Concepto de Terapia Génica

• Es la introducción de material exógeno (natural o recombinante) en humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotípico.

• Es una estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células somáticas mediante la administración de ácidos nucleicos y destinada a curar tanto enfermedades de origen hereditario como adquirido.

• Es la transferencia de material genético nuevo a células de un individuo dando lugar a un beneficio terapéutico para el mismo.

Objetivo de la Terapia Génica

• El principal objetivo de la terapia génica es erradicar o mejorar los síntomas de distintos tipos de enfermedades en las cuales no se han obtenido resultados satisfactorios aplicando terapias tradicionales.

• Todas estas enfermedades podrían ser potencialmente tratadas por terapia génica, pero siguiendo diferentes estrategias:

- Enfermedades Infecciosas (producidas por virus o bacterias patógenas) - Cáncer - Enfermedades Heredadas (deficiencia genética estructural de un producto

génico o de sus niveles de expresión) - Enfermedades del Sistema Inmune (Alergias, inflamación y enfermedades

autoinmunes)

Tipos de terapia génica

Células diploidesCélulas diploides

Somática Germinal

Células haploidesCélulas haploides

Según la estirpe celular

Ideal para enfermedades genéticas hereditariasIdeal para enfermedades genéticas hereditarias

Bioética (abuso y eugenesia)Bioética (abuso y eugenesia)

Uso en biotecnología (animales transgénicos)Uso en biotecnología (animales transgénicos)

Largo plazoLargo plazo

Sin consecuencias evolutivasSin consecuencias evolutivas

MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA

• Inyección directa de ADN “desnudo”• Métodos químicos: DEAE-dextrán, precipitación con

fosfato cálcico• Métodos físicos: Bombardeo de partículas,

Electroporación, Sonoporación, Magnetofección, Transferencia Génica Hidrodinámica

• Vectores: Virales, liposomas, polímeros

TRANSFERENCIA GÉNICA

1) Genes integrados al genoma humano

2) Episomas

NATURALEZA DEL ENFOQUE NATURALEZA DEL ENFOQUE TERAPÉUTICOTERAPÉUTICO

3. EXPRESIÓN PROTEICA CON GANANCIA DE

FUNCIÓN

1. AUSENCIA DE EXPRESIÓN PROTEICA

2. EXPRESIÓN PROTEICA CON PÉRDIDA DE

FUNCIÓN

ENFERMEDADES HEREDITARIAS

MONOGÉNICAS

A. CORRECCIÓN DIRECTA DE LA MUTACIÓN

B. SUPLEMENTACIÓN GÉNICA

ENFERMEDADES POLIGÉNICAS NO

HEREDITARIASC. SILENCIAMIENTO

GÉNICO

NATURALEZA DEL ENFOQUE NATURALEZA DEL ENFOQUE TERAPÉUTICOTERAPÉUTICO

B. SUPLEMENTACIÓN GÉNICA

A. CORRECCIÓN DIRECTA DE LA MUTACIÓN

C. SILENCIAMIENTO GÉNICO

- QUIMERAPLASTOS- NUCLEASAS CON DEDOS

DE ZINC

VECTORES (VIRALES Y NO VIRALES)

ARN DE INTERFERENCIA, OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO, ARNm

ANTISENTIDO, RIBOZIMAS

QUIMERAPLASTOS

OLIGONUCLEÓTIDOS ARN/ADN

EFICAZ EN SISTEMAS IN VITROEN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO

ACTIVACIÓN DEL SISTEMA DE

REPARACIÓN DE ERRORES

EFICAZ EN SISTEMAS IN VITROEN ESTUDIOS IN VIVO NO HA SIDO AÚN PROBADO

QUIMERAPLASTOS

NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC

NUCLEASAS CON DEDOS DE ZINC

VECTORES

VIRALES

NO VIRALES

- ADENOVIRUS- ADENOVIRUS

ASOCIADOS- RETROVIRUS- HERPESVIRUS

- VACCINIA

- LIPOSOMAS

- POLÍMEROS

Vectores viralesVectores viralesVentajas• Tecnología basada en la evolución• Variedad de tropismos celulares disponibles• Frecuencia de transducción robusta• 2 tipos de virus: ADN y ARN• Genes pueden ser llevados episomalmente o integrados en el genoma

Desventajas• Tecnología viral con evolución por infección y proliferación (no benigno)• Puede haber replicación de virus competentes• Riesgos de recombinación con virus salvaje in vivo• Oncogénesis• Riesgo por respuesta inmune

Adenovirus

• Vector más usadoVector más usado• Facilidad de infectar tejidos (principalmente del sistema Facilidad de infectar tejidos (principalmente del sistema

respiratorio) respiratorio) 90% seres humanos poseen anticuerpos 90% seres humanos poseen anticuerpos Rápida degradación (24hs)Rápida degradación (24hs)

• No hay integración del gen en el genoma humanoNo hay integración del gen en el genoma humano• Bueno para células divisibles y no divisiblesBueno para células divisibles y no divisibles• Produce altas concentraciones de proteína en células Produce altas concentraciones de proteína en células

mamíferasmamíferas• Administración: Administración: ex vivoex vivo o o in situin situ• Efectos adversosEfectos adversos: Alta inmunogenicidad: Alta inmunogenicidad

Inyección Inyección del nuevo del nuevo gen en virusgen en virus

Célula Célula humanahumana

Tratamiento exitoso: síntesis de una Tratamiento exitoso: síntesis de una proteína funcionalproteína funcional

Adenovirus

Virus Adeno-asociados

• Amplio espectro de célulasAmplio espectro de células• Puede infectar células divisibles y no divisiblesPuede infectar células divisibles y no divisibles• Infección latente Infección latente Expresión a largo plazo de gen Expresión a largo plazo de gen• Buena relación de bioseguridad Buena relación de bioseguridad no patógenas no patógenas• No estimulan la respuesta inmuneNo estimulan la respuesta inmune• Se encuentran en células infectadas con adenovirus (helper) Se encuentran en células infectadas con adenovirus (helper)

Infección productivaInfección productiva• Integración altamente específica (en un solo lugar) con baja Integración altamente específica (en un solo lugar) con baja

frecuencia frecuencia • Administración: Administración: ex vivoex vivo

Virus Adeno-asociados

Limitación: baja capacidad de empaquetamiento (en Limitación: baja capacidad de empaquetamiento (en resolución)resolución)

Fase I de terapia génica: fibrosis quística, hemofilia BFase I de terapia génica: fibrosis quística, hemofilia B

Considerado para: hemofilia A, deficiencia de Considerado para: hemofilia A, deficiencia de antitripsina y antitripsina y amaurosis congénita de Leberamaurosis congénita de Leber

Tratamiento para infarto del miocardio Tratamiento para infarto del miocardio cirrosis y tumores pancreáticos ocirrosis y tumores pancreáticos ode colonde colon

Alfavirus

• Infectan células divisibles y Infectan células divisibles y

no divisibles.no divisibles.

• Amplio espectro de células. Amplio espectro de células.

• No se integran al genoma No se integran al genoma

humano.humano.

• Infección transitoria.Infección transitoria.

• Efectos adversosEfectos adversos: :

Apoptosis. Apoptosis.

IDEAL PARA LA TERAPIA GÉNICA

DEL CÁNCER

Herpesvirus

• Infectan células divisibles y no Infectan células divisibles y no

divisibles.divisibles.

• Tiene tropismo por las células del Tiene tropismo por las células del

sistema nervioso. sistema nervioso.

• No se integran al genoma humano.No se integran al genoma humano.

• Infección latente y prolongada. Infección latente y prolongada.

• Alta capacidad de empaquetamiento Alta capacidad de empaquetamiento

(20kb)(20kb)

• Efectos adversosEfectos adversos: respuesta inmune. : respuesta inmune.

Herpesvirus en la terapia génica del cáncer: terapia

«suicida»

Gen suicida: Timidino quinasa (TK)Prodroga no tóxica: Ganciclovir

Retrovirus

• Administración: Administración: ex vivoex vivo o o in situin situ

• Se Se integranintegran en células divisibles en células divisibles

• Efectos adversosEfectos adversos: oncogénesis y : oncogénesis y

respuesta inmune. respuesta inmune.

Virus Vaccinia

• Infectan células divisibles y no Infectan células divisibles y no

divisibles.divisibles.

• No se integran al genoma humano.No se integran al genoma humano.

• Infección transitoria muy eficiente. Infección transitoria muy eficiente.

• Efectos adversosEfectos adversos: altamente : altamente

inmunogénico. inmunogénico.

Obtención de virus Vaccinia recombinante

Adenovirus Adenovirus-asociado

Alfavirus Herpesvirus Retrovirus/ Lentivirus

Virus vaccinia

FamiliaAdenoviridae Parvoviridae Togaviridae Herpesviridae Retroviridae Poxviridae

GenomaDNA doble

cadenaDNA simple

cadenaRNA simple

cadenaDNA doble

cadenaRNA simple

cadenaDNA doble

cadena

Infección/ tropismo

Células divisibles y no

divisibles

Células divisibles y

no divisibles

Células divisibles y

no divisibles

Células divisibles y no

divisibles

Células divisibles*

Células divisibles y

no divisibles

Interacción con el genoma humano

Episomal Integrado** Episomal Episomal Integrado Episomal

Expresión del transgén

Transitorio Puede ser prolongado

Transitorio Puede ser prolongado

Prolongado Transitorio

Capacidad de empaquetamiento

7,5kb 4,5kb 7,5kb >30kb 8kb 25kb

* Los lentivirus pueden también infectar células que no se dividen.** Los adenovirus-asociados pueden integrarse en 95% de los casos a una región específica del cromosoma 19.

RESUMEN

Virus quiméricos o seudotipos

• Envoltura de los alfavirus + cápside de los retrovirusEnvoltura de los alfavirus + cápside de los retrovirus

• Combina lo mejor de los dos tipos de vectores:Combina lo mejor de los dos tipos de vectores:

- Infecta un amplio espectro de células (alfavirus)- Infecta un amplio espectro de células (alfavirus)

- El transgén puede ser integrado al genoma humano (retrovirus) - El transgén puede ser integrado al genoma humano (retrovirus)

Vectores no viralesVectores no virales

Ventajas• Pueden infectar cualquier tipo celular. •No son tóxicos (en general). •No generan efectos adversos. •No tienen un límite máximo de ADN a transportar.

Desventajas• Ingreso en la célula poco eficiente. • Sólo para terapias ex vivo.• No se integran al genoma humano.

Vectores no viralesVectores no virales

LIPOSOMAS

POLÍMEROS

SILENCIAMIENTO GÉNICO POST-TRANSCRIPCIONAL

Oligonucleótidos Antisentido

• Se une a pre-mRNA o mRNASe une a pre-mRNA o mRNA• Interfiere en el Interfiere en el procesamientoprocesamiento (splicing, poliadenilación, exportación, (splicing, poliadenilación, exportación,

estabilidad) y en la estabilidad) y en la traduccióntraducción del RNAm del RNAm • Down-regulationDown-regulation: clivaje del ARNm por una RNAsa H o impide la traducción.: clivaje del ARNm por una RNAsa H o impide la traducción.• Up-regulationUp-regulation: Por manipulación del sitio de splicing: Por manipulación del sitio de splicing• Desventaja Desventaja La presencia de estructuras secundarias en el ARN que impide La presencia de estructuras secundarias en el ARN que impide

que se una el oligonucleótido antisentido. Se requieren pruebas previas para que se una el oligonucleótido antisentido. Se requieren pruebas previas para buscar regiones simple cadena.buscar regiones simple cadena.

• Efecto adverso Efecto adverso Off-targetingOff-targeting

• ESTRATEGIAESTRATEGIA1.1. Diseño del oligonucleótido antisentidos Diseño del oligonucleótido antisentidos 2.2. Producción de la molécula por síntesis químicaProducción de la molécula por síntesis química3.3. Incorporación a la célular blanco por liposomas o electroporaciónIncorporación a la célular blanco por liposomas o electroporación4.4. Nueva generación de oligonucleótidos con modificaciones químicas que los Nueva generación de oligonucleótidos con modificaciones químicas que los

hacen más estables. hacen más estables.

Oligonucleótidos Antisentido

DOWN-REGULATION

Oligonucleótidos Antisentido

UP-REGULATION

Restauración del sitio de

splicing

Ribozimas

Pequeñas moléculas de RNA con actividad de endonucleasasPequeñas moléculas de RNA con actividad de endonucleasas Catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster específicos Catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster específicos

Fragmentos largos o cortos:Fragmentos largos o cortos: Largos Largos intrones del GII o GI intrones del GII o GI Cortos Cortos hammerheads (40nt) hammerheads (40nt) Debe conocerse la secuencia previamenteDebe conocerse la secuencia previamente Iguales problemas que los oligos antisentidosIguales problemas que los oligos antisentidos Ingresan mediante plásmidos o administrados exógenamenteIngresan mediante plásmidos o administrados exógenamente Hammerheads sintéticos son más establesHammerheads sintéticos son más estables

Ribozimas

RNA de interferencia

- Sistema descubierto en la década de 1990s en plantas y animales inferiores como mecanismo de regulación de la expresión génica.

- Debido a su gran capacidad inhibitoria de la expresión de proteínas, esta tecnología es empleada en la terapia génica.

dsRNA

siRNA

RESUMEN DEL MECANISMO

DE ACCIÓN DE LOS siRNAs Y

miRNAs EN LA NATURALEZA

RESUMEN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DEL ARN

DE INTERFERENCIA

EN LA NATURALEZA

RNA de interferencia

ESTRATEGIA

•Diseño de siRNA (secuencias de nucelótidos probables)•Producción de la molécula de siRNA: a. Síntesis química b. Transcripción in vitro c. Clonado

•Incorporación a la célula blanco por: a. Microinyección b. Absorción c. Inoculación d. Bombardeo e. Electroporación f. Vectores virales•Nueva generación de siRNA con modificaciones que los hacen más estables (shRNA)

Diseño de un siRNA sintético

Oligonucleótido antisentido RNA de interferenciaEfecto transitorio y regulable, por esto es más fisiológico que el knock down de

genes

Sistema eficaz y potente

Similares niveles de reducción de RNAm y proteínas

Off targeting (silenciamiento de un RNAm no deseado)

Up o down regulation Down regulation

Incorporación a la célula blanco: limitada por liposomas o

electroporación

Incorporación a la célula blanco: más uniforme por vectores virales

1/20 molécula efectiva/testeadas 1/2 a 1/4 molécula efectiva/testeadas

Más barato Más caro

No induce IFN Puede inducir IFN

OLIGONUCLEÓTIDO ANTISENTIDO vs. RNAi

SILENCIAMIENTO GÉNICO POST-TRADUCCIONAL

ADN o ARN simple cadena con afinidad a una proteína o flia. de proteínas para inihibir su función

Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment (SELEX)

¿Cuáles son los puntos para lograr una terapia génica exitosa?

TARGETING La terapia actúe sobre la célula blanco (y no otra)

ACTIVAR el gen transferido

INTEGRAR el gen transferido al genoma de las células blanco (para tener un efecto más duradero)

EVITAR efectos adversos dañinos