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Diagnóstico de Ebola

Camila Sacristán

Universidad de ChileDepartamento de Tecnología MédicaFotografía Médica

RT-PCR

Generalidades:- La reacción en cadena de la polimerasa

con transcriptasa reversa, consiste en la amplificación de un segmento especifico del ARN del virus con una enzima polimerasa, previo a la amplificación se utiliza una enzima llamada transcriptasa reversa que copia este ARN a un ADN complementario o copia (ADNc) ya que la polimerasa solo amplifica ADN.

- La reacción después de la formación del ADNc consta de tres etapas: desnaturalización de la hebra, alineación o hibridación y elongación, las cuales se repiten aproximadamente 30 veces dentro de un termociclador

Imagen sin licencia comercial

ADN POLIMERASA

RT-PCR

Los reactivos necesarios para esta técnica son:- Primers o partidores, que establecen el marco de la amplificación- Nucleótidos: Adenina (A), Citocina (C), Guanina (G) y Timina (T), estos son los

componentes básicos de la cadena de ADN- Inhibidores de la ARNasas, ya que estas enzimas degradan el ARN que se

intenta amplificar- Enzima polimerasa, que el la que amplifica el ADN- Buffer o solución tamponada para mantener el pH de la reacción- Sales de Magnesio, que sirven como cofactor de la polimerasa- Agua

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Técnica RT-PCR

Imagen sin licencia comercial, modificada en su tono (-180) y saturación (+100). Imagen original (arriba) e imagen modificada (abajo)

Antes de iniciar la amplificación, la transcriptasa inversa transcribe el ARN viral extraído de la muestra a ADNc

Primera etapa: Desnaturalización de la hebra- Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.

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Técnica RT-PCR

Imagen sin licencia comercial, modificada en su luminosidad (+66) y saturación (+15).Imagen original (frente) e imagen modificada (fondo)

Segunda etapa: alineación-Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.

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Técnica RT-PCR

Imagen sin licencia comercial, modificación de contraste (+100) y aplicación de filtro artístico Bordes añadidos. Imágenes originales (superiores) y modificadas (inferiores)

Tercera etapa: Elongación Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble

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Técnica ELISA

ELISA: Ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas

Generalidades: -Es la reacción de un complejo anticuerpo-enzima con un antígeno o anticuerpo que está fijado a una superficie solida. Para detectar la reacción se añade un sustrato a la enzima para que genere un producto coloreado, lo que indicará la presencia del antígeno o anticuerpo buscado. - Hay diferentes tipos de ELISA, como por ejemplo el directo, indirecto, el tipo sandwich, competitivo, etc

Imagen sin licencia comercial, modificada en sus niveles de color: +45 hacia el rojo y -100 hacia el amarillo. Imagen original (derecha) e imagen modificada (izquierda)

Técnica ELISA

Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)

ELISA tipo sandwich:-Se fija un anticuerpo a la superficie del soporte o pocillo, al cual se unirá una zona especifica del antígeno (epítope) que se sospecha está en la muestra. -Se agrega la muestra a estudiar-Lavar para eliminar los antígenos que no se han unido a los anticuerpos fijados en el pocillo.

Técnica ELISA

- Luego se agrega un anticuerpo ligado a una enzima que se unirá a otro epítope del mismo antígeno

- Lavar para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado

- Si se produce la unión la enzima estará presente en el pocillo después de los lavados, y al agregar el sustrato se formará un producto coloreado.

Imagen sin licencia comercial modificada en su brillo (-66) y contraste (+62). Imagen Original (arriba) e imagen modificada (abajo)

Técnica ELISA

Imagen sin licencia comercial modificada en su tono (-38), saturación (+15) y luminosidad (+12). Imagen original (izquierda) y modificada (derecha)

Lectura.-Se puede realizar de forma visual para saber cualitativamente la presencia o ausencia del antígeno o anticuerpo buscado, esto se puede hacer en los ensayos que no requieren cuantificacion y no se presenten abundantes casos dudosos.-También se puede realizar con la ayuda de un lector de ELISA. Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final alcanzada.

Bibliografía

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/

tecnicas_2.htm FAO: Manual de procedimientos para el diagnostico molecular de la

Influenza aviar de alta patogenicidad, capítulo 3: generalidades de la técnica RT-PCR.

Cultek: Fundamentos y tipos de ELISA

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