Diseño de equipo de rompimiento celular

5/16/2018 Diseño de equipo de rompimiento celular - slidepdf.com

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)

192

5.

"

• •i 30

~

~ 2.

~;0

CAPiTULO 5 ROM PIMIENTO DE CEWLAS

. . R -.' t de )acharomyses cereoisiae con hOLT . l nge -F igur a 5 .1 1: . omp,ml ell 0 . . I .. d alta presion usando d~feren~es \.'~l.Ivulas. EnZIOHi. g uCO$-Ln81za or a . 0 . •

-6-fosfat o b idrogenasa . Fuent e: Kul a y SchuHe, 1987- 1 E· Copyright. ©1981

fleproducid!;l. ((II €ol pe rmiso d " , ,1 An!;ican hl-~Llt.ut" of Chemica "Igmee:r::;

AIChE. Todos los derechos reservadna.

10 20 30 40 50

Pre5ion (MPa l

_ V il i' l1 Jl a (+ I d e c u c os l a : [D 1 p l a n a

)

53- EQU)PO DE ROMPIM{ENTO CEWLA.R

. Tab la 5 .4 :: bomogenei zador de a lt a presi on .

Pararnetros Operacicnales

P re sio n d e operacion

Diseno de la valvula

Concentracion celular

'Iemperatma

Ac apt ada de: Kul a y Schutt«, 1987

Heproducida CD\ e l p er -m is e d e e l Am;f<:l-L lnst.itute 0 Chemi ca l Eng in eers . COP.H igh~ @l. 9S7

,&. rC hE , TQdo~ Jos-derechcs rescr c ad cs .

El met~clo de r om pi m ie n to p or homogenei aaci on no es sel ec ti ve . No

exi st e.f or ur a d e d if cr en cia r e ntr e la i ib er ac io n d e p ro te in as d el e sp ac io

periplasmico y la s p ro to pla sr na tic as p er 1 0que no e s r ec omendabl e

como rompimiento selective.

La homogerfe izac ion noes efect jva para l adesi nt egraci on de a lgunas

b ac re ri as G ram-po sit iv as q ue p re se nta n una p ar ed c el ula r muy g ru es a

y a pa re ntement e no pueden s er d es in te gr ad as e n e l h omogen eiz a.d or d e

a lta p re sio n; a l m enos it pre sio nes has ta de 55 MPa. Sill embargo,

se ha rcaliz ado con exito cl r ompin.iento de Ieva duras y de bacte rias

Gram-negativas-como la A l ca l ig e ne s e u .! m ph u > (Harrison e t a i, 1 99 0) .

Paramet ros Operacionalos

Ell la Tabla 5.4 se 'listan lo s p arar netr os o peracionales que tienen in-

fluenc.ia en el rqmpimi~nto cel ul ar en e l hornogene izador de a lt a presi on

(Kula y Schutte, 1987) . Como puede observarse el nurnero de par arne-

t ros es menor que l os correspondi en tes a l mol ino de per las 10que l ac il it a

l a o pt ir niz ac io n d e e st e ti po d e p ro ce so s.

Pre sion de Oper ar.ion. Pa ra lograr un rompimie nto eficic nte de ce

Iul as l a presi on de opera-i on del hornogene izador debe . Ie I' superi or it35

MPa (Ia lodust ri a. a liment ic ia opera sus bornogene izedores a una presi on

de 35 NlPa)_ En la Figura 5 .11 se r nuestr a como varia C O " la presion

193



)

194 CAPiTULO 5 R OM PfM fE NT O DE CEWL/lS

de oper acion en uu s olo paso, la liber acion de la enzima O·glucosa- 6-fosfa to -deshi drogenasa de S. ce1"e· ' J ; s - i ae . Se puede ohservar que a 55

MPa. hay tres veces mas enzima en la lraccion libre de celulas, que a

;)0 MPa. Sil l emba rgo, la e nzirn a libcradu e n un sol o paso represent "

sol amente cerc a del 45% de La can ti dad t ot al p reseut e ell la suspension.

La presion de operacion del homcgeneizador depende del producto

que se desee liberar. Durante una operacion se empieza a observar

liberacion de proteina soluble a presiones mayores que 10 iV[Pa, sin

embargo par a liberar ADN se r equieren presiones por ar riba de 25 MPa.

Ell general la s pres iones de ope racion mas us adas sou de 55 MPa.

Diserio de la Valvula. En la Figura 5.10 se rnuestrun las configu-

racioues de las valvulas que se usan con ma s I re cu en cia e n l os homo -

geneizadores: la un idad plan a y la u nidad de cuch il la,

En la Figura 5.11 s e ruuestra eI cornpor ta rn ie nt o d e 105 d05 tipos

de valvulas en eI rornpimiento celula. como una Iunc ion de la presion

de operacion , se puede observer que par arriba de un a presion de 20

MP" la valvula de cuchilla libera'mayor cantidad de enzirna que lao

v al vu la p la na , p or a ba jo d e e sta p re si on l a c an ti da d de enzirna liberada

e s a pr ox ir na damente ig ua l p ar a. ambos ti po s d e v al vu la s,

En Ia Figura 5.12 se presenta el comport.amiento de l a l iberac ion

de una enzir na en I uucion del t iempo d e r ec ir cu la ci on a tr es d if er en te s

presiones y para dos tipos de valvula, se pue de observar que la c autid a d

de enzima liberada aumenta con la presion, y para una presi6n dada el

in cre me nto e s m ay or 5i s e u t il i za una valvula de cuchil la .

Conceutr acion de la Suspensi6n Celular y Temperatura. La

desintegracion celular es indepeudien.e de la concentracion de celulas

d e le vadu ra s e n con centr ac io ne s e nt re J 00 Y 6 00 gramos de peso seco

porIitro.

Durante la hor nogeneizaciou la temper atura de la suspension celu-

lar es un parametro que no se mantiene coustante y par 10 tanto es

diflcil corr elacicnarlo. La constaute especif ica de la velocidad de no-

mogeneizaci6n varia directameute COil la temperatura hasta un valor

de 30 aC. Se ha l l observado difereucias de alrededor de 40% en este

parametro en eI rango de 5 a 300C. Aun asi, se requieren tres pasos a

)

5 .3 . E QU IP O D E R OM PIM IE NT O C EL UL AR

1.0

_ 0.8

1 "

!6

.l ij0.4

40 50 60

Tiempo de Recin::ulaQOn(min)

Valvula: { C I ) de c:ud'lifia: I..) lana

" '" .00: (- ) 55MPa; (--_I 30MP.: (....•.) ISIAP.

Figura 5.12: Efecto del tipo de valvula sobre la liberacion de enzima.Fuent e: Kul a y Schutte, 1987 .

ReproducKla..:one] penulsc de el American Institute of Chemical Engtne('r5. Copyright @1987

AIOhE. Todos los derechos reservedos.

195



196 CAPITULO 5. ROMPIMreNTO DE CELULAS

una presion maxima de 55 MPa Y (I 3WC para a lcanznr una. desinte-.

g raci 6n cel ul ar mayor del 90%.

5.3.3 Microftuidizador

E I m ic rc fl ui,d iza do r e s u n h om og en eiza dor d e a h.a . p re sion qu e tie ne

un mecanisme de rornpinuento celular diferentc al del homogeneizadtl [".

Man to n-Gauli n. S u mecanismo de romp in .ie nt o u til iz a u na bomba d e

a lt a presi on manej ada con a .i re y una. caruara especial de rcmpimiento

con ec ta da a un d is po sit iv e d e con -r ap re sio n. c omo se r nu cs tr » e u la

Figura 5.13.

La suspens ion ccl ul ar se d iv ide e ll dos con 'i eu tes hac iecdol a pasar

a . presi on a t raves de . . dos microcanales de seccio r ; tr an sv er sa l d e" ? x

100 11m, Seguidament e l as corri en tcs son impuctadas a a lt a vel oc ir lad'

y mezcladas en una pared estacionanade L:~ cama:ra de l 'ompllll_ient.o

(Fi gura . 5 .l 4) . Mediant e est e mecan isme l aenergi a, r le ent rada sed i si pa

cesi ~nsta.nt.aDeamente produciendose la rupture celular,

L os lim itc s d e operaciou d e l l l 1 ic r {) f l u~ d i za . d or e s l a u· dados por: 13

p re si on d e a ir e r eq ue rid a p ar a m an ej ar 1 .1 .bornba, las propiedad~5Hsi~

r oq ui ru ic as d e l l iq ui do b om b ea co y l a p l e s io n ' I T l ix i ro a de t ra ba jo p er-

mitida que es de 140 M PoA 1g un a v cn ta ja s q ue p re se uta 1 21m ic ro Ru id iz ad or e n c orn pa ra c. }o n

c on e l h O O "l og en eiz ad or M an to n- Ga ul in (S au er e t a i, " 1989) son l as si-

guientes:

Es m uy corn pac to , se pue d€' montar so bre u na . charola d e acero inoxi-

dable de 30 x · 35 em.

Perrni te un mayor eniriamiento del sistema: Adicim ialment e a l os set -

pentines de er fr.umicnto que iambien presents elManton-Gaul in,

la c am ar a d e iomo imi en to puede col oc ar ac e n un · )J~no de hielo.

Pue de al ca nza rac un rom pim ie uto c el ul ar m as e Rc. l en Le (e n e l caso de

hactenes].

P er rn it e f lu jo s. m as b ajo s ( 2 - 2 3. ij h con p re sio ne s d e ope ra ci ca d e

10 - 95 M P al y m an eja voh im en es m en ore s (30 ml) , 10 que 10

hece compatible con opcraciones de l lujo contiuu~

5 .3 . EQU[PO DE ROMPIMfENTO CELULAR

\

)

Figura ~"13: Diagrama del Microfluidizador; BA: bomba accionada por

1I J , r e ;CC: c am ar a d e c on tr ap re si on : S E: serpe-itm d e e n fr -i a- n ie n to : C R :

cam~:a de rornpimiento; MP: rnedidor de presion; RP : r egu lador de

presion; G: contenedor; V: valvula, Fuente: Sauer e i a i, 1989

Reproduckla COr! el pernnso de John WJ I< ; .y o ! " '; : ! _ SI)Il~ Copyright @19SS. Todos losdl..!:n:c:hos

reservedos

197



198 CAPITULO 5. ROMPIMIENTO DE CEWLAS

Figura 5.14~ Representacion esquerr atica de la camara de rompimiento

d el m ic ro fiu id iz ad or. F ue nt e: S au er e t a i, 1989

Reprod~dda con elpermiso de John Wil ey ~ILJ Sons. Copyright, @1989. Todos los dereches

reeervadcs.

E s re la ti va me nte f ac il d e o pe ra !" .

Parametres Operacionales

A c on ci nu ac io n s e describe el efecto de I. t emperatu r a , d el tamana d e

l o s r e st o s c e l ul a re s y d e l a c c nc en l. ra ci on c el ul ar e n e l p ro ce so d e ru ptu ra

utilizan do un rn ic-otluidizador. .

Temperatura de Op e r acion . Generalrneute cuando se trabaja can

pr es iones altas e s n e c e sa ri o enjriar eI siste ma . S i e l homogene izador )]0

tiene un sistema de enfriamiento eficiente de la cam a n' d e r om p imien to ,

puede p re se nta rse u n in cre me nto h aste d e 80 'C e n I ", t e mp era tu ra de

l a su sp en sio n c el ul ar, 1 0 cua l pu ede ocasionar la desnaturalizacion de

la protein a d e i u te r e s.

£ 1 m ic ro fu id iz ad or p errn ite m an te n er in c re m eu tc s d e t em p er at ur a

menores a . 20 QC en [ a c a .mara de rnmpimien to , que es l apart e de mayor

t em pe ra tu ra . P or o tro lade, e l tie mpo d ura nte e l c ual l as c elu la s e sta n

expuest as a t ernpcrat uras e levadas es muy COltO, dado que el tiempo

de re sid en cia de l as c clu las e n l a c am ara de rornpirniento es de 0.025 a

0.0 4 se gu ndo s. A mbo s e fe ctos c on tribu ye n a incrernentar l a e f i ci e n c i a

de l a o p e ra c i on .

HD I8 l3 NO D E EQUf PO D E ROMPIMI EN TO

E n e s tu d io s sabre e l rorn pim icn to de c elula s de g. coli (Agerkvist.

y E nfo rs 1 99 0), se e nf rio l a c arn ara de ro mp im ie nto P 9r in rn ersio n e n

un baiio de ag ua h elada para proporcionar eufriamiertto a di ci ou al a l'

p ro po rc io na do p or e l serpentfn de l e quipo, L a s uspe nsion ce lular se ali-

mentea una pr es ion de60 M Pa y a unf lu jo de 18 Ilk. La temperatura

d e 1 0. suspens ion a I. e n t r ada vario en t r e 8 y lO'C Despues d el p ri me r

p as o l a te mp era tura a Ia s al id aJ "e a pr ox ir na da me nt e d e 23'C, d e c e re ' a'

de 27"C d es pu e s d el s eg l ll l( lo y a pr ox irn ad am eu te d e 28 'C de spue s de .

tre s pas as. .

Tama iio de los r estos celulur es. 81microfiuidizadorproduce restos

c el ul a. es d e m ay or t arn af io q ue l os p ro du ci do s ell ~ I h c mog en eiza do r .

M an lon -C au lin , g en eran dose susp en sio uss de m en or visc osid ad. A m-

b os e fe ctos fa cil .il an l a se pa rac io n d e l os re sto s e el II l are s. du ra nte la

c en trl fu ga cio n, E st e e fe ctc d ism lrm y~ a .1 a uru en ta r e l n um ero d e pasos

[Age rkvis t y En fors, (990). . .

Concentraci6n Celular, E n in ve sti ga cio ne s re ati za da s C OI I·E . ' C I J / i

( ~aue r eI a i, 1 98 9), s e e nc on tro q ue e l u uc ro ll uid iz ad or. p ue de ro mp er

c el ul as q ue s e e nc ue n tra n e n s ol uc io ne s c uy as cOIlC€r1tracione.s v ar ia n d e

5.6 a 174 g ram os de peso se co p ar l itro .

. E J h e ch a d e q ue e n e l m ic ro fl uid iza dor p ue da n 'm an eja rs e c on ce ntra -

c lones h as ta d e 5 .6 g ramo s d e p eso s eco por litre tiene imp l ic~cio"es en

el disedo op t ima del procesode bioseparacion, c l a d o qu e " , posible pasar

e l c al da d el l er me n ta do r d ir ec ta rn e n te a ll n ic ro A ui di ,a ci or p ar a. ef ec tu ar

la r up tu ra c el ula r. D ee sta mane ra puede elirninarse l a operaci on de

, ?s ec h a d e c el ul as , 0 d is min uir e l g ra do d e cOllcen traciOll_I l€Ces.:t[ ' io pr e -

V I , O a l a r up tu ra . 8 1 c os te de l p ro ce so e n l orrn a iu te gral p ue de se r ruenor

a un c ua nd o l as e ta pa s d e c on ce n tr ac io n y p uri fi ca ci ou p os te ri on s a l a

r up tu ra t ar nb ie n s e v ea n m od if ic ad as

5.4 Diseiio de Equipo de Rompimiento

E n e sta s ec cio u s o p re se n ta n l os p ri nc .p io s de d ise no de l os d os tip os de

e qu ip os m as e mp le ad os e n e l r om pi mi en to c el ul ar a n iv el in du st ri al :

199



l200 CAPiTUW 5. ROMPIMI£NTO DE CeWLAS

M o li no d e P er la s d e A l ta V e lo e id ad .

• h omcg en e i zad or d e A lt a Presion.

5.4.1 Molino de Perlas de Alta Velocidad

L os m ol in os d e p e rl as d e alta v el oc id ad p ue de n s er o pe ra do s e n dos

Iorrnas:

- U p er ac ic n l n te rm i te n te ,

- O p e ra ci on C on ti nu a.

Operacion Intermitente

L o s m o li no s d e p e rl as p ue d en s e r o p e ra do s ell fo rma intermitente cuan -

do e l vo lu me n de l a su sp en sion ce lu la r a tratar e s b ajo, 0 c ua nd o s e

d e s e a e fectuar exper imen tos p a ra g e n e r ar datos d e d i se i io .

E n u na o pe ra cio n in te rrn it cn te , i ni ci al me n te s e c ar ga e l m ol in o con

l as p e rl as y la suspension c el ul ar. D uran te [a op eracio n se cie rra l a

s a li da d e s u sp e n si on y se ag i ta a l a v e l o c id ad es tablecida,

EI g rade de rcm pim ie ntc log rado pucde s er de te rrn in ado de dos

Iorrnas:

- D ir ec ta rn cu te : C on ta nd o e l u um e ro d e c el ul as i ut ac ta s p or u ni da d

d e v ol um e n ,

- l nd ire cta rn en te : M e dia nt e l a m edic io n d e L in c om po ne nte l ib era do

d u ra n t e e l r om pi rn i e n to , 81 1 el caso de p r od u ct o s d e t i po p r ot e i co

l a d et en n iu ac io n d e p ro te iu a t ot al sl» l a a ct iv id ad e n zi m it ic a

s o n m e d ic io n e s C O I I I U I I 1 1 1 eu te u l i l i z a d a s .

81 rornpimiento e e ln la r i ut en ni te n te e n m ol in os d e p erl as a gi ta do s

a a lt as v e lo ci da de s s ig u e u na cin etica d e prim er orde u. E l b al an ce de

m asa d e p ro te i n a l ib e ra d a puede s er e xp re sa do m e di an te l a e cu ac io n

siguiente:

(5.6)

5 .4 . D IS EN O D E E QU TP O D E R OM PIM lE NT O

L a e cu ac ion a nt eri or e st ab le ce q ue [a v el oc id ad d e I ib era ci on d e i a

m as a d e p ro te in a ( ce lu la s r ot as ) e s p ro po rc io ua l a la m as a d e p ro te in a

p re s en te n o l ib e ra da - .

donde:

J '

1 ~ \1 : V ol u m e n l ib re d e l m o l in o . W ]

10 "

R m : C on ce n tra ci on m ax im a d e p ro te in a o bt en ib le , I M / L 3]

R : C on c en tr ac io n · de p ro te i i, .a li be ra da e n e l t ie m po t. [ M / L 3

t: Tiempo d e o pe ra cicn . E n e ] c as o de la m olie nda in te rm ite nte e l

t ie m po d e o pe ra ti on t: e s ig ua l a l tie mpo de re side ncia de las

c e h. la s e n e l m o li no . [t 1

k: C on ~ ta il te d e velocidad especifica de p ri m e r o rd en q ue d epe nd e d el

ti po d e c el ul a, d el t ip o y v el oc id ad d el a gi ta do r, d e l a c ae g a y

t am an o d e l as p erl as , d e l a c on ce n tra ci on c el ul ar y d e l a te m pe -

ratura. [t-I] .

L a .e c ua ci on a n te r io r p ue d e s e r i n te g r ad a arreglandola d e l a s i g u ie n t e

fo rma:

r __!!!_ = k l' «1 Q R ,. - R 10

P ar a o b( en ~ r l a e c ua ci on d e l a o pe ra ci on i nt er m it ~n te :

(5,7)

R ",lll--~kt

R " , - R

D e a cu er do a la e c ua c ic n .a n tc ri or l a s g'raficas de

(5.8)

I n IR rn / ( R m - R )1 V$ t

p ro du ci ra n r ec ta s d e p en di en te k y o rd e n a d a a l o ri ge n c er a.

E n l aFig uraS .l f se m ue stra I a l ibe ra cion d e prote in a a p artir d e

Sa char omyses c e r ev i s ia . utilizando u n m o li no Netzsch L ME 20 ca n di-

f e re n t e s t ip o s de a gita do rcs , E I re su lt ad o m ue st ra c la ra me ut e q ue l a

. d e s il l te g r ac i6 n . c e l ul a r s ig u e u n a c in e t ic a d e p rime r o rd e n i nd e pe n di e nt e

201



lI

202 CAP,TULO 5. R OM PIM fE NT O D E C EL UL AS

0.7

0 .s

0.5

~E

04

~E

e .3:

j0.2

01

Impu::.or~s: (l:.! de postes; (0) de discos:

( D J e x c e n t n c o .

F ig ur a 5 .1 5: L ib er ac io n d e p ro te in a a p ar ti r d e Sacharomyses cereursrce

e n e x pe ri m en t os c on r ec ir cu la ci on p ar a d if er en t es t ip os d e a g it ad or es .

F ue n te : K u la y S c hu tt e, 1 98 1ReproQl, l c id a c on e l permiso de d AII)ericlI], lnstitute of Cheuucel E~,gilleoers. Copyr igh t ©19S 1

A1ChE, 'Iodes 105 derechcs reservedos.

i

SA. D IS EN O D E E QU IP O D E R O MP fM IE NT O

d e l t i po d e a g it ad cr . O b se rv an d os e t am b ie n d if er en L e sv al or es d e k parac ad a t ip o d e a g it ad o- .

En e l case que e l g rade de rorn p im ie nt o s ea se gu id o m e di an te l a

ac t iv id ad e nz ima t i< :a A, l a e cu ac io n ( 5. 8) p ue de s er e xp re sa da c om o:

(5 .9)

E je mplo 5 .2 .- C in etica de rornpimienm in te rmitente .

En e I r om pi rn ie n to i nt er mi te n te p ar a l a o b te n ci on d e u na e n zi ma d e

S. cerevisiae, s e u ti li zo l in m o li no d e p e r] • .s d e a lt a v el oc id ad d e 4 l it ro s

o bt en i en d os s l os s ig u ie n te s d at os :

t iempo R x la ' A x to'(s) (Kg /Kg ) (mol/min- [(g)

00 0.000 0.000

1 .5 1.025 0.625

30 2.150 1.150

45 2.525 1675

60 3.4.25 2.150

Max" 1 0 . 0 0 0 6 7 0 0

a ). - C al cu la r l a c on st an te c in e ti ca p ar a l a I iberacion de proteiha:

b ). - C al cu la r l a c on st an ts c in e ti ca p ar a l a l ib er ac io n d e e n zi ma .

Solucion:

L a s c on s ta H te s c in e ti ca s p uc de n s er o bt en i da s m e di an t e e I e m pl e o d e

l as e c ua ci on e s ( 5. 8) y ( 5. 9) . L o s c al cu lo s n e c e sa r io s s o n l o s s ig u i en t e s:

I t ie m po ( s) l i n ~ l i n 5J- -00 0.0000 00000

15 0.1081 0.0979

30 0.2421 0.1883

45 0.2910 0.2877

60 0.4193 0.3870

203



)

204 CAPiTULO 5 IWMl ' lMfENTO DE GELULAS

a).- M edian te uu aj uste de los da .tos por U 1 l u i n L O S c ua dr ed os s r; :" pu e cl e

o bte n er p ar a l a l ib er ac io u d e p ro te in a l a c ou sta ute ,

k = 6.984 X 10- 3 S-l

b).- D e ig ual rn an era, p ara l a l ibe ra cion de e nzirn a 1 3,co n s t { l n L e es :

k = GA12 X 10- 3 s-I

Operacion Continua

D u r an te l a o pe ra ci on c on ti nu a- d el m ol in o d e p er !a s 1 '1 su sp el 'l sl ol l_ ce lu !a r

a . tra ta r e s a li me nta da c cn tin ua me ute 0 ,1 tu ol it, o e li u no de SlJS e xt re rn os .y r et ira da c on ti nu arn en te e n d e xt re m a o pu e st o

En cl d is er .o d e l os m ol in os d e p erl a s e s n e ce sa no c on sjd era r el grad"

de d isp ersion d e l os tie mp os d e re sid en cia de la s c el ul as e n e l m olin o.

A dife re nc ia de la op era cio n in te rm ite nte , e n u na op ei a cio u c on tin ua e l

ti em po d e re si de n c. a v ar ia p ara l as d if ere n te s c cl ul as d e l a s us pe ns io n,

g e ne ra nd os e u na d is tr ib uc io n de t ie rn po s d e r e s idencia d e l n p ob la ci cn

ce lu lar .

EI tiernpo d e r e si d en c i a med io Ie la dist- ib. icion .de tie mpos de

re si de n ci a e s d if er en tc a l ti ern po d e re si de n cia ideal til dado por:

donde :

t i " < : T ie mp o d e re si de nc ia id ea l. I t ] .

\ f " r : V ol um en l il lre d el m ol in o IU].

F : Fluja a li rn e nt ad o a l m ol in o I Ls /I I·

Grado de Mezclado en un M olin o de Pe r- las. E ,I g rado de de s-

v ia ci6 n de l Il ujo ta po n ide al ell lo s m olin os d e pe rl as c om erc ia le s, h a

sido sim ul ado util izan do e l m ode lo d e " [te acto re s continuos en sere

t ip o ta nq ue p er fe cta rn e nt e a git ad os1? Median t e d u sa d e e ste m od el o

los e xpe rim cn tos con pulse s de tiu ta pe run te n de te nn in ar e l m im ero

-----------

5 .4 D IS EN O DE EQUII'O DE ROMPIMIENTO

de tan que s pe rfe ctam nn te ag itados e n se rie a que e qu ivale e l g rado de

r oe zc la do q ue s e p re se n ta ell e l m o li no ( Sh ii tt e y K ul a, 1 99 0) .

Al aplicar un puls o de t i n t a ell la prirner a etapa de una serie de

tan que s pe rfe ctam en ts ag itados, e l balan ce de la m asa de tin ta para

( ua lq ui er e ta pa n e sta d ad o p er l a e xp re si on :

VM dC , ,!id! = F'(C n_1 - C n)

I donde :

N : N um ero rl e e tap as de l a s erie .

C , , : C on ce ntracion de tin ta en la e tapa n . 1 M / L31 .

Ulilizalldo u r; t iem p o a dim e n si ou al d e fi ui do par:

0= IF = _ !_V , I I tn

la ecuacicn (5-10) pucde expresarse 00010:

s c ;- - - - ; w = N(C"-I - en )

c o n l a s c o n di c io n e s:

0<0 C, = 0

e =0 C, = N C o

0> 0 C o = O

Para Ia e tapa · l I I lmero I l a e c ua cio n d e b al an ce s e reduce a :

eo ,do = -NC ,

y l a f or ma in te g ra da e s:

lIde 1 °= -N dO

NC. C, "

(5.10)

(5.11)

(5.12)

(5.13)

205



20 6 CAPITULO 5 ROMPINUENTO DE CEWLAS

d e ta l m an er a q ue :

C,- = N exp l -NO)C o .

(5.14)

S u st it uy e n do l a e x pr e si on a n te r io r el 1 " e c ua ci on d e b al an ce p ar a

la s e g ul l da e t ap a y efectuando la integracion correspondrente, es posi-

b le o bt en er u na e xp re si on p ara l a c on ce nt l· ac i6 n e n l a se gu nd a e ta pa .

S i gu ie n c lo e s te p ro c ed rm i e nt o e s p o si bl e dernost-ar que para l a e t ap a N

s e t ie n e q ue :

CN NI'ION-I exp( -NO)

C o (N - 1 )1

E n l os e st ud io s d e m e zc .a do a l c oc ie n te C N IC o s e I e d en ot a c om o E

y o s u n a rn e di da d e l a d is tr ib uc io n d e t ie rn pc s d e r es id eu ci a d el t lu id o

d e n tr o d e l r e ci p ic n te ( L Eve n s pi e i, 1 9 72 ) .

L a a pl ic ac io n p ri ct ic a d el d es ar ro ll o a n te ri or p ue de v is ua li za rs e d e-

r iv an d o l a e cu ac io u ( 5. 15 ) r es pc ct o a e e ig il al an do e l r esu lta do a c ero

pa ra 0btene r:

1N=--I~· m , i < : , J , '

donde O m , " es el t ie mp o a di rn en si on a. ,I m al [' ; es maxima. D e t al

r n an e ra q ue e l n i ir n er o d e e t ap as a q ue c qu .v al e e l g r ad e d e m e zd ad o de

u n m a lm o , p ue de s er d et er mi na do a p ar ti r d e l os d at os e xp er im e nt al e s

d e con ceut ta cio n con tr a t iempo que r es ul ta n . 1 a p. ic ar un pulse de

trezador.

E ficien cia de los M olin os de Perlas, 8 1 u um ero de e ta pas d e .m

m o li no d e perlas o bt en id o m e di an te e xp er im e ut os d e p ul so s, p ue de s er

e rn p le ad o p ar " c al cu la r I . e fi ci eu ci a d e r om p im ie n to esperada.

P a ra r e la c io n a r el ruiruero d e e t a p as c o n l a e f ic i en c ia d e r om p im i en t o

e s n e c e sa r io r e al i za r Ut b a la n c e d e p ro t ei u a l i be r ad a ( ce \ ul a s r ot - as ) (011-

s id e ra n d o q u e e! m o li no c on st a d e N e t ap a s t ip o t a nq u e p e rf e ct am e n t e

me zc la d os e n serie, y qu e el rompimiento s ig u e u n a ciuetica d e p r im e r

orden.

E I b al an ce de p ro te i n a l . b e rada ell la p nm cra e ta pa d e l a se rie e sta

dado por:

(5.15)

(5.16)

5 .4 . D fS EN O D E E Q U I P O DE R O M P I M f E N T O

donde:

H ,: C on c en tr ac io n d e p ro te in a l ib er ad a ell l a e t ap a 1. 1M!Ll] .

t: ' I' ie rn p o d e o pe ra ti on . I I]

k: C on st an te d e v el oc id ad e sp ec ff ic a d e p ri me r o rd e n, [rl]

. La e~uaci61: anterior puede ser expresada err [uncion de un t i empo

"dimensional dado por: .

tFe ~ -V ,H

y cbtener,

La ecuacion an t er i or puede ser integrada con l a s c o nd i c io nes

y obtener:

(

kV" ')R, = R" N~.v

1 + N~

L .... .a ecuacion a n te r io r t a rn lHen puede ser expresada como:

R", ( W A f )Rm-R,= I+

NF(5.21)

Continuando c on e st e p ro ce di mi en to p ue de s er d e mo st ra do q ue p ar a

la etapa N se tieue:

)

207

. (5 .17)

(5.18)

( 5 1. 9 ) . .

(5,20)



)

208 C,lNTU/,O 5. ROJvfPfNfmNTO DE CE/,ULAS

. 1 4 " . ( ' I k 1 ' ;, ." ) N---= +-.-R oo r RN NF

(5.22)

Ejen1pio"5.3._:_ Det erruinacion del numero de etapas cquiva

leubes de till rnolino de perl.as.

U n m ol in o d e per l as t ipo p ii ot o COli carnara d e 4 litros d e volumen,

se carga de per-las de tal. rnancru que Ia fracc ion de volumen [ ibre es de

0.48 rcspecto al volurneu de la cemara.

Para. deterrninar el ruimero de etapas de l mol ino de a cu er do a l 01.0-delo de tauques en"S€r"l f"- ' ) se i nt roduce uu pul so de tinta.al molino cuando

este o p er a . e n forma estacio'na.fia C O l i un f iu jo d e ,S O I j lt. L os d at os d e

con~ntraci6il a la s al id a d e l molino apareccu GIL las columnus (l) y (2)de la Tabla siguientc : . .

(1) (2) (3) (4) (.J)

t ( s l.I C.(U) c ss 8 E

2 ! : " } 11.5 287.5 O . \ 8 0.097

50 52.2 \305.0 030 0.442

75 930 2325. 0 0 .5<1 0.787

100 107.3 2682.5 0.72 0908

12.) 101.7 2542 ..) 090 0.861

n o 853 2132.5 1 .0 9 0 .7 22

H5 55:0 lG25.0 l.27 0.550

20P <175 11,87.5 LA S OA02

225 32.S 820.0 \.63 0.278

250 21.8 545.0 1.81 0.18527!, 141 352.0 1.99 0.119

300' S.S 220.0 2.17 O . O j ~

325 5A 135.0 2.:.i5 0046

350 33 82.5 253 0.028

375 \.9 'Ii,S 2_ 1 I 0.016

400 1.1 27.5 2.89 0.009

425 O .G 15.0 J.07 0005

Suma - 16,332.5

. a ).- Ca lc ula r e l tiempo d e r es id en cia i de al.

)

5 .4. D lSENO DE EQU lPO DE ROMPlMfENTO

b).- Estimar el valor de Co.

c).- Obtene r la g "' .Ac a d e E vs O .

d).- Estirna» el mirnero de etapas N

e). - Calrnlur Ia eficiencia POf e tapa s i. k = 1.93 x 10-2,-1f).- Ca lc ula r la e fic ie uc ia g lo ba l d e l as N etapas.

Solucion:

a).- E I t iempo d e r es id en cia i de al e st " da do por :

til

V . , , ,

F

4 I x 0.48 x 3600,

tR h

50t

tR 138 .24 s

b). - E I v alo r de Co puede s er e stimado media nt e I " e xp re si on :

Co = (F) ( l : : i~IC6t)

\!;\.(

De acuerdo a lo s c alc ul os d e la c olumna (3) d e I " Tabl a. a nt er io r,

Co

Co

16332.5

138.24

118.15 Unidades

, c).' En las columna. (4) y (5) de la Tabla anterior aparecen 10.

calculos del tiernpo adimensional By la conccntrecicn adimensional E.

La F ig ur a 5 .1 6 mues tta I " g r< if ic a d e e ste s d at os .

d).- De la Figura 5.16 se puede deter rninar que cuando E present.aun maximo,

Oooa~ = 0.75

Uti li zando l a ecuac ion (5. 16) se obtiene:

209



l210 CAPiTULO 5. ROMPIMIENTO DC ; CE;WLAS

1.0

0.9

o. e

0.7

0.6

0.5

0.'

o. s

0.2

0.1

0.0

0.0 0.5 \.0

Figura 5 .16: D is tr ibuc ion de t iempos de res ideuci a del e jemplo 5 .3 .

I .

5 .4 . D IS EN O D E EQ UIP O D E RO M P IM IE NT O

N. =

N1-0.75

N - 4

)

e).· La e fic ie nc ia d e r omp imient o en c ad a e ta pa d e a cu er do c an l a

ecuacion ( 5 . 2 0 ) e5:.

.... (~)Ej1,czr.ncza = ~(kl!. 1+ W)

e l val or del . g rupo ent rcparent es is de l aexpres ion ant er io r es:

d e ta l r na ne ra que :

kVM

NF

kVM·

NF

.(L~3 x 10-' s-1)(13K24 s)

4

0.067

f).- La e lic .e nc ia g lo ba l p uede s er ob te nid a a p ar ti r d e la e cu ac io n

(5.22),

E/iciencia

E/idencia

0.667

1 + 0.667

04

. R ,, ,(I + 0.667)'

R,.;- RN

. R,,,

R,n - RN

detal manera que:

771.6

RN = 0.87Rm

LiJ-eficiencie. global de rornpimiento en el molino es del 87%.

2Jl



)

212 CAPiTUW 5. R.OMPIMfBNTO DE CELULAS

5.4.2 homogeueizador de Alta Presion

La des integr acion celular en un hor nogeneizador de alt~ presion a: u na

presion lija dada puede ser descrita mediante una cmetrca de prrmer

orden respecto al mirnero de pasos , de tal manera que:

dR '. R)~=k(H,"-dN

(523)

donde:

R: Conceutracion de proteiua liberada (celulas rotas) despues de N

pasos, lMf £ , ' 1 ·

Rn,: Concentr acion maxima de proteina que puede ser lib rada.

(MIL3).

N: Nume ro d e p asos a tr av es d e l a v alv ula d el h omogene iz ador .

i: Cons ta nt s c in eti ca de p rime r o rd en. [ lf pa .s os ]

L a e cu ac io n ante ri or p uede s et i nte gr ad a COil las condiciones:

H=O

obteniendose la ecuaciou:

In~=k'NR", - R

Se h a d et en nin ado exp er ir ne ut alm ent e que l a c on sta nt e k' t icne una

depend en cia con la presion dada POl':

(5.24)

k' = (P" (5.25)

d on d e:

P: Presion de operacion. [M /1' L].

)

5.4. DlSEiw DE EQU[PO DE ROl'vIPllvIlENTO

k" : Con stante dimensional de rompimiento. fA4 -at2a L ? t 1 /pasosJ.

a: Pararnetro constance en fangos Ijnlit~ ' I .dos de presion. Un val or

Upico par a levaduras es a = 2 .9 Y par a E. c ol i a = 2.2.

Combinando l as ecuac iones (5.24) y (5.25) se obtienc:

(5.26)

EI proceso de rornpirniento celular descr ito por la ecuacicn (5.26),

es indepcndiente de la concentr acion celular .· Por otr a parte, se ha re-

portado que la actividad de enzir na liberada en relucion a ia protein a

total liber ada , es independic nte de la presion de operacion, de la tem-

peratura, y d e l a c on centr ac io n i ni cia l d e c clu la s e n e l c as e d e le vadu ra s.

Sin embargo, la [r accion de enzirna liberada respecto ala enzima tota.lpresente depende de la localization de la enaima particular dentro de

l a e str uc tu ra c elu la r (Saue r e l a i, 1 98 9) .

Microfluidizador

En e l c as o d el ll lic ro flu idi za do r l a c in etic a d e r omp im iento p re se nt a u na

ciertadependenciano l ineal con el rnirnero de pasos expresada mcdiant ala ecuacion: .

(5.27)

claude b es un exponentc que varia Con el tipo de celula y torna

valores entr e 0.28 y 1.00 (Sauer et ai, 1989, ) '

Ejemplo 5.4.- Rompimiento de R coli en Ull microfluidiaa-dar.

En la recuperacion de f3 g al ac to si da sa d e E. coli, se Ilace pas ar POl'

un rnicrofluidizador tipo M-110 una suspension celuiar que contiene

47.6 slt en peso seeo. La pr esion de oper acidn utilizada fue de 60 MPa.

La cantidad de proteina liberada despues de cada paso se present.a

en las columnas (I) y (2) de la Tabla siguiente:

213



. .

214

)

CA.PiTULO 5. iWMPiMIENTO DE CELULAS

(I) (2 ) (3)

% Protema

Paso Liberada In [Rm/(R ," - R )I

1 630 0. 994

2 79.0 l.560

3 880 2.120

5 950 3219

10 99.9 6 . 908

a ). - E sf im ar e l v alo r d e l it c or .s ta nt e c ir et ic a d e r ompi rn ie nto COilT

sideraudo que para. este caso a ~ 2.2 y U .~ L _

b).-Estimar el ruimero de pasos paia l ib e ra l' e l 93 % de pro t e in" en'

este proceso.

Soluci6n:

De acue rdo a la ec uacio n ( 5.27 ) el gra do de romp'lm~entopar-a estecaso puede ser expresado como:

de tal manera que de la pen die n te de la g"",fica d e I n[ Rm /( R m . - . f i)1

contra N es posible eat imar k" . Los calcu.los uecesarios S muestra n e n .

lac olumna (3) d e la Tabla ant er io r. Mediant e Ull a just epor mirurnos

cuadrados de estos datos seobt.iene:

k" p'" = 0. 688

y p ar a P =G O M Pa ,

b ).- E I m ir ne -o d e p asos r eq ue ri do s p ar a un a l ib cr ac kin d el 9 3 % de

pro tc ina es:

)

5 .5 . S UM AR lO

IV

IV

(!n~)0.000084 x 60"

3.88 pasos

Se neces i t an 4 pasos de rno li enda .

Comparacion de los Metodos Mecanicos de Ruptura Celular

La Ta bla 5.5 rnucs tra datos de pr oduction de alguua s eneirnas uti-

I is an do e l molino d e p er la s y el hornogeneizarloi M autou- Cau lin . L a

r up tu ra c el ul ar u til iz an do e l mo lin o d e p er ja s p er mite la o bt eu cio n d e

un mayor por ce nt aje d e enz ir na a cf iv a e n un nurnero rnenor de pasos

e n compar ac id n coo e l a or nogeue iz ador . S in embargo , la p ro du cc io n

de proteina en el molino es en general menor que la obteuida en el

hornoge iu izador .

La Tabla 5.6 muestr a los datos par a la liber acion de la enzima (3

gaiadosidasa de ce lu las de E . c ol i u ti li za nd o u n mol ino de pe r - las tipo

Dyno Mil l, un homogenei zador t ipo Manton-Gaul in y U! Microfluidi-

zador . Est es dat os muest ran que e l Micrcfl ui di zador pennite rnanejar

rnayores concentraciones .d e biomasa y produce un rendnni en to mayor

de enzima a ctive. Ade rnas, el tamaf io media de 1 0 . " restos celulares

que se produc en en un pa so e sm ayor que el enc ontr ado en las mismas

condiciones en el homogeueizador Manton-Gaulin,

5.5 Sumario

EIrompimient o cel ul ar es una operaci on necesar ia ruanda e l prcduct o

de i n te res se l oca li za a! i n te ri or de i s cel ul a, Exi st en var ies metodos para

efectuar esta operacirin. A nivel industrial 5610.le ernplean los molinos

de perias agi tados y lo s a o rn og en eiz ador es d e a l r a p re si on E Id is en o d e

l os mol inos est .i bas ado en ecuac iones ernpi ri cas y ell en experimentospiloto.

215



21 6 CAPiTULO 5. R OM P{M IE NTO D E CELULAS 5 . 5. SUJV fAR lO

T a bl a 5 . 5: Comparaciou de metodos de rom pi miento celular.Huptwa cit! eelulas de £ ';I)li ccu dfflehtllS m-i i lodo.s

Metoda Peso scco libcrecidn de Dis tr ib ucion de ViscosidadMofino de Perlas*" homQgcnciZ;)dQr~""_ de j3·Galactosidas,l t..arna.iio ~

Micro- Enzinta . 'CL. Pasos Prod. A CI Pas05 Prod. biomesa Protema Actividad media Picot:! lOs ro o $":

organismo [lberadu solub." N. k g / o SQlub." No . kg! . 1.//1 (% ) (%) ( nm ) (run) (mPllsJ (mPa $)

LevadurasMolino de

SaccharomycfJ Dvglucoso 86 % 60 91% 60Per-Jas·

c{J,TJ.sbcTgtll.tis 6 .ros (O ' i tQ2 min. 49,5 6, 62 612 41}L806 63 ,8

deshidrogeaesa3 mn. 49.5 72 74 553 4 6 5. _ 7 8 7 38 19

SacdUl.r~mycf$ D glucose 98 % '0 95% 60" min 49.5 79 79 529 471,777

19 146·fo.sfa.I,O

Manton,

deshidrcgeoasaGaulin"

C!Jndi.ln. Formato 95% 40 88% 651 paso 48.4 66 58 501 451 llJ 30

hOldin l1 Deshidrogenese2pasos 48.4 76 75 41. 180,457 8

Bncteeias3 pesos 48.1 82 78 217 191 B

B- CeT~US Leucina 84% 16 82% 6Mi.cro6ui _

dizador**deshidrogenesa

1 pasoBrel,ibackrilJm FUmarCL! j 3 85%

"10%

101.9 62 62 693 <193, 633 51 ·'6a.mmon.ieLllenc:i

Ipaso 73.2 65 61 693 <189 ,800 35 15

E, .col i Pcnic i lina 95% 8~% 57lpaso. 47.6 63 61 S7J 486 ,800 28 10.

ecilese2 pesos 47.6 7. 76 480 458 10

~a.do6aciflll. .f D-Lecteto 92% zo 84% 6'J pesos 47.6 88 87 451 4<15 6 6

crJ"l1ju,slu deshidrogeuesa5 pasos 47.6 . 96 9710 pesos 47.6 100 100

.. Activided solubilnede

. .. . N e t zs ch L M E 20

. ,. ,, , Gau li n M3

Adapteda de: KuJa J' Schutte, 19B7

"'Dyno .Ami KD[" a diferentes tiempns prolllMios de rcsideecia... homcgeneizadcr

Adaptada de: Agerkvist y Enfor s, 1990

Reproducide Cone] P£flllisQde John Wiley alld Sons. Cupyrig.!tl @1990. 'Todo:;,los derechcs :Re pr odu cide c an e l p er mise d e e l A Ule ric au In st itu te of Che mic al E ng ine er s Cop yri ght ©19 87

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)

2 1 . 7

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