio mediante quimioluminiscencia del efecto de algunos sacáridos, polisacáridos y sustancias húmicas sobre la oxidación del hierro (II) en agua de mar, efectos que con dichos polisacáridos aun no han sido descritos. Entre los polisacáridos y el hierro (II) puede existir una interacción, la cual afectaría a la estabilización del metal. Los polisacáridos podrían estabilizar al hierro (II), de manera que aumentará la biodisponibilidad total del oligonutriente hierro en agua de mar.

5

4. HIPÓTESIS DE TRABAJO La presencia de polisacáridos disminuye la cinética de oxidación del hierro (II), extendiendo su vida media en agua de mar y por tanto aumentando la biodisponibilidad del hierro para el plancton. 6

5. FUNDAMENTO INSTRUMENTAL

Actualmente, el luminol se usa en varias reacciones quimioluminiscentes, pero existe falta de información definitiva de este mecanismo de reacción, existiendo discordia entre varios autores (King, Lounsbury et al. 1995; Lan and Mottola 1996; Xiao, Palmer et al. 2002). Los trabajos más recientes se basan en el siguiente mecanismo. En el primer paso, el hierro (II) de la muestra, al entrar en contacto con la disolución básica de luminol (pH>10) se oxida rápidamente de acuerdo con la reacción:

Fe (II) + O2 à Fe (III) + O2

-·

En este momento, el superóxido, O2

-·, reacciona con el dióxido de carbono presente para dar el peroxicarbonato:

O2-· + CO2 à CO4

-· El peroxicarbonato reacciona con el luminol para crear el luminol radical, así como se puede ver en la Figura 2. Cuando el radical luminol pasa a 3-aminoftalato, se produce la emisión de luz. Esta emisión de luz es lo que nos da la señal quimioluminiscente al ser recogida con un fotomultiplicador.

Figura 2. Mecanismo propuesto de la quimioluminiscencia del luminol

incluyendo el radical peroxicarbonato. 7

Este método tiene una serie de ventajas y de desventajas. Como ventajas podemos citar que el análisis es en flujo, las respuestas se recogen en fracciones de segundo y tiene una enorme sensibilidad. Algunas de las desventajas de este método, es que responde a cualquier compuesto que se oxide durante la mezcla de reactivos. En la señal, hay contribuciones de la materia orgánica (Ussher, Yaqoob et al. 2005) y de otros metales, principalmente Co y V. (Ussher, Milne et al. 2009). Sin embargo, en nuestro diseño experimental aislamos la respuesta debido exclusivamente al hierro (II) al recoger la variación de señal después de una adición exclusivamente de hierro (II). La respuesta quimioluminiscente es muy variante respecto a los cambios de temperatura y pH (siendo la sensibilidad directamente proporcional a la temperatura e inversamente al pH en el rango 10-12). La sensibilidad puede ser variable con el tiempo si las condiciones no son perfectamente estables. Si algunas burbujas de aire entran en el sistema, en el momento que cambiamos un bote por otro, se traducen en señales muchos más elevadas a las que se obtienen normalmente. La señal quimioluminiscente es proporcional a la concentración del analito, pero en el momento en que se introduce una burbuja en el sistema, produce una distorsión de la señal al pasar por el fotomultiplicador. Por otro lado, la reacción de estudio, la oxidación del Fe(II) es enormemente dependiente de la concentración de oxígeno disuelto, del pH, de las sustancias orgánicas interferentes y de la temperatura; lo cual dificulta el estudio. En nuestro caso, el estudio fue llevado a cabo en un laboratorio que permanece constantemente a 18 ºC. La reproducibilidad diaria fue comprobada realizando medidas en agua de mar al principio y al final del día con una excelente reproducibilidad. Sin embargo, al no haber sido autoclavado el volumen de agua utilizado, no podemos descartar pequeñas variaciones, a través de los días, de oxígeno disuelto y pH debido al crecimiento bacteriano. Esto podría estar detrás de la variabilidad encontrada de un día al otro. 8

6. MATERIALES Y MÉTODOS El equipo usado para este trabajo consta de un fotomultiplicador, una bomba peristáltica, una espiral de teflón, varios tubos de teflón, varios tubos para la bomba peristáltica, un ordenador que almacena la señal emitida por medio de un software específico y varias botellas de volumen graduado de LDPE (polietileno de baja densidad).

El fotomultiplicador es de la marca Hamamatsu (modelo H3919-01). La bomba peristáltica es una bomba de marca Watson y modelo Marlow 205S/CA8. El fotomultiplicador se ha tapado mediante dos cajas y una tela negra opaca para evitar la contaminación lumínica.

La marca de los tubos para la bomba peristáltica es Tygon. Se han usado distintos diámetros para conseguir que el flujo de muestra sea mayor que el del reactivo de luminol. Se han utilizado tubos de teflón para la conducción de muestra y reactivos.

La lectura de datos del fotomultiplicador se ha hecho con una adaptación específica del software Cocosoft (Cocovi-Solberg and Miró 2015). La señal del fotomultiplicador ha sido registrada a una frecuencia de cinco lecturas por segundo y almacenada en ficheros de texto para su posterior tratamiento.

Las muestras y reactivos se han preparado en botellas LDPE (Nalgene) y se han limpiado antes de su primer uso mediante baño de detergente bajo en fosfatos y acidificación por una semana en HCl (30%).

Para el montaje del equipo, hemos introducido todos los elementos necesarios así como se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Representación esquemática del equipo analítico en flujo con detección por

quimioluminiscencia empleado para el desarrollo de este trabajo. 9

El equipo se ha montado de manera que tenemos dos botes, uno para la muestra y otro para la disolución de luminol, los cuales tienen un tubo por el que se bombean dichos compuestos simultáneamente mediante una bomba peristáltica. A continuación, la muestra y el luminol se mezclan en una “T” y empiezan a reaccionar. Durante la reacción, el Fe (II) se oxida a Fe(III), dando lugar a superóxido (𝑂!·!) y gracias a este el luminol pasa a 3-aminoftalato, el cual emite luz que detecta el fotomultiplicador (esta reacción se explica detalladamente en el apartado de fundamento instrumental). La longitud del tubo que va de la T a la espiral es de gran importancia, ya que cuanto más corta sea la longitud del tubo menos tiempo tardará en llegar al fotomultiplicador y menos perderemos de la reacción de oxidación. En nuestro caso, esta distancia ha sido de unos 2 cm. Cuando la mezcla llega a la espiral, transparente a la luz, es recogida por el fotomultiplicador, que mide en continuo, sacando unas medidas que son almacenadas por el software en un ordenador.

La señal quimioluminiscente fue calibrada mediante adiciones de una disolución de

Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O (Sigma-Aldrich) en medio acidificado con HCl (30% Ultratrace Merck). Se prepararon cada semana 20 ml de disolución stock de hierro (II) que tiene una concentración 2 mM de hierro (II) y a la que se le añadieron 400 µL de HCl para su estabilización. A partir de la disolución stock, se prepararon diariamente 10 ml de disolución estándar de hierro (II) 10 µM con 10 µL de HCl para su estabilización.

La disolución de luminol va preparada en medio básico para forzar la oxidación

inmediata del hierro (II) y en presencia de una alta concentración de carbonato debido a su efecto catalizador (ver sección de fundamento instrumental). Consta de tres componentes: 0,5 mM de luminol (Sigma-Aldrich), 0,1 M de Na2CO3 (Sigma-Aldrich), 1 M de NH4OH (Trace, Sigma-Aldrich) y HCl hasta llegar a un pH de 10,4.

Los sacáridos y polisacáridos usados son: ácido galacturónico, fructosa, orcina

monohidratada, ácido poligalacturónico, galactosa, goma xantana, celobiosa, laminarina y sal sódica del ácido algínico.

El ácido galacturónico es un monosacárido de seis carbonos, con una estructura molecular: C6H10O7, el cual se trata de la forma oxidada de la galactosa. El método más utilizado para su obtención es la extracción de cítricos con una posterior filtración y purificación. Este polisacárido se puede encontrar en gran parte de vegetales formando parte de los mismos como sustancia péctica. Nosotros hemos usado, concretamente, el ácido D-(+)-galacturónico monohidratado 93% de la marca Fluka.

Figura 4. Estructura molecular del ácido galacturónico.

10

La fructosa es un azúcar que consta de seis carbonos de fórmula molecular C6H12O6 y cuando cicla lo hace formando un furano. La fuente de extracción de la fructosa es la fruta. La fructosa esta presente en las frutas. La D-(-)-fructosa 99% de marca Aldrich es el compuesto que hemos usado.

Figura 5. Estructura molecular de la fructosa.

La orcina monohidratada es un polisacárido nocivo de fórmula molecular C7H8O2. Este polisacárido puede pasar, mediante la acción del aire o amonio, a una sustancia llamada orceína, la cual tiene una coloración violácea y la usan como colorante. La orcina monohidratada 98% que se ha usado es de la marca Fluka. La orcina se encuentra en el liquen, del cual la extraen.

Figura 6. Estructura molecular de la orcina.

El ácido poligalacturónico es un polisacárido de cadena lineal de moléculas de ácido D-galacturónico. Se obtiene de las paredes celulares, normalmente, de las frutas. Su fórmula molecular es (C6H8O6)n. Este compuesto es higroscópico. El ácido poligalacturónico 95% usado es de la marca Fluka.

Figura 7. Estructura molecular del ácido poligalacturónico.

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La galactosa es un monosacárido de seis átomos de carbono que se puede encontrar en forma de glucoproteína o glucolípido. La galactosa se puede obtener de la leche, ya que las glándulas mamarias la producen para, posteriormente, unirse mediante reacciones enzimáticas a la glucosa y así formarse la lactosa (de la cual esta compuesta la leche). La D-(+)-galactosa 99% tiene una fórmula molecular C6H12O6. La galactosa que se ha usado es de la marca Sigma- Aldrich.

Figura 8. Estructura molecular de la galactosa.

El xantano o goma xantana es un polisacárido sólido que lo producen unas bacterias llamadas Xanthomonas Campestris. Contiene D-glucosa y D-manosa, como principales unidades básicas, así como también contiene ácido D-glucurónico y ácido pirúvico. Este compuesto se obtiene de la fermentación de la pasta de maíz. La marca del compuesto con el que hemos trabajado es Fluka.

Figura 9. Estructura molecular del xantano.

12

La celobiosa es un disacárido que se obtiene de la unión de dos D-glucosas y se obtiene durante la degradación de la celulosa. Es un compuesto higróscopico. La obtención de la celobiosa se hace mediante la acetólisis de la celulosa con anhídrido acético en presencia de ácido sulfúrico concentrado. Su fórmula molecular es C12H22O11. La celobiosa esta presente normalmente en los tubos digestivos de los herbívoros, ya que en ellos están las celulasas que son unos organismos simbióticos capaces de transformar la celulosa en celobiosa. Los herbívoros no son capaces de realizar este proceso mediante un enzima y es por ese motivo que las celulasas están presentes. El enantiómero usado en este caso es D-(+)-celobiosa > 99%, de la marca Fluka.

Figura 10. Estructura molecular de la celobiosa.

La laminarina es un polisacárido macromolecular en el cual la unidad es un glucano (polímero que tiene como unidad monomérica la glucosa, las cuales están unidas entre ellas por enlaces glucosídicos). Se encuentra en unas algas pardas llamadas laminaria digitata. No se puede precisar la composición exacta de la molécula. La laminarina que se ha usado en este trabajo es de la marca Sigma-Aldrich.

Figura 11. Estructura molecular de la laminarina.

La sal sódica del ácido algínico es un polisacárido coloidal formado por dos unidades, una de D-manurónico y una de L-gulurónico. Este polisacárido higroscópico que se obtiene de las algas pardas. Su fórmula molecular es (C6H8O6)n. La marca de este compuesto que hemos usado es Fluka.

Figura 12. Estructura molecular del ácido algínico.

13

En cuanto al NOM (Natural Organic Matter), hemos usado NOM (1R101N) y SRFA (2S101F), tal y como son suministrados por la Internattional Humic Sustances Society (IHSS). El SRFA (Suwannee River Fulvic Acid) es un ácido fúlvico del Río Suwannee y el NOM es la materia orgánica natural del Río Suwannee. El objetivo es comparar la respuesta de los polisacáridos con la de materia orgánica más representativa de la fracción mayoritaria que puede encontrarse en medios naturales. Se han usado a la misma concentración en peso por volumen que los sacáridos.

El agua de mar que se ha usado procede de la costa de la Isla de Cabrera. La muestra

de agua de mar se cogió a un metro de profundidad desde un barco a unos 20 m de la costa. Fue bombeada con una bomba peristáltica y fue filtrada en continuo con un cartucho de filtrado de 0,22 µm de diámetro de poro (Sartobran). Posteriormente, se le realizó una digestión para eliminar la materia orgánica que estuviera presente en la muestra. La digestión se realizó a pH natural por exposición durante dos horas a una lámpara de alta presión de mercurio de 150 W. El agua de mar tiene un pH de 8,19.

Para tratar los datos hemos usado Microsoft Office Excel, que contiene una

herramienta para realizar estudios mediante Anova (Analysis Of Variance, análisis de la varianza). Hemos usado el Anova de un factor debido a que en nuestro trabajo solo hemos trabajado con una variable. Esta herramienta nos permite realizar un análisis para comparar las variables (constantes cinéticas de oxidación) obtenidas en diferentes condiciones experimentales. En el análisis de la varianza se propone una hipótesis nula y una hipótesis alternativa, para N poblaciones (N debe ser mayor de 2):

- Hipótesis nula, H0: las medias de N poblaciones son iguales.

𝜇! = 𝜇! = ⋯ = 𝜇! = 𝜇

- Hipótesis alternativa, H1: el valor esperado de una de las poblaciones difiere de las

demás.

∃𝜇! ≠ 𝜇                      𝑗 = 1, 2,… ,𝑁

Además de proponerse estas hipótesis, el Anova debe cumplir tres requisitos: las poblaciones son normales (puede tomar cualquier valor y la densidad de probabilidad cumple con la ecuación matemática de Gauss); las N muestras en las que se aplica el Anova son independientes; y todas las poblaciones tienen el mismo valor de la varianza. El Anova se basa en la obtención de dicha varianza en dos partes, mediante la observación de todos los datos con respecto a la media global (SCT):

- Variación entre las muestras (SCE), es decir, entre grupos, la cual es la dispersión de las medias de las poblaciones con respecto a la media global.

- Variación dentro de las muestras (SCD), dentro de un mismo grupo (varianza de réplicas), la cual es la dispersión de los valores de cada muestra con respecto a la media de su correspondiente grupo.

14

Para el cálculo del Anova se han necesitado las siguientes ecuaciones: - Media global:

𝑋 =𝑥!"

!!!!!

!!!!

𝑛

- Variación total:  

𝑆𝐶𝑇 = (𝑥!" − 𝑋)!!!

!!!

!

!!!

- Variación entre grupos:

𝑆𝐶𝐸 = (𝑋! − 𝑋)! · 𝑛!

!

!!!

- Variación dentro del mismo grupo:

  (𝑥!" − 𝑋!)!!!

!!!

!

!!!

En estas ecuaciones existe xij que es el valor i de la j muestra, nj es el número de

valores que hay y 𝑋! es la media de dicha muestra. El cociente que viene indicado a continuación, se distribuye según F con N-1 grados de libertad en el numerador y con n-N grados de libertad en el denominador:

𝑆𝐶𝐸𝑁 − 1

𝑆𝐶𝐷𝑛 − 𝑁

Si este cociente es igual a 1, aceptaremos la H0 (hipótesis nula). En cambio, si el

cociente es significativamente distinto a 1, aceptaremos la H1 (hipótesis alternativa).

Para llevar a cabo el Anova debemos seguir los siguientes pasos: analizar, comparar medias y realizar un Anova de un factor. Cuando realizamos el Anova de un factor con el ordenador, obtenemos dos F, la F experimental y la F teórica (crítica), las cuales dependen del intervalo de confianza que se debe definir, que en nuestro caso es 0,05. Cuando F experimental es menor que F teórica, aceptaremos la hipótesis nula, es decir, que las medias de las poblaciones son iguales; en cambio, cuando F experimental es mayor que F teórica, aceptaremos la hipótesis alternativa, es decir, que las medias difieren. 15

7. DISEÑO EXPERIMENTAL

El procedimiento experimental del trabajo se basa en el aislamiento del efecto del polisacárido en la cinética de oxidación del hierro (II).

Para llevar a cabo este aislamiento para el estudio de dicha cinética se ha añadido cada polisacárido al agua de mar a una concentración de 1 mg/L. La concentración de polisacáridos elegida se debe a que responde a la concentración de carbono orgánico disuelto (DOC) en agua de mar: en zonas costeras es 1-5 mg/L, en el fondo en mar abierta es 0,5-0,8 mg/L y en la superficie en mar abierta es 1-1’5 mg/L; es decir, la concentración de DOC de muestras obtenidas en zonas costeras puede llegar a ser bastante mayor a la de muestras procedentes del mar abierto (Romankevich and Ljutsarev 1990; Martin and Fitzwater 1992). Para tratar el agua de mar se ha realizado una filtración para eliminar los organismos unicelulares presentes con una posterior digestión de la muestra para eliminar la materia orgánica natural y aislar el efecto del polisacárido; y, finalmente, se ha mantenido el agua de mar en oscuridad total unos días seguidos para que desaparezcan especies transitorias que pueden influir en la química redox del hierro (del tipo O2

•-o H2O2) ya que toda la reacción que se deba al O2 disuelto. En cada experimento, se han hecho al menos tres adiciones de hierro (II) con una

concentración 10 nM en agua de mar, tres adiciones de hierro (II) con una concentración 10 nM en agua de mar junto a cada polisacárido y unas adiciones de hierro (II) con una concentración 10 nM, 5 nM, 3 nM y 20 nM, en agua de mar. Las tres primeras adiciones corresponden a la reproducibilidad y la señal en agua de mar, las adiciones en los polisacáridos corresponden al propio objeto de estudio y las cuatro últimas adiciones se deben a la calibración. Un hecho diferencial de la quimioluminiscencia del hierro (II) con luminol es que la relación entre la concentración de Fe (II) y la señal no es lineal, sino exponencial (King, Lounsbury et al. 1995). Sin embargo, las calibraciones llevadas a cabo cada día, en un rango de concentraciones 0-30 nM, demostraron que en el rango de concentraciones usado (0-10 nM) la respuesta es lineal. Hemos usado la disolución estándar de hierro (II) para hacer las Se conocen los volúmenes de las adiciones de Fe (II) en las muestras de agua de mar, ya que conocíamos los volúmenes de dichas muestras de agua de mar, por lo que se puede obtener la concentración que queremos. Para hacer estas adiciones de hierro (II) en agua de mar, hemos usado la disolución estándar preparada anteriormente.

Una vez terminado cada experimento, se ha realizado el tratamiento de los datos

obtenidos en dicho experimento. En el tratamiento de datos, se ha prestado interés en la obtención de la constante cinética de la reacción de oxidación de hierro (II) y el tiempo medio de vida de esta especie. Este tratamiento se ha realizado mediante un programa Excel, preparado para la ocasión.

A continuación presentaremos un ejemplo: Las primeras gráficas son las representación de la respuesta por quimioluminiscencia

desde el momento en que se ha adicionado el hierro (II) en agua de mar (Figura 13) o en agua de mar junto al correspondiente polisacárido (Figura 14), en función del tiempo. Se puede observar el carácter de estas cinéticas y si son más lentas o más rápidas. La dispersión de la gáfica es exclusivamente creada por los pulsos de la bomba peristáltica.

16

Las constantes cinéticas se extraen, seleccionando todos los datos que están

comprendidos entre la máxima respuesta y el fin de la cinética. Así, aparecen otras gráficas en el que se representan las mismas variables pero solo con los datos que nos interesa tratar. La gráfica de la izquierda (Figura 15) corresponde a la adición de hierro (II) en agua de mar y la gráfica de la derecha (Figura 16) se corresponde a la adición de hierro (II) en agua de mar junto al polisacárido (ácido galacturónico) en cuestión.

Finalmente, para obtener la constante de cinética se ha linealizado, usando el

logaritmo neperiano y la siguiente expresión:

𝑦 = ln𝑑𝑎𝑡𝑜 − 𝑙í𝑛𝑒𝑎  𝑏𝑎𝑠𝑒 · [𝐹𝑒!!](𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 − 𝑙í𝑛𝑒𝑎  𝑏𝑎𝑠𝑒)

17

0  2000  4000  6000  8000  10000  12000  14000  16000  

2200   2300   2400   2500   2600  

Señal  

Tiempo  (s)  

0  

2000  

4000  

6000  

8000  

10000  

5400   5500   5600   5700   5800   5900  

Señal  

Tiempo  (s)  

0  

2000  

4000  

6000  

8000  

10000  

12000  

14000  

16000  

2300   2350   2400   2450  

Señal  

Tiempo  (s)  

0  

2000  

4000  

6000  

8000  

10000  

5400   5500   5600   5700   5800  

Señal  

Tiempo  (s)  

Figura 13. Representación de la respuesta quimioluminiscente de toda la cinética de

oxidación de Fe (II) en agua de mar.  Figura 14. Representación de la respuesta

quimioluminiscente de toda la cinética de oxidación de Fe (II) en agua de mar junto al ácido galacturónico.

Figura 15. Representación de la parte reproducible de la respuesta

quimioluminiscente de toda la cinética de oxidación de Fe (II) en agua de mar.

Figura 16. Representación de la parte reproducible de la respuesta

quimioluminiscente de toda la cinética de oxidación de Fe (II) en agua de mar junto

al ácido galacturónico.

La curvatura inicial se convirtió siempre en una línea recta que demuestra que, en nuestras condiciones experimentales, la reacción experimenta una cinética de pseudoprimer orden. Esto está de acuerdo con experimentos similares llevados a cabo en distintas matrices (Millero, Sotolongo et al. 1987; Zuo 1995; Santana-Casiano, Gonzalez-Davila et al. 2004). La recta que obtenemos, representando y en función del tiempo, tiene una pendiente, la cual es la constante de la cinética de la cual estamos tratando los datos.

ln[𝐹𝑒!!]![𝐹𝑒!!] = ln

[𝐹𝑒!!]![𝐹𝑒!!]! − 𝑥

= 𝐾𝑡

La expresión anterior es la ecuación cinética de primer orden, donde x es la

concentración de hierro (II) que ya ha reaccionado, [Fe2+]0 es la concentración inicial de hierro (II), [Fe2+] es la concentración que aun queda sin reaccionar en el tiempo t y K es la constante cinética, que en este caso es la oxidación del hierro (II) a hierro (III). Los valores de las constantes cinéticas, en el caso de cinéticas de primer orden, se dan en unidades de s-1.

En la Gráfica 17, se observa la recta que corresponde a la adición de hierro (II) en

agua de mar; y en la Gráfica 18, se observa la recta correspondiente a la adición de hierro (II) en agua de mar junto al polisacárido. Se puede ver que las constantes son diferentes, ya que, este caso, la constante cinética en agua es mayor que la constante con el polisacárido, con lo que se traduce a que el polisacárido frenó la oxidación del hierro (II) añadido, alargando su vida media.

El polisacárido mencionado en todas las representaciones gráficas anteriores es el

ácido galacturónico. Para poder tener una confianza estadística y poder discernir si el efecto de los distintos

polisacáridos fue significativo, se ha realizado una ANOVA, de manera que se han comparado las constantes cinéticas obtenidas en cada polisacárido con la constante obtenida para el agua de mar; y así saber si las cinéticas son diferentes. Se han realizado calibraciones diarias y los datos se presentarán una segunda vez normalizados para poder comparar los resultados que nos han dado en distintos días. 18

y  =  -­‐1,654E-­‐02x  +  1,999E+01  R²  =  9,930E-­‐01  

-­‐21  

-­‐20,5  

-­‐20  

-­‐19,5  

-­‐19  

-­‐18,5  

-­‐18  2300   2350   2400   2450  

ln[Fe(II)]  (M

)  

Tiempo  (s)  

y  =  -­‐6,919E-­‐03x  +  1,963E+01  R²  =  9,825E-­‐01  

-­‐20,5  

-­‐20  

-­‐19,5  

-­‐19  

-­‐18,5  

-­‐18  5450  5500  5550  5600  5650  5700  5750  5800  

ln  [Fe(II)]  (M

)  

Tiempo  (s)  

Figura 17. Representación lineal del logaritmo neperiano de la

concentración de hierro (II) en agua de mar.

 

Figura 18. Representación lineal del logaritmo neperiano de la

concentración de hierro (II) en agua de mar junto al ácido galacturónico.

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para poder entrenarse en la técnica y comprobar la utilidad del diseño experimental, se realizaron estudios preliminares en los que se monitorizó la respuesta de quimioluminiscencia antes y después de la adición de la sustancia de estudio y la reproducibilidad de la respuesta a la adición de una concentración determinada de Fe (II). Durante estos experimentos, se aprovechó para ajustar las adiciones de polisacáridos, del hierro, de NOM; y las concentraciones de todos ellos. También se ajustaron los caudales, tanto de la muestra como de luminol. Esto nos sirvió para comprobar que todos los polisacáridos mantenían la línea base y que adiciones iguales de hierro (II) daban valores equivalentes. Hubo una excepción, la orcina ya que ésta bajaba la línea base y no daba señal al hacer la adición de hierro (II). Se pudo ver también que el caso del NOM, la señal era bastante diferente a la de los polisacáridos ya que existe un aumento de la señal después de la adición del reactivo. Esto es por su propia naturaleza (compuestos orgánicos que se oxiden en contacto con la disolución de luminol) y porque viene contaminado con metales y probablemente con concentraciones significativas de Fe (II).

Cabe decir que el trabajo de laboratorio se realizó en cuatro días diferentes, por lo que resulta difícil comparar los datos obtenidos entre días. Hemos encontrado una gran reproducibilidad de la cinética de oxidación del hierro (II) en agua de mar para el mismo día (dando los mimos valores al inicio y al final de la sesión) pero con diferencias estadísticamente significativas entre días. Esto puede ser causado por pequeñas diferencias de pH, temperatura, oxígeno o productos de actividad bacteriana en el barril de almacenaje del agua de mar irradiada. No pudimos determinar la causa de estas diferencias. Para resolver este problema y poder comparar entre diversos días, hemos hecho un segundo estudio normalizando los datos de cada día con respecto al agua de mar y estos a su vez respecto a la cinética obtenida en agua de mar del tercer día, ya que en este día se obtuvo una mayor cantidad de resultados.

Mediante regresión lineal de las figuras en forma exponencial, se han obtenido las

constantes cinéticas de oxidación de hierro (II) añadido y de ellas los tiempos de vida media de todas las cinéticas que se han llevado a cabo. Así, hemos presentado cuatro tablas, dos con los datos obtenidos y otras dos con los datos normalizados respecto a la cinética encontrada en agua de mar, en las que aparecen todas las constantes cinéticas (del agua de mar, de los polisacáridos y del NOM), los números de experimentos realizados de cada estudio, los tiempos de vida medios (t1/2), los resultados del Anova (F experimental, F teórica y probabilidad) y el resultado según sean o no significativamente diferentes las cinéticas de oxidación en presencia de los diversos polisacáridos respecto a la cinética en agua de mar. En un experimento adicional, se ha comparado el efecto de la salinidad en dos polisacáridos, repitiendo el experimento después de diluir 1:5 en agua ultrapura (día 1 y día 2).

19

En la Tabla 1 y Tabla 2, aparece el tratamiento de los datos obtenidos:

Constante cinética (s-1) Número de experimentos

Tiempo de vida media: t1/2 (s)

Media Desviación estándar

Media Desviación estándar

Día 1 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5 Agua de mar 9,85·10-3 1,05·10-3 4 71 7,13

SRFA 2,76·10-3 1,84·10-5 2 251 1,67 Día 2 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5

Agua de mar 3,31·10-3 3,60·10-4 4 212 22,4 Laminarina 4,14·10-3 4,60·10-4 5 169 19,11

Sal sódica del ácido algínico

3,99·10-3 2,11·10-4 4 174 8,99

Día 3 Agua de mar Agua de mar 1,62·10-2 1,12·10-3 9 42,9 2,77

Ácido galacturónico

6,57·10-3 3,98·10-4 4 106 6,65

Fructosa 1,32·10-2 1,19·10-3 5 53,3 5,42 Ácido

poligalacturónico 1,43·10-2 1,11·10-3 4 48,6 3,89

Galactosa 1,38·10-2 1,07·10-3 3 50,3 4,09 Xantano 1,58·10-2 9,16·10-4 4 44 2,66

Día 4 Agua de mar Agua de mar 1,06·10-2 1,11·10-3 8 66 6,42

Celobiosa 9,67·10-3 2,90·10-4 3 71,7 2,16 Laminarina 9,61·10-3 7,48·10-4 3 72,4 5,87

Sal sódica del ácido algínico

9,37·10-3 5,15·10-4 4 74,2 3,96

NOM 8,45·10-3 1,31·10-3 8 84 14,73

Tabla 1. Valores de la constante de oxidación del hierro (II) (media y desviación estándar), número de los experimentos realizados y tiempos de vida media (media y desviación estándar) de agua de mar (incluyendo el

agua de mar diluida 1:5), de todos los polisacáridos, del NOM y del SRFA.

20

Anova Resultados Anova F experimental F teórica Probabilidad

de equivocarnos

Aceptamos H0 o H1?

Diferencias significativas?

Día 1 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5 Agua de mar

SRFA 81,2773 7,7086 0,0008 H1 Si Día 2 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5

Agua de mar Laminarina 8,5212 5,5914 0,0224 H1 Si Sal sódica del ácido algínico

10,4379

5,9874

0,0179

H1

Si

Día 3 Agua de mar Agua de mar

Ácido galacturónico

272,9108 4,8443 4,1095·10-9 H1 Si

Fructosa 22,5374 4,7472 0,0005 H1 Si Ácido

poligalacturónico

7,9527

4,8443

0,0167

H1

Si

Galactosa 10,3949 4,9646 0,0091 H1 Si Xantano 2,9627 4,8443 0,1132 H0 No

Día 4 Agua de mar Agua de mar

Celobiosa 1,1928 5,3176 0,3065 H0 No Laminarina 1,0542 5,3176 0,3346 H0 No Sal sódica del ácido algínico

94,4641

5,1173

0,0638

H0

No

NOM 9,4290 4,6672 0,0089 H1 Si

Tabla 2. Valores de F experimental y teórico (crítico), junto con la probabilidad de errar si acogemos esos valores y si existen diferencias significativas para todos los polisacáridos, para el NOM y el SRFA con respecto

al agua de mar.

Como podemos ver, durante casi todos los días, existen diferencias significativas entre el agua de mar y los polisacáridos, menos el cuarto día, ya que el resultado estadístico nos dice que no existen diferencias significativas (menos en el caso del NOM). Concretamente, hay un polisacárido que tiene una constante cinética muy diferente a la de agua de mar (K= 1,62·10-2 s-1), el cual es el ácido galacturónico con un valor de la constante cinética de 6,57·10-3 s-1. Al tener una constante menor que la del agua de mar, hace que la cinética sea más lenta y así el tiempo de vida medio sea mayor.

21

La diferencia entre las constantes del ácido galacturónico y del ácido

poligalacturónico, se debe a la interacción del ellos como ligandos y el hierro. El ácido galacturónico interacciona con el hierro , probablemente a través de su grupo funcional hidroxilo, de manera que su constante es menor (4,57·10-3) que la del ácido poligalacturónico (1,43·10-2), debido a que cuando se forma el ácido poligalacturónico esta interacción se anula, haciendo la constante cinética mayor y así el tiempo de vida media menor.

Ésta interacción entre hierro y polisacárido se da mejor en monómeros y dímeros que en polímeros debido a que se necesitan un par de moléculas de polisacáridos para complejar el hierro y los monómeros se disponen mejor espacialmente que los polímeros, como el ácido poligalacturónico, debido a su limitada flexibilidad.

El xantano tiene una cinética de oxidación del hierro (II) más rápida que la fructosa y

la galactosa debido al mismo motivo que el ácido poligalacturónico, son polímeros. En cambio, la fuctosa y la galactosa tienen unas constantes muy parecidas (1,32·10-2 y 1,38·10-2 respectivamente) a causa de que tienen los mimos grupos funcionales y además son monómeros.

La comparación del efecto de la salinidad muestra que tanto la laminarina como la sal

sódica del ácido algínico, que no modificaban de forma significativa la cinética de oxidación del Fe(II), en agua mar diluida 1:5 tienen un efecto contrario al observado mayoritariamente. A menor salinidad ambas sustancias aceleran significativamente la cinética de oxidación del Fe(II). Por ejemplo, si miramos el segundo día, en la que el agua de mar esta diluida, podemos ver que la constante cinética con laminarina es 4,14·10-3 s-1, es decir, que es bastante más rápida que el agua, ya que su constante es 3,31·10-3 s-1. En cambio, mirando el cuarto día, en el que trabajamos con agua de mar, vemos que la constante cinética es 9,61·10-3 s-1 frente a la del agua que es más rápida, con un valor de 1,06·10-2 s-1.

Para hacernos una idea de la magnitud de las diferencias, se han representado las

medias junto con las desviaciones estándar mediante diagramas de caja para cada día. La Figura 19, corresponde al primer día, es decir, al agua de mar diluida y al SRFA; la Figura 20, corresponde al segundo día, es decir, al agua de mar diluida, a la laminarina y a la sal sódica del ácido algínico; la Figura 21, se corresponde con el tercer día, es decir, con el agua de mar, el ácido galacturónico, la fructosa, el ácido poligalacturónico, la galactosa y el xantano; y la Figura 22, se corresponde con el cuarto día, es decir, con el agua de mar , la celobiosa, la sal sódica del ácido algínico y el NOM.

22

Figura 19. Representación de la media y de la desviación estándar de la reacción de oxidación del Fe(II) en agua de mar de referencia diluida 1:5 y tras la adición

de SRFA.

Figura 20. Representación de la media y de la desviación estándar de la reacción de oxidación del Fe(II) en agua de mar de referencia diluida 1:5 y tras la adición de 1mg/L de laminarina y de sal sódica del ácido algínico.

23

Figura 21. Representación de la media y de la desviación estándar de la reacción de oxidación del Fe(II) en agua de mar de referencia y tras la adición de 1mg/L de ácido galacturónico, de fructosa, de ácido poligalacturónico, de

galactosa y de xantano.

Figura 22. Representación de la media y de la desviación estándar de la reacción de oxidación del Fe(II) en agua de mar de referencia y tras la adición

de 1mg/L de celobiosa, de laminarina, de sal sódica del ácido algínico y de NOM.

24

En la Figura 22, que corresponde al cuarto día, se puede ver que el NOM tiene una cinética significativamente diferente a la del agua de mar.

En la Tabla 3 y la Tabla 4, el tratamiento de los datos normalizados. Esto nos permite estudiar el efecto de los distintos sacáridos y polisacáridos independientemente del día del análisis. Estos datos normalizados no tienen unidades, es decir, son adimensionales, debido a que para obtenerlos se dividen los datos de los polisacáridos por los datos del agua correspondientes a los días. Al dividir los datos que tienen las mismas unidades, estas dan uno y así los resultados no tienen unidades. El valor de referencia seleccionado ha sido el de la oxidación de hierro (II) encontrada el tercer día de análisis en agua de mar sin modificar.

Constante cinética Número de experimentos

Tiempo de vida media: t1/2

Media Desviación estándar

Media Desviación estándar

Día 1 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5 Agua de mar 1 1,09·10-1 4 42,9 4,31

SRFA 0,28 1,87·10-3 2 152 1,01 Día 2 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5

Agua de mar 1 1,11·10-1 4 50,4 5,35 Laminarina 1,25 1,14·10-1 5 40,4 4,56

Sal sódica del ácido algínico

1,21 6,37·10-2 4 41,6 2,14

Día 3 Agua de mar Agua de mar 1 6,90·10-2 9 42,9 2,77

Ácido galacturónico

4,05·10-1 32,46·10-2 4 106 6,65

Fructosa 8,08·10-1 8,23·10-2 5 53,3 5,47 Ácido

poligalacturónico 8,84·10-1 6,84·10-2 4 48,6 3,89

Galactosa 8,53·10-1 6,59·10-2 3 50,3 4,09 Xantano 9,75·10-1 5,65·10-2 4 44 2,66

Día 4 Agua de mar Agua de mar 1 1,04·10-1 8 42,9 4,17

Celobiosa 9,13·10-1 2,74·10-2 3 46,6 1,41 Laminarina 9,07·10-1 7,05·10-2 3 47,1 3,82

Sal sódica del ácido algínico

8,84·10-1 4,86·10-2 4 48,2 2,58

NOM 7,98·10-1 1,24·10-1 8 54,6 9,58

Tabla 3. Valores normalizados de la constante de oxidación del hierro (II) (media y desviación estándar), número de los experimentos realizados y tiempos de vida media (media y desviación estándar) de agua de mar

(incluyendo el agua de mar diluida 1:5), de todos los polisacáridos, del NOM y del SRFA.

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Anova Resultados Anova F experimental F teórica Probabilidad

de equivocarnos

Aceptamos H0 o H1?

Diferencias significativas?

Día 1 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5 Agua de mar

SRFA 77,9245 7,7086 0,0009 H1 Si Día 2 Agua de mar diluida en agua ultrapura 1:5

Agua de mar Laminarina 8,5212 5,5914 0,0224 H1 Si Sal sódica del ácido algínico

10,4379

5,9874

0,0179

H1

Si

Día 3 Agua de mar Agua de mar

Ácido galacturónico

270,0201 4,8443 4,3482·10-9 H1 Si

Fructosa 22,0689 4,7472 0,0005 H1 Si Ácido

poligalacturónico

7,9118

4,8443

0,0169

H1

Si

Galactosa 10,3461 4,9646 0,0092 H1 Si Xantano 0,3253 4,9646 0,5810 H0 No

Día 4 Agua de mar Agua de mar

Celobiosa 1,9177 5,1173 0,1995 H0 No Laminarina 1,9777 5,1173 0,1932 H0 No Sal sódica del ácido algínico

4,3125

4,9646

0,0645

H0

No

NOM 12,4532 4,6001 0,0033 H1 Si

Tabla 4. Valores de F experimental y teórico (crítico), junto con la probabilidad de errar si acogemos esos valores y si existen diferencias significativas para todos los polisacáridos, para el NOM y el SRFA con respecto

al agua de mar. Estos datos se ha obtenido de los datos ya normalizados.

Como podemos ver, durante casi todos los días, existen diferencias significativas entre el agua de mar y los polisacáridos, excepto en el caso del cuarto día. Para hacernos una idea de la magnitud de las diferencias, se han representado las medias junto con las desviaciones estándar.

26

La Figura 23, proviene de los datos normalizados.

Figura 23. Representación de los valores normalizados de las constantes cinéticas de oxidación del hierro en

agua de mar junto a todos los polisacáridos, el NOM y el SRFA. Si prestamos atención a los datos (incluyendo los normalizados) de la laminarina y la sal sódica del ácido algínico, vemos que el día dos (agua diluida 1:5) es diferente que el día cuatro, debido a que el agua de mar este o no diluida. Es decir, con esta comparación podemos ver el efecto de la salinidad. En el medio diluido 1:5, la cinética es más lenta para el agua de mar que para los polisacáridos. En cambio, en el agua de mar, la cinética es más lenta para los polisacáridos. Como vemos en la gráfica, podemos corroborar junto con el Anova que el polisacárido que muestra mayor diferencia con respecto al agua de mar es el ácido galacturónico. Tanto el SRFA como el NOM, también muestran diferencias significativas con respecto al agua de mar de referencia (sobretodo el SRFA).

Además también se ha introducido una gráfica (Figura 24) más, para los tiempos de vida medios, normalizados todos respecto del valor en agua de mar del tercer día, para poderlos ver todos una misma gráfica. Se ve que la tendencia general es que la presencia de polisacáridos retrase la cinética de oxidación del Fe(II) alargando su vida media aunque las diferencias no son importantes y en algunos casos estadísticamente nulas. Un ejemplo es el ácido galacturónico ya que varia bastante la cinética con respecto al agua de mar, debido a que la constante es más pequeña y por eso la cinética es más lenta. Esto se traduce a que el tiempo de vida medio es mayor en el caso del ácido galacturónico que en el de los otros polisacáridos. En la gráfica también podemos ver el mismo efecto para el NOM (efecto menos acentuado) pero sobretodo para el SRFA, donde el tiempo de vida medio es bastante mayor que en los polisacáridos.

27

ac gala

cturo

nico

fructo

sa

ac polig

alactu

rónico

galacto

sa

xantin

a

celobiosa

laminari

na

Na-algínico NOM

SRFA

k / k

agua

de

mar

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Gráfico 24. Representación de los tiempos de vida media normalizados para todos los polisacáridos, el

NOM y el SRFA. 28

ac gala

cturo

nico

fructo

sa

ac polig

alactu

rónico

galacto

sa

xantin

a

celobiosa

laminari

na

Na-algínico NOM

SRFA

vida

med

ia F

e(II)

nor

mal

izad

a re

spec

to a

gua

de m

ar U

V (2

2/07

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

vida media agua de mar (22/07) = 42.9 segundos

9. CONCLUSIONES

Este estudio consta de tres fases:

- Se ha ensamblado y se ha hecho una puesta a punto un sistema para medir la cinética de oxidación de hierro (II) en agua de mar. Esta puesta a punto, nos ha dado cierta información sobre los factores que podían influir sobre este sistema. Los factores que influyen son la temperatura y el pH, que varían la señal. También se ha podido ver que la materia orgánica y los metales pueden contribuir a la señal quimioluminiscente.

- Se ha medido el efecto de la presencia de sacáridos y polisacáridos en dicha cinética, dando el siguiente resultado: la tendencia general es que los polisacáridos disminuyen dicha cinética, alargando el tiempo de vida media del Fe(II) en el medio. Existe una gran variabilidad en la respuesta según la naturaleza del sacárido que va desde una variación estadísticamente irrelevante como el xantano hasta una extensión de la vida media por un factor de cinco como la observada para el ácido galacturónico.

- Se ha hecho un estudio de muestras diluidas, en el que se ha revelado un efecto significativo de la salinidad: a menor salinidad, mayor es la velocidad de oxidación del Fe (II) en presencia de polisacáridos y mayor es el papel de los polisacáridos en modificar dicha cinética.

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